Acetyl-CoA Synthase (ACS) katalysiert die Reaktion eines Methylkations, Kohlenstoffmonoxid und CoA zu Acetyl-CoA. Das aktive Zentrum von ACS ist ein Ni,Ni-[4Fe4S]-Cluster (A-cluster), in dem zwei Nickel-Ionen mit einem kubanen [4Fe4S]-Cluster verbrückt sind. An der Biosynthese von komplexen Metallclustern sind in der Regel mehrere akzessorische Proteine, auch Maturationsfaktoren genannt, beteiligt. Die Biosynthese des A-Clusters wurde bisher noch nicht genauer untersucht und es war nicht bekannt welche Proteine die Biosynthese des A-Clusters katalysieren. In dieser Arbeit wurde das Protein AcsF als Maturationsfaktor der ACS identifiziert und seine biochemischen und strukturellen Eigenschaften wurden charakterisiert. AcsF und apoACS aus Carboxydothermus hydrogenoformans bilden einen stabilen Komplex, der zwei Nickel-Ionen binden kann. ApoACS hingegen kann unter den gleichen Bedingungen im Durchschnitt nur weniger als ein Nickel-Ion binden. Der Ni-ACS-AcsF Komplex, an dem zwei Nickel-Ionen gebunden sind, ist katalytisch jedoch nicht aktiv. Erst durch Zugabe von Mg-ATP kann die inaktive Spezies in eine aktive Form überführt werden. AcsF-Proteine gehören zur gleichen Protein-Familie wie CooC-Proteine, die Maturationsfaktoren der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk konnte zeigen, dass AcsF- und CooC-Proteine jeweils eine eigene Untergruppe in dieser Familie bilden. Die AcsF-Proteine von C. hydrogenoformans und Archaeoglobus fulgidus wurden kristallisiert und deren Kristallstrukturen gelöst. Durch einen Vergleich der Strukturen von AcsF mit den Strukturen von zwei CooC-Proteinen konnte aufgedeckt werden, dass die größten strukturellen Unterschiede zwischen AcsF- und CooC-Proteinen zwischem dem Switch I Motif und dem CXC Motif zu finden sind. / Acetyl-CoA synthase (ACS) catalyzes the reaction of a methyl cation, carbon monoxide and CoA to acetyl-CoA. The active site of ACS is a Ni,Ni-[4Fe4S] cluster (A-cluster), in which two nickel ions are bridged to a cubane-type [4Fe4S] cluster. Usually, several accessory proteins are involved in the biosynthesis of such complex metal clusters. However, the biosynthesis of the A-cluster had not yet been investigated and it was not known which accessory proteins take part in its assembly. In this work, the protein AcsF was identified as a maturation factor of ACS, and its biochemical and structural properties were characterized. AcsF and apoACS from Carboxydothermus hydrogenoformans form a stabile complex, that can bind two nickel ions. ApoACS alone, on the other hand, binds on average only less than one nickel ion under the same conditions. The Ni-ACS-AcsF complex, that contains two nickel ions, is not active, but the addition of Mg-ATP converts the inactive species into an active form. AcsF proteins belong to the same protein family as CooC proteins, the maturation factors of carbon monoxide dehydrogenase. A sequence similarity network showed that AcsF and CooC proteins each form their own subgroup within this family. The AcsF proteins from C. hydrogenoformans and Archaeobglobus fulgidus were crystallized and their crystal structures were solved. A comparison of the crystal structures of AcsF proteins with the structures of two CooC proteins revealed that the main structural differences between AcsF and CooC proteins can be found between the switch I motif and the CXC motif.

Das 26S Proteasom ist ein großer Proteinase-Komplex, der aus 32 unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Das 26S Proteasom ist involviert in die ATP-abhängige De-gradation von ubiquitinierten Proteinen, die eine Vielfalt an zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Stressantwort, transkriptionelle Regulation, Chromosomen-Segregation, DNA-Reparatur, Zellzyklus-Steuerung und die Prozessierung von Peptiden für die MHC I Antigen Präsentation regulieren. Die Prozessierung von Peptiden wird ver-stärkt durch eine Interferon ? stimulierbare Variante des Proteasoms übernommen, dem so genannten Immunoproteasom. Die Biogenese dieses großen Komplexes ist ein komplizierter Mechanismus, welcher Expression und Assemblierung der proteasomalen Untereinheiten beinhaltet. In Eukaryonten sind für die Assemblierung und Maturierungsprozesse Helferproteine notwendig. In Mammalia übernimmt diese Funktion das Proteasom maturation Protein POMP. POMP ist wahrscheinlich auch bei der Biogenese des Immunoproteasoms von Bedeutung, da die mRNA von POMP durch Interferon ? induziert wird. Um die Regulation dieser Induktion zu untersuchen wurde der Promotor von POMP für die erste Fragestel-lung dieser Arbeit charakterisiert und seine Induzierbarkeit durch Interferon ? untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die erhöhte mRNA-Menge durch Interferon ?-Stimulation nicht auf eine Promotor-Induktion, sondern auf post-transkriptionelle Ereig-nisse zurückzuführen ist. In der zweiten Fragestellung dieser Arbeit sollte die Genregulation des Proteasoms unter Stressbedingungen untersucht werden. Der Stress wurde durch Inhibition der proteolyti-schen Aktivität des Proteasoms ausgelöst. Wie seit längerem bekannt ist, werden in Bakterien und Hefe die ATP-abhängigen Pro-teasekomplexe über ein kompliziertes regulatorisches Netzwerk gesteuert. Über die transkriptionelle Regulation des Mammalia Proteasoms war bisher wenig bekannt. Im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der proteolytischen Aktivität des Proteasoms durch Behandlung von Mammalia-Zellen mit Proteasom-Inhibitoren durch eine gesteigerte Genexpression der proteasomalen Unter-einheiten kompensiert wird. Alle proteasomalen Untereinheiten werden konzertiert hoch-reguliert. Exemplarisch an der proteasomalen Untereinheit Rpt1(S7) und an dem Matu-rierungsfaktor POMP konnte eine posttranskriptionelle Regulation unter Proteasom-Inhibitor Einfluss ausgeschlossen werden. Die vom Inhibitor induzierte Genaktivierung resultiert in einer de novo Protein-Synthese und führt daher zu einer gesteigerten de no-vo Biogenese des Proteasoms. Dieses Phänomen ist begleitet durch eine vermehrte Ex-pression vom POMP. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Menge an Protea-som in Mammalia auf transkriptioneller Ebene reguliert wird und dass vermutlich ein au-toregulatorischer feedback-Mechanismus eine verminderte proteolytische Aktivität kom-pensieren kann. Diese Daten werden durch Ergebnisse der CAT-Reportergen-Assays des ?1(?)-Promotors gestützt. Exemplarisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität dieses Promotors in Anwesenheit von Proteasom-Inhibitoren ansteigt. Die induzierbare Promotorregion konnte bis auf 130 bp eingegrenzt werden. Innerhalb dieser Promotorse-quenz konnte die Bindung eines Transkriptionsfaktors (Nrf2) durch EMSA-Technik nach-gewiesen werden. / The 26 S proteasome is a high molecular mass proteinase complex that is built by of least 32 different protein subunits. The 26S proteasome is involved in the ATP-dependent degradation of ubiquitinated proteins that regulate a variety of cellular proc-esses including signal transduction, stress response, transcriptional control, chromosome segregation, DNA repair, cell cycle progression and processing of antigenic Peptides for the MHC I pathway. Biogenesis of this large complex is a complicated process compris-ing expression, assembly and maturation of all subunits. This crucial step is supported by POMP (proteasome maturation protein). POMP mRNA is induced by Interferon gamma (IFN ?). We investigated this phenomenon via Reportergen assays with the Promoter re-gion of POMP. POMP mRNA seems not to be regulated on a trancriptional level, but on posttranscriptional events. ATP-dependent protease complexes in bacteria and yeast are systems that undergo a highly sophisticated network of gene expression regulation. However, regulation of mammalian proteasome gene expression has been neglected so far as a possible control mechanism for the amount of proteasomes in the cell. We showed that treatment of cells with proteasome inhibitors and the concomitant impairment of proteasomal enzyme activ-ity induce a transient and concerted up-regulation of all mammalian 26S proteasome subunit mRNAs. Proteasome inhibition in combination with inhibition of transcription re-vealed that the observed up-regulation is mediated by coordinated transcriptional activa-tion of the proteasome genes and not by post-transcriptional events. Our experiments also demonstrate that inhibitor-induced proteasome gene activation results in enhanced de novo protein synthesis of all subunits and in increased de novo formation of the pro-teasome. This phenomenon is accompanied by enhanced expression of the proteasome maturation factor POMP. Thus, our experiments present first evidence that the amount of proteasomes in mammalia is regulated at the transcriptional level and that an auto regu-latory feedback mechanism exists that allows the compensation of reduced proteasome activity. These data are also supported by CAT reportergene assays with the protea-somal subunit ?1(?)-promoter. Exemplary we show the increase of CAT activities in re-sponse to proteasome inhibition. We can restrict the region of the promoter to 130 bp and identify Nrf2 as a possible candidate for a transcription factor via EMSA.

Das COP9 Signalosom ist ein hochkonservierter Proteinkomplex bestehend, aus acht Untereinheiten. In der vorgelegten Promotionsarbeit konnte ein bislang unbekannter Regulationsmechanismus der Biogenese des COP9 Signalosoms identifiziert werden. Die siRNA-vermittelte Reduktion der CSN1-Expression führte zu einer Reduktion der Expression aller CSN-Untereinheiten. Die Transfektion von His-CSN1 in siCSN1-Zellen induzierte die CSN-Neusynthese und ferner einen Anstieg der c-Myc- und STAT1 Expression. Durch die Stimulation der Zellen mit IFN alpha bzw. IFN gamma konnte die de novo Synthese des CSN-Komplexes induziert werden. Die siRNA-vermittelte Inhibition von STAT1, c-Myc bzw. Lin28B führte ebenso wie die Behandlung der Zellen mit AG9 bzw. AG490, pharmakologischen Inhibitoren der JAK-Kinasen, zu einer Reduktion der Proteinexpression der CSN-Untereinheiten. Dabei standen signifikanten Veränderungen auf der Proteinebene geringfügige Änderungen auf der mRNA-Ebene gegenüber. Daher wurde ein post-transkriptioneller Mechanismus zur Regulation der Expression der CSN-Untereinheiten unter Beteiligung von miRNAs postuliert. Diese Regulation wird vermutlich durch die Aktivität von c-Myc und Lin28B verstärkt. Dies stellt einen neuen, bislang unbekannten Mechanismus für die Regulation der Biogenese des COP9 Signalosoms, vermutlich über den c-Myc/Lin28B/let-7-Weg, dar. Die Co-Transfektion der siCSN1-Zellen mit spezifischen komplementären Inhibitoren dieser miRNAs führte zu einer Induktion der Proteinexpression der CSN-Untereinheiten. Die Transfektion von let-7 miRNA-Mimics bewirkte eine Reduktion der Expression der CSN-Untereinheiten in den siCSN1-Zellen. Ferner konnten im Rahmen dieser Arbeit mittels der miRBase Sanger Datenbank und der Software MicroInspector Bindestellen für let-7 miRNAs an den mRNAs der CSN- und der proteasomalen Lid-Untereinheiten identifiziert werden. Der gezeigte Regulationsmechanismus könnte auch für die Biogenese des proteasomalen Lids von Bedeutung sein. / The COP9 signalosome is a highly conserved protein complex composed of eight subunits. In this study a novel, regulatory mechanism of CSN biogenesis was identified. We used stable transfected siCSN1 cells in which the protein and the mRNA expression of CSN subuntis were downregulated. Transfection of His-CSN1 in those siCSN1 cells led to the induction of the de novo Synthesis of the whole CSN complex. In addition the expression of the transcription factors STAT1 and c-Myc was elevated. The cells were treated with IFN alpha or IFN gamma, respectively. This resulted in the induction of the CSN de novo synthesis. Moreover, the siRNA-mediated inhibition of STAT1, c-Myc, Lin28B as well as treatment with the pharmacological inhibitors AG9 or AG490 led to a reduced protein expression of the analysed CSN subunits. We found that in all experiments there was a significant change on protein level in contrast to a marginal change on the RNA level. Based on our study we hypothesized that the CSN biogenesis ist regulated post-transcriptionally by miRNAs. The participation of miRNAs in the regulation of CSN biogenesis was further analysed. The siCSN1 cells were transfected with complementary hairpin inhibitors of let-7 miRNAs, leading to an induction of the CSN synthesis. The transfection of let-7 miRNA-mimics, which enhance the impact of miRNA on target mRNAs, resulted in an decrease of the CSN expression. These findings prove the involvement of miRNAs in CSN biogenesis, presumably via the c-Myc/Lin28B/let-7 pathway. Furthermore, using miRBase Sanger database and MicroInspector software, potential binding sites for let-7 miRNAs were detected within the mRNA sequences of CSN subunits as well as of subunits of the proteasomal lid. Therefore, there is evidence to suggest that this mechanism is crucial for the regulation of the biogenesis of the proteasomal lid as well.

HSP25 ist ein Vertreter der ubiquitär verbreiteten kleinen Hitzeschockproteine, einer Familie innerhalb der großen Klasse der Streßproteine. Es ist an der Vermittlung von zellulärer Streßtoleranz beteiligt, besitzt Chaperoneigenschaften, hemmt die Actinpolymerisation in vitro und ist in der Lage, supramolekulare Komplexe auszubilden. Die hier vorgelegte Arbeit befaßte sich mit der Isolierung, der strukturellen und funktionellen Charakterisierung des Proteins und seinem Vorkommen in verschiedenen Geweben von Ratten mit pathologisch erhöhtem Blutdruck: · Es wurde eine Methode zur schonenden Isolierung von HSP25 aus Ehrlich-Ascites-Tumor (EAT) etabliert. Daraus konnte niedrig- und hochmolekulares Material gewonnen werden. · Unter Anwendung elektronenmikroskopischer und hydrodynamischer Methoden konnte für die hochmolekularen Komplexe des nativen HSP25 ein Strukturmodell abgeleitet wer-den. Es ist durch eine zylinderförmige Struktur aus vier gestapelten Ringen mit je acht HSP25-Monomeren charakterisiert. · Hochmolekulare Komplexe des rekombinanten HSP25 liegen demgegenüber als kom-pakte globuläre Strukturen vor. Elektronenmikroskopische Analysen verschiedener Mutanten und von phosphoryliertem HSP25 zeigen, daß die HSP25-Komplexe mit zu-nehmender Phosphorylierung kleiner werden. Dies belegt einen Zusammenhang zwischen dem Phosphorylierungszustand des Proteins und seiner supramolekularen Organisation. · Mittels Elektronenmikroskopie und Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß nur natives HSP25 aus EAT, aber nicht rekombinantes HSP25 oder HSP25-Mutanten die Actinpolymerisation hemmen. Dies bestätigt den Befund, daß nur unphosphorylierte nati-ve HSP25-Monomere für die Inhibierung der Actinpolymerisation verantwortlich sind. · Es konnten zwei HSP25-Peptide identifiziert werden, die eine Hemmung der Actinpoly-merisation auslösen. Damit konnte erstmals experimentell nachgewiesen werden, daß be-stimmte Sequenzabschnitte von HSP25 eine spezifische Wechselwirkung mit Actin ein-gehen. Mit Hilfe phosphorylierter HSP25-Peptide konnte die Abhängigkeit dieser Reaktion vom Phosphorylierungszustand bestätigt werden. · Vorläufige Ergebnisse mit Zellulose-gebundenen Peptid-Bibliotheken deuten auf eine Wechselwirkung von HSP25 mit einem exponierten Loop in Actin-Domäne IV hin, einem Bereich, der an Actin-Actin-Wechselwirkungen beteiligt ist. · HSP25 hat aufgrund seiner verstärkten Synthese bei vielen pathologischen Prozessen eine medizinische Relevanz. Untersuchungen an verschiedenen Tiermodellen zeigen, daß es bei Hypertonie-belasteten Herzen verstärkt im rechten Ventrikel akkumuliert wird. · Es wird ein Modell vorgestellt, in dem die Struktur-Funktions-Beziehungen für HSP25 zusammengefaßt sind. / HSP25 is a member of the ubiquitous family of small heat shock proteins belonging to the big class of stress proteins. It is related to acquiring of cellular thermotolerance, can act as molecular chaperone, is able to inhibit polymerization of actin in vitro and can form high molecular weight complexes. In this thesis the isolation, structural and functional characteri-zation of this protein as well as its abundance in different tissues of rats suffering on patho-logical forms of hypertension is analyzed: · A method for rapid isolation of HSP25 out of Ehrlich-ascites-tumor (EAT) was estab-lished. From isolated HSP25 low and high molecular weight material could be obtained. · Analysis of high molecular weight complexes by means of electron microscopy and ana-lytical ultracentrifugation results in a structural model characterized by a cylindrical structure composed of four stacked rings each containing eight HSP25 monomers. · High-molecular weight complexes of recombinant HSP25 are organized as compact globular structures. Electron microscopic investigations of different mutants and of in vi-tro phosphorylated HSP25 show a connection between phosphorylational status and su-pramolecular organization of the protein: the higher the degree of phosphorylation the smaller are the HSP35-complexes. · By means of electron microscopy and fluorescence spectroscopy it could be shown that only native HSP25 from EAT but not recombinant HSP25 nor HSP25 mutants inhibit polymerization of actin. This is in agreement with recent results showing that only un-phosphorylated native HSP25 monomers are active inhibitors of actin polymerization. · Two HSP25 derived peptides could be identified as competent inhibitors of actin polym-erization. This is the first experimental evidence for a specific interaction of HSP25 se-quences with actin. This interaction is dependent on the phosphorylational status as con-firmed by phosphorylated HSP25 peptides. · Preliminary results with cellulose bound peptide libraries indicate an interaction of HSP25 with an exposed loop in actin domain IV, an area involved in actin-actin interactions. · HSP25 is of medical relevance because of its increased synthesis in a bright variety of pathological processes. Investigations on different animal models of hypertension show an enhanced accumulation of HSP25 in the right ventricle. · A model is presented summing up the structure-function relationships of HSP25.

Diese Arbeit befasst sich mit der Kinetik der Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen. Anhand dreier Beispiele, der Phosphoglyceratkinase (PGK) aus Hefe, einer Variante von Barstar und des Prion-Proteins des Syrischen Hamsters (SHaPrP(90-232)) wurde insbesondere die Kinetik der Bildung von Amyloidfibrillen und deren kinetischer Vorläuferstrukturen mittels dynamischer und statischer Lichtstreuung, Circulardichroismus, Infrarotspektroskopie, Elektronenmikroskopie und teilweise analytischer Chromatographie untersucht. Die Kinetiken wurden mit Konzepten der Aggregationstheorie von Kolloiden und der chemischen Kinetik beschrieben. Die Modellierung der Kinetiken weist ausgehend von der monomeren PGK bei pH 2 und 190 mM NaCl auf eine zweistufige Reaktionskaskade, bestehend aus irreversiblen, bimolekularen Elementarschritten hin. Während der ersten Stufe wird ein engverteiltes Ensemble von Oligomeren mit einer mittleren Masse von 10 Monomeren und wesentlichen Anteilen an beta-Faltblattstrukturen gebildet. Die Protofibrillen entstehen durch die Vereinigung der strukturell polaren Oligomere, die durch die erste Reaktionsstufe bereitgestellt werden und als kritische Oligomere bezeichnet werden. Die gefundene Kopplung des Wachstums der intermediären Zustände und die Zunahme der beta-Faltblattstruktur kann innerhalb eines verallgemeinerten Diffusions-Kollisions-Modells interpretiert werden, bei dem die beta-Stränge durch intermolekulare Wechselwirkungen stabilisiert werden. Die Fehlfaltung und Aggregation des SHaPrP(90-232) bei pH 4.2 und 1 M GuHCl und geeigneten Zusätzen an Salz zeigt einen augenscheinlichen Zweizustandsübergang mit hoher Reaktionsordnung ( >2.5) zwischen dem monomeren, alpha-helikalen Ausgangszustand und einem beta-faltblattreichen, ringförmigen Oktamer. Die Progresskurven der Umwandlung der Sekundärstruktur lassen sich mit dem Zeitverlauf einer bimolekularen Reaktion anpassen. Das Oktamer bildet bei hohen eingesetzten Proteinkonzentrationen Multimere. Auf sehr langen Zeitskalen setzt die Bildung von Protofibrillen ein. Das kritische Oktamer stellt die Vorstufe der nachgeschalteten Wachstumsphänomene dar. Unter geeigneten Umgebungsbedingungen kann der nicht-nativ, partiell gefaltete Zustand von Barstar bei niedrigem pH (A-Zustand) in einem zweistufigen Prozess erst in Protofibrillen und anschlie"send in reife Amyloidfibrillen konvertiert werden. Zur Aktivierung der Konversion des oligomeren A-Zustandes (mittlere Masse von 16 Monomeren) sind moderate Ionenstärken ([NaCl]>0) und erhöhte Temperaturen (T>50°C) notwendig. Die Bildung der Protofibrillen ist unabhängig von der eingesetzten Proteinkonzentration. Bei Raumtemperatur und entsprechender Ionenstärke bilden sich amorphe Aggregate. Dagegen führt die Erhöhung der Temperatur in Abwesenheit von Salz zur Dissoziation des oligomeren A-Zustandes. Alle drei Proteine müssen zur Ausbildung protofibrillärer Strukturen und gegebenenfalls reifer Fibrillen oligomere Zustände mit partiell gefalteter Konformation einnehmen. Diese kritischen Oligomere sind langlebige Intermediate, die den Dreh- und Angelpunkt für die Bildung nachgeordneter Strukturen darstellen. Die Bildung von Amyloidfibrillen ist somit ein mehrstufiger hierarchischer Strukturbildungsprozess. Die in der Literatur bekannten Modelle der nukleierten Polymerisierung und der nukleierten Konformationskonversion werden dem höchstens in gewissen Teilaspekten gerecht. Die Annahme einer universellen Kinetik der Amyloidbildung kann im Lichte der Ergebnisse dieser Arbeit nicht aufrechterhalten werden. Dagegen scheinen die Zustände des kritischen Oligomers und der Protofibrille als Hierarchiestufen der Amyloidbildung generische Bestandteile des Prozesses zu sein. Die Kinetik der Bildung der verschiedenen Hierarchiestufen weist keine nennenswerten Gemeinsamkeiten zwischen den drei untersuchten Proteinen auf. / This thesis deals with the kinetics of misfolding and aggregation of proteins. The kinetics of amyloid formation and precursors of three proteins, phosphoglcerate kinase (PGK), a barstar variante and the Syrian hamster Prion protein (SHaPrP(90-232)) were investigated by the use of dynamic and static light scattering, infrared spectroscopy, circular dichroism, electron microscopy and in part by analytical chromatography. The kinetics were described with concepts from the theory of colloidal aggregation and chemical kinetics. The modelling of the kinetics starting from the monomeric PGK at pH 2 and 190 mM NaCl points to a two stage reaction cascade built up by irreversible, bimolecuar elementary reaction steps. During the first stage a narrow distributed ensemble of oligomeric states with an average mass of ten monomers and essentially ordered amounts of beta-sheet structure is built up. Protofibrils are formed by coalescence of the structural polar oligomers provided by the first stage which are termed critical oligomers. The found coupling between growth and acquisition of beta-sheet structure is interpreted in terms of a generalized diffusion-collision model, where stabilization takes place by intermolecular interactions. The misfolding and aggregation of SHaPrP(90-232) shows an apparent two-state transition between the initial monomeric, alpha-helical state and an beta-sheet rich, annular octamer with high reaction order (>2.5) at pH 4.2 and 1 M GuHCl with appropriate amounts of salt added. Progress curves monitoring the secondary structure transition can be fitted by the time-course of bimolecular reactions. The octamer forms multimers at high protein concentrations. Formation of protofibrils sets up on very long time-scales. The critical octamer is a precursor for all subsequent growth processes. The non-native, partially folded state of barstar at low pH (A-state) can be converted in a two-stage process first to protofibrils and then to mature amyloid fibrils under appropriate environmental conditions. Conversion of the oligomeric A-state (average mass of 16 monomers) can be activated by elevated temperatures (T>50°C) in the presence of moderate amounts of salt ([NaCl]>0). Formation of protofibrils is independent of protein concentration. Amorphous aggregates are formed at room temperature with sufficient amounts of salt added. In contrast elevated temperatures in absence of salt lead to dissociation of the oligomeric A-state. All three proteins have to populate an oligomeric, partially folded state to form protofibrils and eventually mature fibrils. These critical oligomers are long-lived intermediates which are the pivotal point from which all other structures arise. Formation of amyloid fibrils is a hierarchical assembly process where structures are built up by several stages. Models known from the literature, in particular nucleation polymerization and nucleated conformational conversion, only master partial aspects of amyloid formation. The wide-spread assumption of a universal kinetics of amyloid formation turns out to be unjustified. In contrast, the states of critical oligomer and protofibril seem to be generic parts of the hierarchical assembly process. Comparison of the kinetics of each hierarchical level amoung the three investigated proteins shows no considerable similarities.

Die Modifizierung von Proteinsequenzen unter anderem durch den Austausch von Aminosäuren ist ein zentraler Aspekt in evolutionären Prozessen. Solche Prozesse ereignen sich nicht nur innerhalb großer Zeiträume und resultieren in der Vielfalt des Lebens, das uns umgibt, sondern sind auch täglich beobachtbar. Diese mikroevolutionären Prozesse bilden eine Grundlage zur Immunabwehr höherer Wirbeltiere und werden durch das humorale Immunsystem organisiert. Im Zuge einer Immunantwort werden Antikörper wiederholt der Diversifizierung durch somatische Hypermutation unterworfen. Ziele dieser Arbeit waren, neue Kenntnisse über die Mikroevolution von Antikörpern während der Immunantwort zu gewinnen und die Beziehung zwischen Aminosäureaustauschen und Affinitätsänderungen zu verstehen. Zu diesem Zweck wurde zunächst gezeigt, dass die SPOT Synthese eine präzise Methode ist, um Signalintensitäten drei verschiedenen Bindungsaffinitätsklassen zuzuordnen. Antikörper-Peptid Bindungsdaten, die aus SPOT Synthese Experimenten generiert wurden, bildeten die Grundlage zur Konstruktion der Substitutionsmatrix AFFI - der ersten Substitutionsmatrix, die ausschließlich auf Bindungsaffinitätsdaten beruht. Diese bildete die Grundlage für die Gewinnung eines reduzierten Aminosäuresatzes. Durch einen theoretischen Ansatz konnte gezeigt werden, dass der reduzierte Aminosäuresatz eine optimale Basis für die Epitopsuche darstellt. Für den Prozess der somatischen Hypermutation und Selektion wurde ein neuer Ansatz präsentiert, um für die Affinitätsreifung relevante Mutationen zu identifizieren. Die Analyse zeigte, dass das Spektrum der selektierten Mutationen viel umfangreicher ist als bisher angenommen wurde. Die Tatsache, dass auch einige stille Mutationen stark bevorzugt werden, deutet darauf hin, dass entweder die intrinsische Mutabilität stark unterschätzt wurde oder, dass Selektion nicht nur auf Affinitätsreifung von Antikörpern basiert sondern auch auf ihrer Expressionsrate. / A central task of the evolutionary process is the alteration of amino acid sequences, such as the substitution of one amino acid by another. Not only do these amino acid changes occur gradually over large time scales and result in the variety of life surrounding us, but they also happen daily within an organism. Such alterations take place rapidly for the purposes of defense, which in higher vertebrates, is managed by the humoral immune system. For an effective immune response, antibodies are subjected to a micro-evolutionary process that includes multiple rounds of diversification by somatic hypermutation resulting in increased binding affinity to a particular pathogen. The goal of this work was to provide insights into the microevolution of antibodies during the immune response, including the relationship between amino acid substitutions and binding affinity changes. A preliminary step in this work was to determine the accuracy of the SPOT synthesis technique, which could be shown to be an accurate method for assigning measured signal intensities to three different binding affinity classes. A substitution matrix based on data produced with these binding experiments was constructed and named AFFI. AFFI is the first substitution matrix that is based solely on binding affinity. A theoretical approach has additionally revealed that an AFFI-derived reduced set of amino acids constitutes an optimal basis for epitope searching. For the process of somatic hypermutation and selection, a novel approach to identify mutations relevant to affinity maturation was presented. The analysis revealed that the spectrum of mutations favored by the selection process is much broader than previously thought. The fact that particular silent mutations are strongly favored indicates either that intrinsic mutability has been grossly underestimated, or that selection acts not only on antibody affinity but also on their expression rates.

Fehlerhafte sekretorische Proteine werden über einen speziellen Abbauweg, die ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD), mit Lysin48-verknüpften Ubiquitinketten polyubiquitiniert und dem proteolytischen Abbau am 26S Proteasom zugeführt. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae bilden die beiden ER-membranständigen RING-Ubiquitinligasen Hrd1 und Doa10 zentrale Komponenten im Ubiquitinierungsprozess. Das lösliche zytosolische Ubiquitin-konjugierende Enzym Ubc7, welches mit beiden Ligasen bei der Polyubiquitinierung von Substratproteinen zusammenwirkt, wird über den membranverankerten Co-Faktor Cue1 an die ER-Membran rekrutiert. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse belegen zwei weitere Funktionen für Cue1 im Ubiquitinierungsprozess: Die Bindung von Ubc7 an einen carboxyterminalen Bereich in Cue1 führt zur Stimulation der Ubiquitinierungsaktivität von Ubc7 mit den RING-Ligasen. Darüber hinaus bewirkt die Ubiquitin-bindende CUE-Domäne in Cue1 eine Steigerung der Länge der Ubiquitinketten und deren Syntheserate, was zum effektiven Abbau einiger ER-membrangebundener Substratproteine beiträgt. Die durch Ubc7 synthetisierten Lysin48-verknüpften Ubiquitinketten werden in Abhängigkeit eines schleifenförmigen sauren Bereichs in Ubc7 gebildet. Entfernen dieses Bereichs resultiert im Abbruch der Ubiquitinierung nach Konjugation eines Monoubiquitins auf dem Substrat. An der Hrd1-Ligase werden durch Ubc7 polyubiquitinierte Proteine umgehend zum Proteasom transferiert. Für den Doa10-abhängigen Substratabbau ist die Funktion eines weiteren Ubiquitin-konjugierenden Enzyms, Ubc6, notwendig. Die hier gezeigten Daten weisen auf eine Ubc6-abhängige Verknüpfung von Ubiquitinmolekülen in einer Lysin11-abhängigen Weise hin. Eine Inhibition der Synthese Lysin11-verknüpfter Ubiquitinketten hatte jedoch keinen Effekt auf den Abbau von Substratproteinen. Stattdessen wurde der Abbau von Ubc6 selbst durch Unterbindung der Bildung Lysin27-verknüpfter Ubiquitinketten verhindert. / Aberrant secretory proteins are removed from the cell in a process termed „endoplasmic reticulum-associated protein degradation" (ERAD), as it screens the endoplasmic reticulum for unwanted polypeptides and triggers their elimination via the 26S proteasome. To this end, client proteins of the ERAD pathway are polyubiquitinated with lysine48-linked ubiquitin chains at the ER membrane. Two ER membrane-integrated RING ubiquitin ligases, Hrd1 and Doa10, constitute central components of the ubiquitination machinery in Saccharomyces cerevisiae. To polyubiquitinate substrate proteins, both ligases interact with the ubiquitin-conjugating enzyme Ubc7. Since Ubc7 itself is a soluble cytosolic protein, it is recruited to the ER-membrane by is anchoring factor Cue1. Results in this study reveal two additional functions of Cue1 in the ubiquitination reaction: First, binding of Ubc7 to the Cue1-carboxyterminus stimulates the ubiquitin chain formation by Ubc7 and the ligases. Second, the CUE domain within Cue1 increases the chain length and accelerates the synthesis of the polyubiquitin chain, which results in efficient degradation of certain substrate proteins. Formation of lysine48-linked ubiquitin chains by Ubc7 depends on an acidic loop within Ubc7. Deletion of this structure leads to inhibition of ubiquitin chain elongation after the initial substrate monoubiquitination. Client proteins, ubiquitinated by Ubc7 and Hrd1, are immediately transferred to the proteasome. For Doa10-dependent substrate degradation, the activity of another ubiquitin-conjugating enzyme, Ubc6, is required. Data shown here indicate a function of Ubc6 in the formation of lysine11-linked polyubiquitin, since mutation of this lysine residue resulted in the prevention of ubiquitin chain synthesis. However, expression of this ubiquitin mutant had no effect on substrate degradation. Moreover, the proteolysis of Ubc6 itself is inhibited by prevention of lysin27-linked polyubiquitin chain formation.

Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002, JMB, 317, 401) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin alpha/beta abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin alpha/beta abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2, eine non-ATPase Untereinheit sowie eine ATPase Untereinheit des Base Komplex, funktionelle cNLS beherbergen. Die Deletion der Rpt2 NLS führte zur wt Lokalisation der proteasomalen Subkomplexe. Die Deletion der NLS in Rpn2 dagegen bewirkte eine verschlechterte proteasomale Funktion und eine Mislokalisation der Komplexe. Unsere Daten unterstützen ein Modell wonach die nukleären 26S Proteasomen aus Subkomplexen zusammengelagert werden, die durch Karyopherin alpha/beta in den Zellkern gelangen. / 26S proteasomes fulfil final steps in the ubiquitin-dependent degradation pathway by recognising and hydrolysing ubiquitylated proteins. As the 26S proteasome mainly localises to the nucleus in yeast, we addressed the question how this 2 MDa multisubunit complex is imported into the nucleus. 26S proteasomes consist of 20S proteolytically active core and 19S regulatory particles, the latter composed of two subcomplexes, namely the base and lid complexes. We have shown that 20S core particles are translocated into the nucleus as inactive precursor complexes via the classical karyopherin alpha/beta import pathway (Lehmann et al. 2002; JMB, 317, 401). Here, we provide evidence that nuclear import of base and lid complexes also depends on karyopherin alpha/beta. Potential classical nuclear localisation sequences (NLS) of base subunits were analysed. Rpn2 and Rpt2, a non-ATPase and an ATPase subunit of the base complex, harbour functional NLS. The Rpt2 NLS deletion yielded wild type localisation. However, the deletion of the Rpn2 NLS resulted in improper nuclear proteasome localisation and impaired proteasome function. Our data support the model by which nuclear 26S proteasomes are assembled from subcomplexes imported by karyopherin alpha/beta.

Das Amyloid-beta Peptid (Ab) ist der Hauptbestandteil der extrazellulären Plaques bei der Alzheimerschen Krankheit. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Mechanismen der Wechselwirkungen des Ab mit der Plasmamembran und der nachfolgenden zellulären Aufnahme aufzuklären. Die Aggregation, die zelluläre Aufnahme und die Zytotoxizität von Ab42 wurden durch Verwendung von fluoreszenzmarkierten Ab42 in einem Neuroblastomzellkulturmodell untersucht. Sowohl bei Inkubation mit Monomeren als auch mit Aggregaten wurde in den Zellen Ab42 detektiert. Dabei binden Ab42 Monomere und kleine Aggregate zunächst an die Zellmembran. Allerdings erfolgt keine direkte Aufnahme von Monomeren in die Zelle. Erst nach Ausbildung von Aggregaten mit geordneter Sekundärstruktur wurde Ab42 in den endozytotischen Vesikel detektiert. Voraussetzung für den an der Membran ablaufenden Aggregationsprozess ist, dass die Monomere oberhalb einer kritischen Konzentration anwesend sind, um eine Bildung von beta-Faltblatt-Strukturen (bF) und entsprechenden Aggregaten zu ermöglichen. Ab42 Aggregate, die sich durch eine bF auszeichneten, benötigten keine kritische Schwellenkonzentration für die endozytotische Aufnahme. Eng mit der Aufnahme von Ab42 Aggregaten war die Veränderung des zellulären Metabolismus verbunden. Um die Wechselwirkung zwischen Ab und der Membrannäher zu charakterisieren, wurden Modellmembransystemen einschl. riesigen Membranvesikeln genutzt. Dabei wurde beobachtet, dass sowohl Ab42 als auch Ab40 Einstülpungen in der Membran induzieren können. Kleine Aggregate beider Isoformen, die noch keine bF aufweisen, interagierten bevorzugt mit der ungeordneten Lipidphase und induzierten dabei eine negative Membrankrümmung. Diese Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass möglicherweise das Ab selbst den endozytotischen Prozess unterstützt oder diesen sogar einleiten könnte. Dies könnte auch auf eine mögliche physiologische Funktion von Ab Aggregaten, die nicht toxisch sind, hindeuten. / The accumulation of Amyloid beta peptide 1-42 (Ab42) in extracellular plaques is one of the pathological hallmarks of Alzheimer’s disease. Several studies have suggested that a cellular reuptake of Ab42 may be a crucial step in its cytotoxicity, but mechanisms of Ab-membrane interaction and subsequent cellular uptake are not yet understood. The first aim of the present study is to answer the question whether aggregate formation is a prerequisite or a consequence of Ab-membrane interaction and of Ab endocytosis. We visualized aggregate formation of fluorescently labeled Ab42 by Förster resonance energy transfer and tracked its internalization by human neuroblastoma cells. Both monomeric and aggregated Ab42 entered the cells, however, monomer uptake faced a concentration threshold and occurred only at concentrations and time scales that allowed beta-sheet-rich (bS) aggregates to form. By uncoupling membrane binding from internalization, we found that Ab42 monomers as well as small aggregate species bound rapidly to the plasma membrane and formed bS aggregates. These structures were subsequently taken up and accumulated in endocytic vesicles. This process correlated with inhibition of cellular metabolism activities. Our data therefore imply that the formation of bS aggregates at the cell membrane is a prerequisite for Ab42 uptake and cytotoxicity. The second aim of the study is to investigate the Ab-membrane interaction in vitro by using giant unilamellar vesicles and giant plasma membrane vesicles as model membrane systems. We found that both Ab isoforms, Ab42 and Ab40, interacted with the liquid disordered phase of model membranes. Early aggregation intermediates, which did not yet bind to the amyloiddophilic dye Thioflavin T, induced negative membrane curvature. The ability of Ab to induce membrane deformation suggests that Ab may facilitate its own endocytosis. It also hints at a possible physiological function of non-toxic Ab aggregate species.

Die muskelspezifischen RING-Finger Ubiquitin E3 Ligasen MuRF1, MuRF2 und MuRF3 werden mit verschiedenen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht. MuRF1 und MuRF3 beteiligen sich am Abbau mehrerer Muskelstrukturproteine über das Ubiquitin Proteasom System (UPS) und spielen somit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Skelett- und Herzmuskelstruktur und -funktion. MuRF1 wurde als Atrophie-Marker identifiziert, da seine Expression während der Muskelatrophie ansteigt, und MuRF2 und MuRF3 wirken bei der Stabilisierung von Mikrotubuli und Differenzierung von Myozyten mit. Dennoch sind bisher viele Aspekte der Funktion von MuRF-Proteinen ungeklärt. Die Domänenstruktur der MuRF-Proteine zeigt mehrere hochkonservierte Domänen, die sich an Protein-Protein Interaktionen beteiligen. Die Identifizierung und Charakterisierung ihres Interaktoms ermöglicht ein besseres Verständnis ihrer Funktionen. Aus diesem Grund wurden quantitative massenspektrometrische Analysen durchgeführt, um neue Interaktionspartner und Substrate für MuRF1, 2 und 3 zu identifizieren. Sorting nexin 5 (SNX5), eine Untereinheit des Retromers in Säugetieren, wurde als Interaktionspartner von MuRF3 identifiziert. SNX5, das eine wichtige Rolle in subzellulären Transport-Signalwegen spielt, interagierte über seine BAR-Domäne mit MuRF3. SNX5 und MuRF3 co-lokalisierten und assoziierten mit vesikulären Strukturen des subzellulären Transport-Signalweges. SNX5 wurde außerdem als Substrat von MuRF2 identifiziert. MuRF2 band und ubiquitinierte SNX5 in vivo und vermittelte damit dessen Abbau über das UPS. MuRF3 stabilisierte SNX5 durch die Inhibierung dieses Abbaus. Somit konnten MuRF2 und MuRF3 mit einem in subzellulärem Transport aktiven Protein in Verbindung gebracht werden, das direkt mit Mikrotubuli assoziiert und funktionell von einem stabilen Mikrotubuli-Netzwerk abhängig ist. Dies legt eine mögliche regulatorische Rolle von MuRF2 und MuRF3 in Mikrotubuli-abhängigen subzellulären Transportwegen nahe. / Muscle specific RING-Finger ubiquitin E3 ligases MuRF1, MuRF2 and MuRF3 have been implicated in several cellular functions. MuRF1 and MuRF3 have been shown to bind and degrade muscle contractile and structural proteins via the ubiquitin proteasome system (UPS), thus playing an important role in the maintenance of skeletal and cardiac muscle structure and function. MuRF1 is considered an atrophy marker since its expression increases during muscle atrophy. MuRF2 and MuRF3 are involved in myocyte differentiation and both bind to and stabilize microtubules. Nevertheless, many aspects of the functions of the MuRF-family are unknown. The domain structure of the MuRF family implicates several highly conserved domains involved in protein-protein interaction. Accordingly, one way to better understand the role of MuRF proteins in myocyte function and protein homeostasis is to identify and characterize their interactome. Therefore, quantitative mass spectrometric analysis was used to identify novel interaction partners and target proteins of MuRF1, 2 and 3. Sorting nexin 5 (SNX5), a mammalian retromer subunit which plays an important role in subcellular trafficking pathways, was identified as a novel interaction partner of MuRF3, with which it interacted via its Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR)-domain. SNX5 and MuRF3 co-localized and associated with early endosomes, connecting the microtubule-binding MuRF3 to structures of subcellular trafficking pathway. SNX5 was also identified as a substrate of MuRF2, which interacted with and ubiquitinated SNX5 in vivo, mediating its degradation in a UPS-dependent manner. This MuRF2-mediated degradation was inhibited by MuRF3, which stabilized SNX5. Thus, MuRF2 and MuRF3 were linked to a subcellular trafficking protein, SNX5, which is directly associated with microtubules and functionally dependent on a stable microtubule network, suggesting a possible regulatory role of MuRF2 and MuRF3 in microtubule-dependent subcellular trafficking pathways.