141 |
Analyse et modélisation de nouveaux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1).Boland, Sandro 27 February 2004 (has links)
Résumé Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est l’agent pathogène responsable du Syndrome del’Immunodéficience Acquise (SIDA). A l’heure actuelle, le traitement des patients infectés par le VIH estbasé sur l’emploi de substances chimiques destinées à perturber les différentes étapes du cycle deréplication du virus (chimiothérapie). Même si elles permettent d’améliorer l’état de santé des patientset d’augmenter leur espérance de vie, ces thérapies restent coûteuses, contraignantes et imparfaites.La recherche de nouveaux composés plus efficaces reste donc d’actualité. Ce travail de thèse est dédié à la conception rationnelle et à l’étude d’inhibiteurs non nucléosidiques dela transcriptase inverse du VIH-1 (INNTI) une enzyme essentielle au cycle de réplication de ce virus.Les molécules étudiées dérivent du cycle 2-pyridinone dont sont déjà issues plusieurs familles d’INNTIdécrites dans la littérature. La conception rationnelle de molécules d’intérêt pharmaceutique nécessite une bonne compréhensiondes interactions mises en jeu entre la macromolécule cible et ses ligands. Etant donné qu’aucunestructure cristallographique d’un complexe TI-pyridinone n’est disponible dans la littérature, la premièrepartie de ce travail est consacrée à la proposition d’un mode d’interaction TI-pyridnone et à larationalisation des relations structure-activité liées à cette famille de molécules. Les informationsrecueillies lors de cette étude théorique sont ensuite exploitées dans le but d’aider au développementd’une nouvelle série d’inhibiteurs.
Abstract Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the causative agent of Acquired Immune DeficiencySyndrome (AIDS). Treatment of HIV-infected patients is currently based on the use of chemicalcompounds that interfere with various steps of the viral replication cycle (chemotherapy).Although these therapies allow for a significant improvement of a patient’s health, theynonetheless remain imperfect and expensive. Research for new and improved anti-HIVcompounds is therefore necessary. This Ph. D. thesis is dedicated to the rational design and analysis of new non nucleosideinhibirors of HIV-1 reverse transcriptase (NNRTI), a key enzyme in HIV lifecycle. Most of thestudied compounds are derived from the 2-pyridinone ring, that is part of several NNRTIfamilies. Rational drug design usually requires a good understanding of the main interactions betweenthe macromolecular target (RT) and its ligands. However, no crystal structure of a RT-pyridinone complex has been reported yet. Our first objective was therefore to build atheoretical model describing RT-pyridinone interactions and providing a better understanding ofstructure-activity relationships among pyridinones. The information obtained in this theoreticalmodel was then used in order to develop new and potent inhibitors.
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142 |
Variavilidad en genes de respuesta inmune : papel en la infección por VIH-1 y envejecimiento naturalLaplana Lafaja, Marina 17 July 2012 (has links)
La modulació inadequada o el manteniment de forma crònica
de
la
resposta
immune
poden
provocar
efectes
adversos
a
sistemes
i
òrgans
i
donar
lloc
a
la
manifestació
de
patologies.
En
aquest
context,
els
mecanismes
de
regulació
de
la
resposta
immune
són
un
element
clau
per
mantenir
un
estat
òptim
de
salut
i
un
envelliment
saludable.
La
capacitat
d'organitzar
una
resposta
immune
contra
agents
patògens
o
cèl·lules
tumorals
està
en
part
determinada
pel
fons
genètic
de
cada
individu.
Els
estudis
d'associació
genètica
han
resultat
d'utilitat
per
identificar
variants
de
gens
de
resposta
immune
implicades
en
patologies
que
van
des
del
càncer
o
les
malalties
cardiovasculars
a
infeccions
com
la
tuberculosi
o el
VIH-‐1.
En
la
present
tesi
s'ha
estudiat
la
variabilitat
de
gens
de
resposta
immune
i
el
seu
paper
en
dos
models
diferents:
la
infecció
per
VIH-‐1
i
el
procés
d'envelliment
natural.
En
el
primer
model
s'ha
estudiat
la
variabilitat
del
gen
BST-‐2,
factor
de
restricció
en
la
infecció
per
VIH-‐1,
i
dels
gens
CYP27B1,
GC
i
VDR,
implicats
en
la
síntesi,
transport
i
acció
genòmica
de
la
vitamina
D,
hormona
implicada
en
la
modulació
de
la
resposta
immune.
Així
mateix,
al
segon
model
s'ha
avaluat
l'efecte
de
la
variabilitat
del
gen
VDR
i
dels
gens
RANTES
i
CCR5,
implicats
en
la
mediació
de
la
resposta
inflamatòria.
En
el
model
d'infecció
per
VIH-‐1
s'han
identificat
2
variants
del
gen
BST-‐2
associades
amb
progressió,
una
captura
la
variabilitat
de
la
regió
genòmica
i
l’altra
amb
potencial
efecte
funcional.
En
l'estudi
de
la
relació
de
variants
dels
gens
VDR,
CYP27B1
i
GC
amb
el
ritme
de
progressió
de
la
infecció
s'han
confirmat
i
ampliat
el
nombre
de
marcadors
del
gen
VDR
que
mostren
associació
amb
progressió.
Les
combinacions
haplotípiques
del
gen
VDR
que
s'associen
amb
progressió
són
aquelles
que
optimitzen
la
resposta
a
la
vitamina
D.
Aquests
resultats
poden
interpretar-‐se
en
funció
del
paper
dual
de
la
vitamina
D
en
la
modulació
de
la
resposta
immune.
L'associació
amb
progressió
de
les
variants
identificades
és
més
significativa
en
els
pacients
reclutats
en
el
període
pre-‐
TARGA
(anterior
a
1997).
En
el
model
d'envelliment
natural,
variants
del
gen
VDR
mostren
associació
amb
envelliment
saludable
en
homes.
Les
variants
associades
són
aquelles
que
confereixen
una
capacitat
de
resposta
intermèdia
a
la
vitamina
D.
Això
emfatitza
el
paper
de
la
vitamina
D
en
envelliment
i
posa
de
manifest
la
importància
del
fons
genètic
a
l’hora
d’establir
els
nivells
òptims
de
vitamina
D
per
a
un
envelliment
saludable.
En
relació
als
polimorfismes
dels
gens
CCR5
i
RANTES
no
s'ha
trobat
associació
significativa
pel
locus
CCR5,
encara
que
els
resultats
mostren
una
major
prevalença
de
la
variant
no
funcional,
i
per
tant
pitjor
mediadora
de
la
resposta
inflamatòria,
en
individus
longeus.
Quant
a
les
variants
del
gen
RANTES,
els
resultats
indiquen
una
associació
específica
de
sexe
que
suggereix
l'existència
d'un
determinant
genètic
de
RANTES
que
predisposa
a
un
fenotip
proinflamatori
en
homes
i
a
un
fenotip
antiinflamatori
en
dones. / La
modulación
inadecuada
o
el
mantenimiento
de
forma
crónica
de
la
respuesta
inmune
puede
provocar
efectos
adversos
en
sistemas
y
órganos
y
dar
lugar
a
la
manifestación
de
patologías.
Por
ello,
los
mecanismos
de
regulación
de
la
respuesta
inmune
son
un
elemento
clave
para
el
mantenimiento
de
un
estado
de
salud
óptimo
y
un
envejecimiento
saludable.
La
capacidad
de
organizar
una
respuesta
inmune
contra
agentes
patógenos
o
células
tumorales
está
en
parte
determinada
por
la
fondo
genético
de
cada
individuo.
Los
estudios
de
asociación
genética
han
resultado
de
utilidad
para
identificar
variantes
de
genes
de
respuesta
inmune
implicadas
en
patologías
que
van
desde
el
cáncer
o
las
enfermedades
cardiovasculares
a
infecciones
como
la
tuberculosis
o
el
VIH-‐1.
En
la
presente
tesis
se
ha
estudiado
la
variabilidad
de
genes
de
respuesta
inmune
y
su
papel
en
dos
modelos
distintos:
la
infección
por
VIH-‐1
y
el
proceso
de
envejecimiento
natural.
En
el
primer
modelo
se
ha
estudiado
la
variabilidad
del
gen
BST-‐2,
factor
de
restricción
en
la
infección
por
VIH-‐1,
y
de
los
genes
CYP27B1,
GC
y
VDR,
implicados
en
la
síntesis,
transporte
y
acción
genómica
de
la
vitamina
D,
hormona
implicada
en
la
modulación
de
la
respuesta
inmune.
Asimismo,
en
el
segundo
modelo,
se
ha
evaluado
el
efecto
de
la
variabilidad
del
gen
VDR
y
de
los
genes
RANTES
y
CCR5,
implicados
en
la
mediación
de
la
respuesta
inflamatoria.
En
el
modelo
de
infección
por
VIH-‐1,
se
han
identificado
2
variantes
del
gen
BST-‐
2
asociadas
con
progresión,
una
que
captura
la
variabilidad
de
la
región
genómica
y
otra
con
potencial
efecto
funcional.
En
el
estudio
de
variantes
de
los
genes
VDR,
CYP27B1
y
GC
con
el
ritmo
de
progresión
de
la
infección
se
ha
confirmado
y
ampliado
el
número
de
marcadores
del
gen
VDR
que
muestran
asociación
con
progresión.
Las
combinaciones
haplotípicas
del
gen
VDR
que
se
asocian
con
progresión
son
aquellas
que
optimizan
la
respuesta
a
la
vitamina
D.
Estos
resultados
pueden
interpretarse
en
función
del
papel
dual
de
la
vitamina
D
en
la
modulación
de
la
respuesta
inmune.
La
asociación
con
progresión
de
las
variantes
identificadas
incrementa
su
significación
en
los
pacientes
reclutados
en
el
periodo
pre-‐TARGA
(anterior
a
1997).
En
el
modelo
de
envejecimiento
natural,
variantes
del
gen
VDR
muestran
asociación
con
envejecimiento
saludable
en
hombres.
Las
variantes
asociadas
son
aquellas
que
confieren
una
capacidad
de
respuesta
intermedia
a
la
vitamina
D.
Ello
revela
el
papel
de
la
vitamina
D
en
envejecimiento
y
enfatiza
la
importancia
del
fondo
genético
al
establecer
los
niveles
óptimos
de
vitamina
D
para
un
envejecimiento
saludable.
En
relación
a
los
polimorfismos
de
los
genes
CCR5
y
RANTES
no
se
ha
encontrado
asociación
significativa
para
el
locus
CCR5,
aunque
los
resultados
muestran
una
mayor
prevalencia
de
la
variante
no
funcional,
y
por
lo
tanto
peor
mediadora
de
la
respuesta
inflamatoria,
en
individuos
longevos.
En
cuanto
a
las
variantes
del
gen
RANTES,
los
resultados
indican
una
asociación
específica
de
sexo
que
sugiere
la
existencia
de
un
determinante
genético
de
RANTES
que
predispone
a
un
fenotipo
proinflamatorio
en
los
varones
y
a
un
fenotipo
anti-‐inflamatorio
en
las
mujeres. / The
improper
balance
or
the
maintenance
of
a
chronic
immune
response
can
produce
adverse
effects
on
organs
and
systems
and
prone
to
diseases.
Therefore,
the
regulatory
mechanisms
of
the
immune
response
are
key
factors
to
maintain
an
optimal
health
status
and
to
follow
a
healthy
aging.
The
capacity
to
produce
an
immune
response
against
pathogens
or
tumour
cells
is
partially
determined
by
the
genetic
background
of
the
individual.
Genetic
association
studies
have
been
useful
to
identify
variants
of
immune
response
genes
involved
in
diseases
ranging
from
cancer
or
cardiovascular
disease
to
infections
such
as
tuberculosis
or
HIV-‐1.
In
this
thesis
we
have
studied
the
variability
of
immune
response
genes
and
their
role
in
two
models:
the
HIV-‐1
infection
and
the
natural
aging
process.
In
the
first
model
it
has
been
studied
the
variability
of
BST-‐2
gene,
which
is
an
HIV
restriction
factor,
and
CYP27B1,
GC
and
VDR
genes,
that
are
involved
in
the
synthesis,
transport
and
genomic
action
of
vitamin
D,
hormone
that
modulates
the
immune
response.
In
the
second
model,
we
have
also
evaluated
the
effect
of
VDR
gene
variability
as
well
as
RANTES
and
CCR5
gene
variants,
both
involved
in
mediating
the
inflammatory
response.
In
the
model
of
the
HIV-‐1
infection
we
have
identified
two
variants
of
BST-‐2
gene
associated
with
progression,
one
that
captures
the
variability
of
the
genomic
region
and
the
other
with
potential
functional
effect.
In
the
study
of
VDR,
CYP27B1
and
GC
gene
variants
related
to
progression
rates
we
have
confirmed
and
extended
the
number
of
VDR
gene
markers
showing
association
with
progression.
The
VDR
gene
haplotype
combinations
that
are
associated
with
progression
are
those
that
optimize
the
response
to
vitamin
D.
These
results
should
be
interpreted
as
a
con
to
the
dual
role
of
vitamin
D
in
the
modulation
of
the
immune
response.
The
association
with
progression
of
the
identified
variants
is
significantly
increased
in
patients
enrolled
in
the
pre-‐HAART
(before
1997).
In
the
model
of
aging,
VDR
gene
variants
were
most
associated
with
healthy
aging
in
men.
The
associated
variants
are
those
that
confer
an
intermediate
responsiveness
to
vitamin
D.
This
reveals
the
role
of
vitamin
D
in
aging
and
emphasizes
the
role
of
genetic
background
in
determining
optimal
levels
of
vitamin
D
for
healthy
aging.
In
relation
to
polymorphisms
of
CCR5
and
RANTES
genes
we
do
not
found
significant
association
for
the
CCR5
locus,
although
the
results
show
a
higher
prevalence
of
non-‐functional
variant,
and
thus
a
poorer
mediator
of
the
inflammatory
response,
in
long-‐lived
individuals.
In
relation
to
RANTES
gene
variants,
the
results
indicate
a
sex-‐specific
association
suggesting
the
existence
of
a
genetic
determinant
of
RANTES
that
predisposes
to
a
proinflammatory
phenotype
in
males
and
an
anti-‐inflammatory
phenotype
in
females.
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Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1Gendron, Karine 05 1900 (has links)
Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1.
Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA).
Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the causative agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Viral strains that are resistant to antiretroviral agents used for the treatment of HIV-1 infected patients rapidly emerge. It is thus important to study the viral replication cycle in order to discover new targets for the development of novel agents against HIV-1. Translation of structural proteins and viral enzymes is a key step of the viral replication cycle. These proteins are translated from the HIV-1 full-length mRNA during late stages of the replication. This mRNA can be translated by a cap-dependent mode which is used by the majority of cellular mRNAs. However, since its 5’ untranslated region (5’UTR) contains an internal ribosome entry site (IRES) that we call IRES5’UTR, it can also be translated by an IRES-dependent mode. The IRES-dependent mode enables the full-length mRNA to be translated when the cap-dependent mode is impaired. The activity of the IRES5’UTR is weak in physiological conditions, but it is stimulated when the cell cycle is arrested at the G2/M transition, an arrest induced by HIV-1 infection. A large portion of this IRES, which we name IRES5’UTRc, is present in all HIV-1 mRNAs and its activity is similar to the activity of the complete IRES, which indicates that the IRES-dependent mode can be used by all HIV-1 mRNAs.
During my doctoral studies, I investigated how the HIV-1 IRES5’UTR functions. I transfected Jurkat T cells, a lymphocytic cell line derived from the natural target cells of HIV-1, with a dual-luciferase reporter containing the coding sequences of the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) separated by the complete 5’UTR of the HIV-1 full-length mRNA. Translation of Rluc is cap-dependent while translation of Fluc depends on HIV-1 IRES5’UTR. First, I performed a mutational analysis and I discovered three regions that stimulate the activity of IRES5’UTR and a stem-loop that represses its activity, which we named IRENE (IRES negative element). I showed that the repression induced by IRENE is relieved when cells are exposed to oxidative stress, a type of stress caused by HIV-1 infection. We propose that IRENE maintains the IRES5’UTR in a weakly active conformation in physiological conditions. It is known that IRESes are activated by cellular factors, called ITAFs (IRES trans-acting factors). We propose that the IRES5’UTR adopts an active conformation triggered by the binding of an ITAF that is expressed or relocalized during oxidative stress. These results generated a publication (Gendron et al. Nucleic Acids Research, 2011, 39, 902-912). I then decided to study the effect of the viral protein Tat on the IRES5’UTR activity. In addition to its essential role in the transcription of HIV-1 mRNAs, Tat stimulates the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs by interfering with the inhibition of a canonical initiation factor, eIF2, induced by the protein kinase modulated by double-stranded RNA (PKR) and by unwinding the TAR structure present at the 5’end of all HIV-1 mRNAs. Tat also affects the expression of several cellular genes. I showed that the Tat86 and Tat72 isoforms, but not Tat101, stimulate the activity of the IRES5’UTR. This effect is independent of PKR and TAR, but appears to be dependent upon the conformation of Tat. We suggest that Tat could activate a transcription factor that controls the expression of an ITAF of the IRES5’UTR or else that Tat could directly activate such an ITAF. I also showed that PKR stimulates the IRES5’UTR activity, which is surprising since PKR is an antiviral protein. This effect is independent of the inhibition of eIF2 by PKR and could result from the activation of an ITAF. Knowing that IRES5’UTRc, an active portion of IRES5’UTR is present in all HIV-1 RNAs, our hypothesis is that the stimulation of the IRES activity by PKR would allow Tat mRNA to be translated in the beginning of the replication cycle. This would subsequently allow the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs to proceed, which is stimulated by Tat. These results generated a manuscript that is submitted for publication to RNA.
Altogether, my results, coupled to data from literature, lead me to conclude that, in the late phases of the replication cycle, the activity of the HIV-1 IRES5’UTR is stimulated by oxidative stress, by the cell cycle arrest in G2/M and by the presence of high amounts of Tat, while cap-dependent translation is impaired. The IRES5’UTR would thus be critical to translate the HIV-1 full-length mRNA. Consequently, the IRES5’UTR would constitute a very interesting target for the development of novel anti-HIV agents.
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Analyse du mécanisme de la dégradation du récepteur CD4 par la protéine Vpu du virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1)Binette, Julie 12 1900 (has links)
Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE).
Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »).
La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu.
L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu.
Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4.
Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER).
Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation).
The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation.
Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu.
Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation.
The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.
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Analyse de la réponse macrophagique au Candida albicans chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1Goupil, Mathieu 08 1900 (has links)
La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection opportuniste la plus répandue chez les patients infectés au VIH-1. Un modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) exprimant une partie du génome du VIH-1 (CD4C/HIVMutA) est maintenant disponible. Grâce à ce modèle, il est possible d’étudier les perturbations quantitatives et fonctionnelles des macrophages exprimant les gènes nef, rev et env du VIH-1 dans le contexte d’une COP. Cette étude démontre que la présence du transgène n’influence pas le pourcentage des macrophages dans la muqueuse buccale et le petit intestin, malgré le fait que la charge buccale de C. albicans soit significativement plus élevée chez les souris Tg. Cependant, l’expression du transgène cause une diminution de la production de H2O2 par les macrophages, ainsi que l’augmentation de la production de la cytokine proinflammatoire IL-6 et de la chimiokine MCP-1. / Oro-pharyngeal candidiasis (OPC) is the most common opportunistic infection in HIV-1 infected patients. An OPC model using transgenic mice (CD4C/HIVMutA) expressing selected genes of the HIV-1 genome is now available. Using this model, it is now possible to study potential quantitative and functional disturbances in macrophages expressing the nef, rev and env genes of HIV-1 in the context of OPC. This study shows that transgene expression does not affect quantitative percentage values of macrophages in the oral mucosa and the small intestine, although burdens of C. albicans loads are increased in Tg mice. Transgene expression does induce diminished H2O2 production in macrophages, while increasing production of the proinflammatory cytokine IL-6 and the chemokine MCP-1.
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Étude du mécanisme du changement programmé -1 du cadre de lecture par le ribosomeLéger, Mélissa January 2008 (has links)
Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal
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Développement de systèmes d'administration originaux destinés à la prévention de la contamination par le VIH chez la femmeAka, Armelle Adjoua Sandrine 14 June 2012 (has links) (PDF)
Avec près de 30 millions de morts depuis le début de la pandémie, l'infection par le VIH est un véritable fléau à l'échelle mondiale, surtout en Afrique sub-saharienne. Dans ce contexte, disposer d'une formulation microbicide efficace, facile à administrer par la voie vaginale, représenterait un outil de prévention idéal pour lutter contre cette pandémie. Ainsi, la conception rationnelle de telles formulations représente un enjeu majeur de santé publique.Ce travail décrit la recherche de formulations thermogélifiantes et mucoadhésives à base de pluronics et d'hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC). Outre la caractérisation de leurs propriétés rhéologiques et d'adhésion, ainsi que des études en culture cellulaire suggérant une très faible toxicité de contact, ces hydrogels ont montré d'une part, leur capacité à véhiculer efficacement le peptide M48U1 (équipe L. Martin, CEA) destiné à bloquer l'entrée cellulaire du VIH et d'autre part à ralentir considérablement la diffusion de nanoparticules modèles mimant les particules virale matures du VIH-1, en comparaison d'hydrogel d'hydroxy éthylcellulose (HEC) fréquemment utilisés dans divers essais cliniques infructueux et aussi au mucus cervico-vaginal de macaque. L'ensemble des résultats suggère donc la capacité de ces formulations à constituer une double barrière, physique et pharmacologique, protectrice de la muqueuse vaginale vis-à-vis du VIH.
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Analyses bioinformatiques dans le cadre de la génomique du SIDACoulonges, Cédric 16 December 2011 (has links) (PDF)
Les technologies actuelles permettent d'explorer le génome entier pour y découvrir des variants génétiques associés aux maladies. Cela implique des outils bioinformatiques adaptés à l'interface de l'informatique, des statistiques et de la biologie. Ma thèse a porté sur l'exploitation bioinformatique des données génomiques issues de la cohorte GRIV du SIDA et du projet international IHAC (International HIV Acquisition Consortium). Posant les prémices de l'imputation, j'ai d'abord développé le logiciel SUBHAP. Notre équipe a montré que la région HLA était essentielle dans la non progression et le contrôle de la charge virale et cela m'a conduit à étudier le phénotype non-progresseur non " elite ". J'ai ainsi révélé un variant du gène CXCR6 qui, en dehors du HLA, est le seul résultat identifié par approche génome-entier et répliqué. L'imputation des données du projet IHAC (10000 patients infectés et 15000 contrôles) a été réalisée et des premières associations sont en cours d'exploration.
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Développement d'un test d'interaction entre la protéine d'enveloppe du VIH-1 (gp120) et les corécepteurs CCR5/CXCR4 par résonance plasmonique de surface : criblage et optimisation d'inhibiteurs de l'entrée viraleConnell, Bridgette 16 March 2012 (has links) (PDF)
Il est bien établi que la gp120 du VIH-1 se fixe aux héparane sulfate (HS) cellulaires, par le biais de la boucle V3 ce qui favorise l'infectivité virale. Cependant, une variété de polyanions solubles, conjugués à CD4 (mCD4-HS12) a des propriétés antivirales et a montré in vitro une activité contre le VIH-1 à de très faibles concentrations (nM). En raison de la complexité structurale des HS, le criblage d'oligosaccharides différenciellement sulfatés pour améliorer l'activité de la molécule serait trop difficile. En vue d'obtenir une molécule plus spécifique, de plus haute affinité et plus facile à produire, des peptides mimant les HS ont été synthétisés par nos collaborateurs. Notre but était de cribler ces peptides pour leur capacité à inhiber l'entrée de VIH-1. À cette fin, nous avons mis en place une plateforme permettant d'immobiliser CCR5 et CXCR4 solubilisés sur des biocapteurs (Biacore) pour cribler des molécules qui inhibent la liaison de gp120-CD4 aux corécepteurs. Pour contrôler le processus de solubilisation, CXCL12, le ligand naturel de CXCR4, a été injecté sur CXCR4 immobilisé. Les affinités des isoformes de CXCL12 (α et γ) pour CXCR4 ont été calculées dans les fourchettes de valeurs précédemment obtenues avec des techniques différentes, prouvant ainsi la fonctionnalité de notre système et nous permettant d'étudier les mécanismes de fixation de ces deux isoformes sur CXCR4 ainsi que leur régulation par HS. Le système a ensuite été utilisé pour cribler la capacité d'inhibition des peptides mimétiques du HS. Chaque peptide, [S(XDXS)n] contient des acides aminés qui imitent les groupes hydroxyles, carboxyles et sulfates des HS. Le peptide contenant des résidus sulphotyrosines, une fois conjugué à mCD4 (mCD4-P3YSO3), montre un IC50 de l'ordre du nM, pour l'inhibition simultanée de la liaison de gp120 aux HS, à CD4, aux anticorps, aux corécepteurs ainsi que l'infection par VIH-1 in cellulo. Il constitue le premier inhibiteur bivalent de l'entrée qui cible à la fois les virus R5 et X4 et le concept d'un peptide mimétique des HS se prête à une analyse structurale et fonctionnelle de la liaison des chaînes HS aux protéines, une nouvelle technique dans ce domain
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Induction par Vpr de la dégradation de la protéine CTIP2 via la voie du protéasome dans les cellules microglialesAli, Sultan 02 April 2013 (has links) (PDF)
Le détournement de la machinerie cellulaire basé sur la dégradation par la voie du protéasome est une stratégie fréquemment retrouvée chez les virus afin d'optimiser leur réplication. Ainsi, le VIH-1 a développé toute une série de contremesures via ses protéines accessoires, vif et vpu notamment, afin de cibler les facteurs de restriction vers la voie du protéasome. La protéine accessoire Vpr est également associée à un complexe Cul4 E3 ubiquitin ligase mais est toujoursorphelin de sa cible. Nos travaux ont montré que la protéine CTIP2 est un acteur majeur impliqué dans la restriction de la réplication du VIH-1. Nous proposons de défendre la thèse selon laquelle la protéine CTIP2 est dégradée par la voie du protéasome en présence de la protéine vpr. Nous avons ainsi montré que l'expression de la protéine CTIP2 est plus forte en absence qu'en présence de la protéine vpr. Des expériences utilisant des inhibiteurs de la voie du protéasome sont en faveur d'une régulation de type post traductionnel. Par immunoprécipitation, nous avons montré que CTIP2 fait partie d'un complexe comprenant DDB1 et DCAF1 en présence et en absence de Vpr. Sa dégradation est prévenue en présence du mutant vpr (Q65R) qui n'interagit plus avec DCAF, et en présence d'un Knock Down de DCAF1par ailleurs, DCAF1 est associé avec CTIP2 inclus dans le complexe impliqué dans l'établissement de la latence du VIH-1 comprenant notamment HDAC1. Enfin, les protéines CTIP2, Vpr et DCAF colocalisent dans les noyaux des cellules microgliales. Nos résultats suggèrent fortement que la protéine Vpr favorise la dégradation du facteur CTIP2, qui est décrit comme un facteur restreignant l'infection par le VIH-1 dans les cellules microgliales, et ainsi favorise sa réplication.
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