[EN] Ribosome biogenesis is one of the most important and energy-consuming processes in the cell. However, the vast majority of the events and factors that are involved in the synthesis of ribosomal subunits are not well understood. Ribosome maturation comprises multiple steps of rRNA processing that require sequential association and dissociation of numerous assembly factors. These proteins establish a complex network of interactions that are essential for the pathway to continue. Extensive studies in Saccharomyces cerevisiae allowed to identify some of the genetic and functional correlations between the pre-ribosomal factors that could be organized into interdependent clusters or sub-complexes. A heterotrimer formed by Nop7, Erb1 and Ytm1 (PeBoW complex in mammals) is crucial for the proper formation of the 60S subunit. Depletion of any of the three proteins is inviable and certain truncations result in aberrant processing of 27SA2 rRNA thus impairing cell proliferation. Nop7 and Erb1 have been shown to bind RNA and are recruited to the pre60S before Ytm1. It is also known that the trimer has to be removed from the nascent particle in order to promote its normal maturation. Despite its relevance in the cell, the exact role of PeBoW is not clear and the interactions within the complex have been poorly characterized. In this study we carry out an extensive biochemical and structural analysis of Nop7-Erb1-Ytm1 trimer from S. cerevisiae and from a thermophilic fungus Chaetomium thermophilum. We have been able to reconstitute a stable complex in vitro that was then used in crystallographic trials. We have solved the structure of the C-terminal domain of Erb1 from yeast that folds into a seven-bladed ß-propeller. We prove that this part of the protein binds RNA in vitro, a property that might be important for its function. Moreover, in spite of previous reports suggesting that the ß-propeller domain of Erb1 would not be essential for ribosome biogenesis, we could solve the crystal structure of Ytm1 bound to the carboxy-terminal portion of Erb1 from C. thermophilum. That finding led us to redefine the macromolecular interactions that hold the complex together. First, we have verified that the N-terminal region of Nop7 interacts with Erb1. Furthermore, we have shown that a good affinity binding takes place in vitro between WD40 domain of Ytm1 and the ß-propeller of Erb1. Upon careful analysis of the interface involved in dimer formation we have designed a mutant of Erb1 that exhibits weaker association with Ytm1. We confirm our structural and biophysical data using S. cerevisiae. We prove that a point mutation that decreases the affinity between propellers of Erb1 and Ytm1 negatively affects growth in yeast because it interferes with 60S production. We show that a very conserved interface of protein-protein interaction could be targeted in order to hinder cell proliferation. / [ES] El ensamblaje de ribosomas es uno de los procesos más importantes y costosos energéticamente en una célula eucariota. A pesar de ello, se sabe relativamente poco acerca de la gran mayoría de los eventos y factores implicados en la síntesis de las subunidades ribosomales. La maduración de ribosomas comprende numerosos pasos de procesamiento del rRNA que requieren la asociación y disociación de más de doscientos factores de ensamblaje. Esas proteínas establecen una compleja red de interacciones que son esenciales para que el proceso pueda llevarse a cabo. Los estudios realizados en Saccharomyces cerevisiae han permitido la identificación de algunas correlaciones genéticas y funcionales entre los factores prerribosomales. Es el caso del heterotrímero formado por Nop7, Erb1 e Ytm1 (complejo PeBoW en mamíferos), que es imprescindible para la correcta formación de la subunidad 60S. La ausencia de cualquiera de las tres proteínas es inviable y también se conocen ciertas variantes truncadas que alteran el procesamiento del rRNA 27SA2 y de este modo afectan la proliferación celular. Se ha demostrado que Nop7 y Erb1 se asocian al rRNA y que su reclutamiento al pre60S ocurre antes de la unión a Ytm1. Además se sabe que el trímero tiene que separarse de la partícula prerribosomal emergente con el fin de favorecer su maduración. A pesar de su gran relevancia en la célula, no está claro el papel exacto del complejo PeBoW y tampoco se dispone de conocimientos suficientes acerca de las interacciones intermoleculares que lo mantienen. Durante el desarrollo de este proyecto se ha llevado a cabo un exhaustivo análisis bioquímico y estructural del trímero Nop7-Erb1-Ytm1 procedente de S. cerevisiae y del hongo termofílico Chaetomium thermophilum. En este trabajo hemos sido capaces de reconstituir el complejo estable in vitro que posteriormente se ha utilizado en los ensayos de cristalización, con los que hemos podido resolver la estructura del dominio carboxi-terminal de Erb1 de levadura, cuyo plegamiento corresponde a una hélice enrollada (ß-propeller) de siete hojas. Gracias a la información estructural, hemos demostrado que esa parte de la proteína es capaz de unir RNA in vitro, lo que puede ser una propiedad importante para su función. Además, a pesar de los estudios anteriores que sugerían que la hélice enrollada de Erb1 no era esencial en la biogénesis del ribosoma, hemos resuelto la estructura cristalina de la proteína Ytm1 unida al dominio C-terminal de Erb1 de C. thermophilum. Ese descubrimiento nos ha permitido redefinir las interacciones macromoleculares que mantienen el complejo. Inicialmente hemos confirmado que el extremo amino-terminal de Nop7 interacciona con Erb1. A continuación, hemos demostrado que el dominio WD40 de Ytm1 se une al ß-propeller de Erb1 con una buena afinidad. Después de un detallado análisis de la superficie involucrada en la formación del dímero, hemos sido capaces de diseñar una variante mutada de Erb1 que se asocia más débilmente con Ytm1. Los hallazgos estructurales y biofísicos se han confirmado in vivo usando S. cerevisiae donde hemos demostrado que una mutación puntual que disminuye la afinidad de unión entre los dominios C-terminales de Erb1 e Ytm1 manifiesta un efecto negativo sobre el crecimiento de levadura porque interfiere con la síntesis de 60S. Nuestros resultados establecen un buen ejemplo de una superficie conservada involucrada en interacciones proteína-proteína, que podría considerarse una buena diana para inhibir la proliferación celular eucariota. / [CA] L'ensamblatge de ribosomes és un dels processos més importants i energèticament costosos en una cèl·lula eucariota. Tot i això, es coneix relativament poc de la majoria dels factors implicats en la síntesi de les subunitats ribosomals. La maduració de ribosomes compren moltes etapes de processament del rRNA que requereix l'associació i dissociació de més de dos-cents factors d'ensamblatge. Aquestes proteïnes estableixen una complexa xarxa de interaccions que són essencials perquè el procés es pugi dur a terme. Els estudis realitzats en Saccharomyces cerevisiae han permès la identificació de algunes correlacions genètiques i funcionals entre els factors pre-ribosomals. Aquest és el cas del heterotrímer comprés per Nop7, Erb1 i Ytm1 (complex PeBoW en mamífers), que és imprescindible per a la correcta formació de la subunitat 60S. L'absència de qualsevol de les tres proteïnes és inviable i també és coneixen certes variants truncades que alteren el processament del rRNA 27SA3 i que d'aquesta manera afecten a la proliferació cel·lular. S'ha demostrat que Nop7 i Erb1 s'associen al rRNA i que el seu reclutament al pre60S té lloc abans de l'unió a Ytm1. A més a més, es sap que el trímer ha de separar-se de la partícula pre-ribosomal emergent per tal que es produeixi la seua maduració. Malgrat la seua rellevància en la cèl·lula, no s'ha aclarit el paper exacte del complex PeBoW i tampoc n'hi ha coneixements suficients de les interaccions intermoleculars que el mantenen. Durant el desenvolupament d'aquest projecte s'ha dut a terme un exhaustiu anàlisi bioquímic i estructural del trímer Nop7-Erb1-Ytm1 de S. cerevisiae i del fong termofílic Chaetomium thermophilum. En aquest treball hem estat capaços de reconstituir el complex estable in vitro que posteriorment s'ha utilitzat en el assajos de cristal·lització, amb els que hem pogut resoldre l'estructura del domini carboxi-terminal de Erb1 de llevat i que té un plegament corresponent a una hèlix enrotllada (ß-propeller) de set fulles. Gràcies a la informació estructural, hem pogut demostrar que aquesta part de la proteïna té la capacitat d'unir RNA in vitro, el que pot ser una propietat important per a la seua funció. A més a més, malgrat que els estudis anteriors suggerien que la hèlix enrotllada de Erb1 no era essencial en la biogènesis del ribosoma, hem pogut resoldre la estructura cristal·lina de la proteïna Ytm1 unida al domini C-terminal de Erb1 de C. thermophilum. Aquest descobriment ens ha permès redefinir les interaccions macromoleculars que mantenen el complex. Inicialment, hem confirmat que l'extrem amino-terminal de Nop7 interacciona amb Erb1. A continuació, hem demostrat que el domini WD40 de Ytm1 s'uneix al ß-propeller de Erb1 amb bona afinitat. Després d'un anàlisi detallat de la superfície involucrada en la formació del dímer, hem estat capaços de dissenyar una variant mutada de Erb1 que s'associa més dèbilment amb Ytm1. Les dades estructurals i biofísiques s'han confirmat in vivo utilitzant S. cerevisiae on hem demostrat que una mutació puntual que disminueix l'afinitat d'unió entre els dominis C-terminals de Erb1 i Ytm1 manifesta un efecte negatiu en el creixement del llevat perquè interfereix amb la síntesi del 60S. Els nostres resultats estableixen un bon exemple de una superfície conservada involucrada en interaccions proteïna-proteïna, que es podria considerar una bona diana per a inhibir la proliferació cel·lular eucariota. / Wegrecki, M. (2015). Structural, biophysical and functional characterization of Nop7-Erb1-Ytm1 complex and its implications in eukaryotic ribosome biogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/55941

Yes / Background: The receptor for activated C-kinase 1 (RACK1) is a conserved protein belonging to the WD40 repeat family of proteins. It folds into a beta propeller with seven blades which allow interactions with many proteins. Thus it can serve as a scaffolding protein and have roles in several cellular processes. Results: We identified the product of the Dictyostelium discoideum gpbB gene as the Dictyostelium RACK1 homolog. The protein is mainly cytosolic but can also associate with cellular membranes. DdRACK1 binds to phosphoinositides (PIPs) in protein-lipid overlay and liposome-binding assays. The basis of this activity resides in a basic region located in the extended loop between blades 6 and 7 as revealed by mutational analysis. Similar to RACK1 proteins from other organisms DdRACK1 interacts with G protein subunits alpha, beta and gamma as shown by yeast two-hybrid, pulldown, and immunoprecipitation assays. Unlike the Saccharomyces cerevisiae and Cryptococcus neoformans RACK1 proteins it does not appear to take over Gβ function in D. discoideum as developmental and other defects were not rescued in Gβ null mutants overexpressing GFP-DdRACK1. Overexpression of GFP-tagged DdRACK1 and a mutant version (DdRACK1mut) which carried a charge-reversal mutation in the basic region in wild type cells led to changes during growth and development. Conclusion: DdRACK1 interacts with heterotrimeric G proteins and can through these interactions impact on processes specifically regulated by these proteins. / This work was supported by the DFG and SFB670. TYR acknowledges support from the Professorinnen Program of the University of Cologne.

No description available.

Plastids are the cellular organelles where many of the visual, health and flavor-related metabolites are produced and stored in the fruit, and therefore are valuable components for consumers and breeders. The more sugar and flavor the fruit has, the more appreciated is for the consumer and industry. Thus, one of the breeder's goals is to obtain new varieties with fruits improved in these aspects. Paradoxically, fruits with a high content in chloroplasts have been avoided by the breeders because it usually suffers of oxidative stress disorders; such yellow shoulder impairment and fruit cracking when the light intensity increases. For this reason breeding efforts has been focused mainly on avoiding fruit losses and organoleptic characteristics have been neglected. This thesis aims to improve tomato fruit quality by engineering plants to produce fruits with enhanced fruit chloroplast functions and improved tolerance to oxidative stress, using cisgenic/ intragenic approaches. SlGLK1, SlGLK2 and SlAPRR2 transcription factors have been suggested to be involved in chloroplast development. Tomato MoneyMaker plants were engineered to express SlGLKs and SlAPRR2 either singly or in combination early in development. Those lines provide fruits which accumulate more sugars, carotenoids and specific volatiles than WT. The fruit chloroplast enhanced lines were characterized at the structural, metabolic, proteomics and transcriptomics. A novel additive effect in the chloroplast regulation network resulted when both transcription factors were coexpressed and a hypothesis for this effect is presented. In addition, two tomato traditional varieties (Muchamiel and Pera) expressing tomato genes for BMW anthocyanin regulatory complex under the control of the light inducible promoter (PLI) were produced and characterized. Engineered tomato plants showed large accumulation of anthocyanin specifically in the fruit peel and in Type VI trichomes. Characterization of those tissues indicated specific alterations of the flavonoid pathway that were highly dependent on the light conditions. These tomato lines could be of high interest to protect the fruit chloroplast enhancement lines from eventual stresses involving ROS, and also to assess the effect on plant growth under high light stress and in plant-pest interaction studies. / Los plastidos son orgánulos celulares donde se producen y almacenan muchos de los metabolitos relacionados con atributos organolépticos y compuestos beneficiosos para la salud, por lo tanto se consideran componentes de alto valor añadido para consumidores y mejoradores vegetales. Cuanto mayor contenido en azúcares solubles y sabor presente el fruto más se valoran por los consumidores y la industria. Por lo tanto uno de los objetivos actuales de los mejoradores de tomate es mejorar el fruto en estos aspectos. Paradójicamente, se ha seleccionado en contra de frutos con alto contenido en cloroplastos porque este carácter, bajo alta intensidad lumínica, suele estar asociado a daños en el fruto por estrés oxidativo; como los hombros amarillos del tomate o el agrietado del fruto. Por este motivo los esfuerzos en mejora se han orientado principalmente a evitar pérdidas y consecuentemente la calidad organoléptica se ha visto reducida. El objetivo de esta tesis es mejorar la calidad del fruto de tomate mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética orientadas a incrementar los cloroplastos en fruto y mejorar la tolerancia al estrés oxidativo con una aproximación cis/ intragenica. Los factores de transcripción SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 han sido estudiados por influir en el desarrollo del cloroplasto. Plantas de tomate de variedad MoneyMaker fueron mejoradas genéticamente para expresar de forma individual o conjunta SlGLKs y SlAPRR2 en estadios tempranos de desarrollo. Estas líneas proveen frutos con mayor acumulo de azúcares, carotenos y volátiles que el control MoneyMaker. Las líneas potenciadas en desarrollo de cloroplastos se caracterizaron a nivel estructural, metabólico, proteómico y transcriptómico. Se descubrió un novedoso efecto aditivo en la regulación génica del cloroplasto cuando ambos factores de transcripción se expresan simultáneamente y se presentó una hipótesis para dicho efecto. Además se caracterizaron dos variedades tradicionales de tomate (Muchamiel and Pera) diseñadas para expresar genes pertenecientes al complejo de regulación de antocianinas BMW, bajo el control del promotor inducible por luz (PLI). Las plantas mejoradas genéticamente presentan una gran acumulación de antocianos, especialmente en piel de fruto y en tricomas tipo VI. Caracterización de estos tejidos indican alteraciones específicas en la ruta de flavonoides y una alta dependencia a condiciones de luz. Estas plantas podrían ser de gran interés para proteger frutos con altos niveles de cloroplastos frente al estrés oxidativo generado por ROS, para evaluar el efecto en el crecimiento de la planta bajo condiciones de alta luz y en futuros estudios de interacción planta-patógenos / Els plastidis són orgànuls cel.lulars on es produeixen i emmagatzemen molts dels metabòlits relacionats amb atributs organolèptics i composts beneficiosos per a la salut, per tant es consideren components d'alt valor afegit per a consumidors i milloradors vegetals. Quant major contingut en sucres solubles i sabor presenta el fruït, més serà valorat per part dels consumidors i la industria. Paradoxalment, s'ha seleccionat en contra dels fruïts amb alt contingut en cloroplasts perquè aquest caràcter, davall alta intensitat lumínica, sol estar associat amb danys en el fruït per estrés oxidatiu; com muscles groguencs de la tomata o clevitjament del fruït. Per aquest motiu, l'esforç en millora s'ha orientat principalment a evitar pèrdues de manera que la qualitat organolèptica s'ha vist reduïda. L'objectiu d'aquesta tesi es millorar la qualitat del fruït de tomata mitjançant l'ús de tècniques d'enginyeria genètica orientades a incrementar els cloroplasts al fruït i millorar la tolerància a l'estrès oxidatiu amb una aproximació cis/intragènica. Plantes de tomata de la varietat MoneyMaker foren millorades genèticament per expressar de manera individual o conjunta SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 als moments inicials del desenvolupament. Aquestes línies donen fruïts amb major acumulació de sucres, carotens i volàtils que el control MoneyMaker. Les línies potenciades amb el desenvolupament de cloroplasts es caracteritzaren a nivell estructural, metabòlic, proteòmic i transcriptòmic. Es va descobrir un nou efecte additiu en la regulació gènica del cloroplast quan ambdós factors de transcripció s'expressen de manera simultània i es va presentar una hipòtesi per a dit efecte. A més, es van caracteritzar dos varietats tradicionals de tomata (Muchamiel i Pera) dissenyades per a expressar gens que pertanyen al complex de regulació d'antocians BMW, davall el control del promotor induïble per llum (PLI). Les plantes millorades genèticament presentaren una gran acumulació d'antocians, especialment a la pell del fruït i en tricomes de tipus VI. La caracterització d'aquest teixit indica alteracions específiques en la ruta dels flavonoides i una altra dependència a condicions de llum. Aquestes plantes podrien ser de gran interès per a protegir els fruïts d'alts nivells de cloroplasts front a l'estrès oxidatiu generat pels ROS, i per a avaluar l'efecte en el creixement de la planta davall condicions d'alta llum i en futurs estudis d'interacció planta-patògen. / Cocaliadis Caisson, MF. (2017). A multilevel, developmentally controlled gene engineering strategy for tomato fortification and protection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90401