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Exploring TERRA (TElomeric Repeat-containing RNA) Expression and Regulation During Cell Growth in Saccharomyces cerevisiaePerez Romero, Carmina Angelica 08 1900 (has links)
Please find the referenced videos attached / The physical ends of eukaryotic chromosomes consist of repetitive DNA sequences, which are associated with specialized proteins forming a nucleoprotein structure essential for the integrity of the linear chromosomes, and are known as telomeres. Telomerase is an enzyme responsible for the maintenance of the telomeric repeats at the end of the chromosomes. Telomerase is a ribonucleoprotein, which contains a catalytic subunit that possesses reverse transcriptase activity, and a RNA subunit that acts as a template, since it possess the telomeric repeat sequences necessary to amplify telomere ends. Telomeres are transcribed in most eukaryotes into a non-coding RNA know as TERRA (Telomeric repeats-containing RNA). It has been proposed that TERRA may act as a regulator of telomere homeostasis, and as an inhibitor of telomerase, however, its specific function is still unknown. In Saccharomyces cerevisiae, TERRA is rapidly degraded by the 5’-3’ Rat1 exonuclease, which has hampered its study by classic biochemical experiments in yeast.
In this thesis, we report the use of cytological approaches to study TERRA in budding yeast. Two different approaches were used for this purpose: the fluorescent in-situ hybridization (FISH) and the labeling of TERRA by the MS2-GFP system, which allow the visualization of TERRA transcripts form a single telomere in living cells. With these two approaches, we observed that TERRA is expressed from a single telomere and accumulates as a single perinuclear foci, in a small percentage of cells population. We also demonstrate that TERRA expression occurs due to telomere shortening.
We demonstrate that TERRA interacts in vivo with the telomerase RNA (TLC1) in yeast. Telomere elongation depends on the action of several telomerase molecules that are visible as clusters, which associate with telomeres in late S phase in yeast, and mammalian cells. In adidition, we show that TERRA stimulates the nucleation of telomerase clusters. By performing time course experiments of TERRA and TLC1 RNA in live cells, we observed that TERRA acts as a scaffold for generating telomerase clusters, which are then recruited in late S phase to the telomere from which TERRA molecules originated. The recruitment of TERRA to its telomere of origin is dependent on factors that control telomerase recruitment at telomeres like: Mre11, Tel1 and the yKu complex. We propose that a short telomere expresses TERRA to assemble and organize telomerase molecules, which later on allows their recruitment at the short telomere, where elongation is needed.
Finally we showed an up-regulation of TERRA, and telomerase RNA TLC1, accompanied by a predominant cytoplasmic localization as cell growth progresses from exponential growth to diauxic shift, and stationary phase. In these conditions, TERRA foci co-localize with TLC1 RNA foci, suggesting that the function of TERRA as a scaffold molecule to generate telomerase cluster is necessary for this yeast cell growth phases. / Les télomères à l’extrémité des chromosomes constituent une structure d’ADN et de protéines essentielle à l’intégrité de ces chromosomes. La télomérase est l’enzyme responsable du maintien des répétitions télomériques à l’extrémité des chromosomes. Cette enzyme est constituée d’une sous-unité catalytique, qui possède une activité de transcriptase réverse, et d’une sous-unité d’ARN, qui fourni la matrice nécessaire à la synthèse des répétitions télomériques. Les ARN contenant des répétions télomériques (ou Telomeric repeats-containing RNA; TERRA) constitue une nouvelle classe d’ARN non-codants transcrits à partir des télomères et conservée chez la plupart des eucaryotes. TERRA a été proposé d’agir comme un régulateur de l‘homéostasie des télomères et comme inhibiteur de la télomérase, mais sa fonction spécifique reste inconnue. De plus, chez la levure Saccharomyces cerevisiae, TERRA est rapidement dégradé par l’exonucléase 5’-3’ Rat1, ce qui complique l’étude de cet ARN par les méthodes biochimiques classiques.
Dans cette thèse, nous rapportons l‘utilisation d’une approche cytologique pour étudier TERRA dans les cellules de levures. Deux approches sont utilisées : l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) et l’étiquetage de TERRA à l’aide du système MS2-GFP, qui nous permet de visualiser l’expression de TERRA transcrit d’un seul télomère dans des cellules vivantes. Avec ces deux approches, nous observons que TERRA exprimé à partir d’un seul télomère s’accumule dans un faible nombre de cellules, sous la forme d’un focus périnucléaire. De plus, nous montrons que TERRA est exprimé lorsque son télomère raccourcit.
Par immunoprécipitation, nous montrons que TERRA interagit in vivo avec l’ARN de la télomérase de levure, TLC1. L’élongation des télomères dépend de l‘action de multiples molécules de télomérase, qui sont visibles sous la forme de clusters de télomérases, qui s‘associent en phase S avec les télomères chez la levure et les cellules de mammifère. Nous démontrons que TERRA stimule la nucléation de ces clusters de télomérase. Par imagerie en temps réel de TERRA et de l’ARN TLC1, nous observons que TERRA agit comme molécule d’échafaudage pour générer des clusters de télomérases, qui sont par la suite recrutés, en phase S, au télomère duquel TERRA a été exprimé. Le recrutement d’un focus de TERRA à son télomère d’origine dépend des facteurs contrôlant le recrutement de la télomérase aux télomères : Mre11, Tel1 et le complexe yKu. Nous proposons qu’un télomère court exprime TERRA pour assembler et organiser les molécules de télomérase, afin que celles-ci soit puissent être recrutées au télomère court pour permettre son élongation.
Enfin, nous observons une surexpression de l’ARN de la télomérase TLC1 et de TERRA, ainsi qu’une accumulation cytoplasmique de ceux-ci sous la forme de foci, lorsque la cellule passe de la phase de croissance exponentiel à la phase diauxique, puis à la phase stationnaire. Dans ces conditions, les foci d’ARN TLC1 colocalisent avec les foci de TERRA, suggérant que la fonction de TERRA comme molécule d’échafaudage pour générer des foci de télomérase est aussi nécessaire durant ces phases du cycle de croissance des levures.
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Donation vivante de rein: trajectoire de transplantation, expérience relationnelle et enjeux éthiques et méthodologiques d’une recherche qualitative impliquant des dyades donneur-receveurUmmel, Deborah 06 1900 (has links)
La présente thèse poursuit l'objectif général de mieux comprendre l'expérience de la transplantation d'organe de la perspective de dyades comprenant un donneur et un receveur d'une donation vivante de rein. Pour ce faire, nous proposons une exploration en profondeur de la trajectoire de transplantation et des enjeux relationnels des donneurs et des receveurs. Un second objectif, qui s'est développé au cours de la recherche, est de contribuer à une meilleure compréhension des enjeux entourant la recherche qualitative impliquant des dyades.
Cette thèse est présentée sous la forme de trois articles. Le premier article vise, par le biais de la méthode du méta-résumé, à dresser un portrait le plus complet possible du processus de donation tel qu'il avait été examiné à ce jour par les écrits empiriques qualitatifs disponibles, et à mettre en lumière les aspects qui avaient encore peu été appréhendés par les chercheurs, notamment l'importance de considérer conjointement au sein d'une même recherche des donneurs et des receveurs d'une donation vivante de rein.
Le deuxième article a pour but d'explorer en profondeur l'expérience vécue pour des dyades de donneurs et de receveurs en contexte de donation vivante de rein, et en particulier la trajectoire de transplantation ainsi que les enjeux relationnels. Des entrevues qualitatives ont été menées auprès de cinq dyades (donc cinq donneurs et cinq receveurs). L'analyse phénoménologique interprétative des données recueillies propose un portrait de la trajectoire de transplantation, soit (a) l'expérience de la maladie du receveur, (b) l'expérience d'offrir et d'accepter un rein, (c) la période des tests, (d) la transplantation d'organe à proprement parler et finalement (e) la période post-transplantation. Un apport particulièrement significatif de l'analyse et de l'interprétation de nos données est la mise en relief que le processus de transplantation est mieux compris lorsque l'on considère le contexte social et interpersonnel plus large dans lequel évolue chaque dyade donneur-receveur, et en ce sens, la décision de donner ou d'accepter un rein peut être appréhendée comme un prolongement du rôle social auquel la personne adhère par rapport à autrui dans sa vie quotidienne.
Le troisième article, qui a émergé des leçons acquises en réalisant la recherche effectuée dans l'article précédent, vise à décrire et discuter des défis éthiques et des impacts des décisions méthodologiques dans le cadre de recherches qualitatives impliquant des dyades de personnes se connaissant. Sur la base de nos propres défis empiriques et des écrits scientifiques disponibles, des réflexions et recommandations sont suggérées à différents stades d'un processus typique de recherche qualitative, soit (a) le recrutement, (b) le consentement à participer, (c) la collecte de données, (d) la validation des transcriptions par les participants, (e) l'analyse de données, et (f) la dissémination des résultats. Une réflexion en amont des enjeux entourant ces étapes est susceptible de faciliter l'entreprise de recherches qualitatives impliquant des dyades.
En conclusion, les résultats de notre analyse soulignent l'importance du rôle social et du contexte interpersonnel plus large dans lequel évoluent les donneurs et les receveurs dans la façon dont ils parviennent à donner une signification à leur expérience. Enfin, si la recherche qualitative impliquant des dyades est en émergence, des défis éthiques et des décisions méthodologiques rigoureuses doivent être considérés en amont. / The global objective of this thesis is to help develop a better understanding of how living kidney transplantation donors and recipients experience the donation process as an interactive dyad. To address this objective, we suggest an in-depth exploration of the transplant trajectory and of the relational issues at play between donors and recipients in the context of a living kidney donation. A secondary objective, which developed along the way, is to contribute to a better understanding of how to conduct qualitative research with dyads.
This thesis is comprised of three articles. The first article is a meta-summary that aimed at aggregating results pertaining to both donors and recipients of a living kidney donation to offer a complete picture of the donation process and to highlight avenues that warrant further research, namely looking at both donors and recipients as an interactive dyad within the same study.
The objective of the second article was to provide a better understanding of how living kidney transplantation donors and recipients experience the donation process as an interactive dyad, and in particular the transplant trajectory and the relational issues involved. In-depth qualitative interviews were conducted with five dyads (five donors and five recipients). An interpretative phenomenological analysis of the data suggests that the transplant process can be naturally broken down into five phases of the transplant process: (a) the experience of the disease, (b) the experience of offering and accepting a kidney, (c) the screening period, (d) the surgery, and (e) the post-transplantation period. We found that for each donor-recipient dyad, the transplantation process reflects the unique larger social and interpersonal context within which the dyad evolves, and in this sense, the decision to donate or accept a kidney becomes a reflection of the social role one adheres to with respect to another being in everyday life.
The third article emerged from the lessons we learned in conducting the research described in the second article and describes both the ethical challenges and methodological decisions involved in conducting qualitative research with dyads who have shared a common experience. Based on our experience and on the available literature, we offer reflections and recommendations that follow the typical chronology of the research process: (a) recruitment, (b) consent to participation, (c) data collection, (d) transcript validation by participants, (e) data analysis, and (f) result dissemination. Reflecting ahead upon issues at each of these stages is likely to be beneficial in conducting rigorous qualitative research involving dyads.
In conclusion, our results underline the importance of the unique larger social and interpersonal context within which dyads evolve and achieve a sense of meaning
with respect to their own experience of the donation process. Last, as qualitative research involving dyads continues to evolve, ethical challenges and rigorous methodological decisions should be reflected upon ahead of time.
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Controlled and localized synthesis of molecularly imprinted polymers for chemical sensors / Synthèse localisée et contrôlée de polymères à empreintes moléculaires pour capteurs chimiquesKaya, Zeynep 05 November 2015 (has links)
Les polymères à empreintes moléculaires (MIP), également appelés "anticorps en plastique", sont des récepteurs biomimétiques synthétiques qui sont capables de reconnaître et lier une molécule cible avec une affinité et une spécificité comparables à celles des récepteurs naturels tels que des enzymes ou des anticorps. En effet, les MIP sont utilisés comme éléments de reconnaissance synthétiques dans les biocapteurs et biopuces pour la détection de petits analytes et les protéines. La technique d'impression moléculaire est basée sur la formation de cavités de reconnaissance spécifiques dans des matrices polymères par un procédé de moulage à l'échelle moléculaire. Pour la conception de capteurs et biopuces, une cinétique d'adsorption et une réponse du capteur rapide, l'intégration des polymères avec des transducteurs, et une haute sensibilité de détection sont parmi les principaux défis. Dans cette thèse, ces problèmes ont été abordés par le développement de nanocomposites MIP / d'or via le greffage du MIP sur les surfaces en utilisant des techniques de polymérisation dédiées comme l'ATRP qui est une technique de polymérisation radicalaire contrôlée (CRP). Ces techniques CRP sophistiquées sont en mesure d'améliorer considérablement les matériaux polymères. L'utilisation de l'ATRP dans le domaine de MIP a été limitée jusqu'à présent en raison de son incompatibilité inhérente avec des monomères acides comme l'acide méthacrylique (MAA), qui est de loin le monomère fonctionnel le plus largement utilisé dans les MIP. Ici, un nouveau procédé est décrit pour la synthèse de MIP par ATRP photo-initiée utilisant fac-[Ir(Ppy)3] comme catalyseur. La synthèse est possible à température ambiante et est compatible avec des monomères acides. Cette étude élargit considérablement la gamme de monomères fonctionnels et de molécules empreintes qui peuvent être utilisés lors de la synthèse de MIP par ATRP. La méthode proposée a été utilisée pour la fabrication de nanocomposites hiérarchiquement organisés sur des surfaces métalliques nanostructurés avec des nano-trous et nano-ilots, présentant des effets plasmoniques pour l'amplification du signal. La synthèse de films de MIP à l'échelle du nanomètre localisés sur la surface d'or a été démontrée. Des méthodes de transduction optiques, à savoir la résonance de plasmons de surface localisée (LSPR) et la spectroscopie Raman exaltée par effet de surface (SERS) ont été exploitées. Ces techniques se sont montrées prometteuses pour l'amélioration de la limite de détection dans la détection d'analytes biologiquement pertinents, y compris les protéines et le médicament propranolol. / Molecularly imprinted polymers (MIPs), also referred to as plastic antibodies, are synthetic biomimetic receptors that are able to bind target molecules with similar affinity and specificity as natural receptors such as enzymes or antibodies. Indeed, MIPs are used as synthetic recognition elements in biosensors and biochips for the detection of small analytes and proteins. The molecular imprinting technique is based on the formation of specific recognition cavities in polymer matrices by a templating process at the molecular level. For sensor and biochip development, fast binding kinetics of the MIP for a rapid sensor response, the integration of the polymers with transducers, and a high sensitivity of detection are among the main challenges. In this thesis, the above issues are addressed by developing MIP/gold nanocomposites by grafting MIPs on surfaces, using dedicated techniques like atom transfer radical polymerization (ATRP) which is a versatile controlled radical polymerization (CRP) technique. Theses ophisticated CRP techniques, are able to greatly improve the polymeric materials. The use of ATRP in the MIP field has been limited so far due to its inherent incompatibility with acidic monomers like methacrylic acid (MAA), which is by far the most widely used functional monomer. Herein, a new method is described for the MIP synthesis through photo-initiated ATRP using fac-[Ir(ppy)3] as ATRP catalyst. The synthesis is possible at room temperature and is compatible with acidic monomers. This study considerably widens the range of functional monomers and thus molecular templates that can be used when MIPs are synthesized by ATRP. The proposed method was used for fabrication of hierarchically organised nanocomposites based on MIPs and nanostructured metal surfaces containing nanoholes or nanoislands, exhibiting plasmonic effects for signal amplification. The fabrication of nanometer scale MIP coatings localized on gold surface was demonstrated. Optical transduction methods, namely Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) and Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) were exploited and shown that they hold great promise for enhancing the limit of detection in sensing of biologically relevant analytes including proteins and the drug propranolol.
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Les juges de la Cour Suprême des Etats-Unis et la notion de constitution vivante / The Justices of the Supreme Court of the United States and the notion of the living ConstitutionVlachogiannis, Apostolos 15 June 2011 (has links)
Les juges de la Cour Suprême des États-Unis et la notion de constitution vivante.Une constitution écrite peut-elle évoluer au cours du temps et s’adapter aux besoins et aux valeurs évolutives de la société, sans pour autant être révisée formellement ? Et si oui, qu’en est-il du texte constitutionnel ? Devant ces interrogations, la notion de constitution vivante vise à résoudre le paradoxe du changement matériel de la Constitution sans modification du texte. Elle est sans aucun doute un topos – qui ne manque pas de susciter des critiques,notamment celle de la théorie dite « originaliste » - de la pensée constitutionnelle américaine, un concept mobilisé, en l’occurrence, pour justifier la cause de la réforme juridique et sociale. Elle a été développée,durant le XXe siècle, principalement par des juges de la Cour Suprême américaine qui ont fourni une approche stimulante et fertile de la nature de la Constitution. La notion de constitution vivante exprime donc une conception évolutive de la Loi suprême, qui saurait, par sa flexibilité et sa fonctionnalité,s’adapter au changement de circonstances. Dans ce cadre, elle a été instrumentalisée afin de surmonter la rigidité de la procédure de révision formelle prescrite par l’article V de la Constitution. Cette notion est dès lors porteuse de la tension entre la permanence du texte et l’évolution du droit constitutionnel positif. Pour justifier ce décalage entre la forme et le fond, les juges défenseurs de la constitution vivante ont toujours traité le texte comme un « document vivant », qui doit être lu à la lumière des valeurs évolutives et des idéaux partagés par le peuple américain. / The Justices of the United States Supreme Court and the notion of the livingConstitutionCan a written constitution evolve over time and adapt itself to the changingneeds and values of society, without being formally amended? If yes, thenwhat about the text? The notion of the living constitution tries to solve theparadox of constitutional change without modification of the text. It is acommon place notion – though subject to fierce criticism, notably byoriginalism - of U.S. constitutional thought, a concept invoked on manydifferent occasions in order to promote constitutional and social change. It hasbeen primarily elaborated by certain Justices of the Supreme Court of theUnited States during the 20th century, who have offered a stimulatingapproach of the nature of the U.S. Constitution. From their point of view, thenotion of the living constitution is based on the idea that the Constitutionevolves over time adapting itself to the ever changing circumstances. It thusleads to a theory of interpretation which treats the constitutional provisionsthat allocate powers or guarantee individual rights as flexible and vital.Furthermore, the notion of the living constitution has been used as a means ofovercoming the barrier of the amendment procedure as prescribed by Article Vof the U.S. Constitution. Therefore, it is marked by the tension between thepermanence of the text and the evolution of constitutional law. In order tojustify this evolution, the Justices who defend the notion of the livingConstitution, have always treated the text as a living document, which mustbe read in light of the aspirations and the high ideals of the American people.
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"L'enseignement de la langue et culture d'origine turque en Alsace depuis 2013 : quel nouveau dispositif, quel nouveau public ?" / The teaching of Turkish as original language and culture in Alsace since 2013 : which new educational device, which new public ?Dervisoglu, Gulsen 26 September 2017 (has links)
L’Enseignement des Langues et Cultures d’Origine (ELCO) a été mis en place, dans les années 70, à la suite du regroupement familial. L’ELCO a été créé dans le but d’intégrer les enfants d’immigrés dans le système éducatif français et de leur permettre de garder un lien avec leur langue d’origine en cas de retour des parents. Notre recherche porte sur l’enseignement de la langue et la culture d’origine turque en Alsace. Depuis 2013, l’ELCO s’ouvre dorénavant à tout enfant, quelle que soit son origine. Notre but est de comprendre les raisons du faible taux d’élèves choisissant le turc et ne parlant pas cette langue à la maison ainsi que les facteurs d’influence. Une recherche qualitative a été menée auprès d’élèves, de parents élèves, d’enseignants et de responsables institutionnels. Nous avons opté pour une démarche inductive sans hypothèses préalables. Le taux faible d’élèves s’explique par un nombre important de variables : par exemple : l’invisibilité du dispositif au sein de l’école, la non considération du turc par les parents comme une langue internationale et la non continuité de la langue turque au collège. / The teaching of original languages and cultures (ELCO) was implemented in the 70s, after the family reunification policy. The purpose of ELCO is to integrate children from immigrant’s backgrounds in French educational system, and to preserve their original language in case of return to their parents’ native country. Our study deals with the teaching of Turkish as original language and culture in Alsace and more specifically, in the new change in ELCO that opens the class to a different public. Indeed, since 2013, ELCO has been opened to all children applying for it, regardless of their origin. In our research, we aim at understanding the reasons and the external factors of the low number of pupils that chose Turkish, among children that are not speaking Turkish at home. We selected an inductive approach without starting hypothesis due to the newness of the system. The low number of pupils is explained by multiple variables, such as the irrelevance ELCO within the school, the fact that Turkish is not considered as an international language or the lack of continuity of Turkish learning in junior high school.
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Développement et application de méthodes pour l’analyse virologique et immunologique de l’infection au virus de l’immunodéficience humaineLemieux, Audrée 04 1900 (has links)
Mémoire en cotutelle avec le Dr. Daniel Kaufmann et le Dr. Nicolas Chomont / Dans les dernières années, il a été montré que les provirus intacts et défectueux du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) codent pour des protéines virales qui contribuent à l’activation chronique des lymphocytes T spécifiques au VIH, et ce même sous traitement antirétroviral (ART). Nous avons développé deux méthodes pour étudier, d’un côté, l’intégrité et la clonalité de séquences provirales (virologie), et de l’autre, les réponses T spécifiques au VIH (immunologie). Tout d’abord, nous avons développé une bibliothèque R nommée « IntegrityAlgorithm », automatisant une séquence d’analyse utilisée précédemment pour déduire l’intégrité et la clonalité de séquences quasi-pleine longueur (NFL) de provirus. Chaque séquence provirale est analysée pour la présence, dans cet ordre, d’inversions, d’hypermutations, de grandes délétions internes, de codons stops, de défauts dans la région Ψ et de défauts dans les cadres de lectures ouverts (ORFs). Les provirus dépourvus de ces défauts sont identifiés comme « intacts ». Nous montrons que la hiérarchisation des défauts sous-estime certains défauts, comme les codons stops et les défauts dans le Ψ. L’algorithme produit des résultats en accord avec les données publiées et présente plusieurs avantages par rapport à d’autres algorithmes de prédiction. Nous avons aussi multiplexé l’essai de marqueurs induits par l’activation (AIM), couramment utilisé pour la détection de cellules T spécifiques à un antigène, en mesurant simultanément la co-expression de quatre AIMs (CD69, 4-1BB, OX40 et CD40L) plutôt que deux. En utilisant une stratégie de gating booléen ET/OU, l’approche augmente la fréquence de détection des cellules T CD4+ spécifiques à un antigène en comparaison aux paires d’AIMs standards. La détection des cellules T CD8+ était plutôt dominée par la paire d’AIMs CD69+4-1BB+. Le multiplexage réduit les biais dans la qualification et la quantification des cellules T spécifiques à un antigène, tel qu’il a été montré avec des analyses de phénotypage et des comparaisons intra- et inter-cohorte. Nous avons ensuite modifié la stratégie de gating booléen ET/OU pour une stratégie de gating en « L », nous permettant de trier des cellules vivantes T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH et au cytomégalovirus (CMV). En considérant l’étroite relation qu’entretiennent les provirus du VIH et le système immunitaire, améliorer nos méthodes pour la caractérisation à la fois des provirus, mais aussi des réponses T spécifiques au VIH, demeure essentielle pour une meilleure compréhension de la persistance des réservoirs et pour élaborer des stratégies de vaccination et d’éradication du virus. / In the past years, intact and defective human immunodeficiency virus (HIV) proviruses have been shown to code for viral proteins that contribute to sustaining chronic HIV-specific T cell responses, even under antiretroviral therapy (ART). We have developed two methods to study, on one side, the intactness and clonality of proviral sequences (virology), and on the other, the HIV-specific T cell responses (immunology). We developed an R package named “IntegrityAlgorithm” that automates a previous analysis pipeline used to infer intactness and clonality of near full-length proviral sequences (NFL). Each proviral sequence undergoes analysis to identify, in this order, the presence of inversions, hypermutations, large internal deletions, stop codons, Ψ defects, and defects in the open reading frames (ORFs). Proviruses exhibiting none of these defects are inferred as “intact.” We show that the hierarchization of defects underestimate some defects, such as stop codons or Ψ defects. The algorithm produces consistent results with the data published and presents several advantages over other prediction algorithms. We also multiplexed the activation-induced marker (AIM) assay, commonly used to detect antigen (Ag)-specific T cells, by simultaneously measuring the co-expression of four AIMs (CD69, 4-1BB, OX40, and CD40L) instead of two. When combined in an AND/OR Boolean gating strategy, the approach increases the frequency of Ag-specific CD4+ T cells detected in comparison to single AIM pairs. CD8+ T cell detection is rather dominated by the AIM pair CD69+4-1BB+. Multiplexing reduces biases in the qualification and quantification of Ag-specific T cells, as shown with phenotyping analyses and intra- and inter-cohort comparisons. We then modified the Boolean AND/OR gating strategy to an “L gating” strategy for the purpose of sorting live Ag-specific CD4+ and CD8+ T cells. Considering the interdependent relationship between HIV proviruses and the immune system, improving our methods to characterize both the intactness of proviruses and the HIV-specific T cell responses will remain essential for a better understanding of the reservoirs persistence and to elaborate vaccine and viral eradication strategies.
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