La transcriptase inverse (RT) est un hétéro-dimère p66/p51 avec des activités ADN polymérase et ribonucléase H qui jouent un rôle critique dans le cycle viral du VIH-1. La RT convertit l’ARN génomique viral simple brin en ADN proviral double brin dans le cytoplasme de la cellule infectée. L’efficacité de la RT est augmentée par la protéine de la nucléocapside (NC) grâce à son activité chaperonne vis-à-vis des acides nucléiques et/ou une coopération entre les deux protéines. Dans ce travail, nous avons étudié par la technique de smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) les effets de la NC sur l’interaction entre la RT et un substrat d’ADN au niveau de deux sites de pause de la synthèse de l’ADN(+). Nous avons d’abord réalisé et validé le montage de smFRET. Lors de la validation du montage avec des fluorophores Cy3 encapsulés dans des vésicules lipidiques, nous avons mis en évidence deux mécanismes différents entrainant le photoblanchiment du Cy3. Ensuite, après avoir déterminé les propriétés de liaison à l’équilibre de la RT et la NC sur différents substrats amorce/matrice à l’aide de mesures d’ensemble en solution, nous avons confirmé par smFRET que la RT adopte plusieurs conformations sur son substrat d’ADN, incluant celle qui conduit à la polymérisation de l’ADN. En présence de la NC, nous n’avons observé qu’une réorganisation modérée des différentes conformations du complexe RT/substrat. Par contre, une réorganisation beaucoup plus importante est induite par la NC en présence du dNTP, avec une très forte exaltation des conformations compétentes pour la polymérisation. Nous avons également montré que la NC augmente l’efficacité de synthèse de l’ADN au niveau de sites de pause en diminuant ou en augmentant le temps de dissociation du complexe RT/substrat/dNTP selon le type de site de pause. L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les mécanismes polyvalents par lesquels NC facilite l’activité de la RT. / The reverse transcriptase (RT) is a p66/p51 hetero-dimer with DNA polymerase and ribonuclease H activities which plays a critical role in the viral cycle of HIV-1. RT converts the viral genomic RNA to proviral DNA in the cytoplasm of infected cells. The efficiency of RT is increased by the nucleocapsid protein (NC) through its nucleic acids chaperone properties and/or via direct interaction with RT. In the present work, we investigated the effects of NC on the interaction between RT and its DNA substrate attwo pause sites during the synthesis of (+)DNA by using the smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) technique. In a first step, we implemented and validated the smFRET set-up. Within the validation step, using Cy3 fluorophores encapsulated, in lipid vesicles, we monitored the photobleaching of Cy3 dyes and found out that it was governed by two parallel mechanisms. In a second step, we determined the affinity of RT and NC to different primer/template substrates by using steady-state fluorescence. Then, we confirmed by smFRET that RT adopts different conformations on its DNA substrate, including the one that leads to DNA polymerization. In the presence of NC, we observed only a moderate reorganization of the different conformations of RT/substrate complex. However, NC was found to induce a more important reorganization in the presence of dNTP, with a very strong promotion of the polymerization-competent conformations. We also showed that NC increases the efficiency of DNA synthesis at pause sites by either decreasing or increasing the dissociation time of the RT/substrate/dNTP complex, depending on the type of pause site. Together, these data allow us to further elucidate the mechanisms by which NC facilitates the RT.

Le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type I (VIH-I) est majoritairement dégradé dans les cellules dendritiques dès son entrée. Des travaux précédemment réalisés dans l’équipe montrent que le mécanisme de l’autophagie contribue à la dégradation virale (virophagie) et promeut les réponses immunitaires innées et adaptatives. Etant donné que cette virophagie est par la suite inhibée par le virus dans les cellules dendritiques, mieux comprendre la mise en place de cette autophagie antivirale est primordial afin de pouvoir favoriser et surtout stabiliser les défenses cellulaires. Nos résultats montrent que DC-SIGN, un récepteur lectine de type C (CLR) qui reconnait des carbohydrates mannosylés ou fucosylés, pourrait être impliqué dans la mise en place de cette autophagie antivirale. Ainsi, nous montrons qu’après reconnaissance du VIH, ce récepteur induit l’autophagie et interagit rapidement avec plusieurs protéines autophagiques dont certaines impliquées dans les voies endosomales. En effet, nous montrons pour la première fois l’association de la protéine Atg9 avec le récepteur DC-SIGN internalisé. La protéine Atg9 est un facteur essentiel de l’initiation de la voie autophagique régulant notamment l’apport de membranes issues de la membrane plasmique pour la nucléation de vésicules liées à la voie autophagique. D’autre part, après une étude par spectrométrie de masse de l’intéractome du récepteur DC-SIGN internalisé, nous montrons qu’une E3 ligase faisant partie de la famille des TRIM, TRIM25, est recrutée lors de l’endocytose du récepteur. Cette protéine a été rapportée comme étant impliquée dans la régulation des réponses innées antivirales issues du récepteur de reconnaissance de pathogène (PRR) RIG-I suggérant une fonction essentielle de TRIM25 dans les réponses immunes innées. De manière intéressante, certains membres de la famille TRIM ont été montrés récemment comme étant essentiels pour l’induction d’une forme d’autophagie sélective parfois antivirale, l’autophagie de précision. Dans ce sens, nous montrons qu’un complexe est formé entre le récepteur DC-SIGN, Atg9 et TRIM25, suggérant que l’autophagie mise en place très tôt lors de l’engagement du récepteur DC-SIGN pourrait s’avérer être sélective. L’ensemble de ces éléments constitue une première étape pour une meilleure compréhension des étapes précoces de l’entrée du VIH dans les cellules dendritiques avec la caractérisation d’une virophagie sélective induite lors de l’engagement d’un récepteur de l’immunité innée et qui représente une cible particulièrement intéressante afin d’améliorer certaines stratégies thérapeutiques développées actuellement. / The Human Immunodeficiency Virus type I (HIV-I) is mostly degraded in dendritic cells as soon as it enters. Previous work in the team shows that the mechanism of autophagy contributes to viral degradation (virophagy) and promotes innate and adaptive immune responses. Since this virophagy is subsequently inhibited by the virus in dendritic cells, a better understanding of the implementation of this antiviral autophagy is essential in order to promote and above all stabilize cellular defenses. Our results show that DC-SIGN, a C-type lectin receptor (CLR) that recognizes mannosylated or fucosylated carbohydrates, may be involved in the development of this antiviral autophagy. Thus, we show that after recognition of HIV, this receptor induces autophagy and interacts rapidly with several autophagic proteins, some of which are involved in the endosomal pathways. Indeed, we show for the first time the association of the protein Atg9 with the internalized DC-SIGN receptor. The Atg9 protein is an essential factor in the initiation of the autophagic pathway regulating in particular the supply of membranes originating from the plasma membrane for the nucleation of vesicles linked to the autophagic pathway. On the other hand, after a mass spectrometric study of the internalized DC-SIGN receptor interbody, we show that an E3 ligase belonging to the TRIM family, TRIM25, is recruited during endocytosis of the receptor. This protein has been reported to be involved in the regulation of antiviral innate responses from the RIG-I pathogen recognition receptor suggesting an essential function of TRIM25 in innate immune responses. Interestingly, some members of the TRIM family have recently been shown to be essential for the induction of a form of selective autophagy, sometimes antiviral, precision autophagy. In this sense, we show that a complex is formed between the DC-SIGN, Atg9 and TRIM25 receptors, suggesting that autophagy early on engagement of the DC-SIGN receptor could be selective. All these elements constitute a first step for a better understanding of the early stages of the entry of HIV into dendritic cells with the characterization of a selective virophagy induced when a receptor of the innate immunity And which represents a particularly interesting target in order to improve certain therapeutic strategies currently being developed.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) induit une activation généralisée des réponses de l'hôte impliquant les lymphocytes T mais aussi les cellules du microenvironnement comme les cellules endothéliales. Les microvésicules (MV) sont des vésicules extracellulaires impliquées dans la communication intercellulaire décrites comme des vecteurs de microARNs (miARNs). Dans ce travail, nous avons émis l'hypothèse que l'infection par le VIH-1 induit l'expression de miARNs dans les lymphocytes T CD4 qui peuvent être vectorisés par les MV et transférés de manière paracrine aux CE. Ces MV joueraient un rôle important dans la pathogenèse de l’infection en contrôlant à distance l'homéostasie endothéliale. Nos résultats montrent que le miR-146-5p est uprégulé à la fois dans les lymphocytes T CD4 de patients infectés par le VIH-1, naïfs de traitement et dans les MV issues de ces lymphocytes. En utilisant un modèle de MV d’une lignée lymphocytaire T enrichie en miR-146-5p (miR-146b-MV), nous montrons que ces MV sont capables de : 1) de protéger leur contenu en miARNs de la dégradation par les RNases, 2) de transférer le miR-146b-5p mimic à des HUVEC et 3) réduire la réponse inflammatoire endothéliale in vitro et in vivo, dans les poumons de souris qui ont reçu une injection systémique de miR-146b-MV. Ce transfert est responsable d’une diminution de l’expression d’ICAM-1 et VCAM-1, à travers une down-régulation d’IRAK1 et de TRAF6. L’ensemble de ces résultats montre que le miR-146-5p transféré par des MV peut diminuer les réponses inflammatoires endothéliales et constituer ainsi un mécanisme de défense de l’hôte contre les altérations vasculaires induites par le VIH-1. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) promotes a generalized activation of host responses that involves CD4 T cells, but also cells of the micro-environnement that are not directly infected such as endothelial cells. Microvesicles (MV), implicated in cell-to-cell communication, have been recently described as vectors of microRNAs (miRNAs). We hypothesized that HIV-1 infection induce cellular miRNAs expression in CD4 T cells which may be vectorized by MV and transferred in a paracrine manner to endothelial cells to regulate vascular homeostasis. Using a miRNome quantitative RT-PCR analysis, we showed that HIV-1 infection leads to a dysregulation of several miRNAs and identified miR-146b-5p as upregulated in both CD4 T cells and CD4 T cells derived-MV from antiretroviral therapy (ART)-naive HIV-1 infected patients, compared to age- and sex-matched healthy subjects. Using a CEM T cell line transfected with miR-146b-5p mimic, we demonstrated that MV from CEM overexpressing miR-146b-5p mimic (miR-146b-MV): 1/ protect their miRNA cargo from RNase degradation, 2/ transfer miR-146b-5p mimic into HUVEC, and 3/ reduce endothelial inflammatory response in vitro and in vivo, in lungs from mice injected with miR-146b-MV. This paracrine control of endothelial inflammatory response mediated by MV involved a decreased expression of NF-κB responsive molecules ICAM-1 and VCAM-1, through down-regulation of IRAK1 and TRAF6. Collectively, these findings demonstrate that miR-146b-5p transferred by MV counteract IRAK1- and TRAF6-mediated endothelial inflammatory responses in HIV-1 infection and could be considered as a host defence mechanism against HIV-1-associated vascular alterations.

Les technologies actuelles permettent d’explorer le génome entier pour y découvrir des variants génétiques associés aux maladies. Cela implique des outils bioinformatiques adaptés à l’interface de l’informatique, des statistiques et de la biologie. Ma thèse a porté sur l’exploitation bioinformatique des données génomiques issues de la cohorte GRIV du SIDA et du projet international IHAC (International HIV Acquisition Consortium). Posant les prémices de l'imputation, j’ai d’abord développé le logiciel SUBHAP. Notre équipe a montré que la région HLA était essentielle dans la non progression et le contrôle de la charge virale et cela m’a conduit à étudier le phénotype non-progresseur non « elite ». J’ai ainsi révélé un variant du gène CXCR6 qui, en dehors du HLA, est le seul résultat identifié par approche génome-entier et répliqué. L’imputation des données du projet IHAC (10000 patients infectés et 15000 contrôles) a été réalisée et des premières associations sont en cours d’exploration. / Nowadays with the newest technologies, the entire genome can be explored to uncover genetic variants which may be linked to diseases. This requires bioinformatics tools which are adequate for studies which are at the border between computing, statistics and biology. My thesis work focused on the bioinformatical analysis of genomic data from the GRIV AIDS cohort and from the IHAC (International HIV Acquisition Consortium) project. I first laid the foundation for imputation work by developing the SUBHAP software. Our team showed that the HLA region was essential in non-progression and viral charge control. This led me to study the non progressor non elite phenotype. Thus, I uncovered a variant of the CXCR6 gene which is, apart from HLA, the only result identified with a GWAS approach so far and which has been reproduced. The imputation of data from the IHAC project (10000 infected patients and 15000 control subjects) was also performed and the first associations are now being studied.

L’ARN génomique du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est multifonctionnel et suit au moins deux destins. Soit il est traduit par la machinerie traductionnelle de l’hôte donnant naissance aux polyprotéines Gag et Gag-pol, soit il se dimérise et est encapsidé dans les virions en tant que génome viral. Les travaux du laboratoire visent à identifier les mécanismes moléculaires de la traduction de l’ARN génomique et de sa dimérisation, ainsi que les déterminants gouvernant la balance entre ces deux phénomènes. La traduction de l’ARN génomique viral peut être initiée de trois façons. Selon le mécanisme canonique nécessitant la présence d’une coiffe à l’extrémité 5’ de l’ARN, et grâce à deux sites d’initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Un IRES a été mis en évidence dans la 5’ UTR, dont l’activité est stimulée lors en phase G2/M du cycle cellulaire uniquement. Un second IRES a été découvert dans la région codante de gag. Il est capable de lier directement la petite sous-unité ribosome et le facteur d’initiation eIF3, et permet l’initiation à partir de deux codons AUG situés dans la même phase de lecture, conduisant à la synthèse d’une isoforme additionnelle de Gag. Mon projet de thèse a consisté en l’étude de l’influence de la structure secondaire sur la traduction et la dimérisation. Dans un premier temps, j’ai mis en place au laboratoire une nouvelle technique de sondage de structure, appelée « SHAPE », développée par le laboratoire de K. Weeks. Le SHAPE nous permet désormais de sonder rapidement la structure secondaire de nombreux ARN, et notamment de tester en routine l’effet de mutations sur la structure secondaire. Cette technique a permis d’étudier la structure secondaire de la 5’ UTR dans différentes conditions. Nous avons ainsi identifié une signature de la conformation monomère de la 5 UTR, et découvert un nouvel élément impliqué dans la dimérisation in vitro. Par ailleurs, nous avons montré que des extraits de cellules Hela synchronisées en phase G2/M du cycle cellulaire stimulent l’activité de l’IRES de la 5’ UTR et modifient le profil de réactivité de cette région, traduisant probablement une réorganisation structurale induite par le recrutement de protéines cellulaires. Une autre partie de mon projet de thèse a concerné l’étude de l’IRES de la région codante de gag, Des délétions progressives de l’IRES, à partir des extrémités 5’ et 3’ ont mis en évidence l’existence de deux sites de liaison distincts au ribosome, localisés à proximité de chacun des deux codons d’initiation. La délétion de chaque site a permis de confirmer le rôle de la liaison directe au ribosome dans la traduction de gag. L’ensemble de ces éléments nous permet de proposer un modèle moléculaire conduisant à la formation des complexes d’initiation sur chaque codon AUG. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’une interaction longue-distance entre la boucle PolyA et la région codante de gag régule de la traduction de l’ARN génomique. Un tel mécanisme pourrait permettre de réguler l’efficacité de traduction du gène gag, voire du ratio entre les deux isoformes au cours du cycle réplicatif. / Primate lentiviruses genomic RNA can serve both as an mRNA that encodes for Gag and Gag-Pol polyproteins and as a propagated genome. We previously reported the presence of an IRES activity embedded within Gag coding region itself that drives the production of several isoforms of the Gag polyprotein and that is conserved in HIV-1, HIV-2 and SIVmac. In addition, in vitro reconstitution experiments revealed that the initial step of initiation complex formation is the recruitment of the 40S ribosomal subunit and eIF3. The structural and functional conservation amongst lentiviruses indicates that those properties are important for the virus cycle. In order to define the RNA structural determinants responsible for the formation of IRES/eIF3/40S ternary complex, we have been following functional and biochemical approaches in parallel. Our results indicate that 2 distinct binding sites for the ribosome are present close to the 2 AUG codons used as initiation site for the translation. Further biochemical analyses have shown that 2 ribosomes can be recruited by the same RNA molecule. In order to determine the functional role of the IRES activity on gag translation, we assayed in vitro the translation efficiency of mutants unable to recruit the ribosome. In parallel, we have been following a drug screening strategy to identify small molecules that would inhibit the ribosome recruitment. This approach could pave the way to the definition of the IRESgag as a new therapeutic target, and to the identification of new drugs.

La protéine Nef des virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) joue un rôle essentiel dans la physiopathologie de l’infection et induction du SIDA. La capacité de Nef à perturber le trafic intracellulaire de protéines membranaires, et notamment du récepteur CD4, circulant entre les compartiments de la voie d’endocytose pourrait rendre compte de son importance comme facteur de virulence au cours de l’infection naturelle. Les mécanismes responsables des perturbations de la voie d’endocytose induites par Nef au cours de l’infection ne sont pas totalement élucidés, mais il est admis qu’elles résultent d’interactions avec les complexes adaptateurs (AP) associés à la clathrine et participant au transport vésiculaire entre les différents compartiments de la voie d’endocytose. Notre objectif était de déterminer les mécanismes par lesquels Nef influe positivement sur le pouvoir infectieux du VIH-1 en interagissant avec la machinerie cellulaire de la voie d’endocytose. Notre programme s’est organisé autour de deux axes principaux: le premier a consisté à étudier l’implication respective des différents types de complexes AP (AP-1, -2 et -3) sur les perturbations du fonctionnement de la voie d’endocytose induites par Nef en analysant son impact sur le niveau d’expression de surface de CD4; le deuxième axe a consisté à évaluer l’impact de l’interaction de Nef avec les complexes AP sur les capacités infectieuses des particules virales. Le rôle respectif des différents complexes AP dans ces fonctions de Nef a donc été étudié après déplétion de l’expression des complexes AP-1, AP-2 et AP-3 par une approche d’ARN interférence. Les résultats obtenus montrent que contrairement à certaines données de la littérature, la déplétion des complexes AP de la voie d’endocytose ne semble pas avoir un impact majeur sur la capacité de Nef à moduler l’expression de surface de CD4, même si une légère diminution de l’activité de Nef a pu être révélée dans notre étude réalisée sur des cellules HeLa-CD4 transduites par les shRNA ciblant les complexes AP-2. Inversement, nos résultats confirment que la déplétion des complexes AP-1, AP-2 et AP-3 dans les cellules productrices des particules virales se traduit par une diminution importante des propriétés infectieuses de ces particules sur lesquelles l’impact positif de Nef n’est plus alors capable de se manifester. En conclusion, ce travail a donc permis de montrer que les complexes AP de la voie d’endocytose sont indispensables pour que Nef puisse exercer son rôle positif sur le pouvoir infectieux du VIH-1. Il est maintenant important de confirmer ces résultats en analysant le rôle fonctionnel des complexes AP sur les activités de Nef dans les cibles cellulaires naturelles du VIH-1, lymphocytes et macrophages. / Nef protein of human immunodeficiency virus (HIV-1 and HIV-2) plays an essential role in the pathophysiology of infection and induction of AIDS. The ability of Nef to disrupt intracellular trafficking of membrane proteins, including the CD4 receptor, moving between the compartments of the endocytic pathway could account for its importance as a virulence factor during natural infection. The mechanisms responsible for disruption of the endocytic pathway induced by Nef during infection are not fully understood, but it is accepted that they arise from interactions with adaptor complexes (AP) associated with clathrin and participant in vesicular transport between the different compartments of the endocytic pathway. Our objective was to determine the mechanisms by which Nef positively affects the infectivity of HIV-1 by interacting with the cellular machinery of the endocytic pathway. Our program has been organized around two main axes: the first was to investigate the respective involvement of different types of complexes (AP-1, -2 and -3) on the Nef induced disruption of the endocytic pathway by analyzing its impact on the level of surface expression of CD4; the second axis was to evaluate the impact of the interaction of Nef with AP complexes on the infectious capacity of the viral particles. The respective roles of the different AP complexes in these functions of Nef has been studied after depletion of the expression of complex AP-1, AP-2 and AP-3 by RNA interference approach. The results show that, contrary to some literature data, depletion of AP complex endocytic pathway does not appear to have a major impact on the ability of Nef to modulate the surface expression of CD4, although a slight decreased activity of Nef could be revealed in our study on HeLa-CD4 cells transduced with the shRNA targeting complex AP-2. Conversely, our results confirm that the depletion of complex AP-1, AP-2 and AP-3 in the cells producing viral particles resulted in a significant decrease in infectious properties of these particles on which the positive impact of Nef is no longer able to manifest. In conclusion, this work has shown that complex AP of endocytic pathway are essential for Nef to exercise its positive role in the infectivity of HIV-1. It is now important to confirm these findings by analyzing the functional role of AP complexes on the activities of Nef in the natural cellular targets of HIV-1, lymphocytes and macrophages.

L’hypothèse de gènes chevauchants codés par le brin antisens des rétrovirus est un concept ancien. Cependant, celui-ci n’a été réellement démontré qu’il y a une dizaine d’années avec la découverte de la protéine HBZ du virus HTLV-1 et les résultats récents sur la protéine ASP du VIH-1. Les nouvelles recherches sur cette protéine ont démontré son expression in vivo, mais sa fonctionnalité est toujours inconnue. Nous avons réalisé ici, à partir d’un jeu de données de plus de 20 000 séquences, les premières analyses bioinformatiques sur l’évolution de ce gène chevauchant. Nous avons alors montré que le gène asp est conservé uniquement dans les séquences du groupe M correspondant au groupe pandémique du VIH-1. Nous démontrons de plus, une corrélation entre la présence de l’ORF ASP et la prévalence des différents groupes et sous-types. Nos analyses phylogénétiques montrent que l’apparition de l’ORF ASP est concomitante avec l’émergence de la pandémie du groupe M. Du fait du chevauchement de gènes, l’analyse de la pression de sélection induite par la protéine ASP a impliqué l’utilisation de modèles et de méthodes d’analyses spécifiques. Situé sur la phase -2, ce chevauchement entraîne une correspondance des troisièmes bases des codons de chaque gène. Si on considère un gène « fixe », les contraintes mécaniques induites par ce gène sont très importantes et le gène chevauchant dispose de très peu de flexibilité. Il est alors important d’identifier la pression de sélection propre au gène situé sur la phase -2, et montrer ainsi que sa présence et sa conservation ne sont pas seulement dues aux contraintes induites par le gène fixe. Pour cela, nous avons tout d’abord montré par des analyses de simulations de séquences, à l’aide d’un modèle à codon, que la présence de l’ORF ASP n’est pas due au hasard. Nous avons ensuite développé une méthode d’analyse évolutive basée sur l’étude des mutations silencieuses pour le gène fixe (ici le gène env) entraînant l’apparition ou la disparition des codons Start et Stop sur le gène chevauchant. L’application de cette méthode au gène asp montre qu’il existe bien une pression de sélection induite par la protéine ASP. / The hypothesis of overlapping genes encoded by the antisense strand of the retrovirus is an old concept. However, this one has been really demonstrated that with the discovery of the HBZ protein of HTLV-1 virus, a dozen of years ago and the recent results on the ASP protein of HIV-1. New research on this protein has demonstrated its expression in vivo, but its functionality is still unknown. We performed here, from a data set of more than 20,000 sequences, the first bioinformatic analyses on the evolution of this overlapping gene. We showed that the asp gene is conserved only in the M group sequences corresponding to the pandemic group of HIV-1. Moreover, we demonstrated a correlation between the presence of the ASP ORF and the prevalence of the various groups and subtypes. Our phylogenetic analyses showed that the appearance of the ASP ORF is concomitant with the emergence of the pandemic M group. Because of the overlapping of the genes, the analysis of the selection pressure induced by the ASP protein involved the use of models and specific analysis methods. Located in the frame -2, this overlap induces a correspondence of the third base codon of each gene. If we consider a "fixed" gene, the mechanical constraints induced by this "fixed" gene are very important and the overlapping gene has very little flexibility. Then, it is important to identify the selection pressure of the gene which is in the frame -2 and show that its presence and conservation are not only due to mechanical constraints induced by the "fixed" gene. For this, we first demonstrated by sequence simulation analysis, using a codon model, that the presence of the ASP ORF is not due to chance. Then, we developed a method of evolutionary analysis based on the study of synonymous mutations in the "fixed" gene (here the env gene) causes the appearance or disappearance of start and stop codons in the overlapping gene. When we applied this method to the asp gene, it showed that there is a selection pressure induced by the ASP protein.

Lors de la primo-infection, la plupart des patients infectés par le VIH-1 développent des anticorps neutralisants autologues dirigés contre la glycoprotéine d’enveloppe virale. Ces anticorps exercent une pression de sélection conduisant à l’apparition de variants d’échappement. Nous avons montré que cette pression de sélection se répercute à l’échelle populationnelle, le VIH-1 en tant qu’espèce s’étant adapté au cours de l’épidémie à la réponse immunitaire de la population humaine en devenant de moins en moins sensible aux anticorps neutralisants. Cette adaptation du VIH‐1 a un impact sur les propriétés fonctionnelles de l’enveloppe. Nous avons ainsi observé une augmentation de l’infectivité associée à une augmentation de la cinétique d’entrée des virus qui circulent actuellement. Les virus contemporains montrent également une plus grande résistance à l’enfuvirtide, un inhibiteur de fusion, associée à une meilleure utilisation du co-récepteur CCR5 ainsi qu’une résistance accrue à l’inhibiteur du CD4 M48U1. L’ensemble de nos résultats est en faveur d’une adaptation progressive de l’espèce virale du VIH-1 à son hôte au cours de l’épidémie. / Most of HIV-1 infected patients develop autologous neutralizing antibodies against the viral envelope glycoprotein during primary infection. These antibodies exert a selective pressure that leads to the selection of escape variants. We showed that HIV-1 evolved at the population level towards an enhanced resistance to antibody neutralization over the course of the epidemic, subsequently to the selective pressure exerted by the individual autologous neutralizing antibodies responses. This antigenic drift has an impact on the functional properties of the viral envelope. We showed an increasing infectivity associated with an increasing entry kinetic of the most recently transmitted viruses. The contemporary viruses are also more resistant to the inhibitor of fusion enfuvirtide, related to a better use of the CCR5 co-receptor as well as a progressive increasing resistance to the CD4 inhibitor M48U1. Together our results are in favor of a progressive adaptation of HIV-1 species to humans over the course of the epidemic.

La persistance du VIH-1 est associée au maintien de l’inflammation chronique chez les patients infectés, malgré la mise en place de combinaison de traitements antirétroviraux. L’inflammation chronique est associée à un risque augmenté de développer des comorbidités, non associées au SIDA. Les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont des cellules myéloïdes qui ont été impliqués dans de multiples maladies inflammatoires chroniques. Néanmoins, leur rôle dans l’infection par le VIH-1 est moins bien connue. Afin de pallier ce manque de connaissances, nous avons évalué l’hétérogénéité des PNNs dans le modèle macaque cynomolgus infecté par le SIVmac251. L’analyse phénotypique par cytométrie de masse a révélé la circulation de PNNs immatures en phase chronique de l’infection. En caractérisant l’hétérogénéité des PNNs au cours de l’infection par le SIV, nous avons observé une augmentation des fréquences des neutrophiles immatures et activés dans le sang dès la primo-infection. En phase chronique, les PNNs immatures et activés étaient toujours significativement augmentés dans le sang et la moelle osseuse. Au cours de l’infection, les PNNs avaient une fonction immunostimulatrice envers la prolifération et la sécrétion cytokinique des lymphocytaire T. L’initiation d’un traitement antirétroviral précoce a permis de restaurer le phénotype des PNNs. Les PNNs sont des cellules à fort potentiel pro-inflammatoire abondantes qui devraient être ainsi considérés comme de nouveaux effecteurs de l’inflammation chronique associée au VIH-1. / Even under combinational antiretroviral treatments (cART), HIV-1 persistence is associated with chronic inflammation in infected patients, leading to an increased risk of non-AIDS-related comorbidities. Polymorphonuclear neutrophils (PMN), have been less studied in HIV infection whereas they were associated with chronic inflammation diseases. To evaluate PMN heterogeneity in SIVmac251 nonhuman primate infection model, we first performed multiparameter single-cell phenotyping by mass cytometry giving a global vision of the immune system. This analysis demonstrated circulation of immature PMN with impaired during chronic infection. Then, we characterized neutrophils heterogeneity in the course of SIV infection. In primary infection, there was an increased frequency of CD10- immature and CD62L-low primed PMNs in peripheral blood. In chronic phase, CD10- immature PMNs were significantly higher in bone marrow and blood, maintaining a primed profile. During SIV infection, PMNs demonstrated variable immunomodulatory function against T cells proliferation and cytokine production. Early cART allowed to restore PMN phenotype. In this study, we provide unprecedented insight into PMN heterogeneity in the course of SIV infection. Since PMN represent 40-70% of circulating leukocytes and primed PMN are more potent to release pro-inflammatory cytokines and to transmigrate, they should be considered as a new player in HIV-1 chronic inflammation.

Les premier et second transferts de brin sont deux étapes essentielles de la transcription inverse du génome du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). De nombreuses études in vitro suggèrent que les transferts nécessitent l’action de la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NC). Le premier transfert, se produisant de l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’ de l’ARN génomique du VIH-1, repose en grande partie sur un appariement ADN-ARN impliquant la région r de l’ADN strong-stop (ADNss) et la région R située à l’extrémité 3’ de l’ARN viral (ARN 3’UTR). Les structures, interactions et dynamiques qui gouvernent cet appariement sont mal connues. Jusqu’à notre étude, la formation de l’hybride ADN-ARN n’avait été étudiée in vitro qu’avec des courts acides nucléiques qui ne reflètent que partiellement les structures formées par l’ADNss et l’ARN 3’UTR dans le virus en cours de réplication. L’objectif principal de ma thèse a été de caractériser in vitro les mécanismes moléculaires qui gouvernent l’hybridation de l’ADNss avec l’ARN 3’UTR. Pour atteindre cet objectif, j’ai utilisé des méthodes de la biologie moléculaire et j’ai analysé la structure secondaire de l’ADNss entier avec trois sondes de structure (DNase I, mung bean nuclease et permanganate de potassium) : i) en l’absence de NC ; ii) en présence de NC ; iii) en présence de l’ARN 3’UTR.Les résultats obtenus nous ont permis d’être les premiers à déterminer in vitro la structure secondaire de l’ADNss entier du VIH-1 et à identifier dans celui-ci quatre sites sur lesquels se fixe préférentiellement la NC. A notre connaissance, les structures secondaires des ADNss d’autres rétrovirus n’ont pas été déterminées. Nos données structurales sont en faveur d’une structure secondaire de l’ADNss du VIH-1 constituée de trois tiges-boucles (u5, cpoly(A) et cTAR) et trois régions simple-brin en l’absence ou présence de NC. Notre analyse phylogénétique suggère que la structure secondaire de l’ADNss et les sites forts NC sont conservés parmi les différents groupes du VIH-1. Nos résultats suggèrent aussi qu’une partie de la région u5 de l’ADNss établit des interactions très faibles et probablement transitoires avec une partie de la région U3 de l’ARN 3’UTR en l’absence de NC. En réalisant des cinétiques d’hybridation et en utilisant deux ADNss mutés, nous avons montré que l’hybridation ADNss-ARN 3’UTR nécessite l’activité de la NC et que ce processus ne repose pas sur une seule voie d’initiation. Nos résultats supportent un modèle dans lequel la première étape est la fixation de la NC au niveau des quatre sites, ce qui va déclencher l’ouverture de la structure tridimensionnelle de l’ADNss et favoriser ainsi l’accessibilité de la région r ; la seconde étape étant la déstabilisation par la NC des structures secondaires ; la troisième étape étant l’appariement par la NC des régions complémentaires r et R. L’ensemble des résultats obtenus permet à mon équipe d’accueil d’initier de nouvelles études in vitro et ex vivo. / An essential step of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcription is the first trand transfer that requires base pairing of the R region at the 3’- end of the genomic RNA with the complementary r region at the 3’-end of minus strand strong-stop DNA (ssDNA). HIV-1 nucleocapsid protein (NC) facilitates this annealing process. Determination of the ssDNA structure is needed to understand the molecular basis of NC-mediated genomic RNA-ssDNA annealing. For this purpose, we investigated ssDNA using structural probes (nucleases and potassium permanganate). This study is the first to determine the secondary structure of the fulllength HIV-1 ssDNA in the absence or presence of NC.Our probing data obtained in the absence of NC, suggest weak contacts between the u5 region of ssDNA and the U3 region the genomic RNA. The probing data and phylogenetic analysis support the folding of ssDNA into three stem-loop structures and the presence of four high-affinity binding sites for NC. Using the gel retardation assay, we analyzed the interaction of NC with each site. Taken together, our results support a model for the NC-mediated annealing process in which the preferential binding of NC to four sites triggers unfolding of the threedimensional structure of ssDNA, thus facilitating interaction of the r sequence of ssDNA with the R sequence of the genomic RNA. In addition, using gel retardation assays and ssDNA mutants, we show that the annealing of ssDNA to the 3’- end of the genomic RNA requires NC activity and does not rely on a single pathway (zipper intermediate or kissing complex).