O microrganismo gram-negativo Aggregatibacter actinomycetemcomitans, fortemente associado a quadros de periodontite agressiva, coloniza a cavidade oral, aderindo e invadindo as células epiteliais e participando da formação de biofilme nas superfícies do hospedeiro. A. actinomycetemcomitans expressa Aae, uma proteína de superfície, relacionada com a adesão às células epiteliais. Este estudo avaliou o papel de Aae na adesão a outros substratos tais como proteínas extracelulares colagenosas e não-colagenosas, hidroxiapatita recoberta por saliva (SHA) e na formação de biofilme. Um mutante nulo em aae foi construído e o fenótipo comparado com o da linhagem selvagem (VT1169). O mutante nulo exibiu significativa redução na adesão às células epiteliais e a SHA, na formação de biofilme, além de apresentar-se menos hidrofóbico que a linhagem parental. A capacidade de adesão ao colágeno V e a fibronectina foi fracamente afetada pela interrupção do gene aae. Entretanto, o mutante nulo em aae exibiu uma capacidade diminuída na adesão à laminina e colágenos I, III e IV. Estes dados sugerem que Aae desempenha um importante papel na colonização da cavidade oral, não somente promovendo sua adesão às células epiteliais, mas também a outros substratos. / The gram-negative organism Aggregatibacter actinomycetemcomitans, associated with aggressive periodontitis, colonizes the oral cavity by binding to and invading epithelial cells and by participating in biofilms formed in host surfaces. A. actinomycetemcomitans express Aae, a surface protein, implicated in the adhesion to epithelial cells. This study evaluated the role of Aae in adhesion to other substrates such as collagen and non-collagen extracellular matrix proteins and saliva coated hydroxyapatite (SHA) and in biofilm formation. A null mutant in aae was constructed and its behavior was compared with the wild type strain VT1169. The null mutant exhibited a decreased ability to bind to epithelial cells and to SHA, formed less biofilm and was less hydrophobic than the parental strain. The abilities to bind to collagen V and fibronectin were very poorly affected by aae interruption. However, the null aae mutant exhibited a decreased ability to adhere to laminin, collagen I, III and IV. These data suggest that Aae may play an important role in the colonization of the oral cavity by A. actinomycetemcomitans, not only by promoting its adhesion to epithelial cells, but by mediating adhesion to other substrates.

Orientador: Márcio Zaffalon Casati / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:08:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monteiro_MabelledeFreitas_M.pdf: 1431989 bytes, checksum: 55bf42377e6ffeb3626cb5a8d6551c1c (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O Resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The Abstract is available with the full electronic digital document. / Mestrado / Periodontia / Mestra em Clínica Odontológica

Os tecidos periodontais estão em confronto continuo com microorganismos capazes de disparar mecanismos da resposta imune inata, dando origem ao infiltrado inflamatório. Estudos recentes mostraram a importancia dos receptores do tipo Toll (TLRs) na fase inicial de reconhecimento de diferentes patogenos. A participação de receptores tipo Toll (TLRs) na resposta de neutrófilos e macrófagos frente a periodontopatógenos precisa ser determinada. Nesse estudo procuramos caracterizar o infiltrado inflamatório presente no peritônio de animais deficientes de TLR4-/-, avaliar a atividade fagocítica, bem como a produção de óxido nítrico (NO) e a atividade de mieloperoxidase (MPO) no curso da infecção por Aggregatibacter actinomycetemcomitans. A ausência de TLR4 não influenciou a quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos para o local da infecção, a produção de óxido nítrico, a atividade de MPO e a viabilidade celular. No entanto, neutrófilos e macrófagos de animais TLR4-/- apresentaram menor atividade fagocítica quando comparado ao grupo controle (camundongos WT). Em relação a doença periodontal induzida experimentalmente com Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos deficientes de TLR4, os resultados mostraram que 100% dos animais deficientes de TLR4 sobreviveram a infecção durante o período de observação. Em relação a análise de perda óssea, os dados revelaram uma menor perda progressiva de osso alveolar na região dos molares de animais deficientes de TLR4. A ausência do receptor interferiu na disseminação da bactéria, uma vez que se observou um grande número de bacilos no linfonodo e baco dos animais que não expressaram TLR4, diferente do observado para os animais selvagens (WT). Os resultados indicam a importância da sinalização via TLR4 durante a resposta imune contra Aggregatibacter actinomycetemcomitans. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is an oral gram negative bacteria that contributes to periodontitis progression. Isolated antigens from A. actinomycetemcomitans could be activating innate immune cells through Toll-like receptors (TLRs), molecules that recognize structural components conserved among microorganisms. In this study, we evaluated the role of TLR4 in the recognition of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Neutrophils and macrophage from TLR4 deficient mice and WT mice were collected and used for the subsequent assays. The phagocytosis of leukocytes against A. actinomycetemcomitans and the presence of apoptotic cells were determined by flow cytometry. The in vivo and in vitro production of NO and MPO was evaluated 24h after A. actinomycetemcomitans challenge. In addition, we examined the mechanisms that modulate the outcome of A. actinomycetemcomitans-induced periodontal disease in TLR4-/- mice. The results show that inflammatory cells influx in peritoneal cavity of TLR4-/- mice was similar to that observed into their littermate controls. The phagocytic activity was diminished by cells from TLR4-/- mice. In addition, we did not observe difference in NO and MPO production and the frequency of apoptotic cells between cells from TLR4-/- and WT mice. The results showed that TLR4-deficient mice developed less severe periodontitis after A. actinomycetemcomitans infection, characterized by significantly lower bone loss and inflammatory cell migration to periodontal tissues. Together, these data demonstrate the role TLR4 signals for neutrophils activation after A. actinomycetemcomitans infection and development of periodontal disease.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans está associado à etiologia da periodontite agressiva localizada. A colonização de tecidos do hospedeiro é necessária para patogênese e a adesão é fundamental. A proteína autotransportada Aae faz a adesão da bactéria a células epiteliais gengivais. Proteínas autotransportadas de diferentes espécies apresentam múltiplas funções e podem ser antígenos vacinais na prevenção de infecções. Para entender o papel de Aae na ligação ao hospedeiro e efeito de anticorpos contra Aae, o polimorfismo de aae na região que codifica o domínio de ligação a células epiteliais foi determinado e relacionado à adesão a células epiteliais KB . Aae recombinante foi obtida, e a capacidade de ligação a proteínas da matriz extracelular e soro foi determinada em ensaios com a recombinante e com uma amostra deficiente na expressão de Aae obtida (ensaios comparativos com amostra selvagem). Títulos de IgG contra Aae em pacientes com periodontite agressiva e saudáveis foram determinados e relacionados à resposta humoral contra sorotipos de A. actinomycetemcomitans. Por fim, o efeito de anticorpos contra Aae e/ou seu domínio efetor, produzidos em modelo animal, foi determinado na inibição da adesão mediada por Aae e opsonização por fagócitos. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is related with etiology of localized aggressive periodontitis. Colonization of host tissues is necessary to pathogenesis and adhesion is essential. The autotransporter protein Aae mediates the adhesion of bacteria to gingival epithelial cells. Autotransporter proteins from different species have multiple functions and could be vaccine antigens to prevent infections. To understand the role of Aae in host interaction and the effect of antibodies against Aae, polymorphism of aae in codifying effector domain region of ligation to epithelial cells was determined and related with adhesion to these cells. Recombinant Aae was obtained and the ability of interaction with Extracellular matrix and serum proteins was determined through assays using the recombinant and an obtained defective sample in Aae expression (comparative assays with wild type). IgG titters against Aae were determined in patients with aggressive periodontitis and healthy and related to humoral response against A. actinomycetemcomitans serotypes. At last, the effect of antibodies against Aae and/or its effector domain, obtained in animal model, was determined in inhibition of adhesion to epithelial cells and macrophages oopsonization.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans produz fatores de virulência que induzem destruição periodontal, porém a sua regulação é pouco conhecida. O sistema de dois componentes ArcAB é um regulador da transcrição gênica que percebe concentrações de oxigênio no ambiente. Este estudo tem como objetivo construir uma amostra de A. actinomycetemcomitans arcB deficiente e comparar características fenotípicas e de transcrição gênica em relação à amostra selvagem. As curvas de crescimento em condições de microaerofilia e anaerobiose foram similares. Foram observadas diferenças nas capacidades de adesão e invasão às células epiteliais, de formação de biofilme, de adesão à hidroxiapatita recoberta por saliva e na hidrofobicidade entre as amostras. A análise de transcrição gênica por RT-PCR em tempo real mostrou expressão diferenciada de apaH, vppA, vapA e omp29. Os dados indicam que em A. actinomycetemcomitans, ArcB é capaz de detectar condições redox, sendo associado a expressão de fatores de colonização da cavidade oral, regulando a transcrição de genes associados à virulência. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans produces several virulence factors which induce periodontal destruction, but little is known about their regulation. The two components system ArcAB is a genetic transcription regulator that senses oxygen concentrations in the environment. This study aimed to construct an A. actinomycetemcomitans arcB deficient mutant and to compare phenotypic carachteristics and gene transcription with the wild type. The growth curves under microaerophilic and anaerobic conditions were similar. There were differences in abilities to adhere and invade epithelial cells, to form biofilm, to adhere to saliva-coated hydroxyapatite and in hydrophobicity between the strains. Gene transcription analysis by real time PCR showed differential expression of apaH, vppA, vapA and omp29. These data indicate that in A. actinomycetemcomitans, ArcB is able to detect redox conditions and is associated with colonization factors of the oral cavity, by regulating transcription of genes associated with virulence.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans está associado à periodontite agressiva e produz CDT. Visando contribuir no entendimento do papel da CDT na regulação da resposta imune, foi determinada sua atividade sobre macrófagos e a resposta humoral contra a toxina. CDT inibiu a proliferação de células epiteliais OBA-9 e macrófagos Raw 264.7 e também a produção de NO por células Raw 264.7 e macrófagos peritoneais de camundongos C3H/HePas e C3H/HeJ, mas estimulou a produção de IL-12. Na imunidade humoral, 75% dos soros de indivíduos com PAgL e 81,8% dos PAgG foram reativos para A. actinomycetemcomitans. Não houve diferença na resposta contra CDTA e CDTB entre o soro de pacientes com diferentes condições periodontais. Todos os pacientes PAgG foram soropositivos para a CDTC, porém apenas 8,3% dos indivíduos com PAgL, nenhum dos PC e 25% dos saudáveis foram positivos. CDT tem atividade imunomodulatória e a resposta humoral difere entre indivíduos infectados pela bactéria. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is associated with aggressive periodontitis and produces CDT. Aiming to contribute in the understanding the CDT activity in the immune response regulation, its action on macrophages was determined and the response against the toxin analyzed. CDT inhibited the proliferation of OBA-9 epithelial cells and Raw 264.7 macrophages and also inhibited the NO production by Raw 264.7 cells and peritoneal macrophages of C3H/HePas and C3H/HeJ mice, however, stimulated the IL-12 production. In the humoral immunity, 75% of sera from LAgP subjects and 81.8% were reactive to A. actinomycetemcomitans. There was not difference in the response against CDTA and CDTB among sera of patients with different periodontal conditions. All GAgP subjects were sera-reactivity to CDTC, however only 8.3% LAgP subjects, none in CP and 25% of healthy subjects were positive. CDT has immunomodulatory activity and the humoral response differ among bacteria infected subjects.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans está associado à periodontite agressiva, caracterizada pela intensa reabsorção do osso alveolar. Esta espécie produz a toxina distensora citoletal (AaCDT) que possui atividade de DNAse, e promove o bloqueio das células alvo na fase G2 ou G1/ G2. Por outro lado, CDT ativa a cascata apoptótica pela atividade de PIP3, regulando a proliferação e sobrevivência de linfócitos, pelo bloqueio de Akt. Em monócitos, AaCDT induz aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias e inibe a produção de óxido nítrico e fagocitose. Células precursoras de osteoclastos têm origem hematopoiética e sofrem diferenciação em osteoclastos, mediada pelo RANKL, mas outros fatores co-estimulatórios estão envolvidos. A AaCDT induz a produção de RANKL por fibroblastos. Assim, formulamos a hipótese se CDT influenciaria a homeostase óssea por afetar a diferenciação de células precursoras de osteoclastos. O estudo visou determinar o efeito de AaCDT sobre a sobrevivência, diferenciação e atividade em RAW264.7 e BMC. Os dados sugerem que a CDT interfere na homeostase óssea, favorecendo a indução da diferenciação de células precursoras de osteoclastos e alterando o perfil de citocinas produzidas. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is associated with aggressive periodontitis, characterized by severe alveolar bone resorption. This species produces a distending toxin cytolethal (AaCDT) which has DNase activity, and promotes the blocking of target cells in G2 or G1 / G2 phase. On the other hand, CDT activates the apoptotic cascade by PIP3 activity, regulating lymphocyte proliferation and survival by blocking Akt. In monocytes, AaCDT enhances the production of proinflammatory cytokines and inhibits nitric oxide production and phagocytosis. Osteoclast precursor cells are of hematopoietic origin and must undergo differentiation into osteoclasts mediated by RANKL although other co-stimulatory factors are involved. AaCDT induces the production of RANKL by fibroblasts. Thus, CDT is hypothesized to influence bone homeostasis by affecting the differentiation of precursor cells into osteoclasts. This study aimed to determine the effect of AaCDT on survival, differentiation and activity of osteoclasts precursor cells. The data suggested that CDT interfere in bone homeostasis, favoring the differentiation of osteoclasts precursors cells and by altering their cytokines profile.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a) é associado a periodontite agressiva. Na infecção, pode ocorrer ativação de vias de sinalização do hospedeiro e bacterianas. Objetivos: determinar a transcrição de genes relacionados à virulência bacteriana e das vias de transdução de sinais da célula epitelial após interação bactéria-célula epitelial. Métodos: cepas de A.a foram co-cultivadas com células epiteliais OBA-9. A transcrição dos genes bacterianos e das células epiteliais foi determinada por RT-qPCR e a concentração de citocinas determinada por ELISA. Resultados: A regulação da transcrição de certos genes de virulência de A.a é cepa e tempo específica. Quinze genes foram regulados positivamente nas células OBA-9 infectadas. Altos níveis de GM-CSF, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 e ICAM-1 foram detectados em células OBA-9 infectadas e tecidos gengivais de pacientes com periodontite. Conclusão: a interação entre A. a e célula epitelial pode modular a resposta do hospedeiro com a indução da expressão de fatores que exacerbam o processo inflamatório. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a) is associated with the etiology of aggressive periodontitis. The activation of signaling pathways by the host and bacterial cells occurs during infection. Objectives: to determine the transcription of genes related to bacterial virulence and epithelial cell after bacterial-epithelial cell interaction. Methods: A.a strains were co-cultured with epithelial cells OBA-9. The transcription of A.a virulence genes and genes belonging to signaling transduction pathway were determined by RT-qPCR and the concentration of cytokines was determined by ELISA. Results: the transcription of some virulence genes is strain and time specific. Fifteen genes were up-regulated in OBA-9 cells. High levels of GM-CSF, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 and ICAM-1 were detected in infected OBA-9 cells and tissues of patients with periodontitis. Conclusion: the interaction between A.a and epithelial cell can modulate the host response with induction of factors which exacerbate inflammatory process.

A Diabetes mellitus do tipo I (IDDM), doença metabólica caracterizada pela deficiência na produção de insulina, causa profundas alterações sistêmicas, incluindo a cavidade bucal. A doença periodontal, que se apresenta mais agressiva em pacientes diabéticos, até mesmo na infância, tem como agentes etiológicos microrganismos denominados periodontopatógenos, dentre eles o Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), anteriormente chamado Actinobacillus actinomycetemcomitans, que em associação às alterações na resposta imune e inflamatória decorrentes da diabetes, poderá causar maior reabsorção do osso alveolar precocemente em crianças. A identificação precoce destes agressores poderá ser extremamente útil para a instituição de medidas preventivas e terapêuticas que possam inibir ou minimizar os efeitos nocivos da IDDM e suas conseqüências para a cavidade bucal. Para este fim, métodos moleculares de investigação estão sendo cada vez mais utilizados, destacando-se a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (Real-Time PCR) com alta especificidade e sensibilidade para detectar e quantificar microrganismos, mesmo em pequeno número e em meios, até então, pouco explorados como a saliva. Por fim, a utilização de um antimicrobiano seguro, que possa ser aplicado topicamente por meio da escovação dentária, como o metronidazol 25% na forma de gel, poderia reduzir ou eliminar o A. actinomycetemcomitans evitando a progressão da doença periodontal. Assim, este estudo foi realizado para observar a presença do A. actinomycetemcomitans antes e após o uso do gel de metronidazol 25% uma vez ao dia, em substituição a uma das escovações diárias. Avaliou também a influência deste protocolo de tratamento nos índices de placa, gengival e profundidade de sondagem em 32 crianças, na faixa etária de 3 a 12 anos de idade, divididas em dois grupos: diabéticos tipo I (D) e não diabéticos (ND). Para avaliação da presença do A. actinomycetemcomitans foi utilizado o método da Real-Time PCR. Os resultados obtidos sugerem que o gel de metronidazol 25%, aplicado segundo o protocolo estabelecido neste trabalho foi efetivo para a redução dos índices de placa, gengival e do A. actinomycetemcomitans, no entanto, pareceu não atuar sobre a profundidade de sondagem. Os dados obtidos sugerem que, ainda que a ocorrência da bactéria nos indivíduos avaliados tenha sido baixa e a diferença entre o grupo diabéticos e não diabéticos tenha restringido-se apenas à profundidade de sondagem, o gel estudado demonstrou ser promissor na prevenção da doença periodontal em crianças diabéticas, havendo necessidade da realização de mais estudos clínicos randomizados. / Type I Diabetes mellitus (IDDM) is a metabolic disease characterized by deficiency on the insulin production, causing great systemic alterations, including at the oral cavity. Periodontal disease is more aggressive in diabetic patients, even during the childhood, and presents as etiological microorganisms the Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), formerly Actinobacillus actinomycetemcomitans. This microorganisms in association to alterations in the immune and inflammatory answers caused by diabetes, can promote a larger and early alveolar bone resorption even in children. So, the early identification of these aggressors could be extremely useful for the institution of preventive and therapeutic measures in order to inhibit or minimize the noxious effects of IDDM and their consequences in the oral cavity. Aiming this early identification, molecular biology methods of investigation are being used more frequently, pointing out the Real Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR), which presents high specificity and sensibility to detect and to quantify microorganisms, even in small number and in different media little explored like saliva. The use of a safe topical antibiotic, such as metronidazole 25% gel, which used in association with dental brushing, could reduce or eliminate A. actinomycetemcomitans, avoiding the progression of the periodontal disease. This study evaluated the presence of A. actinomycetemcomitans before and after the use of metronidazole 25% gel once a day, in substitution to one of the daily teeth brushing. It also evaluated the influence of this treatment protocol on the plaque, gingival and probing depth indexes. Thirty-two children, aging from 3 to 12 years were included in this study and they were divided into two groups: type I diabetic (D) and no diabetic (ND). Real-Time PCR methods were used to evaluate the presence of A. actinomycetemcomitans. The obtained data suggest that metronidazole 25% gel, applied according to the established protocol in this study, effectively reduced plaque and gingival indexes and the number of A. actinomycetemcomitans. However, no influence was observed regarding the probing depth. The obtained data suggest that, although the number of bacteria has been small and the difference between the D and ND groups was not observed only regarding probing depth, the studied antibiotic gel demonstrated to be promising in preventing periodontal disease in diabetic children. More randomized clinical trials are necessary for a final conclusion.

As doenças periodontais (DP) afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por micro-organismos gram-negativos anaeróbios presentes no biofilme periodontal. A evolução da doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares, que atuam no micro ambiente local modulando a resposta do hospedeiro em busca do controle da infecção. Acredita-se que citocinas inflamatórias, quimiocinas e seus receptores estão envolvidos na migração celular para os tecidos periodontais, contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de determinação de resistência ou susceptibilidade às DP; ou no desencadeamento do dano tecidual decorrente da resposta. Neste projeto, avaliou-se o papel das células CCR5+ na DP experimental induzida pela inoculação oral de Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos C57BL/6 wild type e camundongos CCR5-knockout. Os resultados mostram que a maioria das células CCR5+ possuem fenótipo compatível com células T do subtipo Th1, devido a co-expressão de CD3 e CXCR3; além de co-expressarem RANKL. Na ausência das células CCR5+, houve uma significativa diminuição da migração de células inflamatórias totais e RANKL+ para os tecidos periodontais, diminuição da reabsorção óssea alveolar, diminuição dos níveis de expressão de citocinas pró-inflamatórias TNF&#945;-, IL-1&#946; e IFN-&#947;, assim como diminuição na expressão de MMP-1, MMP-2 e MMP-13. Sua ausência não interferiu no controle da infecção periodontal apesar da diminuição dos níveis de iNOS. Estes resultados conduzem à conclusão de que a maioria das células CCR5+ são células T do subtipo Th1, que atuam como importantes moduladoras das citocinas TNF&#945;-, IL-1&#946; e IFN-&#947;, das metaloproteinases de matriz MMP-1, MMP-2 e MMP-13, e que também expressam e modulam a expressão de RANKL, tendo participação importante na imunopatogenese da DP experimental, sem interferir no controle da infecção periodontal. Estes fatos tornam as células CCR5+ potenciais alvos para intervenção terapêutica visando ao controle das doenças periodontais. / The periodontal diseases (PD) affect the supportive tissues of the teeth and are triggered by periodontopathogens present in the dental biofilm. The clinical outcome is highly influenced by the host inflammatory and immune response with participation of many cellular types, that act in the local microenvironment modulating the host response to control the infection. Inflammatory cytokines, chemokines and its receptors are thought to be involved in the cellular migration to the periodontal tissues, but there is little knowledge about the mechanisms of determination of resistance or susceptibility to the PD and in the triggering of tissue damage by immune response components. This study evaluated the role of CCR5+ cells in the experimental PD induced by oral inoculation of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in C57BL/6 wild type mice and CCR5-knockout mice. The phenotypic analysis of inflammatory infiltrate demonstrated that the most of CCR5+ cells coexpress CD3 and CXCR3, suggesting a phenotype compatible with Th1-type cells, and also co-express RANKL. In the absence of CCR5+ cells there was a significant overall reduction of inflammatory cells and RANKL+ cells influx to the periodontal tissues, reduction in the alveolar bone resorption, reduction in the levels of pro-inflammatory cytokines TNF&#945;-, IL-1&#946; and IFN-&#947; expression, as a reduction in the expression of MMP-1, MMP-2 and MMP-13. The absence of CCR5+ cells did not impair the control of periodontal infection, despite the reduction of iNOS levels. In conclusion, these data demonstrate that the most of CCR5+ cells are Th1 cells, which act as important modulators of TNF&#945;-, IL-1&#946; and IFN-&#947;, MMP-1, MMP- 2 and MMP-13 levels, and which also express and modulate the expression of RANKL, playing an important role in the immunopathogenesis of experimental PD, without impairing the control of periodontal infection. These facts point to CCR5+ cells as potentials targets to therapeutic interventions aimed to control periodontal diseases.