Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) possuem características bioquímicas e genéticas semelhantes às de Shigella, porém para que ocorra um processo infeccioso são necessárias 102 células de Shigella em relação a 106 células de EIEC. A patogenicidade de Shigella e EIEC se dá pela presença de um plasmídio de virulência denominado pInv, que contêm os genes necessários para a invasão e disseminação bacteriana nas células do hospedeiro. Estudos anteriores relataram que os genes ipaA, ipaB, ipaC e ipaD de EIEC e Shigella não possuem diferenças genéticas que possam explicar sua diferença de patogenicidade. No presente trabalho, foram avaliados os níveis transcricionais dos genes envolvidos na invasão e disseminação dessas bactérias. Pela técnica de RT-PCR semi-quantitativo, pode-se observar diferenças nos níveis de transcrição para a maioria dos genes de virulência selecionados, quando as bactérias estavam em contato com os macrófagos. Porém, sem o contato com estas células, o nível de transcrição dos genes foi o mesmo entre as espécies, com exceção do gene ipaD. Foi verificada que a transcrição deste gene em contato com macrófago é praticamente a mesma entre as bactérias, enquanto que na ausência de macrófagos, o nível de transcrição é bem menor em EIEC, quando comparado no mesmo intervalo de tempo. Após estes resultados foram selecionados os principais genes para estudo por PCR em tempo real. Foi possível observar que o nível de transcrição de EIEC é menor, em relação a Shigella. Mais ainda, a análise dos genes dentro do mesmo operon mostrou uma cinética de transcrição distinta do icsB em relação a outros genes do operon das ipas. Os resultados obtidos sugerem que esta diferença de transcrição possa estar relacionada com a virulência mais branda em EIEC. Ainda mais, Os genes pertencentes ao operon icsB-ipaCB parecem ser regulados de forma distinta. Além disso, a transcrição de ipaD em EIEC, provavelmente, depende de uma via de sinalização distinta de Shigella flexneri. Diante desses resultados, novos estudos estão sendo propostos em nosso laboratório para melhor compreensão do mecanismo de virulência desse enteropatógeno. / Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) serotypes described so far share antigenic, biochemical, genetic and pathogenetic properties with Shigella sp. However, in order for an infectious process to occur, an inoculum of 102 Shigella cells is needed in contrast to as much as 106 EIEC cells. The characteristic ability of S. flexneri and EIEC to enter epithelial cells, multiply intracellularly and spread from cell to cell is uniquely encoded by their 220-kb virulence plasmid. Previous studies realized in our laboratory showed that the genes ipaA, ipaB, ipaC and ipaD do not possess molecular alterations in the nucleotides sequences that can explain the difference in the pathogenicity between EIEC and Shigella spp. In the present work, the transcription levels of the bacterial genes involved in the invasion and escape from host cells were evaluated. Through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis, differences in the transcription levels for the majority selected virulence genes could be observed when bacteria were in contact with the macrophages. However, without the contact with those cells, the transcription levels of the genes were the same between both bacteria species, with the exception of ipaD. When the bacteria is in contact with macrophages, the transcription of ipaD is the same in both species whereas in the absence of macrophages, the transcription level is lower in EIEC than Shigella, when compared in the same period of time. Those results provided the selection of the genes for the real time PCR analysis. In general, the EIEC transcription levels genes are lower than Shigella. More still, the icsB showed a distinct kinetic of transcription from the others genes in the same operon. All results suggest that the lower pathogenicity due to EIEC can partially have to the differences of the virulence genes transcription. Still more, the genes-encoded by operon icsB-ipaCB seem to be regulated of a distinct form. Therefore, transcription of the ipaD in EIEC probably depends on distinct signaling way of S. flexneri. New studies shows to be necessary for the better understanding of the pathogenic mechanism of EIEC.

Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Resumo: A salmonelose é uma das doenças de origem alimentar mais frequentes no mundo, causando diferentes sintomas, de acordo com o hospedeiro. Salmonella spp. é um dos principais micro-organismos patogênicos que contaminam frangos e seus derivados, representando um grande risco à saúde pública, tanto pelos seus fatores de virulência como pela multirresistência aos antimicrobianos. Assim, o objetivo desse trabalho foi caracterizar o potencial patogênico de Salmonella spp. isoladas de frangos obtidos no varejo, através da análise do perfil de virulência e resistência bacteriana aos antimicrobianos e sanitizantes utilizados na indústria e comércio varejista. Foram analisadas 56 isolados de Salmonella spp., com a identificação de 13 sorovares diferentes, sendo S. Enteritidis (42,8%) o mais frequente. Todos os isolados apresentaram os genes de virulência invA, sipB, sipD, sopB, ssaR, sifA, sitC, iroN, tolC, flgK, fljB e flgL. Os genes sopD e spvB estavam ausentes em cinco (8,9%) e 21 (37,5%) isolados, respectivamente. Foi observada a produção de biofilme em 27 (48,2%) isolados, sendo 13 (48,1%) cepas classificadas como fraca produtoras, 12 (44,4%) como moderadas e 2 (7,4%) foram classificadas como fortes produtoras. Nenhum isolado apresentou a enzima β-lactamase de espectro estendido (ESBL), porém detectou-se a presença de dos genes blaCMY-2 e blaNDM em 4 (7,1%) e 42 (75%) dos isolados, respectivamente. Em relação a ação dos sanitizantes, 90% dos isolados foram eliminados na concentração... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Salmonellosis is one of the most common foodborne diseases in the world, causing different symptoms, according to the host. Salmonella spp. is one of the main pathogenic microorganisms that contaminate chickens and their derivatives, representing a great risk to public health, both for their virulence factors and for the multiresistance of antimicrobials. Thus, the objective of this work was to characterize the pathogenic potential of Salmonella spp. isolated from chickens, by analyzing the virulence profile and bacterial resistance to the antimicrobials and sanitizers used in the industry. We analyzed 56 strains of Salmonella spp., with S. Enteritidis (42.8%) being the most frequent. All isolates showed the virulence genes invA, sipB, sipD, sopB, ssaR, sifA, sitC, iroN, tolC, flgK, fljB and flgL. The sopD and spvB genes were absent in five (8.9%) and 21 (37.5%) isolates, respectively. Biofilm production was observed in 27 (48.2%) isolates, where 13 (48.1%) strains were classified as weak produced, 12 (44.4%) as moderate and 2 (7.4%) were classified as strong producers. No single isolate presented the extended-spectrum β-lactamase enzyme (ESBL), but detected a presence of the blaCMY-2 and blaNDM genes in 4 (7.1%) and 42 (75%) isolates, respectively. Regarding the action of the sanitizers, 90% of the isolates were eliminated in the concentration of 0.23% of peracetic acid and 0.44% of sodium hypochlorite, both before and after the sonication process. The isolates of Salmonella... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introdução - A bactéria Listeria monocytogenes é um agente zoonótico transmitido, principalmente, por alimentos. Dentre as fontes de contaminação, destacam-se os produtos de origem láctea, carnes e embutidos, além dos ambientes da indústria de processamento alimentício. Na última década, foram detectadas cepas de L. monocytogenes e L. innocua, em ambiente de frigoríficos e alimento. Estas apresentavam variação na intensidade da virulência para células eucarióticas decorrente de mutações nos genes de virulência. Esta alteração em ambas as espécies, e o relato de um caso fatal de listeriose humana ocasionada por L. innocua atípica demandam atenção, pois apresentam maior risco à saúde da população exposta a estes ambientes e alimentos tornando-se, portanto, uma importante questão de saúde pública. Objetivo - Pesquisar genes de virulência em cepas de L. monocytogenes e L. innocua, isoladas em pontos da linha de abate suíno e do comércio de carne no Estado de São Paulo. Material e Métodos Foram estudadas 40 cepas, dentre estas, isolados de L. monocytogenes e L. innocua com atividade hemolítica atípica. Foram realizados testes de atividade hemolítica e produção de fosfolipase A para caracterização dos isolados. A detecção dos genes de virulência foi realizada através da reação em cadeia pela polimerase (PCR). Para confirmação das sequências amplificadas e a análise das mesmas, os fragmentos obtidos foram sequenciados. A identificação molecular das espécies foi realizada por análise filogenética dos genes prs e 16S rRNA. Resultados Dos 40 isolados, cinco de L. monocytogenes e sete de L. innocua apresentaram atividade hemolítica atípica, sendo que nestes últimos também foi observado halo atípico no meio ALOA. As cepas de L. monocytogenes foram positivas para a detecção de todos os genes de virulência estudados. Dois dos isolados atípicos de L. innocua também foram positivos para todos os genes e os outros cinco foram positivos para hly, plcA e inlC. Foram detectadas mutações nas proteínas InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC e PrfA, nas cepas atípicas, que resultaram em alterações nas suas estruturas secundárias que podem explicar o fenótipo desses isolados. A confirmação de espécie apenas foi alcançada com a análise filogenética do 16S rRNA. Conclusões A partir desses resultados, foi proposta a utilização dos genes prfA, plcB e inlB, como forma de triagem, para diferenciar as espécies L. monocytogenes e L. innocua, de modo a complementar os testes fenotípicos / Introduction - The bacterium Listeria monocytogenes is a zoonotic agent transmitted, mainly, by food. Among the sources of contamination, stands out dairy products, meat and the environments of food processing industry. In the last decade, strains of L. monocytogenes and L. innocua have been detected in food and slaughterhouses environment. These presented variation in the intensity of virulence to eukaryotic cells due to mutations in the virulence genes. These changes in both species, and the report of a fatal case of human listeriosis caused by atypical L. innocua demand attention, because they present greater risk to the health of the population exposed to these environments and food and, therefore, it is an important public health issue. Objective - To search for the virulence genes in strains of L. monocytogenes and L. innocua isolated in points of swine slaughter line and meat trade in Sao Paulo State. Material and Methods 40 strains were studied, among these, isolates of L. monocytogenes and L. innocua with atypical hemolytic activity. Tests of hemolytic activity and production of phospholipase A were performed for isolates characterization. The detection of virulence genes was performed through polymerase chain reaction (PCR). For confirmation of the amplified sequences and analysis of the same, the obtained fragments were sequenced. The molecular identification of species was performed by phylogenetic analysis of 16S rRNA and prs genes. Results - Of the 40 isolates, five L. monocytogenes and seven L. innocua showed atypical hemolytic activity, and in these last ones an atypical halo was also observed in ALOA medium. The L. monocytogenes strains were positive for detection of all virulence genes studied. Two atypical L. innocua isolates were also positive for all genes and the other five were positive for hly, plcA and inlC. Mutations in InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC and PrfA proteins were detected, in the atypical strains, which resulted in changes in their secondary structures that may explain the isolates phenotype. Species confirmation was achieved only with phylogenetic analysis of 16S rRNA. Conclusions - From these results, it was proposed the use of prfA, plcB and inlB genes as a way of screening, to differentiate the species L. monocytogenes and L. innocua, in order to complement the phenotypic tests

Dentre as espécies conhecidas do gênero Arcobacter, as espécies A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são consideradas potecialmente zoonóticas, podendo ser transmitidas por alimentos de origem animal. O presente estudo teve como objetivos isolar e caracterizar fenotipica e genotipicamente cepas de Arcobacter spp. provenientes de carcaças de suínos e amostras de ambiente de abatedouro localizado no Estado de São Paulo. As cepas isoladas foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase para a identificação e detecção de um grupo de genes de virulência. A concentração inibitória mínima frente a nove antimicrobianos usados para o controle da infecção pelo agente foi determinada e as cepas foram analisadas através do PFGE e pelo AFLP. Dentre as 30 carcaças avaliadas, 25 foram positivas para o agente e 70 cepas foram selecionadas e identificadas como Arcobacter spp. As espécies isoladas foram A. butzleri (n=61), A. cryaerophilus (n=7) e A. skirrowii (n=2). A frequência dos possíveis genes de virulência encontrada variou de 71,4% a 100% para os genes tlyA, pldA, cj1349, ciaB, cadF e mviN. Não foram detectados os genes hecA, hecB e irgA. O perfil de virulência ciaB/ cj1349/ mviN/ cadF/ pldA/ tlyA foi o mais frequente e detectado em 66% das cepas. Todas as cepas foram sensíveis à gentamicina e tetraciclina e 77,1% foram multirresistentes, dentre estas o perfil mais frequente foi de resistência a azitromicina/ florfenicol/ ácido nalidíxico/ telitromicina/ clindamicina Houve grande diversidade genotípica entre as cepas através do PFGE e do AFLP, e ambas a técnicas apresentaram o mesmo poder discriminatório na análise das cepas isoladas. / Among the known species of the genus Arcobacter, the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii are considered potentially zoonotic and can be transmitted by food of animal origin. This study aimed to isolate and characterize phenotypically and genotypically strains of Arcobacter spp from swine carcasses and slaughterhouse environment samples located in the State of São Paulo. The isolated strains were subjected to polymerase chain reaction for identification and detection of a group of putative virulence genes. The minimum inhibitory concentration was determined against nine antimicrobials indicated for the control of infection by the agent and the strains were analyzed by PFGE and by AFLP. Among the 30 carcasses evaluated, 25 were positive for the agent and 70 strains were selected and identified as Arcobacter spp. The isolated species were A. butzleri (n = 61), A. cryaerophilus (n = 7) and A. skirrowii (n = 2). The frequency of virulence genes found ranged from 71.4 % to 100 % for genes tlyA , pldA , cj1349 , ciaB , cadF and mviN . The genes hecA, hecB and irgA were not detected. The virulence profile ciaB/ cj1349/ mviN/ cadF/ pldA/ tlyA was the most frequent and detected in 66 % of the strains. All strains were susceptible to gentamicin and tetracycline and 77.1% were multirresistant, among these the most common profile of resistance was azithromycin/ florfenicol/ nalidixic acid/ telithromycin/ clindamycin There were large genotypic diversity among strains by PFGE and AFLP and both techniques showed the same discriminatory power in the analysis of the isolated strains.

INTRODUÇÃO: As Aeromonas são bactérias distribuídas predominantemente em meio aquático. São consideradas patógeno emergente, podendo causar doenças em peixes como também no homem. Os problemas mais comuns são a gastrenterite no homem e morte em peixes. OBJETIVO: Este estudo foi desenvolvido para comparar a identificação fenotípica com a genotípica, e também para conhecer o perfil de resistência aos antibióticos em Aeromonas caviae, A. aquariorum, e A. sanarellii isoladas do ambiente aquático e a presença de genes de virulência e resistência. MATERIAL E MÉTODOS: O DNA das 24 cepas em estudo foi extraído por choque térmico e purificado utilizando CTAB. Foram realizadas as PCRs para a detecção dos genes de virulência e dos genes de resistência, após a realização do antibiograma. RESULTADOS: Foram identificadas 4 A. caviae das quais 3(75,0 por cento) apresentaram pelo menos um dos genes act, ast ou alt. Das 3 A. aquariorum, 1(33,3 por cento) apresentaram positividade para os genes act e ast. Entre os 5 isolados de A. sanarellii 1(50,0 por cento) possuíam os genes alt e ast. Seis isolados não foram posicionados taxonomicamente entre as espécies descritas de Aeromonas, e dentre essas um exemplar apresentou o gene alt. Em relação às enzimas MBL e AmpC foram obtidos respectivamente: 3(100 por cento) e 3(100 por cento) em A. aquariorum; 2(50,0 por cento) e 4(100 por cento) em A. caviae; 3(75,0 por cento) e 5(100 por cento) em Aeromonas spp.; 1(20 por cento) e 5(100 por cento) A. sanarellii; Nenhum isolado apresentou resultado positivo, no teste fenotípico, para a produção de ESBL. Com a realização da PCR foi detectada a presença de 5 amostras com gene tipo blaMOX, 21blaCPHA , 17 tipo blaTEM e 2 cepH. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que os isolados podem servir potencialmente como reservatórios de resistência aos antimicrobianos e ainda, que os isolados podem ser considerados patógeno emergentes e significativos para a saúde pública / INTRODUCTION: Aeromonas spp. is predominantly distributed in the aquatic environment. They are regarded as emerging pathogen, causing disease in fish but also in man. The most common problems are gastroenteritis in humans and death in fish. OBJECTIVE: This study was designed to compare phenotypic with genotypic identification, and also to know the profile of antibiotic resistance in Aeromonas caviae, A. aquariorum, and A. sanarellii isolated from aquatic environment and the presence of virulence genes and resistance. MATERIAL AND METHODS: DNA from 24 strains under study was extracted by thermal shock and purified using CTAB. PCR reactions were performed for the detection of virulence and resistance genes, after the completion of the antibiotic resistance test. RESULTS: We identified four A. caviae from which 3(75.0per cent) had at least one of the genes act, ast or alt. From 3 A. aquariorum, 1(33.3per cent) was positive for the genes act and ast. Among the five isolated A. sanarellii, 1(50.0per cent) had the alt and ast genes Six isolates were not positioned within taxonomically described species of Aeromonas, and among these only one strain presented the alt gene. Regarding the MBL and AmpC it was obtained respectively: 3(100per cent) and 3(100per cent) isolates from A. aquariorum; 2(50.0per cent) and 4(100per cent) isolates from A. caviae; 4(66.7per cent) and 3(50.0per cent) isolates from Aeromonas spp.; and 1(20per cent) and 5 (100per cent) isolates from A. sanarellii. None of the isolates showed positive results in the phenotypic test for ESBL production. The PCR reaction detected the presence of 5 strains with blaMOX-like gene; 21 with blaCPHA gene; 17 with blaTEM-like gene and 2 with cepH gene. CONCLUSION: These findings suggest that the isolates may serve as potential reservoirs of antimicrobial resistance and also that the isolates could be considered emerging pathogens of public health significance

O amplo espectro da candidíase e respectiva importância clínica da infecção impulsionam as pesquisas que visam esclarecer os mecanismos de patogenicidade e identificação dos fatores de virulência de Candida sp. Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar através de testes fenotípicos e moleculares a capacidade de adesão, atividade de proteases e variabilidade genética de isolados clínicos de C. albicans e C. tropicalis. A capacidade de adesão às glicoproteínas de matriz extracelular laminina e fibronectina foi avaliada utilizando-se a técnica de ELISA (Enzyme-linked imunosorbent assay). A pesquisa de proteases foi realizada pelos métodos semiquantitativo, em placa de ágar com albumina bovina, e quantitativo, em solução-tampão com hemoglobina. A presença dos genes ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 e PLB1 foi verificada pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e os polimorfismos intra e interespécies pela técnica do DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD). Todos os isolados de C. albicans e C. tropicalis apresentaram ligação a laminina e a fibronectina imobilizadas. Os isolados Ca33 e Ct13 apresentaram índice de adesão relativa significativamente maiores em relação aos demais isolados para as duas glicoproteínas (p < 0,001). A atividade de proteases foi observada em todos os isolados de C. albicans tanto pelo método semiquantitativo quanto pelo método quantitativo. A atividade de proteases dos isolados de C. tropicalis foi melhor evidenciada através do método quantitativo. A amplificação de fragmentos dos genes relacionados à adesão (ALS2 e ALS3), atividade de proteases (SAP1 e SAP3) e fosfolipase (PLB1) foi observada em todos os isolados de C. albicans. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produtos de amplificação para os genes pesquisados. A variabilidade genética avaliada pela técnica do RAPD revelou uma população heterogênea em ambas as espécies. No entanto, C. tropicalis apresentou maior diversidade genética que C. albicans. / The wide spectrum of candidiasis and its clinical importance encourage the research with the purpose of clarifying the mecanisms of pathogenicity and identification of virulence factors of Candida sp. Therefore, the aim of this study was to verify through phenotypic and molecular assays the adhesion, enzymatic activity e genetic variability of clinical C. albicans and C. tropicalis isolates. The adhesion ability to the extracellular matrix glycoproteins laminin and fibronectin was evaluated using the ELISA technique (Enzyme-linked imunosorbent assay). The research of proteases was carried out in agar plate containing bovine albumin and through a quantitative method in buffer solution containing hemoglobin. The presence of ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 and PLB1 was verified using polimerase chain reaction (PCR) and intra and interespecies polimorphisms through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) technique. All C. albicans and C. tropicalis isolates binded to immobilized laminin and fibronectin. Ca33 and Ct13 isolates had relative adhesion index significantly higher than the other isolates for both glycoproteins (p < 0,001). Protease activity was observed in all isolates of C. albicans using either the semi-quantitative or quantitative assay. The protease activity of C. tropicalis was better detected through the quantitative assay. The amplification of genes related to adhesion (ALS2 and ALS3), proteases (SAP1 and SAP3) and phospholipase (PLB1) activity using PCR was observed in all C. albicans strains. PCR amplification products were not observed in C. tropicalis isolates for the researched genes. The genetic variability by RAPD revealed an heterogeneous population in both species. Nevertheless, C. tropicalis presented higher genetic variability than C. albicans strains.

Resumo: Escherichia coli destaca-se entre os principais patógenos de importância na suinocultura e saúde pública e apresenta diversos patótipos, caracterizados pela presença de diferentes fatores de virulência. Os objetivos deste trabalho foram detectar genes de virulência e determinar a sua freqüência, bem como caracterizar o perfil de resistência às drogas antimicrobianas de estirpes de E. coli shigatoxigênica (STEC) e enteropatogênica (EPEC) isoladas de fezes e carcaças de suínos abatidos na região de Ribeirão Preto - SP. Esse estudo foi conduzido com 226 amostras de fezes e 215 amostras de carcaça de suínos colhidas de três diferentes abatedouros. As estirpes isoladas foram submetidas ao teste bioquímico para confirmação da espécie, teste de suscetibilidade a antimicrobianos, teste para determinação dos sorogrupos e PCR para detecção dos genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfAO113, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, toxB, iha e bfp, foram isolados 3,4% de EPEC e 0,2% de STEC. Os fatores de virulência foram encontrados em quatro diferentes combinações: eae + lpfAO113 (1,6%); eae (1,4%); eae + toxB + lpfAO157/OI-141 + ehxA (0,4%) e stx2 (0,2%). Não houve isolados positivos para os genes lpfAO157/OI-154, saa, efa1, iha e bfp. Todos os isolados foram sensíveis à nitrofurantoína e 93,75% resistentes à tetraciclina. Os resultados mostraram que amostras provenientes de suínos da região de Ribeirão Preto-SP apresentaram E. coli que contêm genes de virulência associados a STEC e EPEC. Esse fato é um alerta para que esses animais sejam monitorados, pois podem ser potenciais reservatórios de STEC e EPEC causadoras de doenças em humanos / Abstract: Escherichia coli stands out among the main pathogens of importance to the swine industry and public health and presents several pathotypes characterized by the presence of different virulence factors. The aims of this study were to determine the frequency, detect virulence genes and characterize the resistance profile to antimicrobial drugs of Shiga toxigenic Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains isolated from feces and carcasses of pigs slaughtered in the region of Ribeirão Preto - SP. This research was carried out with 226 fecal samples and 215 carcasses samples from swine collected from three different slaughterhouses. The strains isolated were submitted to antimicrobial susceptibility test, biochemical test to confirm the specie, test to determine the serogroups and PCR for detection of genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfAO113, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, toxB, iha and bfp, 0,2% of STEC and 3,4% of EPEC were isolated. The virulence factors were found in four different combinations: eae + lpfAO113 (1,6%); eae (1,4%); eae + toxB + lpfAO157/OI-141 + ehxA (0,4%) and stx2 (0,2%). There were no positive isolate for genes lpfAO157/OI-154, saa, efa1, iha and bfp. All isolates were susceptible to nitrofurantoin and 93.7% resistant to tetracycline. The results showed that samples from swines in the region of Ribeirão Preto have E. coli containing virulence genes associated with EPEC and STEC strains. This fact is a warning that these animals should be monitored because they can be potencial reservoirs of STEC and EPEC that cause disease in human / Orientador: Fernando Antônio de Ávila / Coorientador: Everlon Cid Rigobelo / Banca: José Moacir Marin / Banca: Antonio José Piantino Ferreira / Mestre

O controle da contaminação de alimentos por Listeria monocytogenes é um desafio para a indústria, pois a bactéria é tolerante a muitas condições adversas que são empregadas para conservação de alimentos. L. monocytogenes é uma bactéria patogênica e pode causar doença de natureza não entérica grave, em pessoas imunocomprometidas, idosas e durante a gestação. No presente estudo foi avaliada a expressão gênica de duas linhagens L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a mais comumente isoladas de alimentos e L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b mais comumente encontradas em surtos hospitalares, utilizando caldos modelos formulados a partir de extratos de carne e peptona de peixe, suplementados ou não com glicose, cloreto de sódio, orégano, pimenta do reino e uma mistura desses ingredientes. Os caldos modelos formulados e suplementados ou não com os ingredientes foram incubados por 1 hora a 25ºC e em seguida, foi realizada extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA). O cDNA foi amplificado e quantificado por PCR em tempo real, com primers para os genes alvos prfA, inlA, actA e hly, que codificam respectivamente o fator regulador positivo, internalina A, actina e hemolisina, relacionados à virulência desta bactéria. L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a cultivada em caldo de carne acrescido de glicose diminuiu a expressão de prfA, actA e hly, enquanto que em caldo de peixe acrescido do mesmo ingrediente, foi observada maior expressão para os genes inlA, actA e hly. Nos caldos de carne acrescidos de cloreto de sódio houve aumento da expressão de hly em L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, mas o mesmo ingrediente causou redução da expressão dos genes inlA, actA e hly em L. monocytogenes IAL 633. Em caldo de peixe adicionado de cloreto de sódio, houve concordância no efeito observado para as duas culturas de L. monocytogenes avaliadas, com menor expressão dos genes inlA e prfA. Com pimenta do reino em caldo carne foi observado aumento da expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115 e redução dos genes prfA, inlA, actA e hly para L. monocytogenes IAL 633. Já em caldo de peixe acrescido de pimenta do reino, a modulação gênica ocorreu somente para L. monocytogenes ATCC 19115, com redução do gene prfA e aumento inlA e actA. O orégano foi o ingrediente que mais afetou a expressão gênica de L. monocytogenes nas condições estudadas, com aumento da expressão de actA em caldo de carne e redução de hly, para L. monocytogenes ATCC 19115. Em contrapartida, para L. monocytogenes IAL 633 ocorreu a repressão dos mesmos genes e também de inlA e prfA, enquanto que em caldo de peixe ocorreu redução somente para o gene prfA. Ainda, em caldo de peixe acrescido de orégano foi observado redução da expressão dos genes prfA e inlA, porém aumento na expressão de actA e hly para L. monocytogenes ATC 19115. A combinação de todos os condimentos também afetou a expressão gênica, sendo que em caldo de carne houve aumento da expressão dos genes prfA e inlA, porém foi reduzida a expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115. Para a mesma linhagem (ATCC 19115), em caldo de peixe ocorreu a redução da expressão dos genes prfA, inlA e actA. L. monocytogenes IAL 633 em caldo de carne com a mistura de ingredientes teve reduzida a expressão dos genes inlA e actA, essa redução também foi detectada em caldo de peixe para o gene prfA. No presente estudo foi possível observar uma repressão de todos os genes alvos estudados para L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a quando incubada em caldo de carne suplementado com os diferentes ingredientes, mas o mesmo padrão não foi observado para L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, indicando a complexidade da expressão gênica em função dos componentes de alimentos. / The control of food contamination by Listeria monocytogenes is a challenge for the industry because the bacterium is tolerant to many adverse conditions applied in food preservation. L. monocytogenes can cause serious non-enteric disease in immunocompromised persons, in the elderly and during pregnancy. In the present study it was evaluated the gene expression of two strains, L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a (most commonly isolated from food) and Listeria monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b (more common in clinical cases). Model broths were prepared with meat extract and fish peptone, supplemented or not with glucose, sodium chloride, oregano, black pepper and a mixture of these ingredients. The formulated model broths supplemented or not with the ingredients were incubated for 1 hour at 25° C and next, RNA extraction was performed and complementary DNA (cDNA) was synthesized. The cDNA was amplified and quantified by Real Time PCR with primers for the target genes: positive regulatory factor (prfA), internalin A (inlA), actin (actA) and hemolysin (hly). L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a grown in meat broth plus glucose decreased expression prfA, actA and hly, while in fish broth, increased expression was observed for inlA, hly, and actA genes. In meat broth added sodium chloride, increased hly expression was observed for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b but the same ingredient caused a decrease of the expression of genes inlA and hly in L. monocytogenes IAL 633. In fish broth added sodium chloride, for the two cultures of L. monocytogenes evaluated there was a lower expression of inlA and prfA gene in comparison with the control. With meat broth containing black pepper, it was observed an increased actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115 and lower expression of prfA, inlA, actA gene; for L. monocytogenes IAL 633 lower expression of hly was observed in this broth formulation. In fish gravy plus black pepper, modulation of gene expression occurred only in L. monocytogenes ATCC 19115 that showed decrease for prfA and increase for inlA and actA. Oregano was the ingredient that affected most the gene expression of L. monocytogenes under the conditions studied, with increased actA expression in broth and hly reduction for L. monocytogenes ATCC 19115. However, for L. monocytogenes IAL 633 there was repression of the inlA and prfA genes, in fish stock was reduced only for prfA gene. Also in fish stock plus oregano was observed reduction of prfA and inlA genes, but increased expression of the actA and hly for L. monocytogenes ATC 19115. The combination of all the condiments also caused different effects on gene expression, and in broth increased the expression of genes prfA and inlA, but reduced the actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115, for the same strain (ATCC 19115) broth fish was a reduction of prfA, inlA and actA genes. L. monocytogenes IAL 633 in broth with the mixture of ingredients reduced the expression of inlA and actA genes, this reduction were also seen in fish broth for the prfA gene. L. monocytogenes has complexity of the modulation of the expression of virulence factors in food, but in the present study it was possible to observe a repression in the modulation pattern of all target genes studied L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a when incubated in broth supplemented with different ingredients, which did not occur for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Scheffer.pdf: 2086782 bytes, checksum: 928db75671ab568b474a01a176b2665e (MD5) Previous issue date: 2012-12-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Shigellosis is a disease manifested from mild diarrhea to severe ysentery. The ability to invade cells, cause injury and imbalance in the homeostasis to the intestinal mucosa and modulate the inflammatory response has been attributed to several factors of pathogenicity of Shigella spp. In this study, thirty-six isolates of Shigella were identified from an etiologic study of childhood diarrhea in 1,500 children aged 0-10 years who were admitted to hospitals in Manaus (East-South-and-West Zones) between August 2007 and July 2009. Shigella flexneri was the most common (65%), followed by Shigella sonnei (20%), Shigella boydii (12.5%) and Shigella dysenteriae (2.5%). Among the isolates, one isolate (intermediate) resistant to ciprofloxacin and 1 (intermediate) to ceftriaxone, which are antibiotics recommended by WHO. Molecular typing of the pathogenicity factors showed evidence of the pathogenic potential of shet- 1B subunit of Shigella and can lead to complications related to dehydration. Frequencies of the IpaBCD (the most prevalent factors among isolates) followed by IpaH suspect associations to fever and bowel injury. The IpaH was clearly associated to bloody diarrhea. And finally, differences in the frequencies of Shet-2 positives between febrile-based groups reinforce its role in the inflammatory response. This study has contributed to the few data in the literature on the pathogenicity of wild Shigella isolates associated to shigellosis and consolidate the importance of finding ways to block the toxicity of these major pathogenicity factors / A shigelose é uma doença manifestada desde uma diarreia leve até uma severa disenteria. A habilidade de invadir células e provocar lesão na mucosa intestinal, bem como levar ao desequilíbrio na homeostase e modular a resposta inflamatória em nível intestinal tem sido atribuídos a diversos fatores de patogenicidade das Shigella spp. Neste trabalho, trinta e seis isolados de Shigella foram identificados a partir de um estudo etiológico de diarreia infantil em 1.500 crianças com idade entre zero a dez anos que deram entrada nos hospitais de Manaus (Zona Leste, Zona Sul e Zona Oeste) com quadro diarreico, no período entre agosto de 2007 a julho de 2009. Shigella flexneri foi à espécie mais frequente (65%), seguida por S. sonnei (20%), S. boydii (12,5%) e S. dysenteriae (2,5%). Entre os isolados, merece destaque o aparecimento de um isolado resistente (intermediária) à ciprofloxacina e 1 resistente (intermediária) à ceftriaxona, que são os antibióticos recomendados pela OMS. A tipagem molecular dos fatores de patogenicidade mostrou evidências sobre o potencial patogênico da subunidade shet-1B das Shigellas, podendo levar a complicações relacionadas à desidratação, de IpaH na febre e na lesão do intestino evidenciado pelo diarreia sanguinolenta. IpaBCD foram os fatores de virulência mais predominantes seguido de IpaH. E uma frequência maior de Shet-2+ em crianças febris em relação a não febris foi verificada. Este estudo vem contribuir com a pouca literatura que existe em relação aos fatores de patogenicidade de isolados de Shigella selvagens com quadro diarreico com ou sem shigelose e consolidar a importância de encontrar caminhos para bloquear a toxicidade destes principais fatores de patogenicidade

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) à um patÃtipo de E. coli que tem sido cada vez mais identificado como agente etiolÃgico das doenÃas diarrÃicas. Esse trabalho teve como objetivos determinar a prevalÃncia de EAEC e investigar a importÃncia de alguns genes associados à virulÃncia no grau de severidade das doenÃas diarrÃicas causadas pelo microorganismo, alÃm de avaliar o impacto dessas infecÃÃes na inflamaÃÃo intestinal e no estado nutricional de crianÃas carentes de Fortaleza, CearÃ. CrianÃas na faixa etÃria entre 2 e 36 meses, com histÃrico ou nÃo de diarrÃia nos Ãltimos 14 dias, tiveram suas medidas antropomÃtricas avaliadas e suas amostras fecais coletadas. O diagnÃstico de EAEC foi realizado por reaÃÃo de polimerase em cadeia (PCR) dos genes aaiC (cromossomal) e aatA (plasmidial). Amostras positivas foram pesquisadas quanto à presenÃa dos genes de virulÃncia aggR (regulador transcricional), aap (dispersina), pic (enterotoxina), pet (enterotoxina) e astA (enterotoxina). A sequÃncia nucleotÃdica do gene aggR foi analisada atravÃs de seqÃenciamento. AlÃquotas fecais foram submetidas à quantificaÃÃo de lactoferrina (LFF) e citocinas (IL-4, IL-10, TNF-&#945; e IFN-&#947;) atravÃs de reaÃÃo imunoenzimÃtica (ELISA). Esse estudo analisou 83 crianÃas com diarrÃia (casos) e 83 crianÃas sem diarrÃia (controles). EAEC foi encontrada na mesma proporÃÃo entre ambos os grupos (41,0%). CrianÃas com diarrÃia apresentaram reduÃÃo significativa na espessura da prega cutÃnea, Ãndice de massa corporal e escores-z peso-por-idade (WAZ) e peso-por-altura (WHZ), mas a presenÃa da bactÃria nÃo foi associada com alteraÃÃes nos Ãndices antropomÃtricos analisados. Entre as amostras positivas para EAEC, nÃo houve diferenÃa quanto à presenÃa isolada dos fatores de virulÃncia pesquisados nas crianÃas que desenvolveram ou nÃo diarrÃia. Avaliando as freqÃÃncias desses genes em combinaÃÃo, cepas de EAEC expressando os genes aggR, aap, pic, pet e astA foram isoladas em freqÃÃncia superior significativa de crianÃas doentes quando comparadas com cepas de EAEC expressando somente aggR, aap, pic e astA (excluindo o gene pet). A anÃlise da seqÃÃncia codificadora do gene aggR apresentou 27 polimorfismos em um Ãnico nucleotÃdeo (SNPs), distribuÃdos entre cinco amostras caso e trÃs controles. Mais de 80,0% das crianÃas estudadas apresentaram inflamaÃÃo intestinal caracterizada por elevados nÃveis de LFF, independente da presenÃa de diarrÃia e EAEC. Todas as crianÃas com diarrÃia associada com EAEC apresentaram altas concentraÃÃes de LFF. NÃveis basais de citocinas fecais foram observados entre crianÃas de ambos os grupos. A variabilidade na presenÃa dos fatores de virulÃncia pesquisados ratifica a heterogeneidade das cepas de EAEC. A combinaÃÃo de genes codificadores de fatores de virulÃncia mostrou que a presenÃa do pet està associada com a doenÃa causada por EAEC. A infecÃÃo pela bactÃria nÃo causou impacto significativo nos Ãndices antropomÃtricos analisados. As elevadas concentraÃÃes observadas de LFF sugerem a existÃncia de fatores adicionais desencadeadores do processo inflamatÃrio. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is a pathotype of diarrheagenic E. coli, which has increasingly been identified as an etiological agent of diarrheal disease. This purpose of this study is to determine the prevalence of EAEC and examine the importance of some virulence-related genes in the severity of the diarrheal disease caused by this microorganism, and further evaluate the impact of these infections on intestinal inflammation and the nutritional status of poor children from Fortaleza, Ceara. Children aged 2 to 36 months, with and without an occurrence of diarrhea in the previous 14 days, had their anthropometric data evaluated and their stools collected. Diagnosis of EAEC was done by polymerase chain reaction (PCR) of the aaiC (chromosomal) and aatA (plasmidial) genes. Positive samples were further analyzed for the presence of the virulence genes aggR (transcription regulator), aap (dispersin), pic (enterotoxin), pet (enterotoxin) and astA (enterotoxin). The nucleotide sequence of aggR gene was also analyzed by sequencing. Aliquots of stool samples were quantified for lactoferrin (LFF) and cytokines (IL-4, IL-10, TNF-&#945; e IFN-&#947;) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This study analyzed 83 children with diarrhea (cases) and 83 children without diarrhea (controls). EAEC was found in the same proportion in both groups (41.0%). Children with diarrhea presented with significantly reduced skin thickness, body mass index and weight-for-age (WAZ) and weight-for-height (WHZ) z-scores. However, the presence of the bacteria was not associated with changes in the analyzed anthropometric measures. Among the positive samples for EAEC, there was no difference in the presence of the isolated virulence genes in the children with or without diarrhea. Observing the frequencies of these genes in combination, EAEC strains carrying the aggR, aap, pic, pet and astA genes together were isolated in significantly higher frequencies from sick children when compared to EAEC strains expressing only aggR, aap, pic, and astA (excluding pet). Nucleotide sequence analysis of the aggR gene presented 27 polymorphisms of a single nucleotide (SNPs), distributed among five case samples and three control samples. More than 80.0% of studied children had intestinal inflammation characterized by elevated levels of LFF, regardless of the presence of illness and EAEC. All children with diarrhea associated with EAEC presented with high concentrations of LFF. Basal levels of fecal cytokines were observed among children from both groups. Variability in the presence of the evaluated virulence factors confirms the heterogeneity of EAEC strains. The combination of the virulence related genes expressed showed that pet has an association with illness caused by EAEC. The infection by this bacterium did not cause significant impact on the anthropometric index analyzed. The high concentrations of LFF observed suggest that there may be additional factors triggering the inflammatory process.