L’un des obstacles majeurs à l’éradication du VIH-1 est sa capacité à faire évoluer rapidement son matériel génétique. Ceci lui permet de contourner le système immunitaire de l’hôte ainsi que la pharmacologie antirétrovirale due à l’émergence de formes mutantes et résistantes des enzymes ciblées. A l’origine de ses recombinaisons génétiques, se trouvent d'une part les erreurs commises par la RT lors de l’étape de transcription inverse et d'autre part les processus de transfert de brins qui sont facilités par la protéine de nucléocapside (NC). Notre objectif est de mieux comprendre les propriétés chaperon de la NC pendant le premier transfert de brin ; au cours de celui-ci, la NC déstabilise les structures secondaires des acides nucléiques impliqués ARN et ADN afin de les hybrider pour former un duplex ARN/ADN. Nous souhaitons notamment savoir si la NC est capable de reconnaître la polarité des chaines d’acides nucléiques selon leur nature et si cette capacité module ses propriétés déstabilisatrices. Nos travaux sur la dynamique interne de la protéine ont permis de montrer que certains mouvements étaient corrélés avec les modalités de fixation sur l’ARN. Nous avons ainsi pu montrer, en comparant les propriétés des différentes formes maturées de la NC au cours du cycle viral, que les domaines p1 et p6 présents dans les formes immatures (NCp9 et NCp15) modulaient les propriétés d’interaction comparé à la forme mature (NCp7). Ceci nous amène à reconsidérer le rôle des différentes parties de la polyprotéine Gag sur les propriétés du domaine NC au sein de ce précurseur Gag. Ce domaine apparaissant largement responsable de la reconnaissance et de la sélection du génome viral ARN pour l’encapsidation dans les particules néosynthétisées. Pour réaliser cette étude, nous avons étudié différents complexes entre la NC avec différents acides nucléiques (ARN et ADN), ce en utilisant principalement la résonance magnétique nucléaire couplée à d’autres méthodes biophysiques et biochimiques dans le but d’obtenir des informations à l’échelle atomique. Ce travail peut également être utile dans la conception d’une nouvelle classe d’inhibiteurs dirigés contre la NC sachant que celle-ci représente une cible thérapeutique attrayante vu qu’elle est très conservée et très importante pour l’infectiosité. / One of the major difficulty in the eradication of HIV-1 is its ability to evolve rapidly its genome. This permit to the virus to escape the host immune response and the antiretroviral pharmacology due to the emergence of mutant and resistant forms of the target enzymes.The origin of these genetic recombination is, in one hand the errors commited by the RT during the reverse transcription stage and in the other hand the strand transfer processes facilitated by the nucleocapsid protein (NC).Our goal is to understand the chaperonnig properties of NC protein during the first strand transfer ; where NC destabilizes the involved RNA and DNA secondary structures to anneal them and form a hybrid RNA/DNA duplex.In order to determine this mecanism, we seek, if NC protein have the property to recognize the polarity of nucleic acids chains and if this modulates its destabilization properties. Also, our work on the internal dynamic of the protein showed that some motions are correlated to its binding to RNA.We compared the properties of different maturated forms of NC protein during the viral life cycle and we concluded that p1 and p6 domains present within the immature forms (NCp9 and NCp15) adjusted differently the interaction properties to nucleic acids compared to the mature form (NCp7). It leads us to reconsider the role of the different parts of the Gag polyprotein on the properties of the NC domain within this Gag precursor. This domain appears to be largely responsible for the recognition and selection of the viral genomic RNA in order to package it in the newly formed viral particles.To permform this study, we studied different complexes between NC and nucleic acids sequences (RNA and DNA) using mainly NMR spectroscopy and biophysical or biochemical methods to obtain informations at the atomic scale. This work can also be useful in the design of a new class of inhibitors against NC protein which is an attractive therapeutic target due to its conservation and importance in viral infectivity.

Avec plus de 39 millions de personnes infectées à travers le monde, le virus de l’immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1) est un problème majeur de santé publique. Bien que la thérapie antirétrovirale contrôle la réplication virale, améliore la santé et prolongent la vie des personnes vivant avec le VIH-1, elle ne permet pas d’éradiquer complètement le virus. En effet, celui-ci établit des phases de latence en intégrant son génome dans l’ADN cellulaire des cellules cibles, entrainant la formation de ce que l’on appelle le réservoir latent du virus. Ce réservoir se situe principalement dans les lymphocytes T CD4+, bien qu’on le retrouve également dans les cellules myéloïdes, et il constitue le principal obstacle à l’éradication du virus. Il est donc impératif de mieux comprendre les facteurs de l’hôte qui régissent non seulement la susceptibilité de ces cellules à l’infection et qui contribuent également à la persistance du VIH-1. Nous postulons que les micro-ARN (miARN), des petits ARN produits par la cellule et qui régulent l’expression génique, jouent un rôle au cours de l’infection par le VIH-1. Dans un premier temps, nous nous sommes concentrés sur le rôle des miARN dans l’entrée virale. À l’aide d’un séquençage de nouvelle génération des miARN dans les macrophages, nous avons déterminé que le miARN-103, ainsi que son paralogue le miARN-107, ciblent l’ARNm du corécepteur CCR5 utilisé par le VIH-1. Nous montrons que l’induction de l’expression des miARN-103/107 est régulée par le facteur de transcription p53 et rend les macrophages réfractaires à l’entrée du VIH-1. Nous observons que le niveau d’expression des miARN-103/107 est enrichi dans les macrophages résidant dans les tissus intestinaux de donneurs sains et les macrophages alvéolaires des personnes sous thérapie antirétrovirale, ce qui contribue vraisemblablement à leur résistance à l’infection par le VIH-1. Étant donné que les lymphocytes T CD4+ constituent le principal réservoir du VIH-1, nous avons ensuite étendu l’étude du miARN-103 dans ces cellules. Récemment, il a été montré que la latence virale serait la conséquence de l’infection de lymphocytes T CD4+ dans une fenêtre très étroite suite à leur activation. Ces cellules qui 3 transitionnent vers un phénotype mémoire posséderaient des propriétés uniques, comme une augmentation temporaire de l’expression du corécepteur viral CCR5, ainsi qu’une capacité réduite de transcrire l’ADN proviral intégré. Nos résultats montrent que le miARN-103, qui cible également le CCR5 dans les lymphocytes T CD4+, participe à la modulation du CCR5 selon l’état d’activation de la cellule et contribue indirectement à l’établissement de la latence virale dans ces cellules. De plus, nos résultats montrent que les lymphocytes T CD4+ issus d’individus qui contrôlent l’infection par le VIH-1 expriment des niveaux réduits d’ARNm de CCR5 (lorsque comparés à ceux d’individus non-contrôleurs). Cet état étant associé à une tendance à la hausse du miARN-103, suggère que le miARN-103 pourrait participer au contrôle de l’expression de CCR5 in vivo. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé un séquençage de nouvelle génération de l’ARN des lymphocytes T CD4+ infectés. À la suite de cette analyse, nous avons déterminé que le miARN-26a participe à la régulation de CD59, une protéine cellulaire incorporée dans les virions jouant un rôle clé dans l’activation du complément en inhibant la formation du complexe d’attaque membranaire. Au cours de l’infection, ce miARN est diminué dans les cellules productivement infectées. Cette diminution est associée à une augmentation de CD59 dans les cellules infectées et à la surface des virions produits par ces cellules, favorisant leur échappement à la lyse médiée par le complément. Nous montrons que l’introduction d’un analogue du miARN-26a dans les cellules rend les virions produits par ces dites cellules plus sensibles à la lyse médiée par le complément. En conclusion, les observations et analyses réalisées dans le cadre de cette thèse nous aident à mieux comprendre le rôle des miARN dans l’infection et la persistance du VIH-1. Ces résultats aident à notre compréhension des facteurs de l’hôte qui régissent la susceptibilité de ces cellules à l’infection ainsi que la persistance virale, et pourraient aider au développement de stratégies thérapeutiques. / With more than 39 million people infected in the world, human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a major public health problem. Although antiretroviral therapy controls viral replication, improves the health, and prolongs the lives of people living with HIV-1, it does not completely eradicate the virus. Indeed, the virus has established latency phases by integrating its genome into the cellular DNA of target cells, leading to the formation of what is called the latent reservoir of the virus. This reservoir is located mainly in CD4+ T cells, although it is also found in myeloid cells, and it has become the main obstacle to eradication of the virus. It is therefore imperative to better understand the host factors that not only govern the susceptibility of these cells to infection but also contribute to HIV-1 persistence. We postulate that microRNAs (miRNAs), which are small RNAs produced by the cell involved in regulation of gene expression, have a role during HIV-1 infection. First, we focused on the role of miRNAs in viral entry. Using next generation miRNA sequencing in macrophages, we determined that miRNA-103, as well as its paralogue miRNA-107, target the mRNA of CCR5, the HIV-1 coreceptor. We show that the induction of miRNA-103/107 expression is regulated by the transcription factor p53 and makes macrophages more resistant to HIV-1 entry. We observe that the expression level of miRNAs-103/107 is enriched in resident macrophages in intestinal tissues of healthy donors and alveolar macrophages of people on antiretroviral therapy, which likely contributes to their resistance to infection by HIV-1. Given that CD4+ T cells constitute the main reservoir of HIV-1, we then extended the study of miRNA-103 in these cells. Recently, it has been shown that viral latency is the consequence of the infection of CD4+ T cells within a very narrow window following their activation. These transitioning to memory T cells are thought to possess unique properties, such as a temporary increase in the expression of the viral coreceptor CCR5, as well as a reduced capacity to transcribe integrated proviral DNA. Our results show that miRNA-103, which also targets CCR5 in CD4+ T cells, participates in the modulation of CCR5 depending on the activation state of the cell 5 and indirectly contributes to the establishment of viral latency in these cells. Furthermore, our results show that CD4+ T cells from individuals who control HIV-1 infection express reduced levels of CCR5 mRNA (when compared to those from non- controller individuals), this being associated to a upward trend in miRNA-103 expression, suggesting that miRNA-103 may participate in the control of CCR5 expression in vivo. Secondly, we carried out next generation RNA sequencing of HIV-1 infected CD4+ T cells. Their resulting analyses determined that miRNA-26a participates in the regulation of CD59, a cellular protein that is incorporated into virions and has a key role in complement activation by inhibiting the formation of the membrane attack complex. During infection, this miRNA is decreased in productively infected cells. This decrease is associated with an increase in CD59 in infected cells, as well as on the surface of virions produced by these cells, favoring their escape from complement- mediated lysis. We show that introduction of miRNA-26a mimics in cells makes the virions produced by these cells more sensitive to complement-mediated lysis. In conclusion, the observations and analyses developed in this thesis will help us better understand the role of miRNAs in HIV-1 infection and persistence. These results help in the understanding of host factors that govern the susceptibility of these cells to infection as well as viral persistence and could help in the development of therapeutic strategies.

Objectif : Étudier l'association entre l’utilisation de contraceptifs hormonaux et le risque d'acquisition du VIH-1 chez les femmes au Malawi, en Afrique du Sud, en Zambie et au Zimbabwe. Devis : Analyses secondaires de 2887 femmes âgées de 17-55 ans ayant participé à l’étude HPTN 035, une étude de phase II/IIb sur l’efficacité de deux gels microbicides pour prévenir la transmission du VIH chez les femmes à risque. Méthodes : L'association entre l'utilisation de contraceptifs hormonaux et le risque d'acquisition du VIH-1 a été évaluée en utilisant des modèles de Cox. Des risques relatifs sont estimés où le groupe de référence est celui des femmes qui n’utilisent pas de contraceptifs hormonaux. De plus, un modèle multivarié de Cox est utilisé afin de contrôler pour les facteurs potentiellement confondants. Résultats : Les contraceptifs injectables ont été utilisés par 52,1% des femmes, alors que les contraceptifs oraux ont été utilisés par 20,7% de celles-ci. Pendant l'étude, il y a eu 192 séroconversions. L'incidence observée du VIH était de 2,28; 4,19 et 4,69 pour 100 personne-années pour les contraceptifs oraux, injectables et non hormonaux, respectivement. Lors de l’analyse multivariée, nous n'avons trouvé aucune association significative entre l’usage des contraceptifs hormonaux et l’acquisition du VIH-1. Le risque relatif ajusté (RRa) pour les contraceptifs oraux est de 0,573 (IC de 95% : [0,31-1,06]) et 0,981 (IC de 95% : [0,69 ; 1,39]) pour les contraceptifs injectables. Conclusions : Bien que cette étude ne démontre pas d’association entre l’usage des contraceptifs hormonaux et le VIH-1, nous concluons toutefois que ces méthodes de contraception ne protègent pas contre le VIH-1, et il est ainsi recommandé aux femmes utilisant des hormones contraceptives de toujours utiliser le condom pour prévenir l'infection au VIH-1. / Objective: To investigate the association between the use of hormonal contraceptive and the risk of acquiring HIV-1 infection in women from Malawi, South Africa, Zambia and Zimbabwe. Design: Secondary analyses of 2887 women aged 17-55 years who participated in the HPTN 035 trial, a Phase II/IIb trial on the efficacy of two microbicide gels to prevent HIV transmission in women at risk in Africa. Methods: The association between the use of hormonal contraceptive and the risk of acquiring HIV-1 was evaluated using Cox proportionnal models. Relative risks of exposed women were estimated using as a reference group the women who do not use hormonal contraceptives. In addition, a multivariate Cox model was used to control for potentially confounding factors. Results: Injectable contraceptives were used by 52.1 % of women, while oral contraceptives were used by 20.7% of them. During the study, there were 192 seroconversions. The observed HIV-1 incidence was 2.28, 4.19 and 4.69 per 100 woman-years for oral, injectable and non-hormonal contraceptive users, respectively. In multivariate analysis, we found no significant association between the use of hormonal contraceptives and HIV-1 acquisition. The adjusted relative risk (aRR) for oral contraceptives was 0.573 (95% CI: [0.31 to 1.06]) and 0.981 (95% CI: [0.69, 1.39]) for injectable contraceptives. Conclusions: Although this study did not demonstrate an association between hormonal contraceptive use and the risk of HIV-1 infection, we conclude, however, that these methods of contraception do not protect against HIV-1, and it is thus recommended that women using contraceptive hormones always use condoms to prevent HIV-1.

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1. / La protéine accessoire U (Vpu) du VIH‐1 cible efficacement BST2/Tetherin, facteur de restriction restreignant la relâche de divers virus enveloppés à même la surface cellulaire. Le récepteur naturel de BST2 récemment découvert est ILT7, une protéine exclusivement exprimée à la surface des cellules produisant l'essentiel de l'interféron de type 1 (IFN-­1) lors d'infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs). L'interaction entre BST2 et ILT7 réprime la production d'IFN‐1 des pDCs. Considérant le potentiel immunorégulateur de BST2 récemment décrit, nous avons entrepris d'évaluer cet aspect de l'antagonisme de Vpu sur BST2. À l'aide d'un système de co­‐culture entre une lignée de cellules T CD4+ infectée avec un virus exprimant ou n'exprimant pas Vpu et les cellules mononucléées du sang périphérique ou de pDCs purifiés, nous avons observé que Vpu est responsable d'une atténuation majeure de la sécrétion d'interféron de type 1 (IFN-­1) produite en réponse aux cellules infectées. La présence de molécules de BST2 de surface libres est essentielle à ce processus, puisque le bloc de toute interaction en trans de BST2 par des anticorps polyclonaux α­‐BST2 abroge l'effet de Vpu. Similairement, Vpu ne peut exercer cet effet lorsque ILT7 est déplété dans les pDCs à l'aide de petits ARN interférents. Enfin, l'introduction de protéines recombinantes solubles d'ILT7 dans le système de co-culture semble prévenir l'effet inhibiteur de Vpu, suggérant que Vpu exploite l'interaction de BST2 avec ILT7 pour moduler la sécrétion d'IFN-­1 des pDCs. En conclusion, nos résultats démontrent que Vpu exerce un contrôle sophistiqué de la production d'IFN‐1 par les pDCs en réponse aux lymphocytes T CD4+ infectés par le VIH-­1. Il semble ainsi que l'action de Vpu favorise, par un mécanisme encore méconnu, l'activation d'ILT7 à travers BST2. En effet, cette fonction de Vpu semble tout aussi dépendante de BST2 que de l'ILT7. En favorisant la relâche virale et en menant à l'inhibition de la réponse antivirale des pDCs, la régulation ciblée de BST2 par Vpu est non seulement cruciale à la dissémination du virus, mais aussi à sa réplication.

Les glycoprotéines d'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) sont impliquées dans une étape importante du cycle de réplication, l’entrée virale. La liaison de la glycoprotéine gp120 à CD4 contribue à la fixation du virus à la cellule cible et déclenche des changements conformationnels dans celle-ci afin de permettre à la gp120 se lier au récepteur de chimiokine CCR5 ou CXCR4. Contrairement à tous les enveloppes du groupe phylogénétique M, qui possède une sérine à la position 375, ceux du clade CRF01_AE possèdent une histidine. Ce résidu fait partie d'une cavité "Phe43" dans laquelle le résidu 43 de CD4 fait contact avec la gp120. Ici, nous avons évalué les conséquences fonctionnelles du résidu 375 en le remplaçant par une serine dans deux enveloppes CRF01_AE (CM244 et 92TH023), la sérine étant présente dans tous les autres clades du groupe M. Nous avons observé que la réversion de l'acide aminé 375 vers une sérine entraine une perte de fonctions des deux Envs CRF-AE tel que mesuré par une perte de l'infectivité et leur capacité à médier la fusion cellule à cellule. Le phénotype observé était la conséquence d’une très faible interaction avec CD4, qui n’était pas le résultat d’une enveloppe défectueuse ou instable. Par conséquent, la modification de l’acide aminé en position 375 a aussi altéré la sensibilité de neutralisation du virus par sCD4, qui en était diminuée. De plus, on a observé que certaines mutations des couches topologiques du domaine interne de la gp120 ont permis un rétablissement partiel de la fonctionnalité en restaurant l’interaction avec CD4. Les niveaux d’infectivité et de fusion des mutants des couches topologiques se rapprochant des enveloppes sauvages de CRF01_AE suggèrent une coévolution entre la cavité phe43 et les résidus du domaine interne de la gp120. Une compréhension des différences qui existent entre les enveloppes de CRF01_AE et les enveloppes de virus du groupe M, permettra d’avoir une idée sur la fonctionnalité des glycoprotéines d'enveloppe. Il serait possible de mettre en évidence des mécanismes impliqués dans les changements conformationnels des Envs qui permettent l’évasion des anticorps dirigés contre elle. De plus, ces possibles différences dans les enveloppes de CRF01_AE pourraient être exploitées pour le développement des différentes approches vaccinales. / The envelope glycoproteins (Env) from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) mediate viral entry. The binding of the HIV-1 gp120 glycoprotein to CD4 contributes to the attachment of the virus to the target cell and triggers conformational changes in gp120 that allow high-affinity binding to the chemokine receptor CCR5 ou CXCR4. Contrary to all other Envs from the same phylogenetic group M, which possess a serine at position 375, the majority of CRF01_AE strains possess a histidine. This residue is part of the “Phe43” cavity, where residue 43 of CD4 engages with the gp120. Here we evaluated the functional consequences of replacing this residue in two CRF01_AE Envs (CM244 and 92TH023) by a serine, present in all the other clades from group M. We observed that reversion of the 375 amino acid to a serine resulted in a loss of functionality of both CRF_AE Envs, as measured by a loss in infectivity and their ability to mediate cell-to-cell fusion. The observed phenotype was the result of a weak interaction with CD4, which was not due to defective processing or trimer stability of these Envs. Therefore, modification of the amino acid at position 375 has also altered the sensitivity of virus neutralization by sCD4, which was reduced. Importantly, mutation of certain residues of the gp120 inner domain layers were able to partially restore wild-type levels of infectivity and cell-to-cell fusion to both CRF01-AE H375S Envs, suggesting a co-evolution of the Phe43 cavity and the gp120 inner domain. An understanding of the differences between the CRF01_AE envelopes and envelopes from group M presenting a serine at position 375 will provide a better knowledge about the functionality of the envelope glycoproteins. Among other things, it would be possible to identify the mechanisms involved in conformational changes of glycoproteins as well as those involved in the escape of envelope recognition by Env specific antibodies. Moreover, these possible differences in CRF01_AE envelopes could be exploited for the development of different vaccine approaches.

Les mutations de résistance génotypiques constituent un problème majeur pour l’optimisation du traitement antirétroviral chez les patients infectés par le VIH-1 naïfs au traitement ou prétraités. Cependant, l’analyse de l’impact des mutations sur la réponse au traitement est compliquée par i) le nombre élevé de mutations, ii) la colinéarité possible entre ces mutations, iii) le faible nombre de patients inclus dans les études et iv) la définition du critère de jugement. Les objectifs de cette thèse sont 1) de donner une vue d’ensemble et de discuter, en collaboration avec le réseau européen NEAT (European AIDS treatment network), les critères de jugement utilisés dans les essais cliniques récents et ceux utilisés lors de l’analyse des mutations de résistance, 2) d’évaluer l’impact des mutations génotypiques sur la réponse au traitement chez les patients naïfs dans le cadre d’une grande collaboration Européenne (EuroCoord-CHAIN) et 3) de comparer des méthodes adaptées pour les données à haute-dimension dans le but de construire un score génotypique pour la prédiction de la réponse virologique chez les patients prétraités. Les critères de jugement composites sont les plus utilisés dans les essais cliniques récents mais un critère purement virologique devrait être utilisé pour l’analyse de l’impact des mutations génotypiques. Les mutations de résistance transmises impactent sur la réponse à la première ligne de traitement si le traitement antirétroviral n’est pas adapté au génotype du virus du patient. L’analyse en composantes principales et l’analyse partial least square avaient une bonne capacité à prédire la réponse virologique mais n'étaient guère meilleures que le score génotypique. Nous allons continuer à travailler sur la comparaison de ces méthodes utilisant des critères de jugement différents dans le cadre de notre collaboration avec le Forum for collaborative HIV research. / Genotypic resistance mutations are a major concern for antiretroviral treatment optimisation in HIV-1 infected treatment naïve and treatment experienced patients. However, the analysis of the impact of genotypic mutations on treatment outcome is hampered by methodological issues such as the i) high number of possible mutations, ii) the potential collinearity between mutations, iii) the low number of patients included in those studies and iv) the definition of a virological endpoint. The objective of this thesis are 1) to give an overview and to discuss endpoints used in recent clinical trials in collaboration with European AIDS treatment network (NEAT) and those used in the context of drug resistance analysis, 2) to investigate the impact of genotypic resistance mutations on treatment outcome in treatment naïve patients in a huge European collaboration EuroCoord-CHAIN and 3) to compare methods adapted for high-dimensional data in order to construct a genotypic score to predict treatment outcome in treatment experienced patients. We saw that most of the endpoints used in recent clinical trials are composite endpoints but pure virological outcomes should be used for the evaluation of drug resistance mutations. Transmitted drug resistance mutations impact on virological outcome of initial antiretroviral therapy if the treatment of the patient is not adapted to the viral genotype the patient is harbouring. Principal component analysis and partial least square showed a good performance but had only a slightly better predictive capacity for a virologal outcome compared to the genotypic score. We continue working on the comparison of these and other methods using different endpoints in the context of a collaboration with the Forum for collaborative HIV research.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.

La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection opportuniste la plus répandue chez les patients infectés au VIH-1. Un modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) exprimant une partie du génome du VIH-1 (CD4C/HIVMutA) est maintenant disponible. Grâce à ce modèle, il est possible d’étudier les perturbations quantitatives et fonctionnelles des macrophages exprimant les gènes nef, rev et env du VIH-1 dans le contexte d’une COP. Cette étude démontre que la présence du transgène n’influence pas le pourcentage des macrophages dans la muqueuse buccale et le petit intestin, malgré le fait que la charge buccale de C. albicans soit significativement plus élevée chez les souris Tg. Cependant, l’expression du transgène cause une diminution de la production de H2O2 par les macrophages, ainsi que l’augmentation de la production de la cytokine proinflammatoire IL-6 et de la chimiokine MCP-1. / Oro-pharyngeal candidiasis (OPC) is the most common opportunistic infection in HIV-1 infected patients. An OPC model using transgenic mice (CD4C/HIVMutA) expressing selected genes of the HIV-1 genome is now available. Using this model, it is now possible to study potential quantitative and functional disturbances in macrophages expressing the nef, rev and env genes of HIV-1 in the context of OPC. This study shows that transgene expression does not affect quantitative percentage values of macrophages in the oral mucosa and the small intestine, although burdens of C. albicans loads are increased in Tg mice. Transgene expression does induce diminished H2O2 production in macrophages, while increasing production of the proinflammatory cytokine IL-6 and the chemokine MCP-1.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the causative agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Viral strains that are resistant to antiretroviral agents used for the treatment of HIV-1 infected patients rapidly emerge. It is thus important to study the viral replication cycle in order to discover new targets for the development of novel agents against HIV-1. Translation of structural proteins and viral enzymes is a key step of the viral replication cycle. These proteins are translated from the HIV-1 full-length mRNA during late stages of the replication. This mRNA can be translated by a cap-dependent mode which is used by the majority of cellular mRNAs. However, since its 5’ untranslated region (5’UTR) contains an internal ribosome entry site (IRES) that we call IRES5’UTR, it can also be translated by an IRES-dependent mode. The IRES-dependent mode enables the full-length mRNA to be translated when the cap-dependent mode is impaired. The activity of the IRES5’UTR is weak in physiological conditions, but it is stimulated when the cell cycle is arrested at the G2/M transition, an arrest induced by HIV-1 infection. A large portion of this IRES, which we name IRES5’UTRc, is present in all HIV-1 mRNAs and its activity is similar to the activity of the complete IRES, which indicates that the IRES-dependent mode can be used by all HIV-1 mRNAs. During my doctoral studies, I investigated how the HIV-1 IRES5’UTR functions. I transfected Jurkat T cells, a lymphocytic cell line derived from the natural target cells of HIV-1, with a dual-luciferase reporter containing the coding sequences of the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) separated by the complete 5’UTR of the HIV-1 full-length mRNA. Translation of Rluc is cap-dependent while translation of Fluc depends on HIV-1 IRES5’UTR. First, I performed a mutational analysis and I discovered three regions that stimulate the activity of IRES5’UTR and a stem-loop that represses its activity, which we named IRENE (IRES negative element). I showed that the repression induced by IRENE is relieved when cells are exposed to oxidative stress, a type of stress caused by HIV-1 infection. We propose that IRENE maintains the IRES5’UTR in a weakly active conformation in physiological conditions. It is known that IRESes are activated by cellular factors, called ITAFs (IRES trans-acting factors). We propose that the IRES5’UTR adopts an active conformation triggered by the binding of an ITAF that is expressed or relocalized during oxidative stress. These results generated a publication (Gendron et al. Nucleic Acids Research, 2011, 39, 902-912). I then decided to study the effect of the viral protein Tat on the IRES5’UTR activity. In addition to its essential role in the transcription of HIV-1 mRNAs, Tat stimulates the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs by interfering with the inhibition of a canonical initiation factor, eIF2, induced by the protein kinase modulated by double-stranded RNA (PKR) and by unwinding the TAR structure present at the 5’end of all HIV-1 mRNAs. Tat also affects the expression of several cellular genes. I showed that the Tat86 and Tat72 isoforms, but not Tat101, stimulate the activity of the IRES5’UTR. This effect is independent of PKR and TAR, but appears to be dependent upon the conformation of Tat. We suggest that Tat could activate a transcription factor that controls the expression of an ITAF of the IRES5’UTR or else that Tat could directly activate such an ITAF. I also showed that PKR stimulates the IRES5’UTR activity, which is surprising since PKR is an antiviral protein. This effect is independent of the inhibition of eIF2 by PKR and could result from the activation of an ITAF. Knowing that IRES5’UTRc, an active portion of IRES5’UTR is present in all HIV-1 RNAs, our hypothesis is that the stimulation of the IRES activity by PKR would allow Tat mRNA to be translated in the beginning of the replication cycle. This would subsequently allow the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs to proceed, which is stimulated by Tat. These results generated a manuscript that is submitted for publication to RNA. Altogether, my results, coupled to data from literature, lead me to conclude that, in the late phases of the replication cycle, the activity of the HIV-1 IRES5’UTR is stimulated by oxidative stress, by the cell cycle arrest in G2/M and by the presence of high amounts of Tat, while cap-dependent translation is impaired. The IRES5’UTR would thus be critical to translate the HIV-1 full-length mRNA. Consequently, the IRES5’UTR would constitute a very interesting target for the development of novel anti-HIV agents.