Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1999. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves [174]-186). Also available on the Internet.

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2009. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains iv, 60 p. : ill. (some col.). Includes abstract. Includes bibliographical references.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neonatal hypoxic-ischemic injury (HI) is the direct complication to severe choking and may cause brain damage. HI may be found in different stages and clinical manifestations contributing to neonatal morbidity and mortality. The neuropathology of neonatal HI insult is multi-factorial and complex. Hypoxic-ischemic brain damage begins during the insult and extends during the recovery period after reperfusion, thus, it is an evolutionary process. Adenosine deaminase (ADA) is an aminohidrolase actively involved in the metabolism of purines catalyzing irreversibly adenosine and 2'desoxiadenosine into inosine and 2'desoxinosine, respectively. The objectives of this study were to evaluate the activity of ADA in the cortex of rats subjected to neonatal HI at different post-insult time points. Effects of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) levels were also assessed in cortex. The histological analysis was evaluated using hematoxylin eosin (HE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the cortex of these animals. The ADA activity was significantly increased 8 days after the insult in the left hemisphere in the cortex. In this period, TBARS levels were significantly increased in the cortex of these animals. HE revealed the presence of ischemic area in the cerebral cortex 8 days after HI. A moderate lymphocytic infiltration was also evidenced in the cortex during this period. A proliferation and an increase in the expression of GFAP in the periphery of the ischemic area was observed, resulting in astrocytosis in the cortex of these animals. In conclusion, an activation of the immune system was observed due to the inflammatory process caused by the HI insult that may be correlated with astrocytosis and lymphocytic infiltration observed in the cerebral cortex of animals that suffered insult 8 days after neonatal HI. / A lesão hipóxico-isquêmica (HI) neonatal é a complicação imediata à asfixia grave e pode causar dano cerebral. A HI pode apresentar-se em diferentes estágios e manifestações clínicas contribuindo assim intensamente na morbidade e mortalidade neonatal. A neuropatologia do insulto HI neonatal é multi-fatorial e complexa. O dano cerebral hipóxicoisquêmico inicia durante o insulto e estende-se no período de recuperação após a reperfusão, portanto é um processo evolutivo. A adenosina deaminase (ADA) é uma aminohidrolase que participa ativamente do metabolismo das purinas catalisando irreversivelmente a adenosina e 2 desoxiadenosina em inosina e 2 desoxinosina, respectivamente. Os objetivos deste estudo foram avaliar em ratos submetidos à HI neonatal a atividade da ADA no córtex destes animais em diferentes tempos pós-insulto. Também foram avaliados em córtex os efeitos dos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A análise histológica foi avaliada através da hematoxilina eosina (HE) e proteína glial fibrilar ácida (GFAP) no córtex destes animais. A atividade da ADA aumentou significativamente 8 dias após o insulto no hemisfério esquerdo no córtex. Neste período os níveis de TBARS mostraram-se significativamente aumentados no córtex destes animais. A HE revelou presença de área isquêmica no córtex cerebral 8 dias após a HI. Também evidenciou uma moderada infiltração linfocitária no córtex neste período. Houve proliferação e aumento na expressão da GFAP na periferia da área isquêmica, resultando em astrocitose no córtex dos animais submetidos à HI. Conclui-se que houve uma ativação do sistema imune em decorrência do processo inflamatório causado pelo insulto HI que pode estar correlacionada com a astrocitose e a infiltração linfocitária observada no córtex cerebral dos animais que sofreram o insulto 8 dias após a HI neonatal.

The parasite Rangelia vitalii is the etiologic agent of rangeliosis, a disease that leads to a wide variety of clinical signs, including hemostatic disorders characterized by bleeding. However, the causes of this process have not been established. The aim of this study was to evaluate the production of megakaryocytes, platelet count, clotting time, platelet activity and to determine the activity of enzymes that hydrolyze nucleotides and adenine nucleosides in platelets of dogs experimentally infected with R. vitalii. For this study, 12 dogs were separated in two groups: Group A was composed by five healthy dogs, and group B composed by seven dogs experimentally infected with R. vitalii. After inoculation, the animals were monitored by blood smears. The parasite was found within erythrocytes, neutrophils and monocytes five days post-inoculation (PI). Blood collection to perform platelet count, coagulation tests and measurement of platelet aggregation was performed on days 0, 10 and 20 PI. On days 10 and 20 PI, after this procedure, the dogs were anesthetized for collecting bone marrow samples to evaluate the production of megakaryocytes. To measure the activity of ectonucleotidases and adenosine deaminase, blood samples were collected on days 12 and 21 PI. Blood samples were stored in tubes containing EDTA to quantification of platelets, evaluation of platelet aggregation and measurement of enzymatic activity. The blood was stored in tubes containing citrate for realization of the clotting time. This study revealed a reduction (P<0.01) of platelet numbers in the infected group when compared to control group. Prothrombin time and active partial thromboplastin time showed no significant difference between infected and control animals. There was an increase (P<0.01) in the number of megakaryocytes in infected group when compared with control group. A reduction (P<0.01) of platelet aggregation was observed in dogs infected with R. vitalii. The hydrolysis of ATP, ADP, AMP and deamination of adenosine decreased (P<0.01) on day 12 PI. On day 21 PI, the activity of adenosine deaminase remained reduced (P<0.01), whereas it was observed an increase (P<0.05) in NTPDase levels. From these results, we can conclude that rangeliosis is responsible for severe thrombocytopenia during the acute phase of infection, and this can be due to splenic sequestration and/or immune-mediated thrombocytopenia. Also, alterations in purinergic system contribute to the occurrence of hemostatic disorders observed in this disease. / O parasito Rangelia vitalii é o agente etiológico da rangeliose, uma enfermidade que cursa com uma grande variedade de sinais clínicos, incluindo desordens hemostáticas caracterizadas por sangramentos. Entretanto, as causas das alterações no processo hemostático nessa doença ainda não foram esclarecidas. O objetivo deste estudo foi avaliar os distúrbios hemostáticos através da produção de megacariócitos e contagem de plaquetas, a coagulação sanguínea, a atividade plaquetária e determinar a atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeo de adenina em plaquetas de cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Para este estudo, 12 cães foram separados em dois grupos: Grupo A foi composto por cinco cães saudáveis, e grupo B com sete cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Após inoculação, os animais foram monitorados quanto à parasitemia por esfregaço sanguíneo. O parasito foi encontrado no interior de hemácias, neutrófilos e monócitos cinco dias pós-inoculação (PI). As coletas de sangue para a realização da contagem plaquetária, testes de coagulação e mensuração da agregação plaquetária foram realizadas nos dias 0, 10 e 20 PI. Nos dias 10 e 20 PI, após esse procedimento, os cães foram anestesiados para coleta do aspirado de medula óssea com a finalidade de avaliar a produção de megacariócitos. Para avaliar a atividade das ectonucleotidases e adenosina desaminase, as coletas de sangue foram realizadas nos dias 12 e 21 PI. Este estudo demonstrou redução (P<0,01) no número de plaquetas entre o grupo infectado em relação ao controle. Os tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativado não apresentaram diferença significativa entre animais infectados e controles. Ocorreu aumento (P<0,01) do número de megacariócitos no grupo infectado quando comparado com o controle. Foi observado uma diminuição (P<0,01) na agregação plaquetária em cães infectados por R. vitalii. A hidrólise de ATP, ADP, AMP e desaminação da adenosina foram reduzidas (P<0,01) no dia 12 PI quando comparadas com o grupo controle. No dia 21 PI, a atividade da adenosina desaminase manteve-se reduzida (P<0,01), enquanto que ocorreu aumento (P<0,05) na atividade da ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase). A partir dos resultados, pode-se concluir que a rangeliose é responsável por grave trombocitopenia na fase aguda da infecção, a qual pode estar associada ao sequestro e/ou destruição imunomediada e, que alterações no sistema purinérgico contribuem para a ocorrência das desordens hemostáticas observadas na infecção pelo parasito R. vitalii.

Uliginosina B é um derivado acilfloroglucinol natural, isolado de espécies de Hypericum nativas da América do Sul. Estudos prévios demonstraram que a uliginosina B apresenta efeitos do tipo antidepressivo e antinociceptivo em baixas doses (até 15 mg/kg, i.p. ou v.o.) e, em doses elevadas (90 mg/kg, i.p.), prejudica a coordenação motora. A atividade antidepressiva depende da ativação da neurotransmissão monoaminérgica e envolve a regulação da homeostase através do balanço de Na+. A atividade antinociceptiva é mediada por receptores opioides e dopaminérgicos da família D2. O efeito atáxico depende da ativação de receptores opioides e dopaminérgicos. Os efeitos parecem ser decorrentes da sua capacidade de inibir a recaptação de monoaminas (especialmente dopamina) com consequente ativação de receptores opioides e monoaminérgicos. O objetivo deste estudo foi aprofundar o conhecimento sobre o mecanismo de ação antinociceptiva de uliginosina B, investigando o envolvimento da neurotransmissão monoaminérgica, glutamatérgica e purinérgica. O tratamento com uliginosina B aumentou a disponibilidade intersticial de dopamina e seu metabólito, ácido homovanílico (HVA), no estriado de ratos; dados que reforçam o papel da neurotransmissão dopaminérgica nos efeitos da uliginosina B. O papel das outras monoaminas e da neurotransmissão glutamatérgica foi investigado nos efeitos antinociceptivo e atáxico induzidos por uliginosina B. A ataxia (90 mg/kg, i.p.) foi completamente prevenida pelo tratamento prévio com pCPA (inibidor da síntese de serotonina) e MK-801 (antagonista do receptor glutamatérgico NMDA), mas não foi afetada pelo prétratamento com prazosina ou ioimbina (antagonistas de receptores adrenérgicos α1 e α2, respectivamente). A atividade antinociceptiva (15 e 90 mg/kg, i.p.) foi reduzida significativamente pelo pré-tratamento com pCPA e MK-801 e aumentada pelo prétratamento com prazosina e ioimbina, apenas na dose mais elevada (90 mg/kg, i.p.). A importância da neurotransmissão monoaminérgica para o efeito antinociceptivo da uliginosina B foi confirmada através da análise isobolar. A associação de uliginosina B com amitriptilina (inibidor da recaptação de monoaminas) ou clonidina (agonista adrenérgico α2) apresentou interação aditiva – dados sugestivos de substâncias com mecanismos de ação mediados pelas mesmas vias – enquanto a associação com morfina (agonista opioide) apresentou interação sinérgica – dados indicativos de um possível uso clínico, como adjuvante opioide na farmacoterapia da dor. O efeito antinociceptivo de uliginosina B (15 mg/kg, i.p.) também foi prevenido pelo tratamento prévio com DPCPX e ZM-241385 (antagonistas de receptores adenosinérgicos A1 e A2A, respectivamente). Este efeito esta relacionado, pelo menos em parte, com a capacidade da uliginosina B aumentar a hidrólise de AMP na medula espinhal e de ATP no córtex cerebral. A uliginosina B também inibiu in vitro a atividade da enzima Na+,K+-ATPase (isoformas α1 e α3). O conjunto de dados apresentados nesta tese evidencia a uliginosina B como um padrão estrutural multirreceptor promissor no desenvolvimento de fármacos com ação analgésica. Em suma, os efeitos antinociceptivo e atáxico induzidos pelo tratamento com uliginosina B são mediados pela ativação da neurotransmissão monoaminérgica, glutamatérgica, purinérgica e opióide, requisitadas com diferente grau de importância; e ainda envolvem o balaço iônico da Na+,K+-ATPase. / Uliginosin B is a natural acylphloroglucinol derivative obtained from Hypericum species native to South America. Previous studies have shown that uliginosin B presents antidepressant-like and antinociceptive effects at low doses (up to 15 mg/kg, i.p. or p.o.), and at high doses (90 mg/kg, i.p.) it impairs the motor coordination. The antidepressant-like activity seems to depend on the activation of monoaminergic neurotransmission and ionic balance of Na+. The antinociceptive effect is mediated by opioid and D2 dopamine receptors. The ataxic effect involves opioid and dopaminergic receptors activation. The uliginosin B effects appear to be a consequence of their ability to inhibit reuptake of monoamines (especially dopamine) with subsequent activation of opioid and monoaminergic receptors. The aim of this study was to deepen our knowledge about the mechanism of antinociceptive action of uliginosin B, investigating the involvement of monoaminergic, glutamatergic and purinergic neurotransmissions. Treatment with uliginosin B increased the interstitial availability of dopamine and its metabolite, homovanillic acid (HVA), in the striatum of rats; these data underscore the role of dopaminergic neurotransmission in the effects of uliginosin B. The role of other monoamines as well as the glutamatergic neurotransmission, were investigated in the antinociceptive and ataxic effects induced by uliginosin B. The ataxic effect (90 mg/kg, i.p.) was completely prevented by pre-treatment with pCPA (a serotonin synthesis inhibitor) and MK-801 (a NMDA glutamatergic receptor antagonist), but was not affected by pretreatment with prazosin or yohimbine (α1 and α2 adrenoceptor antagonists, respectively). The antinociceptive activity (15 and 90 mg/kg, i.p.) was significantly reduced by pretreatment with pCPA and MK-801 and increased by pretreatment with yohimbine and prazosin only at the highest dose (90 mg/kg, i.p.). The importance of monoaminergic neurotransmission for the uliginosin B antinociceptive effect was confirmed by isobolar analysis. The association between uliginosin B with amitriptyline (monoamine reuptake inhibitor) or clonidine (α2 adrenergic agonist) showed additive interaction - findings suggestive of substances with mechanisms of action mediated by the same pathways - while the association with morphine (opioid agonist) showed synergistic interaction - indicative of a possible clinical use as adjuvant to opioid pharmacotherapy of pain relief. The antinociceptive effect of uliginosin B (15 mg/kg, i.p.) was also prevented by pretreatment with DPCPX and ZM-241385 (A1 and A2A adenosinergic receptor antagonists, respectively). This effect is related, at least in part, to its ability of increases the AMP and ATP hydrolysis in the spinal cord and cerebral cortex synaptosomes, respectively. Moreover, uliginosin B inhibited the Na+,K+-ATPase activity (α1 and α3 isoforms) in vitro. The data set presented in this thesis pointed uliginosin B as a promising multirreceptor molecular pattern in the analgesic drug development. In summary, the antinociceptive and ataxic effects induced by uliginosin B were mediated by the activation of monoaminergic, glutamatergic, purinérgico and opioid neurotransmission and involves the ionic balance, required with different degree of importance.

Trichomonas vaginalis é o agente etiológico da doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo, sendo registrados aproximadamente 276 milhões de novos casos de tricomonose a cada ano. O estabelecimento da infecção se deve principalmente à capacidade de adesão do parasito às células epiteliais vaginais, cervicais ou de próstata, seguida pela intensa reação inflamatória, resultado da infiltração de neutrófilos no sítio da infecção. Nucleotídeos e nucleosídeos, especialmente ATP e adenosina, são liberados para o espaço extracelular por células em situações de estresse ou injúria tecidual e desenvolvem seus efeitos sinalizadores através da ativação de purinoceptores. Ainda, as ectonucleotidases, NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, são capazes de hidrolisar os nucleotídeos gerando adenosina e finalmente, a enzima adenosina deaminase (ADA) é responsável pela conversão de adenosina em inosina. A expressão gênica de cinco NTPDases putativas presentes no genoma de T. vaginalis foram investigadas, assim como o envolvimento da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. Nossos resultados mostraram que diferentes isolados de T. vaginalis expressam os genes TvNTPDase1, 2, 3, 4 e 5, sendo observado o maior número de transcritos para TvNTPDase1, 2 e 4. A sequência preditiva de aminoácidos revelou a presença das cinco regiões conservadas da apirase, domínios transmembrana, sítios de fosforilação, peptídeos sinais e os prováveis sítios ativos da enzima. A análise filogenética demonstrou maior similaridade das TvNTPDases com as formas intracelulares da enzima, como as NTPDases 4 e 7 humanas e a de Saccharomyces cerevisiae. Além disso, a restrição de soro promoveu aumento significativo da atividade da NTPDase de T. vaginalis, no entanto sem corresponder com o aumento de expressão gênica de determinada(s) sequência(s). Quanto à participação da sinalização purinérgica na resposta inflamatória de células do hospedeiro frente ao parasito, foram utilizados como modelos celulares as células epiteliais vaginais (HMVII), cervicais (HeLa) e neutrófilos humanos. As linhagens HMVII e HeLa mostraram expressar todos os subtipos de receptores P1, P2X e P2Y e XI os diferentes isolados de T. vaginalis, que foram cocultivados com as células, mostraram hidrolisar eficientemente os nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Ainda, o isolado clínico fresco TV-LACM6 foi o único a apresentar elevada citotoxicidade frente às células epiteliais vaginais e cervicais, no entanto não foi detectado aumento da liberação de ATP pelas células após o cocultivo, provavelmente devido à alta atividade da enzima NTPDase observada nesse isolado. Os trofozoítos de T. vaginalis não foram capazes de aumentar a produção de IL-8 e IL-6 pelas linhagens HMVII e HeLa, e apenas os isolados ATCC30236 e TV-LACM6 causaram aumento na secreção da citocina MIP-3α pelas células epiteliais cervicais. Finalmente, o nucleotídeo ATP e o nucleosídeo adenosina não modularam a produção dos mediadores inflamatórios investigados. Em relação aos neutrófilos, estes mostraram aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e IL-8 após incubação com os trofozoítos de T. vaginalis. Os nucleotídeos e nucleosídeos da adenina e guanina não produziram efeito na produção de ERO e IL-8; no entanto, quando o nucleosídeo adenosina foi incubado junto com o inibidor da enzima ADA (EHNA) observou-se uma redução significativa da produção de ERO e IL-8 pelos neutrófilos, devido à inibição da ADA e consequentemente, ao aumento da concentração de adenosina disponível no meio extracelular. Os nossos resultados indicaram a ativação do receptor A1 dos neutrófilos nessa condição. O conjunto de dados aqui obtidos contribuiu para uma melhor caracterização da família de enzimas NTPDases de T. vaginalis assim como para um maior conhecimento acerca da influência da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. / Trichomonas vaginalis is the agent of the most common non-viral sexually transmitted disease worldwide, causing 276.4 million new cases a year. The establishment of the infection is closely related to the parasite ability to adhere to vaginal, cervical and prostate epithelial cells, followed by an intense inflammatory response as result of neutrophil infiltration. Nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, are released into the extracellular space by cells under stress or injury and they exert their signaling effects through activation of the purinoceptors. Moreover, the ectonucleotidases, NTPDase and ecto-5'-nucleotidase, are capable of hydrolyzing the nucleotides producing adenosine and finally, the adenosine deaminase (ADA) is responsible for the conversion of adenosine to inosine. We investigated the gene expression of five putative NTPDases found in T. vaginalis genome as well as the involvement of purinergic signaling on the host-parasite relationship. Our results showed that different T. vaginalis isolates are able to express TvNTPDase1, 2, 3, 4 and 5 and that TvNTPDase1, 2 and 4 are the most expressed genes. Predictive amino acid sequence revealed the presence of the five apyrase conserved regions, transmembrane domains, phosphorylation sites, signal peptides and the active sites. Phylogenetic analysis showed that TvNTPDases share more similarity with the intracellular enzymes, such as human NTPDase 4 and 7 and Saccharomyces cerevisiae NTPDase. In addition, the serum limitation caused a significant increase in NTPDase activity, but without association with the gene expression of a specific TvNTPDase sequence. Regarding the participation of purinergic signaling on the inflammatory responses against the parasite, the vaginal (HMVII) and cervical (HeLa) epithelial cells and the human neutrophils were used as cellular models. HMVII and HeLa cell lines showed to express all subtypes of P1, P2X and P2Y receptors and the different T. vaginalis isolates, which were co-cultured with the cells, showed to hydrolyze efficiently ATP, ADP and AMP. Furthermore, only the fresh clinical isolate, TV-LACM6, caused a profound cytotoxicity against the vaginal and cervical epithelial cells. Interestingly, it was not detected an increase in ATP release by the cells after cocultivation, probably due to the high NTPDase activity dislplayed by TV-LACM6 isolate. The T. vaginalis trophozoites were not able to increase the production of IL-8 and IL-6 by HMVII and HeLa cells and only ATCC30236 and TV-LACM6 isolates enhanced MIP-3α secretion by the cervical epithelial cells. Finally, neither ATP nor adenosine has modulated the production of the inflammatory mediators here investigated. Considering the neutrophils, T. vaginalis stimulated the production of reactive oxygen species (ROS) and IL-8 by these immune cells and both adenine as guanine nucleotides and nucleosides did not cause any effect on ROS and IL-8 levels. However, when adenosine was incubated with an ADA inhibitor (EHNA) we observed a significant reduction of ROS and IL-8 production by neutrophils, due to inhibition of ADA with a subsequent increase of adenosine concentration in the extracellular milieu. . Our results suggested the participation of A1 receptor in this condition. The data set obtained in this study contributed to the characterization of T. vaginalis NTPDases family as well as to a better understanding of the influence of purinergic signaling on host-parasite relationship.

In diverse eukaryotic organisms, double-stranded RNA (dsRNA) induces robust silencing of cellular RNA cognate to either strand of the input dsRNA; a phenomenon now known as RNA interference (RNAi). Within the RNAi pathway, small, 21 nucleotide (nt) duplexed RNA, dubbed small interfering RNAs (siRNAs), derived from the longer input dsRNA, guide the RNA induced silencing complex (RISC) to destroy its target RNA. Due to its ability to silence virtually any gene, whether endogenous or exogenous, in a variety of model organisms and systems, RNAi has become a valuable laboratory tool, and is even being heralded as a potential therapy for an array of human diseases. In order to understand this complex and unique pathway, we have undertaken the biochemical characterization of RNAi in the model insect, Drosophila melanogaster. To begin, we investigated the role of ATP in the RNAi pathway. Our data reveal several ATP-dependent steps and suggest that the RNAi reaction comprises as least five sequential stages: ATP-dependent processing of double-stranded RNA into siRNAs, ATP-independent incorporation of siRNAs into an inactive ~360 kDa protein/RNA complex, ATP-dependent unwinding of the siRNA duplex to generate an active complex, ATP-dependent activation of RISC following siRNA unwinding, and ATP-independent recognition and cleavage of the RNA target. In addition, ATP is used to maintain 5´ phosphates on siRNAs, and only siRNAs with these characteristic 5´ phosphates gain entry into the RNAi pathway. Next, we determined that RISC programmed exogenously with an siRNA, like that programmed endogenously with microRNAs (miRNAs), is an enzyme. However, while RISC behaves like a classical Michaelis-Menten enzyme in the presence of ATP, without ATP, multiple rounds of catalysis are limited by release of RISC-produced cleavage products. Kinetic analysis of RISC suggests that different regions of the siRNA play distinct roles in the cycle of target recognition, cleavage and product release. Bases near the siRNA 5´ end disproportionately contribute to target RNA-binding energy, whereas base pairs formed by the central and 3´ region of the siRNA provide helical geometry required for catalysis. Lastly, the position of the scissile phosphate is determined during RISC assembly, before the siRNA encounters its RNA target. In the course of performing the kinetic assessment of RISC, we observed that when siRNAs are designed with regard to 'functional asymmetry' (by unpairing the 5´ terminal nucleotide of the siRNA's guide strand, i.e. the strand anti-sense to the target RNA), not all of the RISC formed was active for target cleavage. We observed, somewhat paradoxically, that increased siRNA unwinding and subsequent accumulation of single-stranded RNA into RISC led to reduced levels of active RISC formation. This inactive RISC did not act as a competitor for the active fraction. In order to characterize this non-cleaving complex, we performed a series of protein-siRNA photo-crosslinking assays. From these assays we found that thermodynamic stability and termini structure plays a role in determining which proteins an siRNA will associate with, and how association occurs. Furthermore, we have found, by means of the photo-crosslinking assays, that siRNAs commingle with components of the miRNA pathway, particularly Ago1, suggesting overlapping functions or crosstalk for factors thought to be involved in separate, distinct pathways.

Dans le cerveau, les fonctions de la phosphatase alcaline non spécifique des tissus (TNAP) ne sont pas clairement identifiées. La localisation et l'expression de cette enzyme au niveau neuronal suggère cependant, qu'elle joue un rôle important dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Cela est supporté par la présence de graves crises d'épilepsie chez les humains porteurs d'une mutation de la TNAP. Ces crises d'épilepsie sont létales chez les souris KO pour la TNAP. Des études chez la souris montrent que la TNAP pourrait réguler l'inhibition postsynaptique médiée par le GABA et elle pourrait être impliquée dans l'inhibition présynaptique médiée par l'adénosine. L'adénosine est, en partie, synthétisée via la déphosphorylation successive de l'ATP en ADP puis en AMP par des ectonucléotidases. Parmi elles, la TNAP et l'ecto- 5'-nucléotidase (NT5E) catalysent l'hydrolyse de l'AMP en adénosine dans le cortex cérébral. L'adénosine agit principalement au niveau présynaptique par l'intermédiaire des récepteurs A1. Ainsi l'adénosine a une influence sur la transmission synaptique et sur la plasticité synaptique. Ceci pourrait expliquer, en partie, les crises d'épilepsie observées chez les souris KO pour la TNAP. Les deux objectifs principaux de ma thèse ont été : (1) évaluer la contribution de la TNAP dans la production d'adénosine dans le cerveau ; (2) étudier l'influence de l'adénosine sur la plasticité synaptique. Premièrement, l'étude de la contribution de la TNAP dans la production d'adénosine dans le cerveau a été réalisée au moyen de deux approches complémentaires. Une approche métabolomique (spectroscopie RMN du proton) sur des cerveaux entiers de souris KO pour la TNAP a permis de montrer que la TNAP participe, entre autre, à la synthèse d'adénosine dans le cerveau. Une deuxième approche, électrophysiologique sur tranches de cerveaux de souris in vitro, nous permet d'examiner les conséquences de l'inhibition des ectonucléotidases intervenant dans la synthèse de l'adénosine. Elle a révélé que l'inhibition des ectonucléotidases (TNAP et NT5E) ne supprime pas l'effet inhibiteur de l'AMP médiée par les récepteurs A1. Deuxièmement, nous avons étudié l'influence de l'adénosine sur la plasticité synaptique à courte terme. Nous avons enregistré des potentiels de champs dans la couche Ia du cortex piriforme en réponse à des stimulations électriques (3,125 à 100 Hz) présentée avec des fréquences recouvrant la gamme d'oscillations physiologiques. Nos résultats montrent qu'avec de fortes concentrations d'adénosine, la facilitation est accentuée par rapport à celle observée en situation contrôle. Cet effet est observé pour des fréquences supérieures ou égales à 25 Hz. De plus, cette accentuation est d'autant plus grande que la fréquence est élevée (maximum atteint à 100 Hz pour 100 µM). En bloquant l'action de l'adénosine endogène, l'effet contraire est observé : une facilitation déficitaire par rapport au contrôle et dont le défaut est croissant avec la fréquence de stimulation. Tous ces résultats convergent vers l'hypothèse qu'une déficience en TNAP, traduite par une absence d'adénosine, pourrait contribuer au maintien des processus épileptiques générés par un déséquilibre de l'inhibition et de l'excitation dû à une diminution de GABA. L'effet inhibiteur de l'AMP médié par les récepteurs A1 ne serait pas suffisant pour contrecarrer les crises d'épilepsie observées chez les sujets hypophosphatasiques et les souris KO pour la TNAP. / The functions of Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP) in the brain are not clearly identified. The localization and expression of TNAP at the neuronal level, however, suggests that it plays a prominent role in the development and the function in the brain. This is supported by the presence of severe epileptic seizures in humans carrying TNAP mutation. These epileptic seizures are lethal in TNAP KO mice. Studies in mice show that TNAP could regulate GABA-mediated postsynaptic inhibition and may be involved in presynaptic inhibition mediated by adenosine. Adenosine is, partly, synthesized via the successive dephosphorylation of ATP to ADP and then to AMP by ectonucleotidases. Among them TNAP and ecto-5'-nucleotidase (NT5E) are able to hydrolyze AMP into adenosine. Adenosine acts mainly at the presynaptic level via A1 receptors activation. Adenosine has an influence on synaptic transmission and thus on synaptic plasticity. This could partly explain the epileptic seizures observed in TNAP knock-out mice. The two main purposes of my thesis were: (1) to evaluate the contribution of TNAP in adenosine production in the brain; (2) to study the influence of adenosine on synaptic plasticity. Firstly, the study of the contribution of TNAP in adenosine production in the brain was carried out using two complementary approaches. A metabolomic approach (proton NMR spectroscopy) on whole brains of TNAP KO mice showed that TNAP in involved in adenosine synthesis in the brain. In a second approach, in vitro electrophysiological recordings on mouse brain slices allowed us to examine the consequences of the inhibition of the ectonucleotidases involved in adenosine synthesis. This revealed that inhibition of ectonucleotidases (TNAP and NT5E) did not suppress the inhibitory effect of AMP mediated by A1 receptors. Secondly, we studied the influence of adenosine on short-term synaptic plasticity. Field potentials were recorded in response to electrical stimulations (3.125 to 100 Hz) applied with frequencies encompassing the range of physiological oscillation. Our results show that, with high adenosine concentrations, the facilitation is emphasized compared to that observed in the control situation. This effect is observed for frequencies greater than or equal to 25 Hz. In addition, the higher the frequency, the greater the facilitation. Finally, by blocking the action of endogenous adenosine, the opposite effect was observed: a deficient facilitation with respect to the control, whose defect was increasing with stimulation frequency. All these results converge towards the hypothesis that TNAP deficiency, expressed by absence of adenosine, could contribute to the maintenance of the epileptic processes generated by an imbalance of the neuronal inhibition and the excitation due to a decrease of GABA. AMP inhibitory effect mediated by A1 receptors, would not be sufficient to counteract epileptic seizures observed in hypophosphatasic patients and TNAP KO mice.

Uliginosina B é um derivado acilfloroglucinol natural, isolado de espécies de Hypericum nativas da América do Sul. Estudos prévios demonstraram que a uliginosina B apresenta efeitos do tipo antidepressivo e antinociceptivo em baixas doses (até 15 mg/kg, i.p. ou v.o.) e, em doses elevadas (90 mg/kg, i.p.), prejudica a coordenação motora. A atividade antidepressiva depende da ativação da neurotransmissão monoaminérgica e envolve a regulação da homeostase através do balanço de Na+. A atividade antinociceptiva é mediada por receptores opioides e dopaminérgicos da família D2. O efeito atáxico depende da ativação de receptores opioides e dopaminérgicos. Os efeitos parecem ser decorrentes da sua capacidade de inibir a recaptação de monoaminas (especialmente dopamina) com consequente ativação de receptores opioides e monoaminérgicos. O objetivo deste estudo foi aprofundar o conhecimento sobre o mecanismo de ação antinociceptiva de uliginosina B, investigando o envolvimento da neurotransmissão monoaminérgica, glutamatérgica e purinérgica. O tratamento com uliginosina B aumentou a disponibilidade intersticial de dopamina e seu metabólito, ácido homovanílico (HVA), no estriado de ratos; dados que reforçam o papel da neurotransmissão dopaminérgica nos efeitos da uliginosina B. O papel das outras monoaminas e da neurotransmissão glutamatérgica foi investigado nos efeitos antinociceptivo e atáxico induzidos por uliginosina B. A ataxia (90 mg/kg, i.p.) foi completamente prevenida pelo tratamento prévio com pCPA (inibidor da síntese de serotonina) e MK-801 (antagonista do receptor glutamatérgico NMDA), mas não foi afetada pelo prétratamento com prazosina ou ioimbina (antagonistas de receptores adrenérgicos α1 e α2, respectivamente). A atividade antinociceptiva (15 e 90 mg/kg, i.p.) foi reduzida significativamente pelo pré-tratamento com pCPA e MK-801 e aumentada pelo prétratamento com prazosina e ioimbina, apenas na dose mais elevada (90 mg/kg, i.p.). A importância da neurotransmissão monoaminérgica para o efeito antinociceptivo da uliginosina B foi confirmada através da análise isobolar. A associação de uliginosina B com amitriptilina (inibidor da recaptação de monoaminas) ou clonidina (agonista adrenérgico α2) apresentou interação aditiva – dados sugestivos de substâncias com mecanismos de ação mediados pelas mesmas vias – enquanto a associação com morfina (agonista opioide) apresentou interação sinérgica – dados indicativos de um possível uso clínico, como adjuvante opioide na farmacoterapia da dor. O efeito antinociceptivo de uliginosina B (15 mg/kg, i.p.) também foi prevenido pelo tratamento prévio com DPCPX e ZM-241385 (antagonistas de receptores adenosinérgicos A1 e A2A, respectivamente). Este efeito esta relacionado, pelo menos em parte, com a capacidade da uliginosina B aumentar a hidrólise de AMP na medula espinhal e de ATP no córtex cerebral. A uliginosina B também inibiu in vitro a atividade da enzima Na+,K+-ATPase (isoformas α1 e α3). O conjunto de dados apresentados nesta tese evidencia a uliginosina B como um padrão estrutural multirreceptor promissor no desenvolvimento de fármacos com ação analgésica. Em suma, os efeitos antinociceptivo e atáxico induzidos pelo tratamento com uliginosina B são mediados pela ativação da neurotransmissão monoaminérgica, glutamatérgica, purinérgica e opióide, requisitadas com diferente grau de importância; e ainda envolvem o balaço iônico da Na+,K+-ATPase. / Uliginosin B is a natural acylphloroglucinol derivative obtained from Hypericum species native to South America. Previous studies have shown that uliginosin B presents antidepressant-like and antinociceptive effects at low doses (up to 15 mg/kg, i.p. or p.o.), and at high doses (90 mg/kg, i.p.) it impairs the motor coordination. The antidepressant-like activity seems to depend on the activation of monoaminergic neurotransmission and ionic balance of Na+. The antinociceptive effect is mediated by opioid and D2 dopamine receptors. The ataxic effect involves opioid and dopaminergic receptors activation. The uliginosin B effects appear to be a consequence of their ability to inhibit reuptake of monoamines (especially dopamine) with subsequent activation of opioid and monoaminergic receptors. The aim of this study was to deepen our knowledge about the mechanism of antinociceptive action of uliginosin B, investigating the involvement of monoaminergic, glutamatergic and purinergic neurotransmissions. Treatment with uliginosin B increased the interstitial availability of dopamine and its metabolite, homovanillic acid (HVA), in the striatum of rats; these data underscore the role of dopaminergic neurotransmission in the effects of uliginosin B. The role of other monoamines as well as the glutamatergic neurotransmission, were investigated in the antinociceptive and ataxic effects induced by uliginosin B. The ataxic effect (90 mg/kg, i.p.) was completely prevented by pre-treatment with pCPA (a serotonin synthesis inhibitor) and MK-801 (a NMDA glutamatergic receptor antagonist), but was not affected by pretreatment with prazosin or yohimbine (α1 and α2 adrenoceptor antagonists, respectively). The antinociceptive activity (15 and 90 mg/kg, i.p.) was significantly reduced by pretreatment with pCPA and MK-801 and increased by pretreatment with yohimbine and prazosin only at the highest dose (90 mg/kg, i.p.). The importance of monoaminergic neurotransmission for the uliginosin B antinociceptive effect was confirmed by isobolar analysis. The association between uliginosin B with amitriptyline (monoamine reuptake inhibitor) or clonidine (α2 adrenergic agonist) showed additive interaction - findings suggestive of substances with mechanisms of action mediated by the same pathways - while the association with morphine (opioid agonist) showed synergistic interaction - indicative of a possible clinical use as adjuvant to opioid pharmacotherapy of pain relief. The antinociceptive effect of uliginosin B (15 mg/kg, i.p.) was also prevented by pretreatment with DPCPX and ZM-241385 (A1 and A2A adenosinergic receptor antagonists, respectively). This effect is related, at least in part, to its ability of increases the AMP and ATP hydrolysis in the spinal cord and cerebral cortex synaptosomes, respectively. Moreover, uliginosin B inhibited the Na+,K+-ATPase activity (α1 and α3 isoforms) in vitro. The data set presented in this thesis pointed uliginosin B as a promising multirreceptor molecular pattern in the analgesic drug development. In summary, the antinociceptive and ataxic effects induced by uliginosin B were mediated by the activation of monoaminergic, glutamatergic, purinérgico and opioid neurotransmission and involves the ionic balance, required with different degree of importance.

Trichomonas vaginalis é o agente etiológico da doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo, sendo registrados aproximadamente 276 milhões de novos casos de tricomonose a cada ano. O estabelecimento da infecção se deve principalmente à capacidade de adesão do parasito às células epiteliais vaginais, cervicais ou de próstata, seguida pela intensa reação inflamatória, resultado da infiltração de neutrófilos no sítio da infecção. Nucleotídeos e nucleosídeos, especialmente ATP e adenosina, são liberados para o espaço extracelular por células em situações de estresse ou injúria tecidual e desenvolvem seus efeitos sinalizadores através da ativação de purinoceptores. Ainda, as ectonucleotidases, NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, são capazes de hidrolisar os nucleotídeos gerando adenosina e finalmente, a enzima adenosina deaminase (ADA) é responsável pela conversão de adenosina em inosina. A expressão gênica de cinco NTPDases putativas presentes no genoma de T. vaginalis foram investigadas, assim como o envolvimento da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. Nossos resultados mostraram que diferentes isolados de T. vaginalis expressam os genes TvNTPDase1, 2, 3, 4 e 5, sendo observado o maior número de transcritos para TvNTPDase1, 2 e 4. A sequência preditiva de aminoácidos revelou a presença das cinco regiões conservadas da apirase, domínios transmembrana, sítios de fosforilação, peptídeos sinais e os prováveis sítios ativos da enzima. A análise filogenética demonstrou maior similaridade das TvNTPDases com as formas intracelulares da enzima, como as NTPDases 4 e 7 humanas e a de Saccharomyces cerevisiae. Além disso, a restrição de soro promoveu aumento significativo da atividade da NTPDase de T. vaginalis, no entanto sem corresponder com o aumento de expressão gênica de determinada(s) sequência(s). Quanto à participação da sinalização purinérgica na resposta inflamatória de células do hospedeiro frente ao parasito, foram utilizados como modelos celulares as células epiteliais vaginais (HMVII), cervicais (HeLa) e neutrófilos humanos. As linhagens HMVII e HeLa mostraram expressar todos os subtipos de receptores P1, P2X e P2Y e XI os diferentes isolados de T. vaginalis, que foram cocultivados com as células, mostraram hidrolisar eficientemente os nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Ainda, o isolado clínico fresco TV-LACM6 foi o único a apresentar elevada citotoxicidade frente às células epiteliais vaginais e cervicais, no entanto não foi detectado aumento da liberação de ATP pelas células após o cocultivo, provavelmente devido à alta atividade da enzima NTPDase observada nesse isolado. Os trofozoítos de T. vaginalis não foram capazes de aumentar a produção de IL-8 e IL-6 pelas linhagens HMVII e HeLa, e apenas os isolados ATCC30236 e TV-LACM6 causaram aumento na secreção da citocina MIP-3α pelas células epiteliais cervicais. Finalmente, o nucleotídeo ATP e o nucleosídeo adenosina não modularam a produção dos mediadores inflamatórios investigados. Em relação aos neutrófilos, estes mostraram aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e IL-8 após incubação com os trofozoítos de T. vaginalis. Os nucleotídeos e nucleosídeos da adenina e guanina não produziram efeito na produção de ERO e IL-8; no entanto, quando o nucleosídeo adenosina foi incubado junto com o inibidor da enzima ADA (EHNA) observou-se uma redução significativa da produção de ERO e IL-8 pelos neutrófilos, devido à inibição da ADA e consequentemente, ao aumento da concentração de adenosina disponível no meio extracelular. Os nossos resultados indicaram a ativação do receptor A1 dos neutrófilos nessa condição. O conjunto de dados aqui obtidos contribuiu para uma melhor caracterização da família de enzimas NTPDases de T. vaginalis assim como para um maior conhecimento acerca da influência da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. / Trichomonas vaginalis is the agent of the most common non-viral sexually transmitted disease worldwide, causing 276.4 million new cases a year. The establishment of the infection is closely related to the parasite ability to adhere to vaginal, cervical and prostate epithelial cells, followed by an intense inflammatory response as result of neutrophil infiltration. Nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, are released into the extracellular space by cells under stress or injury and they exert their signaling effects through activation of the purinoceptors. Moreover, the ectonucleotidases, NTPDase and ecto-5'-nucleotidase, are capable of hydrolyzing the nucleotides producing adenosine and finally, the adenosine deaminase (ADA) is responsible for the conversion of adenosine to inosine. We investigated the gene expression of five putative NTPDases found in T. vaginalis genome as well as the involvement of purinergic signaling on the host-parasite relationship. Our results showed that different T. vaginalis isolates are able to express TvNTPDase1, 2, 3, 4 and 5 and that TvNTPDase1, 2 and 4 are the most expressed genes. Predictive amino acid sequence revealed the presence of the five apyrase conserved regions, transmembrane domains, phosphorylation sites, signal peptides and the active sites. Phylogenetic analysis showed that TvNTPDases share more similarity with the intracellular enzymes, such as human NTPDase 4 and 7 and Saccharomyces cerevisiae NTPDase. In addition, the serum limitation caused a significant increase in NTPDase activity, but without association with the gene expression of a specific TvNTPDase sequence. Regarding the participation of purinergic signaling on the inflammatory responses against the parasite, the vaginal (HMVII) and cervical (HeLa) epithelial cells and the human neutrophils were used as cellular models. HMVII and HeLa cell lines showed to express all subtypes of P1, P2X and P2Y receptors and the different T. vaginalis isolates, which were co-cultured with the cells, showed to hydrolyze efficiently ATP, ADP and AMP. Furthermore, only the fresh clinical isolate, TV-LACM6, caused a profound cytotoxicity against the vaginal and cervical epithelial cells. Interestingly, it was not detected an increase in ATP release by the cells after cocultivation, probably due to the high NTPDase activity dislplayed by TV-LACM6 isolate. The T. vaginalis trophozoites were not able to increase the production of IL-8 and IL-6 by HMVII and HeLa cells and only ATCC30236 and TV-LACM6 isolates enhanced MIP-3α secretion by the cervical epithelial cells. Finally, neither ATP nor adenosine has modulated the production of the inflammatory mediators here investigated. Considering the neutrophils, T. vaginalis stimulated the production of reactive oxygen species (ROS) and IL-8 by these immune cells and both adenine as guanine nucleotides and nucleosides did not cause any effect on ROS and IL-8 levels. However, when adenosine was incubated with an ADA inhibitor (EHNA) we observed a significant reduction of ROS and IL-8 production by neutrophils, due to inhibition of ADA with a subsequent increase of adenosine concentration in the extracellular milieu. . Our results suggested the participation of A1 receptor in this condition. The data set obtained in this study contributed to the characterization of T. vaginalis NTPDases family as well as to a better understanding of the influence of purinergic signaling on host-parasite relationship.