Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the causative agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Viral strains that are resistant to antiretroviral agents used for the treatment of HIV-1 infected patients rapidly emerge. It is thus important to study the viral replication cycle in order to discover new targets for the development of novel agents against HIV-1. Translation of structural proteins and viral enzymes is a key step of the viral replication cycle. These proteins are translated from the HIV-1 full-length mRNA during late stages of the replication. This mRNA can be translated by a cap-dependent mode which is used by the majority of cellular mRNAs. However, since its 5’ untranslated region (5’UTR) contains an internal ribosome entry site (IRES) that we call IRES5’UTR, it can also be translated by an IRES-dependent mode. The IRES-dependent mode enables the full-length mRNA to be translated when the cap-dependent mode is impaired. The activity of the IRES5’UTR is weak in physiological conditions, but it is stimulated when the cell cycle is arrested at the G2/M transition, an arrest induced by HIV-1 infection. A large portion of this IRES, which we name IRES5’UTRc, is present in all HIV-1 mRNAs and its activity is similar to the activity of the complete IRES, which indicates that the IRES-dependent mode can be used by all HIV-1 mRNAs. During my doctoral studies, I investigated how the HIV-1 IRES5’UTR functions. I transfected Jurkat T cells, a lymphocytic cell line derived from the natural target cells of HIV-1, with a dual-luciferase reporter containing the coding sequences of the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) separated by the complete 5’UTR of the HIV-1 full-length mRNA. Translation of Rluc is cap-dependent while translation of Fluc depends on HIV-1 IRES5’UTR. First, I performed a mutational analysis and I discovered three regions that stimulate the activity of IRES5’UTR and a stem-loop that represses its activity, which we named IRENE (IRES negative element). I showed that the repression induced by IRENE is relieved when cells are exposed to oxidative stress, a type of stress caused by HIV-1 infection. We propose that IRENE maintains the IRES5’UTR in a weakly active conformation in physiological conditions. It is known that IRESes are activated by cellular factors, called ITAFs (IRES trans-acting factors). We propose that the IRES5’UTR adopts an active conformation triggered by the binding of an ITAF that is expressed or relocalized during oxidative stress. These results generated a publication (Gendron et al. Nucleic Acids Research, 2011, 39, 902-912). I then decided to study the effect of the viral protein Tat on the IRES5’UTR activity. In addition to its essential role in the transcription of HIV-1 mRNAs, Tat stimulates the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs by interfering with the inhibition of a canonical initiation factor, eIF2, induced by the protein kinase modulated by double-stranded RNA (PKR) and by unwinding the TAR structure present at the 5’end of all HIV-1 mRNAs. Tat also affects the expression of several cellular genes. I showed that the Tat86 and Tat72 isoforms, but not Tat101, stimulate the activity of the IRES5’UTR. This effect is independent of PKR and TAR, but appears to be dependent upon the conformation of Tat. We suggest that Tat could activate a transcription factor that controls the expression of an ITAF of the IRES5’UTR or else that Tat could directly activate such an ITAF. I also showed that PKR stimulates the IRES5’UTR activity, which is surprising since PKR is an antiviral protein. This effect is independent of the inhibition of eIF2 by PKR and could result from the activation of an ITAF. Knowing that IRES5’UTRc, an active portion of IRES5’UTR is present in all HIV-1 RNAs, our hypothesis is that the stimulation of the IRES activity by PKR would allow Tat mRNA to be translated in the beginning of the replication cycle. This would subsequently allow the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs to proceed, which is stimulated by Tat. These results generated a manuscript that is submitted for publication to RNA. Altogether, my results, coupled to data from literature, lead me to conclude that, in the late phases of the replication cycle, the activity of the HIV-1 IRES5’UTR is stimulated by oxidative stress, by the cell cycle arrest in G2/M and by the presence of high amounts of Tat, while cap-dependent translation is impaired. The IRES5’UTR would thus be critical to translate the HIV-1 full-length mRNA. Consequently, the IRES5’UTR would constitute a very interesting target for the development of novel anti-HIV agents.

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires. / Human CD4+ T cells are heterogeneous in terms of permissiveness to infection by the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Our laboratory previously demonstrated that Th1 cells (CXCR3+CCR6- phenotype) are relatively resistant to infection, whereas Th1Th17 cells (CXCR3+CCR6+ phenotype) are highly permissive to HIV-1. HIV replication depends on several cellular restriction or permissiveness factors acting at different stages of the viral life cycle. However, despite several advances, our knowledge on signaling pathways involved in HIV replication is still limited. The main objective of this MSc degree project is to characterize the molecular mechanisms of permissiveness and resistance to HIV in Th1Th17 and Th1 cells respectively. This thesis is divided into four parts, aiming at : (i) the identification of canonical pathways and biological functions differentially regulated in Th1Th17 vs Th1 cells through the analysis of their whole genome transcriptome; (ii) the validation of differential expression of relevant genes identified by microarrays at mRNA and protein levels; (iii) the characterization of the functional role of some of these factors (i.e. PPARG, AhR) on HIV replication in Th1Th17 versus Th1 cells; and (iv) the identification of the level at which these factors interfere with the HIV replication cycle. Our analysis of the large sets of microarray data by Gene Set Enrichment Analysis and Ingenuity Pathway Analysis indicate that Th1Th17 compared to Th1 cells are more susceptible to cell activation and apoptosis, promote superior inflammation and express at low levels genes related to the proteosomal degradation. These differences in the regulation of various biological functions and pathways can partly explain the susceptibility to HIV infection in these cells. We then confirmed the differential expression of some genes of interest in Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) cells at mRNA and protein levels. Finally, we demonstrated the role of the transcription factors PPARG and AhR in the regulation of HIV replication. The activation of PPARG by rosiglitazone induces an important decrease in HIV replication in CD4+ T cells, while AhR activation by its exogenous ligands TCDD and FICZ promotes viral replication. We propose that the PPARG pathway acts as a negative regulator of HIV replication in these cells by interfering with Th17 polarization and probably by inhibiting the transcriptional activity of NF-kB. The role of nuclear versus cytoplasmic AhR appears diametrically opposed, since RNA interference against AhR is also associated with a significant increase in HIV replication. It is thus possible that the cytoplasmic form of AhR, known for its E3 ubiquitine ligase activity, is involved in proteasomal degradation of the viral particles. The mechanism by which the nuclear versus cytoplasmic form of AhR interferes with viral replication is being studied in the laboratory. This study represents the first characterization of the differential expression of genes in the entire genome of CD4+ T subpopulations permissive (Th1Th17) versus resistant (Th1) to infection by HIV. Ours results identify new molecular targets for therapeutic strategies to limit HIV replication in primary CD4+ T lymphocytes.

La cryptococcose chez les patients atteints du VIH-1 est principalement causée par Cryptococcus neoformans var. grubii tandis que Cryptococcus gattii infecte surtout les personnes immunocompétentes. Afin d’élucider les mécanismes causant la susceptibilité différentielle à l’égard de ces deux espèces de Cryptococcus dans le contexte de l’infection au VIH-1, nous avons utilisé un modèle novateur de la cryptococcose chez la souris transgénique CD4C/HIVMutA, qui exprime les gènes nef, env et rev du VIH-1. L’expression du transgène VIH-1 a augmenté le recrutement pulmonaire des macrophages alvéolaires mais a diminué celui des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en réponse à l’infection par le C. neoformans ou le C. gattii. La production pulmonaire des chimiokines MCP-1 (CCL2) et RANTES (CCL5) était également réduite chez les souris transgéniques infectées par l’une ou l’autre de ces espèces de Cryptococcus. La production pulmonaire de MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TGF-β, IL-2, IL-4 et IL-13 était augmentée chez la souris infectée au C. neoformans comparativement à C. gattii. In vitro, les macrophages alvéolaires prélevés chez la souris Tg et stimulés par des agonistes ont produit davantage de MIP-1β, alors que les chimiokines MCP-1 et RANTES n’ont pas été détectées. / The most common cause of cryptococcosis in HIV-1-infected patients is Cryptococcus neoformans var. grubii, while Cryptococcus gattii usually infects immunocompetent people. We used a novel inhalation model of cryptococcosis in CD4C/HIVMutA transgenic mice expressing nef, env, and rev of HIV-1 to examine the mechanisms that cause differential susceptibility to these species of Cryptococcus in the context of HIV-1 infection. HIV-1 transgene expression increased alveolar macrophage but decreased pulmonary CD4+ and CD8+ T lymphocyte recruitment. Pulmonary production of the CC chemokines MCP-1 (CCL2) and RANTES (CCL5) was reduced in transgenic mice infected with C. neoformans or C. gattii, and concentrations were lower after infection with C. gattii compared to C. neoformans. Production of MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TGF-β, IL-2, IL-4 and IL-13 was increased in mice infected with C. neoformans compared to C. gattii. Production of MIP-1β by alveolar macrophages harvested from Tg mice was enhanced after agonist exposure in vitro, but production of the chemokines MCP-1 and RANTES was undetectable.

Objectif: La caractérisation des facteurs immunitaires associés à la protection contre l’infection au VIH est cruciale pour le développement de stratégies de prévention. Cette étude évalue les IgGs dirigées contre l’enveloppe du VIH-1 dans le sérum et les liquides cervicovaginaux (LCV) de travailleuses du sexe béninoises. Méthode : Notre étude porte sur 23 travailleuses du sexe séropositives (TS+) et 20 travailleuses du sexe séronégatives (TS-). Le potentiel de neutralisation a été évalué par un essai de neutralisation. La détection d’IgGs a été effectuée par un ELISA sur base cellulaire. La capacité d’induire une réponse ADCC a été est évaluée par l’élimination de cellules cibles recouvertes de gp120 par le mécanisme d’ADCC. Résultats : Malgré que nous n’ayons pas détecté d’IgG dirigées contre l’enveloppe du VIH-1, ni d’activité de neutralisation ou d’élimination de cellules cibles par ADCC chez les TS-, nous avons facilement détecté ces activités de neutralisation et d’élimination de cellules cibles par ADCC chez les TS+ dans le sérum et les LCV qui reconnaissent mieux la forme de l’enveloppe liée à CD4. Ces IgGs pourraient être impliquées dans l’élimination par ADCC des cellules cibles présentant les glycoprotéines de l’enveloppe à leur surface, et ce à la muqueuse vaginale, le premier site de transmission virale. Conclusion : Ces résultats permettent pour la première fois de montrer la conformation de l’enveloppe préférentiellement reconnue par les IgGs présentes au site de transmission par voie sexuelle. / Objective: Characterization of the immune correlates of protection against HIV infection is crucial for the development of preventive strategies. This study examined HIV-1 envelope glycoproteins (Env) specific IgG in systemic and mucosal compartments of female Beninese commercial sex workers (CSWs). Design: 23 HIV-1-positive and 20 highly-exposed HIV-1-seronegative (HESN) CSWs were studied. Methods: HIV-1-Env specific IgG detection in sera and cervico-vaginal lavages (CVLs) from the study population was done by cell-based ELISA. The HIV neutralizing activity was evaluated with a neutralization assay. HIV-1 specific antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) response of the cohort was measured with a FACS-based assay evaluating the ADCC-mediated elimination of gp120-coated target cells. Results: No anti-HIV-1-Env-specific IgG, neutralizing or ADCC activities were detected in samples from HESN CSWs. Samples from HIV-1-infected CSWs presented ADCC activity in both sera and CVLs. Anti-Env IgG from sera and CVLs from HIV-1-infected CSWs preferentially recognized the Env in its CD4-bound conformation. Conclusion: Theses results demonstrate for the first time that HIV-1-infected CSWs have ADCC-mediating IgG that preferentially recognize Env in its CD4-bound conformation at the mucosal site.

La problématique de la neutralisation par les anticorps constitue un enjeu majeur dans la perspective de la conception d’un vaccin efficace contre le VIH et les connaissances récemment acquises conforte NT l’absolue nécessité de maintenir une recherche cognitive fondamentale sur le sujet. L’un des objectifs de ce travail de thèse a été de documenter les propriétés biologiques en terme de sensibilité à la neutralisation de variants présents chez certains patients asymptomatiques à long terme (ALT) et présentant des caractéristiques particulières. Nous avons pu identifié certains déterminants moléculaires associés à la sensibilité ou à la résistance à l’anticorps monoclonal 2G12 tels le site potentiel de glycosylation (PNGS) en position N302 et la longueur de la boucle V1V2 du gène env. Nous avons ensuite caractérisé la relation entre l’évolution du gène env et la sensibilité à la neutralisation dans un contexte d’évolution tardive chez un patient ALT. Ces travaux ont permis de mettre en évidence une poursuite de l’évolution du gène env plus de 10 ans après l’infection et ceci malgré la présence d’anticorps largement neutralisants et d’une réponse autologue croissante au cours du temps. Le contexte de la transmission mère enfant (TME) constitue un modèle de choix afin d’étudier le rôle des anticorps neutralisants. Afin d’identifier d’éventuels corrélats de protection, mon travail a consisté à étudier la réponse neutralisante dans une population de 114 couples mères-enfants. Nous avons pu confirmer que le spectre de neutralisation des sérums maternels n’était pas associé à une moindre TME du VIH-1, mais que les anticorps neutralisant certains isolats pourraient constituer des indicateurs d’intérêt associé à un moindre risque de transmission. L’ensemble de ces travaux souligne à nouveau la complexité et la pertinence à poursuivre les investigations relatives à l’identification d’éventuels corrélats de protection. / Basic research on neutralizing antibodies. still remains relevant in term of HIV vacccine development. One of the aim of this thesis was to document the neutralization sensitivity of particular HIV-1variants from long term non progressor (LTNP) patients. We first identified molecular signatures associated with sensitivity to 2G12, such as a potential N-linked glycosylation site (PNGS) at N302 and a longer V1V2 loop of gp120. We also studied the relationship between long-term evolution of the virus and neutralization sensitivity in a LTNP patient. We showed that HIV-1 may continue to evolve in presence of both broadly neutralizing antibodies and increasing autologous neutralizing activity more than 10 years post-infection. Mother-to-child transmission provides a natural model for studying the role of neutralizing antibodies. In previous studies, we showed that the presence or high titers of neutralizing antibodies against a CRF01_AE strain, MBA, was associated with a lower rate of HIV-1 intrapartum transmission in Thailand (Barin et al., 2006; Samleerat et al., 2009). In order to confirm this observation and to identify potential correlates of protection in the MTCT context, we examined the breadth and levels of neutralizing antibodies in 57 transmitting and 57 non-transmitting untreated HIV-1 infected mothers. Our study confirmed that the breadth of maternal neutralizing antibodies was not associated with protection of infants from infection, but that neutralizing antibodies to particular strains might be associated with a lower rate of MTCT of HIV-1.

Le VIH-1 est l'agent infectieux qui cause le SIDA. De nombreuses thérapies existent pour combattre le SIDA mais aucune ne permet son éradication et des résistances apparaissent. Le développement de nouvelles thérapies est donc nécessaire. Les anticorps simple-domaine (sdAb) de lamas présentent les propriétés idéales pour le développement de molécules neutralisantes. Des lamas ont donc été immunisés avec Vpr et les formes native, ou induite par un miniCD4, du trimère de gp140 (partie extracellulaire de l'enveloppe (Env)). Des banques de sdAbs ont ensuite été construites et des sélections par phage display et par double hybride ont été réalisées. Trois sdAbs se liant au site de liaison du co- récepteur de l'Env et un sdAb se liant au site de liaison du CD4 ont ainsi été sélectionnés. Ces sites sont conservés mais difficile d'accès pour des immunoglobulines conventionnelles. Ces sdAbs ont ensuite été caractérisés par ELISA, SPR et cytométrie de flux pour leur capacité de liaison à différentes Env, et en « single round assay » pour leur capacité de neutralisation d'un large spectre (LS) de pseudovirus. Des protéines multidomaines (plusieurs sdAbs reliés par un linker) ont ensuite été construites et testées pour leur neutralisation. Plusieurs de ces molécules, neutralisant un LS de virus, pourraient être utilisées dans des microbicides. La stabilité caractéristique des sdAbs, même en absence de formation de pont disulfure, par exemple dans un environnement réducteur tel que le cytoplasme, est primordiale dans le développement d'anticorps intracellulaires (intrabodies). / HIV-1 is the infectious agent of AIDS. Numerous therapies exist to fight AIDS, but they are not able to eradicate it, and resistances appear. So, new therapy development is necessary. Single-domain antibodies (sdAb) of llamas have ideal properties to develop neutralizing molecules. So, llamas have been immunized with Vpr and with free or miniCD4 induced trimeric gp140 (extracellular part of the envelope (Env)). SdAb libraries have been built and selections were done by phage display and yeast two hybrid. Three sdAbs targeting the co-receptor binding site of the Env and one sdAb targeting the CD4 binding site have been selected. These sites are conserved but inaccessible by conventional immunoglobulins. These sdAbs have been characterized by ELISA, SPR and FACS for their ability to bind different Env and by single-round assay for their neutralization ability. Multimeric proteins (linked sdAbs) have been built and tested for their neutralization ability. Several of these molecules are able to neutralize a broad spectrum of pseudoviruses. They can be used in microbicides. The characteristic stability of these sdAbs, even without disulfide bound formation, ie into reducing environment, as the cytoplasm, is primordial for intracellular antibody (intrabody) development. One sdAb anti-Vpr has been selected using the Sos Recruitment System (SRS), an yeast two-hybrid system allowing detection of cytoplasmic protein-protein interactions. This sdAb is able to alter the localization of its antigen into eukaryotic cells. It is a proof of concept ot the use of SRS in the selection of intracellularly functional sdAbs.

Le virus de l'immunodéficience humain de type 1 VIH-1 est un rétrovirus responsable d'une pandémie touchant actuellement 34 millions de personnes dont près de 25 millons en sont morts. En dépit des grands progrès réalisés dans le développement de nouveaux médicaments visant à bloquer la réplication de ce virus, l'émergence rapide de souches virales mutantes résistantes imposent l'urgence et la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre ce virus. La Reverse Transcriptase (RT) duVIH-1 joue un rôle majeur dans le cycle viral puisqu'elle est responsable de convertir l'ARN génomique simple brin en ADN double afin d'intégrer l'ADN génomique de la cellule hôte. La forme biologique de la RT est un hétérodimère formé de la sous unité p66 et la sous unité p51. Les sous unités sont constituées des sous domaines fingers, palm, « connection », thumb et RNase H, ce dernier étant absent sur la sous unité p51. L'activation de la RT est un processus en deux étapes : la première étape consiste en l'association rapide des deux sous unités, suivie d'une deuxième étape plus lente, correspondant à des changements conformationnels fins à l'interface entre p66/p51.Dans l'objectif d'inhiber la fonction de la RT, nous avons proposé une nouvelle stratégie fondée sur l'utilisation des peptides interfacials courts dérivant de séquences hautement conserver de la RT, capables de cibler efficacement les interactions protéine/protéine et de bloquer la dimérisation et l'activation par maturation de la RT. La dimérisation des deux sous unités implique leur interaction part les domaines de connexion. Dans la première partie de ce travail de thèse, nous avons criblé et isolé des peptides capables d'interférer avec cette interaction impliquant un « cluster » de résidus aromatiques. Nous avons identifié un peptide court PID4, et démontré que ce peptide induit un changement de conformation de la RT, entrainant la dissociation du complexe. La maturation implique l'interaction de résidus localisés au niveau de « hot spot » dans le domaine RNase H de p66 et thumb de p51. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons sélectionné un peptide court, P27, issus du domaine thumb pouvant inhiber l'étape de la « maturation » (P27). Ces deux classes de peptides bloquent la réplication virale et sont efficaces sur plusieurs souches virales et sur des mutants résistants aux NNRTIS et NRTIS.Les résultats obtenus sur nos deux classes d'inhibiteurs peptidiques, démontrent bien que la dimérisation et la maturation de la RT constituent des cibles de choix pour bloquer l'activité polymérase de la RT et ainsi stopper la prolifération virale par un nouvel concept moins exposer à l'émergence des mutation de résistance. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a retrovirus responsible of a disease currently affecting 34 million people and caused the death of 25 million people from its discovery in the 1980s. Despite the great progresses made in the development of new drugs to block the replication of the virus, the rapid emergence of resistant mutant strains requires the development of new therapeutic strategies to combat this agent.The Reverse transcriptase (RT) plays an essential role in the replication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and remains a primary target of anti-HIV-1 drugs. The biologically active form of HIV-1 RT is a heterodimer of two subunits, p51 and p66, each consisting of distinct sub-domains: the fingers, the palm, the connection and the thumb are present in both of them. p66 contain also an RNAse H sub-domains. The formation of RT is a two-step mechanism, involving first the rapid association of the two subunits (Dimerization), followed by conformational changes (Maturation) yielding the biologically active form of the enzyme.In order to inhibit the function of RT, we have proposed and elaborated a new strategy based on short interfacial peptides that target protein-protein interfaces involved in RT- dimerization and activation. The dimerization of two subunits involves interaction between their connection domains. In the first part of this thesis, we screened and isolated peptides capable of interfering with the interaction, involving a "cluster" of aromatic residues. We identified a short peptide PID4, and demonstrated that induces a conformational change in the RT, resulting in dissociation of the heterodimer complex. Maturation involves the interaction of residues located at "hot spot" in the RNase H domain of p66 and the thumb domain of p51. The second part of this thesis is based on a screening of peptides, derived from the thumb domain of the enzyme. We have identified a short peptide (P27) which inhibits the maturation step and abolish replication of HIV-1 LAI. These two classes of peptides block viral replication and are effective in several viral strains and mutants resistant to NNRTIs and NRTIs.Taken together, the results of our two classes of peptides inhibitors, demonstrate that the dimerization and maturation of RT constitutes an attractive target for AIDS chemotherapeutics and for the design of more specific new antiviral drugs that can bypass resistance limitation.

Les travaux portent sur l'élaboration de nanoparticules dont le coeur polyester (PLA) est recouvert d'une couche polysaccharide hydrophile à base de dextrane. Des composés amphiphiles polysaccharidiques (DexC6, DexN3, Dex-g-PLA-g-N3) ont été synthétisés et leur comportement tensioactif a été évalué. Cette capacité à stabiliser les interfaces a été mise à contribution pour élaborer les nanoparticules via deux procédés: émulsion/évaporation de solvant organique et nanoprécipitation. Un peptide inhibiteur de la dimérisation de la protéase du VIH-1 (Pam-LEY), a alors été encapsulé au sein de nanoparticules PLA recouvertes de DexC6. Bien que stable en milieu aqueux de haute force ionique (4M), la désorption de la couronne physiquement adsorbée est observée en présence de SDS. La Chimie-click a été une alternative pour fixer cette couronne polysaccharidique hydrophile de façon irréversible à la surface des nanoparticules selon 2 stratégies. D'une part, des copolymères organosolubles Dex-g-PLA-g-N3 ont été présynthétisés par Chimie-click puis nanoprécipités dans l'eau. L'autre méthode consiste à émulsionner une solution aqueuse de DexN3 et une solution organique de PLA alpha-alcyne en présence de CuBr. Une chimie-click se produit alors in situ à l'interface liquide/liquide, et assure le lien covalent entre le coeur et la couronne de la nanoparticule. La Chimie-click nous a également permis d'obtenir des nanoparticules possédant des fonctions azide résiduelles à leur surface. Une post-fonctionnalisation de ces dernières à été réalisée avec un dérivé d'ATWLPPR, un peptide ciblant les co-récepteurs NRP-1 de VEGF surexprimés au niveau des néo-vaissaux irriguant les tumeurs cancéreuses / This work deals with biodegradable/biocompatible polymeric nanoparticles based on PLA and covered by a polysccharidic shell (dextran). First of all, amphiphilic dextran derivatives (DexC6, DexN3, Dex-g-PLA-g-N3) have been produced and their surfactive properties have been evaluated depending on their architecture and substitution degree. Then we took advantages of their ability to stabilize interfaces to formulate nanoparticles via two processes: emulsion/organic solvent evaporation and nanoprecipitation. Pam-LEY, peptide used as HIV-1 protease dimerisation inhibitor, was encapsulated with 40% efficiency into PLA nanoparticules covered by DexC6. Because this DexC6 surface is just physically adsorbed on the PLA core, a desorption is observed in presence of SDS. The use of Click-chemistry was judged interesting to solve that issue and to covalently link the hydrophilic polysaccharidic shell to the PLA core. Two strategies could be opposed. One one hand, oil-soluble Dex-g-PLA-g-N3 copolymers have been synthesized by click chemistry in homogeneous media and then nanoprecipitated in water. On other hand, an hydrophilic DexN3 has been emulsified with a alpha-alkyne PLA organic solution, in the presence of CuBr. By this way, click-chemistry occured in situ, at liquid/liquid interface during the emulsification step. Produced triazole rings link the core to the shell.Moreover, the use of the Huisgen cycloaddition reaction allowed us to produce nanoparticles having some residual azide functions on their surface. The nanoparticles have been post-fonctionnalized by a peptide used to target NRP-1, co-receptor of Vascular Endothelial Growth Factor over-exprimed on the cancer tumors area

TRBP (TAR RNA Binding Protein), est un facteur activateur de la réplication du Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Cette protéine cellulaire qui interagit avec les ARN double brins est connue pour son rôle crucial dans la voie des miRNA. Isolée pour sa capacité à interagir avec la séquence leader TAR présente à l'extrémité 5' de tous les ARN du VIH-1, TRBP favorise la réplication du VIH-1 au niveau post-transcriptionnel, en partie via l'inhibition de la PKR (Protéine Kinase ARN dépendante).Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels TRBP facilite la réplication du VIH-1, le complexe protéique associé à TRBP a été purifié par immunoprécipitation par double affinité et identifié par spectrométrie de masse. En plus des facteurs déjà connus, un nouveau partenaire à activité ARN 2'-O-méthyltransférase (2'-OMTase) potentielle a été copurifié : la protéine FTSJ3. Chez les eucaryotes supérieurs, deux 2'-OMTases permettent la méthylation des ARNm cellulaires au niveau de la position ribose 2'-O- du premier (coiffe 1) et du deuxième nucléotide (coiffe 2). Cette coiffe 1/2 est une signature moléculaire permettant de discriminer les ARNm endogènes et exogènes. Dans la cellule, MDA5, un senseur cytoplasmique, reconnait les ARN exogènes non coiffés et déclenche la production d'interférons (IFNs) de type I pour établir un état antiviral. Pour échapper à la réponse immune innée, certains virus ont développé des mécanismes leur permettant de mimer une coiffe 1/2.Le VIH ne code pas pour une activité 2'-OMTase. Cependant FTSJ3, de par son interaction avec TRBP, se retrouve à proximité de l'extrémité 5' de l'ARN viral. Cette 2'-OMTase méthyle l'ARN TAR in vitro, qui, transfecté dans les cellules monocytaires humaines U937 n'induit plus la production d'IFNs de type I. A l'inverse, le virus VIH-1 produit en l'absence de FTSJ3 déclenche une induction de l'expression des IFNs de type I dépendante de MDA5 dans les cellules U937. L'expression de ce virus est atténuée suite à un défaut d'import nucléaire. Ainsi, ces travaux montrent que la protéine FTSJ3, recrutée au niveau de l'extrémité 5' de l'ARN du VIH-1 par TRBP, facilite la réplication du VIH-1 en assurant la synthèse d'une coiffe 1/2 qui permet au VIH-1 d'échapper à la reconnaissance par le senseur MDA5 et à l'induction des IFNs de type I. Cette étude met en évidence un nouveau mécanisme permettant au VIH-1 d'échapper à la détection par le système d'immunité innée cellulaire. / TRBP (TAR RNA Binding Protein) is a cellular RNA binding protein that facilitates the replication of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1). Isolated for its ability to bind HIV-1 TAR sequence present at the 5' end of all HIV-1 RNA, TRBP promotes HIV-1 replication at a post-transcriptional level by counteracting the antiviral activity of the protein kinase R (PKR).To gain more insight on how TRBP enhances HIV-1 replication, TRBP associated factors were purified using tandem immunoaffinity purification and identified by mass spectrometry. In addition to already known associated factors, a new protein with a putative RNA 2'-O-methyltransferase activity (2'OMTases) was copurified: FTSJ3. In higher eukaryotes, cellular mRNA are methylated on 2'-O ribose position on the first (Cap 1) and second nucleotide (Cap 2). This capping provides a molecular signature for the discrimination of endogenous versus exogenous mRNA. In the cell, MDA5, a cytoplasmic sensor, recognizes exogenous uncapped RNA and activate type I interferons (IFNs) production to establish an antiviral state. To evade innate immune response, some viruses have evolved mechanisms to mimics cap 1/2.HIV-1 does not encode a 2'O-MTase activity. However, owing to its interaction with TRBP, FTSJ3 is recruited at the 5' end of the viral genome and methylates TAR RNA in vitro. When capped by FTSJ3, TAR does not induce type I IFNs anymore when transfected in monocytic cell line U937. Conversely, HIV-1 viruses produced in FTSJ3 knock-down cells triggers type I IFNs expression through MDA5 sensing. This virus is attenuated, expressed in low amounts because of a block at the level of HIV-1 nuclear import. This study shows that FTSJ3 is recruited to HIV-1 5' end TAR sequence by TRBP and facilitates HIV-1 replication. HIV-1 RNA capping allows HIV-1 escape from MDA5 sensing and type I IFN induction. This study highlights a new way of HIV-1 escape from innate immune system.

La protéine Tat (Trans-activator of transcription) est certainement l’une des cibles présentant le plus d’intérêts dans la lutte contre le VIH-1. En effet, synthétisée précocement, elle joue un rôle central dans le cycle viral et protège les cellules infectées. Secrétée dans le milieu extracellulaire, elle participe à l’immunodéficience en inhibant certaines fonctions ou en induisant l’apoptose des cellules du système immunitaire. Elle est également impliquée directement dans de nombreuses pathologies associées au VIH-1. Dans une première étude, nous avons voulu savoir si la trithérapie était capable d’inhiber la synthèse et la sécrétion de la protéine Tat. Nous avons proposé à des patients infectés, sous trithérapie, ayant une charge virale indétectable, de nous permettre de faire cinq prélèvements sanguins (un tous les trois mois pendant un an) afin de vérifier la présence d’anticorps anti-Tat. Nous avons pu constater que 86% des patients avaient des anticorps anti-Tat mais que ces anticorps pouvaient disparaître ou apparaître chez une majorité de patients, démontrant que la protéine Tat continue d’être sécrétée malgré les antiviraux. Une deuxième étude, sur des sérums de patients, a été effectuée afin de déterminer si la protéine Tat était structurée dans le sang des patients. Il existait une polémique, dans la littérature, sur le fait que la protéine Tat soit naturellement non structurée. Nous avons démontré que la protéine Tat est structurée dans le sérum de patients. De plus, l’activité biologique de la protéine Tat est étroitement liée à l’acquisition de sa conformation. Dans le cadre du développement clinique d’un vaccin anti-Tat dans le laboratoire, nous avons effectué des vaccinations sur des souris afin de déterminer la dose, l’adjuvant, la voie d’administration et le nombre de rappels à effectuer ainsi que la vérification de la tolérance et de la toxicité du vaccin. Des essais cliniques sont en préparation dans le cadre d’un protocole thérapeutique. Le laboratoire développe également une autre approche thérapeutique avec un anticorps monoclonal de souris capable de reconnaitre et de neutraliser les variants Tat représentatifs des cinq principaux sous-types du VIH-1. Cet anticorps qui sera humanisé, servirait à une future immunothérapie en combinaison à la trithérapie pour des patients en phase précoce ou tardive ou encore pour des nouveaux nés dont le système immunitaire est peu fonctionnel. / The protein Tat (Trans-activator of transcription) is definitely one of the most interesting targets in the fight against HIV-1. Synthesized early, it plays a central role in the viral life cycle and protects infected cells. Secreted into the extracellular medium, it participates in the immunodeficiency by inhibiting some functions or inducing apoptosis of immune cells. It is also directly involved in many diseases associated with HIV-1. In a first study, we examined whether HAART was able to inhibit the synthesis and secretion of the Tat protein. We proposed to HIV-1 infected patients under HAART, with undetectable viral load, to allow us to do five blood samplings (one every three months for one year) to verify the presence of antibodies against Tat. We found that 86% of patients had antibodies against Tat but these antibodies could disappear or appear in a majority of patients showing that Tat protein continues to be secreted in spite of antiviral treatment. A second study of patient sera was carried out to determine if Tat was structured in the blood of patients. There was a controversy in the literature about the fact that Tat could be naturally unstructured. We showed that Tat is structured in the serum of patients. In addition, the biological activity of Tat is closely related to the acquisition of its conformation. As part of a clinical development of a Tat vaccine in the laboratory, we carried out vaccinations in mice to determine the dose, the adjuvant, the route of administration, the number of boosts, tolerance and toxicity of the vaccine. Clinical trials are planed with a therapeutic protocol. The laboratory is also developing another therapeutic approach with a mouse monoclonal antibody able to recognize and neutralize Tat variants representative of the five major subtypes of HIV-1. This antibody will be humanized and could be used for future immunotherapy, in combination with HAART for patients in early or late stage of the pathology or to newborn babies who have a weak immune system.