Ovinos são considerados reservatórios de Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC). Este estudo pesquisou amostras de 100 carneiros no Estado de São Paulo. PCR foi empregada para detecção de stx1, stx2, eae, ehx, e intiminas. RFLP-PCR foi realizado para identificação das variantes de stx1/stx2 e fliC. Cinco isolados eae+stx- de sorotipos O128:H2, O145:H2, O153:H7 e O178:H7 apresentaram intiminas b, g e e. Cinqüenta e seis STEC foram obtidos e os genótipos foram stx1cstx2d-O118 (56,1%), stx1c (33,3%), stx2d-O118 (7,6%), e stx1cstx2dOX3a (3%). Os sorotipos mais freqüentes foram ONT:H8, ONT:H-, O75:H-, O174:H8 e O5:H-. Gene fliC codificando para H2, H8, H14, H16, H19, H21 ou H28 foi identificado em 25/33 isolados. ehx foi detectado em três/cinco EPEC Atípicas e em 38 (57,6%) STEC. Sensibilidade aos antimicrobianos foi observada em 77,2% dos isolados STEC. A análise da similaridade genética por PFGE revelou 24 perfis entre 40 isolados STEC e EPEC atípicas. O estudo demonstrou que ovinos saudáveis podem se comportar como reservatórios de STEC e EPEC atípica. / Lambs are reported as carriers of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) worldwide. This study surveyed 100 sheep in São Paulo, Brazil. PCR was used for detection of stx1, stx2, eae, ehx, and intimins. RFLP-PCR investigated the stx1/stx2 variants and flagellar antigen (fliC). Five isolates were eae+/stx-, belonging to serotypes O128:H2, O145:H2, O153:H7 and O178:H7, harboring b, g and e intimins. Fifty-six STEC isolates were recovered, and stx genotypes were stx1cstx2d-O118 (56.1%), stx1c (33.3%), stx2d-O118 (7.6%), and stx1cstx2dOX3a (3%). A diversity of STEC serotypes was observed, but most frequent were ONT:H8, ONT:H-, O75:H-, O174:H8 and O5:H-. fliC gene coding for H2, H8, H14, H16, H19, H21 or H28 was identified in 25/33 isolates. ehx gene was detected in three Atypical EPEC and in 38 (57,6%) STEC. Fifty-one (77.2%) STEC were susceptible to antimicrobials tested. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) revealed 24/40 profiles. The study showed that healthy ovine can be carrier of STEC and atypical EPEC in Brazil.

Haemophilus parasuis é o agente etiológico da Doença de Glässer, que causa artrite, pneumonia, meningite e poliserosite em suínos e tem assumido grande importância na suinocultura moderna, uma vez que sua ocorrência tem aumentado significativamente nos últimos anos em rebanhos afetados pelo circovirus suíno tipo 2. No presente estudo foram avaliadas 117 amostras de H. parasuis isoladas dentre os anos de 2009 a 2014, isoladas de suínos de diferentes estados do da região Centro-Sul do Brasil. As estirpes foram submetidas à sorotipificação, confirmação do gênero/espécie pela PCR, o perfil de resistência a antimicrobianos foi avaliado através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM), foi realizada a caracterização genotípica das amostras por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) e por sequenciamento de múltiplos sítios (multilocus sequence typing - MLST) e a presença de genes de virulência vtaA foi analisada. Os sorotipos mais frequentes foram: 4 (21,3%), seguido do 5 (12,9%), do 13 (9,4%), do 14 (7,7%) e do sorotipo 1 (1,7%), e em alguns casos mais de um sorotipo foi identificado na mesma granja e até no mesmo animal, resultado este parecido ao encontrado no restante do mundo. Em todas as amostras o gene vtaA estava presente, para alguns antibióticos os índices de resistência foram elevados, como para tilosina (98,29%), danofloxacina (95,72%), sulfadimetoxina (88,03%), penicilina (77,7%) e a multirrestencia atingiu o índice alarmente de 93,16% das estirpes. Foram identificados 67 perfis diferentes no PFGE e das 9 amostras analisadas pelo MLST foram identificados novos STs, até então, não descritos mundialmente. Quando os novos STs foram comparados com os previamente descritos, estas se dispersaram entre as descritas em diferentes países. Neste estudo foi possível observar que as estirpes de H. parasuis brasileiras possuem alta variabilidade, tanto nos sorotipos, perfis de resistência, análises genômicas de PFGE e MLST / Haemophilus parasuis is the etiological agent of Glässer disease that causes arthritis, pneumonia, meningitis and polyserositis in pigs and has assumed great importance in modern swine production, since its occurrence has increased significantly in recent years in herds affected by porcine circovirus type 2. In the present study 117 strains of H. parasuis isolated between 2009 to 2014 were utilized, isolated from pigs of south center of Brazil. The strains were serotyping, confirmed genus/species by PCR, the antimicrobial resistance profile was evaluated determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and strains were genotypically characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) and presence of vtA virulence gene. The major serotypes identified were 4 (21.3%), 5 (12.9%), 13 (9.4%), 14 (7.7%) and at last the 1 (1.7%), In some cases more than one serotype was identified in the same farm and in the same animal, this results were identified in others parts of the world. All samples had vtA gene. The resistance for some antibiotics was high for tylosin (98.29%), danofloxacin (95.72%) sulfadimetoxin (88.03%), and penicillin (77.7%). Multidrug resistance rates reached 93.16% of the samples. A total of 67 different profiles were identified in PFGE and nine samples were analyzed by MLST. All nine strains tested were identified as new STs. When these strains were compared with MLST database, they were dispersed among the strains from other countries. In this study, it was clear that the Brazilian H. parasuis strains are highly variable considering serotypes, resistance profiles, genomic analysis of PFGE and MLST

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico que infecta preferencialmente tecidos queratinizados, e é o agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de dermatofitoses humanas. Recentemente, este fungo tornou-se a causa de infecções profundas e generalizadas em pacientes imunocomprometidos. As estratégias terapêuticas para controlar esse tipo de infecção apresentam várias limitações, como o aparecimento de linhagens resistentes e o número restrito de alvos celulares disponíveis. Novas estratégias terapêuticas são necessárias, sendo o foco de muitas investigações. Acriflavina é uma droga citotóxica com atividade antifúngica envolvida na inibição da topoisomerase. Embora seja um composto intercalante de DNA, já foi relatada a super expressão de genes que codificam enzimas envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e no transporte de ferro em resposta a esta droga, sugerindo um amplo espectro de efeitos celulares. A fim de melhor compreender seus efeitos moleculares, o objetivo deste trabalho foi avaliar o transcriptoma de T. rubrum em resposta a acriflavina. Os perfis transcricionais em resposta a esta droga foram analisados utilizando a metodologia de RNA-seq empregando o sequenciamento em larga escala SOLiD System. Foram comparadas quatro bibliotecas sendo uma o cultivo de T. rubrum em meio Sabouraud e três períodos de exposição à droga: 3 horas, 12 horas e 24 horas. Foram geradas aproximadamente 200 milhões de reads, as quais foram filtradas e alinhadas no genoma de T. rubrum disponível no Dermatophyte Comparative Database Broad Institute utilizando os algoritmos Bowtie e Tophat. As reads alinhadas foram processadas utilizando os algoritmos Cufflinks e Cuffdiff para estimar a abundancia dos transcritos e testar os genes diferencialmente expressos entre o controle e as condições de exposição à droga. Foram identificados 3.153 genes diferencialmente expressos. Após o estabelecimento de critérios mais estringentes, foram selecionados 490 genes diferencialmente expressos em resposta à droga. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares como reações de oxidação e redução, transporte transmembrana, transporte de íons e metais e a patogenicidade. Os genes envolvidos com patogenicidade foram reprimidos, sugerindo que a droga interfira com processos importantes para instalação e manutenção da infecção no hospedeiro. Outros fatores de virulência como genes envolvidos no ciclo do glioxilato, também foram reprimidos pela droga. Além disso, genes da via de biossíntese do ergosterol foram reprimidos pela droga, o que constitui um provável novo mecanismo de ação de acriflavina. Os resultados obtidos nesta análise em larga escala contribuem com a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na adaptação ao estresse em dermatófitos e podem auxiliar o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Além disso, estes resultados contribuem com a anotação do genoma e transcritoma de T. rubrum e outros dermatófitos. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is an anthropophilic filamentous fungus that infects keratinized tissues and is the most common etiologic agent isolated in cases of human dermatophytoses. Recently, it has become the cause of deep and widespread infections in immunocompromised patients. Therapeutic strategies to control these infections have several limitations, such as the appearence of resistant strains and the limited number of antifungal cellular targets. New therapeutic strategies are necessary, being the focus of many investigations. Acriflavine is a cytotoxic drug with antifungal activity involved in topoisomerase inhibition. Although it presents DNA intercalating properties, it has already been reported the over-expression of genes coding for enzymes involved in mitochondrial respiratory-electron transport and in iron transport in response to this drug, suggesting a broad spectra of cellular effects. In order to better understand its molecular effects we evaluated T. rubrum transcriptome in response to acriflavine in a time-course assay using the next generation sequencing technology SOLiD System. RNA-seq was performed comparing T. rubrum growth in Sabouraud medium as the control and the three periods of drug exposure, 3h, 12h, and 24h. RNA-seq generated approximately 200 million short reads that were mapped to the Broad Institutes Dermatophyte Comparative Database using Bowtie and TopHat algoritms. Differential gene expression analysis was performed using Cufflinks and Cuffdiff. It was identified 3,153 differentially expressed genes. A more stringent cut-off threshold was established and this analysis revealed a subset of 490 genes modulated in response to the stress caused by exposure of T. rubrum to acriflavine. These genes are involved in various cellular processes such as oxidation-reduction reactions, transmembrane transport, metal ion binding, and pathogenicity. The genes involved in pathogenicity were down-regulated, suggesting that this drug interferes with virulence factors that allow the development of infection and persistence of the dermatophyte in the host. Other virulence factors such as genes involved in the glyoxylate cycle were also repressed by the drug. Moreover, genes involved in ergosterol biosynthesis pathway were down-regulated by the drug and may constitute a new mechanism of action of acriflavine. The results obtained in this large scale analysis provide insights into the molecular mechanisms underlying the responses of T. rubrum to stress conditions and may aid the development of new antifungal drugs. Furthermore, these results contribute to improve gene annotation and open reading frame prediction for T. rubrum and other dermatophyte genomes and transcriptomes.

Streptococcus mutans (S. mutans) é considerado o principal agente etiológico da cárie dentária e estudos acerca de sua virulência têm sido realizados com o intuito de compreender melhor os mecanismos de patogenia da doença. Dentre outros fatores, a virulência dessa espécie bacteriana está relacionada a sua habilidade em produzir proteína ligante de glucano tipo A (GbpA) e mutacinas, proteínas que desempenham importante papel na adesão celular e colonização da superfície dentária. Desta forma, o objetivo da presente pesquisa foi analisar, geneticamente, esses fatores de virulência de S. mutans e verificar sua relação com a persistência e transmissão de genótipos entre os membros de oito famílias brasileiras. Foram utilizados 392 isolados clínicos de S. mutans obtidos a partir da saliva de 20 indivíduos adultos cárie-ativos. Os microrganismos foram previamente identificados e genotipados em um estudo anterior que avaliou sua transmissibilidade e estabilidade ao longo do tempo. As amostras estocadas a -86°C foram reativadas por semeadura em diferentes meios de cultura (ágar sangue e ágar Mitis Salivarius Bacitracina Sacarose) e repicadas em caldo de Infusão de Cérebro e Coração. Após extração do DNA cromossômico bacteriano foram realizadas análises genético-moleculares, por meio da reação em cadeia da polimerase, visando a detecção nas amostras dos genes envolvidos na produção de GbpA (gbpA) e codificadores dos tipos I, II, III e IV de mutacinas (mutAI, mutAII, mutAIII e mutAIV). Os dados obtidos foram analisados por meio das estatísticas descritiva e inferencial, utilizando-se os testes de Qui Quadrado, Odds Ratio (OR) e exato de Fisher, a um intervalo de confiança de 95% (IC95%) e nível de significância de 5%. Os genes gbpa, mutAI, mutAII, mutAIII e mutAIV foram detectados, respectivamente, em 77,3%, 12,5%, 51%, 16,6% e 89,8% dos isolados de S. mutans considerados viáveis (N=392). A virulência do S. mutans apresentou associação com sua transmissão (P<0,001) e estabilidade (P=0,011), sendo que os genótipos mais virulentos apresentaram aproximadamente três vezes mais chance de serem transmitidos (OR=3,07; IC95% 2,02 - 4,66) e aproximadamente duas vezes mais chance de persistirem na cavidade bucal dos indivíduos (OR=2,06; IC95% 1,17 - 3,63) do que os menos virulentos. Apesar da prevalência dos genes mutAI (P<0,001) e mutAIII (P<0,001) terem sido diferentes entre os genótipos de S. mutans transmitidos e não transmitidos, não houve associação (P=0,357) entre a experiência de cárie dentária das crianças e a virulência dos genótipos adquiridos. Os resultados sugerem que os genótipos dotados de informação genética para sintetizar GbpA e mutacinas apresentam importante vantagem ecológica no processo de colonização por S. mutans, mantendo-se estáveis na microbiota bucal do hospedeiro e favorecendo a transmissão intrafamiliar. / Streptococcus mutans (S. mutans) is the main etiologic agent in the development of dental caries and several studies about its virulence have been conducted to understand the mechanisms of disease pathogenesis. Among other factors, the virulence of this bacterial species is based on their ability to produce glucan-binding protein-A (GbpA) and mutacins, proteins that play an important role in cell adhesion and colonization of the dental surface. Thus, the aim of the present study was to analyze, genetically, these virulence factors of S. mutans and to investigate their relation with the persistence and transmission of genotypes among the members from eight Brazilian families. A total of 392 clinical isolates of S. mutans, collected from 20 caries-active adults, were utilized. These microorganisms were previously identified and genotyped in a study that evaluated their transmissibility and stability over time. The samples stored at -86°C were plated on different culture media (blood agar and Mitis Salivarius Sucrose Bacitracin agar) and grown in Brain Heart Infusion broth. After extraction of bacterial chromosomal DNA, the samples were amplified, by the technique of polymerase chain reaction, for the presence of genes coding for GbpA (gbpA) and for mutacins types I, II, III and IV (mutAI, mutAII, mutAIII and mutAIV). Data obtained were analyzed through descriptive and inferential statistics, using the Chi-Square, Odds Ratio (OR) and Fisher\'s exact tests, with a 95% confidence interval (95%CI) and a significance level of 5%. The gbpa, mutAI, mutAII, mutAIII and mutAIV genes were detected, respectively, in 77.3%, 12.5%, 51%, 16.6% and 89.8% of viable clinical isolates (N=392). The virulence of S. mutans was associated with the transmission (P<0,001) and stability of colonization (P=0.011). The most virulent genotypes showed approximately three times more likely to be transmitted (OR=3.07; 95%CI 2.02 - 4.66) and approximately two times more likely to persist in the oral cavity (OR=2.06; 95%CI 1.17 - 3.63) than the less virulent genotypes. Despite the prevalence of genes mutAI (P<0.001) and mutAIII (P<0.001) have been different between the genotypes of S. mutans transmitted and no transmitted, there was no association (P=0.357) between the experience of dental caries of children and the virulence of the acquired genotypes. The results suggest that the genotypes with genetic information to synthesize GbpA and mutacins can represent an important ecological advantage in the process of colonization by S. mutans, remaining stable in the oral microbiota of the host and favoring an intrafamilial transmission.

Os objetivos desta pesquisa foram observar a incidência de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica clásssica (EPEC) e E. coli invasora (EIEC) em alimentos e estudar algumas de suas propriedades. Foram estudadas 360 amostras de alimentos, de origem animal e vegetal, das quais foram isoladas 1351 cepas diferentes de E.coli. Todas foram sorotipadas para investigação daquelas pertencentes aos sorogrupos enteropatogênicos clássicos, e as cepas imóveis e lisinadescarboxilase negativas sorotipadas para identificação daquelas pertencentes aos sorogrupos invasores. A capacidade de produção das enterotoxinas LT e ST de todas as cepas de E. coli foi também investigada. As amostras patogênicas isoladas corresponderam a 1,6 do total de cepas de E.coli estudado. Os alimentos de onde foram isolados representaram 4,2% do total de amostras de alimentos estudados e 5,2% das amostras de alimentos contendo E. coli. Não foram isoladas amostras de EIEC nas amostras de alimentos estudadas. As amostras de EPEC isoladas pertenceram aos sorogrupos 026 e 0125. Entre as amostras de ETEC isoladas predominaram aquelas produtoras somente da toxina LT, não tendo sido isoladas amostras capazes de produzir as toxinas LT e ST simultaneamente. Nenhuma das amostras de ETEC pertenceu aos sorogrupos enterotoxigênicos mais frequentes, nem possuiu os fatôres de colonização CFA/I e CFA/II. No teste de resistência a drogas, a maioria das amostras enteropatogênicas mostrou-se sensível às drogas utilizadas. O modelo de fermentação de açúcares foi relativamente uniforme entre estas amostras, e bastante semelhante ao apresentado pelo gênero Escherichia. / The objectives of this research work were to study the incidence of enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic. E.coli (EPEC) and invasive E. coli (EIEC) in foods, and to study some of their properties. 360 food samples, both of animal and plant origin, were studied and 1351 different E. coli strains were isolated. All of them were serotyped in order to identify those belonging to the serogroups enteropathogenic for children (EPEC). The strains which were non-motile and lysine descarboxylase negative were serotyped for the identification of those belonging to invasive serogroups. The capacity of all strains in producing enterotoxins ST and LT was also investigated. The isolated pathogenic strains corresponded to 1,6% of the E. coli strains tested. The foods from which they were isolated represented 4,2% of the total of food samples tested, and 5,2% of the food samples showing contamination with E. coli. No invasive strain was observed in the food samples tested. The isolated EPEC strains belonged to serogroups 026 and 0125. There was a prevalence of enterotoxin LT only producing strains among the ETEC ones, and no strain able to produce both enterotoxins LT and ST simultaneously was observed. None of them belonged to the usual enterotoxigenic serogroups, nor had colonization factors CFA/I and CFA/II. The antibiotic resistence test showed that the majority of pathogenic strains were sensitive to the drugs employed. The sugar fermentation model was relatively uniform among these strains, and very smilar to the one showed by the genus Escherichia.

Orientador: Renata de Oliveira Mattos Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_LiviaAraujo_M.pdf: 2021430 bytes, checksum: 07a84279508cd84bfef41550d34e6ca7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Streptococcus mutans (SM) é um patógeno oral da cárie dentária e endocardite infecciosa. Para se estabelecer no hospedeiro, SM precisa se adaptar às condições biofísicas e aos fatores de defesa do hospedeiro. Para isto, SM utiliza sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC). Dois SDCs, VicRK e CovR, são associados à virulência de SM. O objetivo deste trabalho foi investigar a participação dos reguladores de transcrição gênica VicRK e CovR na evasão de SM ao sistema complemento e fagocitose. Dessa forma, a marcação pelo complemento foi comparada entre os mutantes vicK- e covR- obtidos da cepa SM UA159 (UAvic e UAcov, respectivamente) e UA159, através da incubação com soro humano a 20% ou soro humano livre de C1q (30 min, 37 ?C, 10% CO2). A deposição de C3b sobre a superfície de SM foi analisada também nas cepas cultivadas em meio com 0,1% de sacarose. A quantidade de C3b nas superfícies bacterianas foi determinada através de reações com anticorpos IgG de cabra anti-C3 humano conjugado com FITC e análise de citometria. Bactérias incubadas com PBS foram usadas como controle negativo. O reconhecimento das cepas de SM por anticorpos séricos opsonizantes foi realizado com anticorpos anti-IgG humano conjugado com FITC e anti-IgM humano conjugado com APC. Para análise da fagocitose, as mesmas cepas coradas com FITC foram incubadas com neutrófilos (PMN) por 5 e 30 min. na presença ou ausência de soro humano a 20%; o número de PMN com bactérias fagocitadas foi determinado por citometria de fluxo. A deposição de C3b foi menor em UAcov (10,86%) e em UAvic (7,6%), comparado à UA159 (23,5%). Na presença de sacarose, a marcação por C3b caiu para 10,86% em UA159, e para os mutantes UAcov e UAvic foi reduzida a 6,6 e 3,96%, respectivamente (ANOVA p<0,001). Os mutantes UAcov e UAvic foram menos reativos contra anticorpos IgG e IgM. A fagocitose por PMN foi reduzida em UAcov e UAvic em cerca de 50 a 60% em relação à UA159 nos tempos de 5 e 30 min. (ANOVA p< 0,005). Assim, a inativação dos sistemas VicRK e CovR reduz significativamente a deposição de C3b do complemento e a frequência de fagocitose de SM, indicando que estes SDC regulam genes envolvidos no escape à opsonização pelo complemento / Abstract: Streptococcus mutans (SM) is an oral pathogen of dental caries and infective endocarditis. To get established in host sites, SM needs to adapt to biophysical conditions and host defense factors. To this purpose, SM applies transcriptional regulatory systems of two components (SDC). Two SDCs, VicRK and CovR, have been implicated in SM virulence. The aim of this study was to investigate the role of VicRK and CovR on SM evasion from complement system and phagocytosis by neutrophils (PMN). Thus, complement deposition was compared between vicK- and covR- mutants obtained strain UA159 (UAvic and UAcov, respectively) and the parent UA159 exposed to 20% human serum or human serum depleted of C1q (30 min, 37ºC, 10% CO2). Deposition of C3b on SM surfaces was also analyzed in strains cultivates in the presence of 0.1% sucrose. The amount of C3b on the bacterial surface was determined by reactivity with goat IgG antibody anti-C3 conjugated FITC and flow cytometry analysis. Bacteria incubated with PBS were used as negative control. The reactiveness of SM strains with human serum antibodies was quantified by flow citometry with anti- human IgG- FITC and anti- human IgM-APC antibodies. For analysis of phagocytosis, the strains stained with FITC were incubated with PMN during 5 and 30 min. in the presence or absence of 20% human serum; the number of internalized bacteria by PMN was determined by flow cytometry. The deposition of C3b on UAcov (10.86 %) and UAvic (7.6%) was lower, compared to UA159 (23.5%) (ANOVA p<0,001). In the presence of sucrose, C3b deposition decreased to 10.86 % in UA159, and to 6.6 and 3.96% in UAcov and UAvic , respectively (ANOVA p < 0.001). The UAcov and UAvic mutants were less reactive with IgG and IgM antibodies. The phagocytosis by PMN was 50 to 60% reduced in UAcov and UAvic compared to UA159, respectively at times 5 and 30 min. (ANOVA p < 0.005). Thus, inactivation of CovR and VicRK TCS systems significantly reduces deposition of complement C3b and phagocytosis by PMN in a serum-dependent way, indicating that these SDC regulate genes involved in the evasion of complement to opsonization / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestra em Biologia Buco-Dental

Orientador: Renata de Oliveira Mattos-Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:04:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vizoto_NataliaLeal_M.pdf: 1501643 bytes, checksum: 855281de051e36237ad28b6d3f428f1b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Streptococcus mutans é o principal patógeno da cárie dental em humanos, por ser capaz de se acumular no biofilme dentário principalmente na presença de sacarose e produzir e tolerar grandes concentrações de ácidos, os quais causam a desmineralização dos dentes. Além disto, S. mutans pode estar associado à etiologia da endocardite bacteriana, doença cuja evolução envolve a formação de biofilmes em válvulas cardíacas lesadas. S. mutans expressa diversas proteínas de superfície envolvidas na adesão e acúmulo bacteriano em biofilmes. Estas incluem as glucosiltransferases (codificadas por gtfB, gtfC e gtfD), as quais sintetizam glucanos extracelulares a partir da sacarose, e as proteínas ligantes de glucano (codificadas por gbpA, gbpB, gbpC e gbpD). Os genes gtfB/C/D, gbpB/C são controlados diretamente pela proteína reguladora CovR. Em diversas espécies patogênicas de Streptococcus, como Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae, CovR compõe o sistema regulador de transcrição de dois componentes CovRS (Cov, de control of virulence), o qual regula diversos genes de virulência. Em S. mutans, CovR foi identificado como um regulador órfão pois o gene que codifica o receptor de membrana cognato não foi identificado no mesmo locus gênico de covR. Em S. mutans, CovR regula diversos genes envolvidos na formação de biofilmes (gtfB/C, gbpC e gbpB), na biossíntese do envelope celular e na resposta a estresses. Os estímulos que ativam CovR em S. mutans ainda não são conhecidos. O presente projeto visa caracterizar a participação de CovR na resposta de S. mutans ao contato com a saliva e sangue humano. Para isto, uma cepa knock-out de covR- foi comparada com a respectiva cepa selvagem quanto ao crescimento e/ou sobrevida em saliva e sangue de voluntários saudáveis. O efeito da exposição à saliva na expressão dos genes regulados diretamente por CovR também foi avaliado / Abstract: Streptococcus mutans is the main pathogen of dental caries in humans, because it can accumulate in the biofilm in the presence of sucrose and produce and tolerate high concentrations of acids, which cause demineralization of teeth. Moreover, S. mutans is involved in the etiology of bacterial endocarditis, a disease whose evolution involves the formation of biofilms on damaged heart valves. S. mutans expresses several surface proteins involved in bacterial adhesion and accumulation in biofilms. These include the glucosiltransferases (gtfB, gtfC and gtfD), which synthesize extracellular glucans from sucrose, and glucan binding proteins (encoded by gbpA/B/C/D). The genes gtfB/C/D, and gbpB/C are directly controlled by the regulatory protein CovR. In several pathogenic species of Streptococcus, such as S. pyogenes and S. agalactiae, CovR is the transcriptional regulator that compose the two-component system CovRS (Cov for control of virulence), which regulates several virulence genes. In S. mutans, CovR was identified as an orphan regulator, because the gene encoding its cognate membrane receptor was not identified at the same locus of covR. In S. mutans, CovR regulates several genes involved in biofilm formation (gtfB/C, and gbpB/C), in biosynthesis of the cell envelope and in stress responses. The stimuli which activate CovR in S. mutans are not yet known. This project aims to characterize the participation of CovR in S. mutans response to contact with saliva and blood. To this purpose, a knock-out mutant of covR was compared with parent strain regarding growth and/or survival in human saliva and blood. The effect of exposure to saliva in the expression of genes directly by covR was also analyzed / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Wander José da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-20T13:31:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_LeticiaMachado_M.pdf: 2717766 bytes, checksum: fc9c2fda8a63938d55e0dc22f2155635 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os materiais reembasadores para próteses dentais removíveis, após a exposição à cavidade bucal, apresentam alterações estruturais que facilitam a colonização por espécies de Candida. Neste contexto, o ácido undecilênico (AUD) tem sido incorporado na formulação deste material na tentativa de reduzir o desenvolvimento de biofilmes fúngicos. No entanto, concentrações de AUD liberadas pelo material reembasador e os efeitos destas sobre o desenvolvimento dos biofilmes de Candida ainda não foram elucidados. Por isso, a proposta deste estudo foi investigar a cinética de liberação do AUD a partir do material reembasador e avaliar o efeito deste sobre o desenvolvimento de biofilmes de C. albicans ou C. glabrata. Inicialmente, simulou-se in vitro a liberação do AUD na cavidade bucal através da imersão de corpos de prova de material reembasador (10 mm x 2 mm) em saliva artificial, sendo o produto da liberação quantificado através de cromatografia gasosa. Em seguida, a suscetibilidade de um isolado de referência e dois isolados clínicos de C. albicans (ATCC 90028, P01 e P34) e C. glabrata (ATCC 2001, P11 e P31) ao AUD foi investigada através da concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima (CFM) e tempo de morte celular (time-kill). Para avaliar o efeito do AUD sobre os biofilmes de Candida, películas de saliva foram formadas na superfície de corpos de prova de material reembasador contendo AUD (grupo experimental) ou não (controle) e, em seguida, biofilmes dos isolados citados foram formados sobre estas superfícies. Nos períodos de adesão, 24, 48 e 72 h de desenvolvimento dos biofilmes, foram realizadas análises de contagem celular através de diluição decimal seriada; de atividade metabólica através da redução mitocondrial do XTT; de estrutura dos biofilmes através da microscopia confocal a laser; e secreção enzimática de proteinases e fosfolipases através de métodos colorimétricos. Os dados foram submetidos à análise de variância seguida de teste de Tukey com nível de significância de 5%. As concentrações de AUD liberadas pelo material reembasador estavam dentro dos intervalos de CIM e CFM encontrados para todos os isolados avaliados. Pelo teste de time-kill foi possível observar que na CIM, o AUD teve ação fungistática por até 8 horas de exposição, para todos os isolados investigados. A presença de AUD não alterou a contagem celular, atividade metabólica, estrutura dos biofilmes e secreção enzimática nos estágios iniciais de colonização (adesão e 24 h) para ambas as espécies investigadas (p > 0.05). A exposição ao AUD resultou em menor contagem celular (p < 0.05) e atividade metabólica (p = 0.001) para os biofilmes maduros (48 e 72 h) de C. albicans, embora alterações estruturais e de secreção enzimática não foram identificadas (p > 0.05). Em contraste, biofilmes maduros de C. glabrata apresentaram maior quantidade de células (p = 0.004), atividade metabólica (p < 0.001) e secreção de proteinases no grupo experimental (p < 0.001). Considerando as limitações deste estudo, pôde-se concluir que a liberação de AUD pelo material reembasador não evitou a colonização de biofilmes de Candida / Abstract: After exposure to oral cavity, denture liners exhibit structural alterations which facilitate colonization by Candida species. In this context, undecylenic acid (UDA) has been incorporated into denture liner formulation in an attempt to reduce the development of fungal biofilms. However, released concentrations of UDA from denture liner and its effects on Candida biofilms have not yet been elucidated. Therefore, the purpose of this study was to investigate the UDA-released concentrations from denture liner and evaluate its effects on C. albicans or C. glabrata biofilms development. Initially, it was simulated, in vitro, the UDA-releasing at oral cavity by immersing specimens of denture liner (10 mm x 2 mm) in artificial saliva, and the released product was quantified by gas chromatography. Then, susceptibility tests of a reference strain and two clinical isolates of C. albicans (ATCC 90028, P01 and P34) and C. glabrata (ATCC 2001, P11 and P31) for UDA were performed by minimal inhibitory concentration (MIC), minimal fungicidal concentration (MFC) and time-kill assays. For evaluate the effects of UDA-released on Candida biofilms, specimens of denture liner containing UDA (experimental group) or not (control group) were saliva-coated and then, biofilms of mentioned strains were developed on such surfaces. At adhesion phase, 24, 48 and 72 h, developed biofilms had their cells counts analyzed by serial dilution; metabolic activity by XTT reduction assay; biofilm structure by confocal laser microscopy; and enzymatic activity of proteinases and phospholipases by colorimetric methods. Data were subjected by analysis of variance followed by Tukey test with a significance level of 5%. UDA-released concentrations from denture liner were within the ranges of MIC and MFC for all strains evaluated. Time-kill results demonstrated that UDA at MIC had a fungistatic behavior for at least 8 hours of exposition for all strains investigated. The presence of UDA did not alter the cell counting, metabolic activity, biofilm structure and enzymatic secretion in the early stages of colonization (adhesion and 24 h) for both species investigated (p > 0.05). At UDA exposure, mature biofilms (48 and 72 h) of C. albicans presented lower cell counts (p < 0.05) and metabolic activity (p = 0.001), although structural changes and enzymatic secretion were not identified (p > 0.05). In contrast, C. glabrata mature biofilms showed higher cell counts (p = 0.004), metabolic status (p < 0.001) and also high secretion of proteinases in the experimental group (p < 0.001). Within the limitations of this study, it could be concluded that UDA-released from DL did not avoid Candida biofilms colonization / Mestrado / Protese Dental / Mestre em Clínica Odontológica

O Staphylococcus aureus é um patógeno extremamente versátil tanto em termos de resistência a antimicrobianos quanto em virulência. O S. aureus resistente a oxacilina (ORSA) adquire a resistência a toda a classe de beta-Iactâmicos através de um cassete cromossômico (SCCmec) que carrega o gene mecA, mas pode carregar outros genes de resistência. A soma desses genes de resistência e de virulência torna o S. aureus um grave problema para hospitais do mundo inteiro, que nos últimos vem se estendendo também à comunidade. Foram estudados 50 isolados de ORSA, dentre os quais 15 pertencentes ao clone endêmico brasileiro (CEB) e 3 cepas SCCmec tipo IV isoladas entre 1995 e 1999. Adicionalmente, 32 amostras ORSA SCCmec tipo IV isoladas no Hospital de Clínicas de São Paulo. As amostras foram analisadas quanto ao perfil de sensibilidade a antimicrobianos, classificação do tipo de SCCmec, perfil de virulência quanto a toxinas e adesinas, classificação do grupo agr (locus regulatório dos genes de virulência) e sua funcionalidade, avaliação da expressão dos genes de toxinas e genotipagens por PFGE e MLST. Observou-se que as cepas CEB são multiresistentes. Já as cepas SCCmec IV apresentam um perfil de sensibilidade maior, uma vez que possuem um tipo de SCCmec que não carrega outros genes de resistência além do gene mecA. As amostras CEB SCCmec IV não apresentaram grandes diferenças no conteúdo de toxinas e adesinas. Apenas as cepas SCCmec IV isoladas entre 1995 e 1999 apresentaram um maior conteúdo de genes de virulência que as isoladas no HC. As cepas SCCmec IV isoladas no Brasil não são altamente virulentas como descrito em outros países. Não possuem fatores de virulência como a Leucocidina Panton-Valentine, toxinas exfoliativas e enterotoxinas. Por outro lado, possuem a alfa-hemolisina e a leucocidina LukD-LukE, toxina ainda pouco estudada, que vem sendo apresentada em pesquisas como causa de lesões oculares graves e diarréias pós-antibioticoterapia. Não foi possível estabelecer uma relação entre o tipo de agr e o perfil de virulência das cepas, uma vez que os perfis foram muito semelhantes mesmo entre cepas de grupos agr diferentes. / Staphylococcus aureus is an extremely successful pathogen for it is both highly resistant to antibiotics in addition to being virulent. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) acquires resistance to the beta-Iactam antibiotics through the acquisition of a chromosomal cassette (SCCmec) which carries the mecA gene, and can carry other resistance genes. The presence of these genes in S. aureus makes it a serious problem in hospitaIs worldwide. In spite of usually being restricted to the nosocomial environment, over the last few years MRSA has been spreading throughout the community. Fifty nosocomial MRSA strains were studied, including 15 belonging to the Brazilian endemic clone (BEC), 3 type IV SCCmec strains isolated between 1995-1999, and 32 type N SCCmec isolates from the \"Hospital de Clínicas (HC) de São Paulo\". The isolates were analyzed as to their susceptibility profile, SCCmec type, virulence and expression profile (toxins and adhesins), agr group classification and functionality, PFGE and MLST profiles. BEC isolates proved to be multiresistant to antibiotics. Type IV SCCmec strains presented a susceptibility profile to a number of drugs of different antimicrobial classes. BEC and type N SCCmec strains did not present significant differences in their virulence profiles. Only the type IV SCCmec strains isolated in 1995-1999 presented a greater virulence profile than those isolated in the HC. Type IV SCCmec strains isolated in Brazil were not highly virulent as described in other countries. Brazilian isolates usually do not possess virulence factors such as the Panton-Valentine leukocidin, exfoliative toxins and enterotoxins. On the other hand, they usually possess alpha-hemolysin and the LukED leukocidin, which is still very poorly studied that have been presented in papers like cause of serious ocular lesions and post-antimicrobial therapy diarrhea. A relation between the agr type and the virulence profile was not established, for virulence profiles were very similar even between isolates belonging to different agr groups.