Die erfolgreiche Synthese und Faltung von Proteinen ist eine Voraussetzung der Zellfunktion und ein Versagen der Proteinhomöostase führt zu Krankheit oder Tod. In der Zelle sichern molekulare Chaperone die korrekte Faltung der Proteine oder tragen zur Entsorgung unwiederbringlich fehlgefalteter Proteinsubstrate bei. Unter diesen Chaperonen sind kleine Hitzeschockproteine (sHsp) ein ATP-unabhängiger Teil des Proteostasenetzwerks. In dieser Arbeit habe ich das bisher wenig erforschte sHsp HSP-17 aus C. elegans untersucht. Im Gegensatz zu anderen sHsps zeigte HSP-17 nur eine geringe Aktivität beim Verhindern der Aggregation von Proteinsubstraten. Stattdessen konnte ich in vitro zeigen, dass HSP-17 die Aggregation von Modellsubstraten fördert, was hier für Metazoen-sHsps erstmals gezeigt wurde. HSP-17 kopräzipitiert mit Substraten und modifiziert deren Aggregate möglicherweise. HSP-17 kolokalisiert in vivo mit Aggregaten, und seine aggregationsfördernde Aktivität konnte ich für das physiologische Substrat KIN-19 und heterolog exprimierte polyQ-Peptide validieren. Durch ex vivo Analysen konnte ich zeigen, dass die Aktivität von HSP-17 für die Fitness relevant ist  In einem zweiten Projekt habe ich zur Entwicklung eines neuen Modelles für Aß-Pathologie in C. elegans beigetragen, welches substöchiometrische Markierungen verwendet, um eine zeitnahe Visualisierung der Aß-Aggregation in spezifischen Zelltypen zu ermöglichen. Das Modell spiegelt bekannte Phänotypen der Aß-Proteotoxizität aus Menschen und bestehenden C. elegans Aß-Stämmen wider. Interessanterweise zeigt eine Untergruppe der Neuronen, die IL2-Neuronen, eine höhere Anfälligkeit für die Aggregation und Proteotoxizität von Aß1-42. Eine gezielte Reduktion von Aß1-42 in IL2 Neuronen führt zu einer systemischen Reduktion der Pathologie. Somit bietet das Modell eine neue Plattform, um die Bedeutung molekularer Chaperone, wie z. B. der sHsps, für Amyloidosen zu untersuchen, auch im Hinblick auf menschliche Erkrankungen. / Successful synthesis and folding of proteins is a prerequisite for cellular function and failure of protein homeostasis leads to disease or death. Within the cell, molecular chaperones ensure correct protein folding or aid in the disposal of terminally misfolded protein substrates. Among these chaperones, small heat shock proteins (sHsps) are ATP-independent members of the proteostasis network. In this work, I analyzed the so far under-researched C. elegans sHsp HSP-17. Unlike other sHsps, HSP-17 exhibited only weak activity in preventing aggregation of protein substrates. Instead, I could show in vitro that HSP-17 can promote the aggregation of protein substrates, which is the first demonstration for metazoan sHsps. HSP-17 co-precipitates with substrates and potentially modifies the aggregates.  HSP-17 colocalizes with aggregates and pro-aggregation activity is present in vivo, which I demonstrated for the physiological substrate KIN-19 and heterologously expressed amyloidogenic polyQ peptides. By physiological, biochemical and proteomic analysis I showed that HSP-17 activity is relevant for organismal fitness In a second project, I contributed to the development and characterization of a novel model of Aß pathology in C. elegans. This new AD model employs sub-stoichiometric labeling to allow live visualization of Aß aggregation in distinct cell types. The model mirrors known phenotypes of Aß proteotoxicity in humans and existing C. elegans Aß strains. Interestingly, a subset of neurons, the IL2 neurons, is shown to be more vulnerable to Aß proteotoxicity and targeted depletion of Aß in these neurons systemically ameliorates pathology. Thereby, the model presents a new platform to assess the relevance of molecular chaperones such as sHsps in amyloidosis with a perspective on human disease.

Kovalente posttranslationale Modifikationen (PTMs) beeinflussen die Struktur und Funktion von Proteinen. Zu den bedeutendsten PTMs zählt die Proteinphosphorylierung. Labile Phosphorylierungen an Cystein- und Lysinresten, sowie Pyrophosphorylierungen an Serin- und Threoninbausteinen sind vermehrt in den Fokus der Wissenschaft gerückt. Trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der Massenspektrometrie (MS) bleibt die Analyse dieser empfindlichen Modifikationen mittels Tandem-MS eine große Herausforderung. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass Elektronentransferdissoziation (ETD) in Kombination mit zusätzlicher HCD Aktivierung (EThcD) in der Lage ist, Peptide mit labilen Phosphorylierungen in der Seitenkette unter Erhalt der Modifikation zu fragmentieren. In verschiedenen proteomischen Ansätzen wird demonstriert, dass EThcD eine zweifelsfreie Identifizierung natürlich vorkommender Cysteinphosphorylierungen ermöglicht. Darüber hinaus wurde unter dem Gesichtspunkt der Labilität von Lysinphosphorylierungen ein bottom-up-Phosphoproteomikansatz etabliert. Das MS-Verfahren beruht auf der Generierung eines diagnostischen Phospholysinimmoniumions, welches im zweiten Schritt die Erfassung eines zusätzlichen EThcD-Spektrums desselben Precursorions veranlässt (triggert). Darüber hinaus wird im Zuge dieser Arbeit gezeigt, dass sich pyrophosphorylierte Peptide unter CID-Bedingungen in ihrem Neutralverlustmuster von isobaren diphosphorylierten Peptiden unterscheiden. Dieses Verhalten stellt einen Schlüsselschritt in einer neutralverlustgetriggerten EThcD Methode dar, welche die zweifelsfreie Identifizierung von Pyrophosphorylierungen ermöglicht. Darauf basierend konnten in Hefezellen und humanen embryonalen Nierenzellen die ersten Proteinpyrophosphorylierungen, einer neuen endogenen posttranslationalen Modifikation, nachgewiesen werden. / Covalent posttranslational modifications (PTMs) influence the structure and function of proteins. Protein phosphorylations belong to the most important PTMs. Rarely characterized labile phosphorylations, for instance phosphorylations of cysteine and lysine and pyrophosphorylations of serine and threonine residues got into the focus of science. However, the analysis of those delicate modifications via tandem mass spectrometry remains a challenge. In the present work, it is shown that electron-transfer dissociation (ETD) combined with HCD supplemental activation (EThcD) is able to fragment peptides with labile phosphorylations at the side chains without losing the modification. In several bottom-up proteomic approaches, EThcD allowed the reliable identification of a naturally occurring cysteine phosphorylation. Moreover, methods for identification of lysine phosphorylations were developed. For the proteome wide analysis of lysine phosphorylations, considering the lability, a bottom-up phosphoproteomic approach with a highly selective mass spectrometry method was established. The MS-method relies on the generation of diagnostic phospholysine immonium ions during HCD, which trigger in a second step an additional EThcD spectrum of the same precursor ion. This strategy ensures the confident identification of lysine phosphorylated peptides. Furthermore, the present work shows that isobaric pyro- and diphosphorylated peptides differ in their neutral loss pattern during CID. This behavior was a key step in a specific neutral loss triggered EThcD method, which enabled the reliable identification of pyrophosphorylations. This method allowed the identification of the first protein pyrophosphorylations, a new endogenous PTM, in yeast and human embryonic kidney cells.

Die Interaktion von RING-finger-Ubiquitin (Ub)-Ligasen (E3-Enzyme) mit Ub-konjugierenden Enzymen (E2-Enzyme) bestimmt wie schnell ein Zielprotein mit einer Ub-Modifikation versehen wird. In dieser Arbeit wird die Stimulation der E2-Enzyme Ubc6 und Ubc7 durch die E3-Enzyme Hrd1 und Doa10 untersucht. Es wird gezeigt, dass Ubc6~Ub-Konjugate bereitwilliger sogenannte "closed conformations" annehmen als Ubc7~Ub-Konjugate, was wiederum die Tendenz, Ub zu übertragen, steigert. Die katalytische Aktivität von Ubc7 kann durch RING-Domänen stimuliert werden. Durch einen allosterischen Mechanismus, der linchpin allostery, werden Ubc7~Ub-Intermediate in "closed conformations" gedrängt. Zusätzlich werden spezifische Kontakte zwischen RING-finger-Domänen und der Ub-Einheit in einem E2~Ub-Konjugat identifiziert. Diese schränken die Flexibilität des Konjugates weiter ein und begünstigen dadurch die Reaktivität des E2~Ub-Intermediates. Dieser Mechanismus scheint weit verbreitet zu sein und wurde schon bei anderen Ub-Ligasen beobachtet. Poly-Ub-Signale werden in mehreren Schritten generiert. In einer Priming genannten Reaktion wird die erste Ub-Einheit auf das Zielprotein übertragen. Dieser Vorgang erfordert sehr flexible Enzyme, die in diversem Umfeld Akzeptorstellen finden und mit Ub modifizieren. Die zweite Reaktion, die elongation, umfasst das schrittweise Anheften weiterer Ub-Moleküle an die erste Einheit. Im Gegensatz zum Priming, beruht die Bildung einheitlicher Ketten auf der wiederholten und robusten Konjugation von Ub-Molekülen in gleichbleibendem Milieu. Ub-Ligasen verwenden verschiedene Strategien, um die unterschiedlichen Herausforderungen dieser Reaktionen zu bewältigen. Während Doa10 je ein E2-Enzym pro Reaktion nutzt, kann Hrd1 ein einzelnes E2-Enzym durch linchpin allostery ausreichend stimulieren, um beide Prozesse durchzuführen, wie diese Arbeit zeigt. / The interaction of RING-finger ubiquitin (Ub) ligases (E3 enzymes) with Ub conjugating enzymes (E2 enzymes) dictates how fast a Ub modification is synthesized on a client protein. This thesis addresses the catalytic stimulation of the E2 enzymes Ubc6 and Ubc7 by their cognate E3 enzymes Hrd1 and Doa10. Results show that Ubc6~Ub conjugates adopt closed conformations more readily than Ubc7~Ub conjugates, indicative for an inherently higher propensity to transfer Ub. The catalytic activity of Ubc7 can be stimulated by a RING domain which relies on so-called linchpin allostery. This drives Ubc7~Ub intermediates into a closed conformation. In addition, specific contacts of the RING-finger domain and the Ub moiety in an E2~Ub conjugate were identified which further restrict the flexibility of the conjugate and thereby increase the reactivity of the E2~Ub intermediate. This seems to represent a common mechanism for the stimulation of E2 enzymes because similar contacts of RING-finger proteins with Ub have been observed for other Ub ligases. Poly-Ub signals on proteins are generated in successive steps. The first reaction, called "priming", comprises the attachment of an initial Ub moiety to the target. This requires high flexibility of the involved enzymes to modify acceptor sites in a versatile environment. The second step is the sequential addition of Ub to previously attached Ub molecules in a process termed elongation. In contrast to priming, the formation of uniform Ub chains relies on the repeated and robust conjugation of Ub moieties in a mostly invariant setting. Ub ligases employ different strategies to meet the divergent requirements of these reactions. Doa10 uses separate E2 enzymes for priming and elongation. This thesis shows that Hrd1 efficiently stimulates a single E2 enzyme for the catalysis of both steps via linchpin allostery.

Posttranslationale Modifikationen sind chemische Veränderungen, die ein Protein nach der Translation durchläuft. Sie sind wichtig für die Regulierung der Funktion, Struktur und Interaktion von Proteinen. Die Einführung von Modifikationen in Biomoleküle ist zudem ein Hilfsmittel in der Chemischen Biologie, um neue Informationen über ihr Verhalten zu erlangen und ihre Aktivität zu verändern. Die Fehlregulierung von posttranslationalen Modifikationen steht häufig in direkter Verbindung zum Ausbruch von Krankheiten. Ein Beispiel ist das Tau Protein welches eine Schlüsselrolle in der Alzheimer Erkrankung hat. Im Laufe der Krankheit wird Tau hyperphosphoryliert, was zu einem Funktionsverlust des Proteins und zur Bildung von nicht-löslichen Aggregaten führt. Die Mechanismen hinter dieser Fehlregulierung zu eluieren gehört zu einer der großen Herausforderungen der Alzheimerforschung. Diese Doktorarbeit hat sich mit der Entwicklung einer neuen semi-synthetischen Ligationsstrategie beschäftigt, die es ermöglichen soll die Rolle einzelner Phosphorylierungen in der Prolin-reichen Region des Tau Proteins zu untersuchen. Hierfür wurden geeignete Ligationsstellen identifiziert, Ligationsmöglichkeiten geprüft und die Synthese der einzelnen Fragmente optimiert. Desweiteren wurde in dieser Dissertation eine neuartige Anwendung der Staudinger-Phosphonit Ligation entwickelt, die es ermöglicht mit Boran-geschützten P(III) Verbindungen azidhaltige Moleküle zu lichtspaltbaren Phosphonamidaten zu modifizieren. Die P(III) Bausteine beinhalteten dabei nicht nur zwei lichtspaltbare 2-Nitrobenzyl-Substituenten, sondern erlauben zudem über eine Alkingruppe eine vielfältige Funktionalisierung. Die Bestrahlung durch UV Licht induziert die Spaltung der P-N Bindung der Phosphonamidate und setzte das Ursprungsmolekül mit einer zusätzlichen Aminfunktion frei. Dahingehend wurden erste Schritte unternommen, damit die Lichtspaltung keine Modifikation mehr am Ursprungsmolekül hinterlässt. / Post-translational modifications are essential in the regulation of the function, folding and interaction of proteins. Similarly, the modification of biomolecules is a main tool in chemical biology to gain new insights into their molecular mechanisms and to alter and fine-tune their activity. The dysregulation of post-translational modifications is often associated with disease. An example are the abnormally hyperphosphorylated tau proteins that are the main component of neurofibrillary tangles, one of the pathological hallmarks of the neurodegenerative disease Alzheimer‘s disease. The origin of these hyperphosphorylations, which render a soluble and mostly unstructured protein into insoluble aggregates, is a key question in Alzheimer research. First steps towards a tau semi-synthesis that allow for the site-specific introduction of phosphorylations in the proline-rich domain were taken by identifying suitable ligation sites, finding the ideal sequential ligation strategy, providing reliable protein expression protocols and optimizing the synthesis of the synthetic peptides equipped with phosphorylated residues. Furthermore, this thesis explored the use of the Staudinger-phosphonite reaction in the synthesis of photo-cleavable phosphonamidates to modify biomolecules in a reversible manner. This conjugation method allowed for the chemoselective modification of an azido-containing target molecule with a borane-protected P(III) reagent that was equipped with photo-cleavable 2-nitrobenzyl substituents and one alkyne for functionalization. UV irradiation induced the phosphonamidate P-N bond cleavage and resulted in the release of the target molecule with an additional amine functionality. In this regard, first steps were undertaken to develop a traceless variant of this cleavage. The application of the photo-cleavable phosphonamidates was demonstrated in streptavidin-mediated immobilization assays, which is just one example for the use of this valuable methodology.

Es wird allgemein angenommen, dass Proteine exponentiell degradiert werden. Das bedeutet, dass neu synthetisierte als auch alte Proteine mit gleicher Wahrscheinlichkeit degradiert werden. Es tauchen jedoch immer mehr Hinweise dafür auf, dass das nicht immer der Fall sein muss. Um diese Fragestellung systematisch anzugehen, haben wir eine Methode zur metabolischen Pulsmarkierung mit der nichtkanonischen Aminosäure Azidohomoalanine (AHA) entwickelt. AHA ermöglicht die Anreicherung von neu synthetisierten Proteinen direkt nach einem Puls oder nach einer „chase“ (Nachverfolgung) Periode in AHA freiem Medium. Wir kombinierten diese Methode mit SILAC und Shotgun Proteomik um zu quantifizieren wieviel Protein nach verschiedenen chase-Perioden übrig bleibt. Damit konnten wir Degradationsprofile für tausende von Proteinen erstellen. Unsere Daten zeigen, dass mehr als 10 % der Proteine nicht exponentiell degradiert werden (NED). Diese Proteine werden mit fortschreitendem Alter ausschließlich stabiler. Proteasomale Degradation von überschüssigen Proteinkomplexuntereinheiten scheint einen Großteil der NEDs zu erklären. Beim Vergleich zwischen murinen und humanen Zellen stellte sich heraus, dass NED teilweise konserviert ist. Das liegt scheinbar daran, dass diese Zellen trotz unterschiedlichem Ursprungs einheitlich bestimmte Untereinheiten überproduzieren. Da überschüssige NED Proteine bereits unter Standardbedingungen degradiert werden, nahmen wir an, dass die zusätzliche Überproduktion eines NED Proteins seine Level im stationären Zustand nicht verändern sollte. Um dies zu zeigen, quantifizierten wir Degradationskinetiken von Proteinen einer aneuploidenZelllinie. Wir fanden, dass NED Proteine, die auf trisomischen Chromosomen codiert sind, nicht in gleichem Maße ihr stationäres Level steigerten wie exponentiell degradierte Proteine. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese verzeichneten wir stattdessen eine Zunahme der anfänglichen Degradationsraten dieser NED Proteine. / Proteins are thought to be degraded exponentially. That means that newly synthesized proteins have the same probability to be degraded as old proteins. However, evidence has accumulated showing that this is not true in all cases. To analyze this more systematically, we developed a method employing metabolic pulse-labeling by the non-canonical amino acid azidohomoalanine (AHA). AHA enables enrichment of newly synthesized proteins directly after pulse or after chase in AHA-free medium. We used SILAC and shotgun proteomics to quantify how much protein remains after different lengths of chase to create degradation profiles for thousands of proteins. Importantly, these degradation profiles allowed us to detect changes in degradation kinetics as the proteins age. We found that more than 10 % of proteins are non-exponentially degraded (NED). These protein are exclusively stabilized by age. Proteasomal degradation of excess protein complex subunits seems to explain a large fraction of NED. Comparing NED in mouse and human cells, we found that NED is at least partially conserved, seemingly due to cells consistently making too much of certain subunits. These overproduced subunits are on average shorter and more structured than the exponentially degraded proteins within the same complex. Finally, since excess NED proteins are degraded during baseline conditions, we hypothesized that making more of a NED protein would not increase its steady state levels. We employed an aneuploidy cell model and found that indeed NED proteins encoded on trisomic chromosomes did not increase in steady state levels to the same extent as exponentially degraded proteins. Instead, we recorded an increase in initial degradation of these proteins. In summary, we present a method for global pule-chase experiments allowing the detection of age-dependent protein degradation with possible implications for the understanding of aneuploidy and cancer.

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist an der Degradation cytosolischer Proteine und der Generierung von Antigenen beteiligt, die über MHC Klasse I Moleküle CD8+ T Zellen präsentiert werden. Die Antigenprozessierung wird durch Typ I und II Interferone beeinflusst, welche die Formierung des Immunoproteasoms und des Proteasomen-Aktivators PA28 induzieren und so die katalytische Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems qualitativ verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde im Zellkulturmodell unter dem Einfluss von IFN gamma die zunehmende Inkorporation der Immunountereinheiten in de novo assemblierende 20S Proteasomen und die daraus resultierende Veränderung der proteolytische Aktivität untersucht. Die Inkorporation der Immunountereinheiten wurde mittels 2D Gelelektrophorese und Western Blots von 20S Proteasomen untersucht, die nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit IFN gamma aus HeLa Zellen isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 24h einer IFN gamma Stimulation die strukturelle Heterogenität des zellulären Proteasomenpools zunimmt, indem sowohl intermediäre als auch Immunoproteasomen assemblieren. In der Nativ-PAGE von Lysaten IFN gamma stimulierter Zellen wurde eine Zunahme des 20S Proteasoms als freier Komplex und in Assoziation mit PA28 beobachtet, während die Menge des zum ATP-abhängigen Abbau von polyubiquitinierten Proteinen notwendigen 26S Proteasoms unverändert blieb. Die Stimulation mit IFN gamma hatte eine Steigerung der gesamtproteasomalen Aktivität zur Folge, die unter Inhibition der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 verzögert erfolgte. Die katalytischen Eigenschaften isolierter Proteasomen wurden anhand der Generierung eines immunrelevanten Hepatitis C CTL Epitops des viralen Core Proteins in vitro untersucht. Im Verlauf der IFN gamma Stimulation de novo assemblierte Proteasomen wiesen jeweils unterschiedliche Präferenzen für die Generierung des untersuchten CTL Epitops auf. Eine weitere, proteasomen-spezifische Änderung der katalytischen Aktivität bewirkte die Assoziation des Proteasomen-Aktivators. Innerhalb der ersten zwölf Stunden einer IFN gamma Stimulation wurde das Epitop vermehrt mit der Unterstützung des Proteasomen-Aktivators generiert, nach 24 Stunden zunehmend durch freies 20S Proteasom. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit zeigen, dass Strukturvarianten des Proteasoms zusammen mit PA28 redundant funktionieren und eine hohe proteolytische Plastizität des UPS gewährleisten. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the degradation of cytosolic proteins and the processing of MHC class I restricted antigens. The generation of these antigens is influenced by type I and II interferons which induce the expression of immunoproteasomes and the proteasome activator PA28; and thereby impact the quality of peptides processed by the proteasome system. The adoption of the proteasome system to a proinflammatory environment has been investigated in a cell culture model by isolating proteasomes after different stages of IFN gamma stimulation. The composition of isolated proteasomes was analysed by 2D PAGE and western blot approach. The presented work shows that within 24h of IFN gamma stimulation an increasing heterogeneity of the cellular proteasome pool is observed, resulting from the assembly of both intermediate type proteasomes and immunoproteasomes at the early stage of IFN gamma stimulation. It could be shown by native PAGE of HeLa cell lysates that IFN gamma induces increasing amounts of 20S proteasomes and PA28 associated proteasomes without decreasing the amount of 26S proteasomes that are necessary for the ATP dependent degradation of ubiquitinated proteins; and resulting in an enhanced total proteasomal activity in vitro. This increase in activity was delayed when the interaction of 20S proteasomes and PA28 was inhibited. A comparative analysis of the ability of isolated 20S proteasomes to generate a known hepatitis C virus derived CTL epitope in vitro proved that during early IFN gamma stimulation de novo assembled proteasomes exhibited a structure specific preference to generate the HCV CTL epitope either alone or in combination with the proteasome activator PA28. Within the first 12h of IFN gamma stimulation the epitope was generated with higher efficiency by 20S proteasomes in association with PA28, whereas after 24h the impact of PA28 on the proteasome pool was less pronounced. The presented work shows that IFN gamma induces a heterogeneity of 20S proteasomes in the early stage of stimulation, acting in combination with the proteasome activator in a redundant manner; and provides a high proteolytic placticity of the proteasome system.

Die Phospholipid-Hydroperoxid Glutathion-Peroxidase (phGPx) ist ein monomeres Selenoprotein, welches innerhalb der Familie der Glutathion-Peroxidasen aufgrund seiner breiten Substratspezifität und der Fähigkeit Proteinthiole zu modifizieren eine Sonderstellung einnimmt. Vom Gen der phGPx werden nach heutigem Kenntnisstand drei verschiedene Protein-Isoformen gebildet. Die mitochondriale Isoform enthält am N-Terminus ein mitochondriales Insertionssignal und wird bevorzugt im Testis exprimiert. Von einem im Leserahmen stromabwärts liegenden Startkodon wird die kürzere, ubiquitär exprimierte zytosolische Isoform synthetisiert. Eine dritte phGPx-Isoform besitzt eine N-terminale nukleäre Lokalisationssequenz (kodiert von einem alternativen Exon 1) und wird vornehmlich in den Kernen post-meiotischer Zellen der Spermatogenese gefunden. Aufgabe dieser Arbeit war es, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die am Zustandekommen des vielfältigen Expressionsmusters der phGPx-Isoformen beteiligt sind. Im ersten Teil der Arbeit wurden transkriptionelle Regulationsmechanismen der phGPx-Expression untersucht. Im proximalen Promotorbereich (-100 bp – +228 bp) des phGPx-Gens wurden unter in vitro (Supershift-Assay) und in vivo (Chromatin-Immunopräzipitation) Bedingungen die Transkriptionsfaktoren Sp1 und NF-Y identifiziert, die an drei GC-reiche Motive beziehungsweise zwei inverse CCAAT-Boxen binden. Darüber hinaus konnten in kompetetiven Gelshift-Assays im proximalen Promotorbereich zwei Bindungssequenzen identifiziert werden, die von Faktoren der Smad-Familie gebunden werden. Funktionelle in vitro Promotorstudien mit mutierten Promotorkonstrukten zeigten, dass die Mutagenesen der Sp1- und NF-Y Bindestellen einen starken Einfluss auf die Reportergenaktivität hatten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden durch Untersuchungen von Protein-RNA-Interaktionen post-transkriptionelle Mechanismen der Expressionsregulation studiert. Mit Hilfe des in vivo Ansatzes des Hefe Drei-Hybrid Systems wurde der Guanin-reiche Sequenz bindende Faktor 1 (GRSF1) identifiziert, der in der 5’-untranslatierte Region der mitochondrialen phGPx-mRNA bindet. In RNA Gelshift-Assays wurde die Spezifität dieser Interaktion bestätigt und näher charakterisiert. Schließlich wurden für GRSF1 und die phGPx Expressionsprofile in murinen Gewebe erstellt sowie die zeitabhängige Expression beider Proteine während der Embryogenese verfolgt. Die auffällig ähnlichen Expressionsmuster lassen ähnliche Regulationsmechanismen vermuten. Die in dieser Arbeit identifizierten trans-regulatorischen Proteine Sp1, NF-Y, Smad und GRSF1 sollten an der differentiellen Expression der phGPx-Isoformen beteiligt sein. / The Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase (phGPx) is a monomeric selenoprotein that is unique in the family of Glutathione Peroxidases due to its low substrate specificity and its ability to oxidise protein thiols. Three different isoforms are known to derive from one common gene. The mitochondrial Isoform contains an N-terminal mitochondrial insertion sequence and is preferentially expressed in postpubertal testis. The shorter, ubiquitously expressed, cytosolic isoform is expressed from an in-frame start codon. A third isoform contains an N-terminal nuclear localization signal coded for by an alternative exon 1 and is preferentially expressed in the nuclei of post-meiotic spermatides. The aim of the present study is to investigate the molecular mechanisms leading to the different isoforms and causing their tissue specific expression pattern. In the first part of this work transcriptional regulatory mechanisms will be analysed. Within the proximal promoter region (-100 to +228 bp) of the phGPx gene the transcription factors SP1 and NF-Y were identified to bind to three GC-boxes and two CCAAT-boxes respectively using in vitro methods (Supershift Assays) and in vivo methods (Chromatine immunoprecipitation). Moreover, performing competitive gel shift assays two binding elements for the smad family of transcription factors could be identified. Functional in vitro reporter gene assays provided evidence that the mutagenesis of the binding sequences for NF-Y and Sp1 has a strong impact on promoter activity. In the second part of this work post-transcriptional events in the expression regulation of the phGPx were analysed on the basis of protein/RNA interactions. Applying the in vivo approach of the yeast three hybrid system the Guanin-riche sequence binding factor 1 (GRSF1) could be identified binding to the 5’-untranslated region of the mitochondrial phGPx messenger. RNA mobility shift assays were performed to further characterize the specificity of this protein/RNA interaction. Eventually, the tissue distribution of GRSF1 and phGPx was studied in murine tissues and their expression kinetics were followed during murine embryogenesis. The obvious parallel expression kinetics for mitochondrial phGPx and GRSF1 suggest common regulatory mechanisms for these two genes. All the identified trans-regulatory elements are very likely to be involved in the differential expression regulation of the phGPx isoforms.

Das Proteasomsystem ist die Hauptquelle von Peptiden für die MHC Klasse I Antigen-Präsentation. In Vertebraten kann dieses durch die Expression verschiedener Subtypen des 20S Proteasoms moduliert werden. Die häufigsten Subtypen sind konstitutive Proteasomen (c20S) mit den katalytischen Untereinheiten beta1, beta2 und beta5 und Immunoproteasomen (i20S) mit den Immunountereinheiten beta1i, beta2i und beta5i. Die Expression von i20S optimiert in der Regel die MHC Klasse I Antigen-Präsentation, indem die Bildung von Peptiden mit hoher Affinität zu MHC I Molekülen verstärkt wird. Die Bildung von i20S wird momentan durch ein Modell der kooperativen Assemblierung erklärt, das auf der präferentiellen Interaktion zwischen den Immunountereinheiten beruht. In dieser Arbeit wurde die Assemblierung von 20S Proteasomen in beta5i defizienten Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes analysiert. In diesem Modell konnte keine präferentielle Interaktion zwischen den Untereinheiten festgestellt werden. Stattdessen zeigen die Ergebnisse, daß die Integration von konstitutiven oder Immunountereinheiten durch direkte Kompetition reguliert wird. Des Weiteren wurde während der Infektion eine beta5i-abhängige Zunahme der zellulären Proteasommenge festgestellt und somit ein neuer Mechanismus zur Regulation des zellulären Proteasomgehaltes entdeckt. Funktionell führt die beta5i-Defizienz zu einer verringerten MHC I Expression auf antigenpräsentierenden Zellen und zu einer verminderten Prozessierung des bakteriellen Antigens LLO296-304. Bei der Analyse der LLO296-304 spezifischen CD8 T Zell Antwort konnte jedoch kein Unterschied zwischen Wildtyp- und beta5i defizienten Mäusen festgestellt werden .Die Kontrolle der Infektion in den beta5i defizienten Mäusen ist jedoch in der Leber verzögert. Dies deutet darauf hin, dass die Erkennung und Elimination infizierter Zellen durch cytotoxische CD8 T Zellen auf Grund der geringeren MHC Klasse I Präsentation bakterieller Antigene behindert wird. / The proteasome-system is the main source of peptides for MHC class I antigen presentation. In vertebrates this system can be modulated by the expression of different subtypes of the 20S proteasome. The most common subtypes are constitutive proteasomes (c20S) with the catalytic subunits beta1, beta2 and beta5 and immunoproteasomes (i20S) with the immunosubunits beta1i, beta2i and beta5i. Expression of i20S generally optimizes MHC class I antigen presentation by increasing the generation of peptides with high affinity to MHC class I molecules. Currently, the formation of i20S is explained by a model of cooperative proteasome assembly, which is based on preferential interactions among the immunosubunits. Here, the assembly of 20S proteasomes was analysed in beta5i deficient mice during an ongoing infection with Listeria monocytogenes. In this model, no preferential interactions among constitutive subunits or immunosubunits could be determined. Instead, the results show that the integration of constitutive subunits or immunosubunits is regulated by direct competition. Further, a beta5i-dependent increase in cellular proteasome quantity was observed following infection. This reveals a novel mechanism for the regulation of cellular proteasome quantity, which is based on the differential expression of beta5i. Functionally, the deficiency in beta5i results in a reduced MHC class I cell surface expression on professional antigen presenting cells and a drastically diminished processing of the bacterial antigen LLO296-304. However, the analyses of LLO296-304 specific CD8 T cells did not reveal differences in the frequencies of these T cells between wild-type and beta5i deficient mice. Still, the control of infection in the liver of beta5i deficient mice was delayed. This phenotype suggests that the recognition and elimination of infected target cells by cytotoxic CD8 T cells is constrained due to the lowered MHC class I presentation of bacterial antigens.

Zahlreiche pathogene „missense“-Mutation, die verhindern, dass Proteine korrekt gefaltet werden, befinden sich in geordneten Regionen von Proteinen. Andere krankheitsrelevante Mutationen befinden sich in ungeordneten Regionen und beeinflussen somit nur begrenzt die Funktionalität, zum Beispiel durch Veränderungen kurzer linearer Sequenzmotive, die Protein-Protein Interaktionen vermitteln. In dieser Arbeit wird ein peptidbasierter Interaktionsscreen präsentiert mit dem sich Veränderungen im Interaktom identifizieren lassen. Synthetische Peptide von wild-typ und zugehörigen mutierten Proteinregionen ermöglichen die gleichzeitige Untersuchung von mehr als hundert Mutationen mittels Massenspektrometrie. Mehr als ein Drittel aller getesteten Mutationen hatten veränderte Interaktionen zur Folge. Darunter befanden sich auch drei Prolin zu Leucin Mutationen in zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen, die zusammen mit dem benachbarten Leucin einem Dileucinmotiv ergeben und dadurch verstärkt mit Clathrin interagieren. Dieses Motiv wurde bereits mit Clathrin-vermittelter Endozytose in Verbindung gebracht. Die hinzugewonnene Endozytose könnte Krankheitsmechanismen erklären, da die Mislokalisation der betroffenen Transmembranproteine zum effektiven Verlust derer Funktion führen würde. Diese Hypothese wurde hier von verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten bezüglich der P485L Mutation im Glukose Transporter-1 (GLUT1), die das GLUT1-Defizit-Syndrom hervorruft, bestätigt. Weitere Evidenz wurde außerdem für die Funktionalität anderer mutationsbedingter Dileucinmotive gewonnen. Die systematische Analyse von pathogenen Mutationen hat gezeigt, dass Dileucinmotive signifikant und spezifisch in ungeordneten zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen überrepräsentiert sind. Dieser Peptidescreen macht das Potenzial unvoreingenommener Analysen zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen deutlich, die von Veränderungen in Protein-Protein Interaktionen hervorgerufen werden. / Many disease-associated missense mutations prevent proteins from folding correctly and lead to loss-of-function. These mutations are often found in ordered regions of proteins. Another class of disease-related missense mutations can be found in disordered regions. These are thought to impair only specific parts of a protein’s functions. Those mutations could modify short linear motifs that mediate protein-protein interactions. Here, we designed a peptide-based interaction screen to identify interactions that are affected by mutations in disordered regions. We used synthetic peptides corresponding to the wild type and mutated protein regions spotted on cellulose membrane to pull-down interaction partners. This setup allows for the screening of more than hundred mutations at a time via mass spectrometry. Here, we focused on mutations implicated in neurological diseases. More than one-third of tested variant pairs show differential interactions. Three disease-related proline to leucine mutations in cytosolic tails of transmembrane proteins lead to gain of a dileucine sequence. Several dileucine-containing peptide motifs are involved in clathrin-mediated endocytosis (CME). Also in the presented screen, the newly created motifs mediate interaction with the CME machinery. This could explain the disease mechanisms since mislocalization of the affected transmembrane proteins would lead to their loss of function. This hypothesis has been corroborated for glucose transporter-1 (GLUT1) P485L, causing GLUT1 deficiency syndrome. We were able to provide functional evidence also for additional gained dileucine motifs. A systematic analysis of pathogenic mutations revealed dileucine motifs to be overrepresented in structurally disordered cytosolic regions of transmembrane proteins. The data gained with the peptide screen highlights the power of differential interactome mapping as a generic approach to unravel disease mechanisms caused by changes in protein-protein interactions.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Staudinger-Phosphonit-Reaktion auf Azidohomoalanin-haltiges Ubiquitin angewendet, um ortsspezifisch modifizierte Alkinphosphonamidat-Ubiquitine zu erzeugen. Diese Ubiquitin-basierten Sonden wurden bei neutralem pH-Wert in selektiven Konjugationen mit DUBs, die ein Cystein im aktiven Zentrum beinhalten, eingesetzt, auch in Anwesenheit anderer Thiole. Dabei beobachteten wir DUB-Spezifitäten in Abhängigkeit von der Phosphonamidat-Position innerhalb der Sonde. Die DUB-Selektivität konnte auch an Pull-Down-Experimenten aus Zelllysaten gezeigt werden. Zusätzlich konnte die Cystein-Selektivität der Sonde an ausgewählten konjugierten DUBs mittels MS/MS-Analyse nachgewiesen werden. Wir beobachteten auch unterschiedliche Ausmaße der DUB-Inhibition bei der Inkubation mit den verschiedenen Phosphonamidat-Sonden. Im Hinblick auf das DUB-Targeting in lebenden Zellen untersuchten wir auch Bedingungen für zellpenetrierende Peptid-konjugierte Ubiquitine für einen Transport der Sonde in das Zytosol der Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit haben wir die neuartige, chemisch induzierte Phosphonothiolat Elektrophile für Thiol-Konjugation angewendet, um unhydrolysierbare ubiquitinierte Substrate herzustellen. Es gelang uns, ein hoch elektrophiles Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat mit guter Ausbeute zu erzeugen. Wir konnten die frisch hergestellte Sonde in Konjugationen mit Cysteinen an ausgewählten Proteinen einsetzen. Um unser Konzept zu etablieren, generierten wir ein monoubiquitiniertes α-Synuclein und demonstrierten dessen strukturelle Integrität in einer enzymatischen Ubiquitinierung des Konjugats. Außerdem stellten wir ein künstlich K48-verknüpftes Diubiquitin her, das von spezifischen Antikörpern ähnlich erkannt wurde wie das native K48-verknüpfte Diubiquitin, aber in Gegenwart von DUBs sich als stabil erwies. Das Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat zeigte ebenfalls eine selektive DUB-Konjugation, wenn nur kurze Inkubationszeiten verwendet wurden. / In the first part of this thesis a Staudinger-phosphonite reaction was applied on azidohomoalanine-containing ubiquitin to generate site-specifically modified alkynephosphonamidate ubiquitins. These ubiquitin-based probes were utilized in selective conjugations of active site cysteine-containing DUBs at neutral pH, even in the presence of other thiols. Furthermore, we observed DUB specificities depending on the phosphonamidate position within the probe. The selectivity could also be demonstrated in pull-down experiments from cell lysates. Moreover, the probe’s cysteine selectivity within chosen conjugated DUBs could be determined using MS/MS analysis. Consequently, we observed varying extents of DUB inhibition upon incubation with the different phosphonamidate probes. For DUB targeting in living cells we also investigated conditions of cell penetrating peptide conjugated ubiquitin in order to successfully deliver them to the cytosol. In the second part of this thesis, we applied the novel chemically induced phosphonothiolate electrophiles for thiol conjugation to produce unhydrolyzable ubiquitinated substrates. Starting from a disulfide-activated cysteine ubiquitin mutant, we managed to generate a highly electrophilic ubiquitin vinylphosphonothiolate in satisfactory yield. We could apply the freshly prepared probe in conjugations with cysteines on selected proteins, in which the conjugation product showed to be remarkably stable. To establish our concept, we prepared monoubiquitinated α-synuclein and demonstrated its structural integrity in the performance of an enzymatical ubiquitination of the conjugate. Furthermore, we produced an artificially K48-linked diubiquitin, which was similarly recognized by specific antibodies as the native K48-linked diubiquitin and was not hydrolyzed in the presence of DUBs. The ubiquitin vinylphosphonothiolate displayed also selective DUB conjugation, when only short incubations were used.