Tesis para optar al grado académico de Magister en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En la actualidad la mujer ha decido posponer la maternidad hasta después de los 30 años. El aplazar la maternidad hacia la ventana de subfertilidad (31 a 41 años), provoca una disminución de la fertilidad y en el éxito de los programas de fertilización in vitro, los cuales poseen estrechos márgenes de éxito, que se hacen cada vez más pequeños conforme va aumentando la edad de las mujeres. Por esta razón es necesario conocer los mecanismos involucrados en el envejecimiento ovárico, durante el periodo de subfertilidad femenino. Para ello se ha utilizado el modelo múrido, debido a su similitud con procesos que regulan la función del ovario en el ser humano, considerándose como un buen modelo para comprender los mecanismos involucrados en el envejecimiento reproductivo. Se ha demostrado que durante el periodo de sub-fertilidad y en mujeres menopáusicas, los ovarios presentan características fisiológicas similares a las encontradas en el Síndrome de ovario poliquístico, patología de alta prevalencia en mujeres durante edad fértil. Estas observaciones se basan en el hecho de que en ambas condiciones existe un retraso en el desarrollo folicular, disminución del número de folículos antrales y la aparición de estructuras quísticas, que prevalecen incluso después de la menopausia. Se ha descrito que uno de los factores que participa en la aparición de estas condiciones es el aumento del tono nervioso simpático y del contenido de noradrenalina (NA) intraovárica, la que ejerce su función a través de la activación de los receptores 2-adrenérgicos. Este aumento en la actividad nerviosa simpática del ovario se ha relacionado con un aumento en la secreción de hormonas esteroidales y la mantención y/o aparición de las estructuras quísticas, lo que conduce a problemas de fertilidad. Para disminuir la estimulación del sistema nervioso simpático sobre el ovario en el periodo de subfertilidad de la rata (8 a 10 meses), y para determinar si la NA participa en el cese de la función ovárica y/o formación de los quistes foliculares, se propuso bloquear la acción de los receptores -adrenérgicos. Para ello, se administró una inyección diaria de propranolol (antagonista -adrenérgico), durante 2 meses a ratas que se encuentran en el periodo de subfertilidad. Después de los dos meses de tratamiento se analizó la ciclicidad estral de la rata por medio de la observación microscópica del frotis vaginal, se determinaron las hormonas esteroidales en plasma mediante EIA, la concentración de NA y su metabolito MHPG en ovario mediante HPLC; además se realizó análisis morfológico de los ovarios. Los resultados muestran que el bloqueo -adrenérgico con propranolol permite reactivar el desarrollo folicular. Esto evidenciado por: a) el aumento en el número de folículos antrales sanos y cuerpos lúteos, b) el aumento del porcentaje de ovulación y los niveles de hormonas esteroidales en el plasma, c) la disminución en el número de folículos quísticos (quistes y prequistes) y el tamaño de los folículos tipo III y prequistes. Considerando que durante el envejecimiento existe un aumento del tono adrenérgico sobre el ovario, que podría resultar perjudicial, hemos logrado, mediante el bloqueo - adrenérgico, mejorar la funcionalidad ovárica. Este tratamiento reactivó el desarrollo folicular, evidenciado en la recuperación de la esteroidogénesis y foliculogénesis, dando a este fármaco expectativas para su uso a nivel clínico como terapia de ayuda, para poder expandir o retrasar la ventana de subfertilidad en la mujer / Today women have decided to postpone childbearing even after their thirties. The delay of the motherhood towards the subfertility period is associated to diminished fertility and a decreased success rate in in vitro fertilization programs, the latter being rarely successful and even less successful as women get older. For this reason it became necessary to understand the mechanisms related to ovarian ageing during the subfertility period. To accomplish this, the murine model has been used, because it describes almost all the process that regulates the ovarian function in humans, therefore is a good model for understanding the mechanisms involved in the reproductive aging. It has been show that during the sub-fertility and the menopausal period in woman, the ovaries present physiological characteristics similar to those found in the polycystic ovarian syndrome, the pathology with the highest prevalence in women during the fertility age. The observations are based, for example, in the delay in follicular development, decreased number of antral follicles and the spontaneous generation of cystic structures, that prevail until the menopausal age. Today we know one of the factors that participates in the generation of this condition is the rise in the sympathetic tone and the noradrenaline (NA) released in the ovary, which exerts his function through the 2-adrenergic receptor activation. That is correlated with the steroid hormone secretion and the maintenance or generation of the cystic structures, leading to fertility issues. To inhibit the effect in the rise of the sympathetic tone in the ovary during the sub fertility period, and to determine if the NA participates in the cessations of the ovarian function and/or follicular cyst formation and maintenance, we propose a pharmacological block the - adrenergic receptors. To achieve this we administered propranolol, a -adrenergic receptors antagonist, in a daily injection for 2 months, to rats that have reached the sub fertility period (8 and 10 months old). After 2 months of propranolol treatment, estrous cyclicity was analyzed through vaginal smear, steroidal hormones were analyzed in plasma through EIA, the NA content and one of its metabolites was measured in HPLC and finally we performed a morphological analysis of the complete ovary. The results show that the -adrenergic blockade allows reactivation of the follicular development, which is evidenced by an increase in: a) healthy antral follicles and corpora lutea amount, b) ovulation percentage and esteroidal hormones levels in plasma, and c) decreased amount of cystic follicles (cyst and precyst) and in the follicles size (type III follicles and precyst). Therefore we can observe an activation in follicular development that leads to ovulation and inhibits the cyst formation pathway. During aging there is an increase in the ovarian adrenergic tone. After the -adrenergic blockade, we could see the improvement of the ovarian function and follicular development, as evidenced by the rise in the steroidogenesis and folliculogenesis. These findings let us propose propranolol for use in clinical trials as a clinical therapy help, to expand or delay the sub fertility period in the woman

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en bioquímica clínica y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La neurotransmisión noradrenérgica está relacionada con procesos como el aprendizaje y la memoria. Se ha observado en el cuadro depresivo una disminución en la neurotransmisión de noradrenalina (NA), alteraciones de la arquitectura dendrítica y la disminución de los niveles de factores tróficos como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). El hecho de que una variación de los niveles de NA pueda activar diferentes receptores adrenérgicos en el espacio sináptico, podría explicar en parte los mecanismos de plasticidad sináptica involucrados en cambios morfofuncionales, desde acciones sobre la complejidad dendrítica hasta la modulación sobre procesos complejos como aprendizaje y memoria. Esta noción es apoyada por el hecho de que los fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico revierten la atrofia dendrítica observada en modelos animales de depresión, y recuperan el deterioro cognitivo. En base a estos antecedentes hemos propuesto en esta Tesis que: “La activación de receptores β‐adrenérgicos promueve un aumento en la complejidad dendrítica en cultivos primarios de neuronas hipocampales”. Se obtuvieron cultivos hipocampales de ratas en estado fetal de 18 días (E18), y se cultivaron durante 7 días in vitro (7 DIV). En estos cultivos se evaluó a través de Western Blot la respuesta frente a la estimulación de receptores β‐adrenérgicos, midiendo la fosforilación de la Proteína de Unión al Elemento de Respuesta al AMP cíclico (CREB) frente a estímulos cortos (5‐ 15 minutos) con noradrenalina (100 nM) en ausencia y presencia del β‐antagonista propranolol (10 μM). Junto con ello, se observó la distribución de CREB fosforilado a través de inmunocitoquímica luego de estímulos de 2 horas con los mismos fármacos. No fue posible a través de estas técnicas observar modificaciones en la intensidad de la señal o la distribución de p‐CREB. Sin embargo, la adición de NA fue capaz de promover un incremento en el calcio citosólico, como se demostró a través del uso de sondas fluorescentes, y una reducción en la actividad neuronal evaluada por registros whole-cell. Los cultivos a los 7 DIV presentan receptores β2‐adrenérgicos, visualizados a través de Western Blot. Más aún, estudios de inmunocitoquímica muestran que el receptor β2 presenta una distribución principalmente somatodendrítica. A través de la estimulación farmacológica de los cultivos durante 24 horas con NA 100 nM o clenbuterol 25 nM, en ausencia y presencia de propranolol 10 μM, se estudió si la activación de receptores adrenérgicos modula la morfología dendrítica. Ésta fue evaluada a través de la medición de puntos de intersección (Análisis de Sholl), puntos de ramificación, largo y número de dendritas. La estimulación con clenbuterol 25 nM no produjo efecto sobre ninguno de estos parámetros, descartando la participación de los receptores β2‐ adrenérgicos en la arquitectura dendrítica. Tampoco produjo efectos en la morfología de las dendritas la administración por separado de noradrenalina o propranolol. Sin embargo, los cultivos estimulados con NA posterior a la incubación con propranolol mostraron una reducción en el número de intersecciones del análisis de Sholl en el rango de los 30‐80 μm en comparación con el control. Estos cambios están acompañados por un descenso en el largo total de las dendritas primarias, y en particular de las dendritas primarias mayores a 40 μm, sin que el número de dendritas primarias por neurona se viera modificado. Un efecto similar se observó en las dendritas secundarias. Estos resultados sugieren que los cambios en el largo dendrítico observados probablemente no se asocian a la activación de receptores β2‐adrenérgicos. Proponemos que la activación de receptores α‐ y β1‐adrenérgicos regularían la morfología neuronal, probablemente con efectos opuestos, controlando el largo dendrítico de las dendritas primarias y secundarias de mayor tamaño. El estudio realizado en esta Tesis por primera vez describe efectos de la activación de receptores adrenérgicos sobre la morfología neuronal, pudiendo explicar en parte los cambios morfológicos y mejoría cognitiva tras el tratamiento de fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico / Noradrenergic neurotransmission is related with processes as learning and memory. In depressive behavior, it has been observed a decrease in noradrenaline (NA) neurotransmission, alterations on dendritic arborization and a decrease in levels of trophic factors, such as brain derived neurotrophic factor (BDNF). The fact that different levels of NA can activate different adrenergic receptors at synaptic cleft, could explain part of synaptic neuroplasticity mechanisms involved in morphofunctional alterations, from actions on dendritic complexity to modulation of complex processes as learning and memory. This notion is supported by the fact that drugs that increase levels of NA at synaptic cleft reverse dendritic atrophy observed in animal models of depression, and recover cognitive impairment. Considering these antecedents, this Thesis proposed that: “Activation of β‐adrenergic receptors promotes an increase in dendritic complexity in primary cultures of hippocampal neurons”. Hippocampal primary cultures were obtained from embryonic day 18 (E18) Sprague‐Dawley rat fetuses, and cultured for 7 days in vitro (7DIV). In these cultures, changes in phosphorylation of cAMP‐response element binding protein (CREB) were evaluated by Western Blot, in response to short stimulus (5‐15 min) with 100 nM NA in absence and presence of 10 μM propanolol, a β‐adrenergic receptor antagonist. In addition, levels of phosphorylated CREB (p‐CREB) were measured by immunocytochemistry, after stimulation of 2 hours with the same drugs. It was not possible to observe modifications on signal intensity of p‐CREB through these techniques. However, the addition of NA promoted an increase in cytosolic calcium, measured by fluorescent probes for calcium, and a reduction of neuronal activity evaluated by whole‐cell recording. The 7 DIV cultures showed β2‐adrenergic receptors, which were visualized by Western Blot. Moreover, immunocytochemistry studies showed that β2‐adrenergic receptor was distributed in neurons mainly in the somato‐dendritic compartment. Through pharmacological stimulation of cultures for 24 hours with 100 nM NA or 25 nM clenbuterol, with 10 μM propranolol absent or present, the activation of adrenergic receptors and their role in dendritic morphology has been measured. Morphology was evaluated through the measurement of intersection points (Sholl Analysis), branching points, and dendritic length and number. Stimulation with 25 nM clenbuterol did not have effect on any of these parameters, thus any role of β2‐adrenergic receptors in dendritic architecture was discarded. Neither administration of NA nor propranolol alone produced effects on dendrite morphology. However, NA‐stimulated cultures after incubation with propranolol showed a reduction in the number of intersections in Sholl analysis compared with controls, in the 30‐80 μm range. Those changes were accompanied by a reduction in primary dendrites greater than 40 μm, without any modifications in primary dendrite number per neuron. A similar effect was shown in secondary dendrites. These results suggest that changes observed in dendritic length were probably not associated with the activation of β2‐adrenergic receptors. We propose that the activation of α‐ and β1‐adrenergic receptors may regulate neuron morphology, probably with opposite effects, controlling dendritic length of longer primary and secondary dendrites. The study carried out in this Thesis describes for first time the effects of adrenergic receptors activation in dendrite morphology, and may explain in part the morphological changes and cognitive improvement after treatment of drugs that increase levels of NA in the synaptic cleft

Macrófagos são capazes de sintetizar melatonina quando ativados por agonistas de TLRs de forma dependente da ativação da via NF-κB. A melatonina produzida pelos macrófagos está relacionada com o favorecimento da fagocitose de partículas ricas em manose. Catecolaminas são capazes de ativar a via NF-κB em células imunocompetentes, e são produzidas por estas células quando ativadas. É conhecido que a descarga noturna de noradrenalina na glândula pineal é responsável pela produção de melatonina na fase de escuro. Hipotetizamos que catecolaminas, ao exemplo da glândula pineal, pudessem induzir a síntese de melatonina em macrófagos. Avaliamos se agonistas adrenérgicos poderiam regular a produção de melatonina nos macrófagos RAW 264.7. Analisamos também o efeito da melatonina em conjunto com agonistas adrenérgicos no modelo experimental de lesão pulmonar aguda. Ambas catecolaminas foram capazes de aumentar a expressão da enzima AA-NAT total ou fosforilada e induzir a síntese de melatonina, via ativação de β-adrenoceptores; sendo dependente de NF-κB, e não da sinalização mediada por AMPc. A instilação de LPS nos pulmões dos camundongos induz a expressão de Tnf e de Aa-nat, o que é inibido pelo agonista β2-adrenérgico. A melatonina exerce um efeito anti-inflamatório na produção de citocinas in vivo e in vitro, além de inibir a expressão de Nos2 em macrófagos MH-S, sem alterar arginase-1. Os dados aqui apresentados sugerem que a via de sinalização NF-κB faz a integração da sinalização adrenérgica com a produção de melatonina em macrófagos / TLRs-activated macrophages can synthesize melatonin in a NF-κB pathway-mediated manner. Macrophage-produced melatonin is related to the favoring of mannose-rich particles phagocytosis. Catecholamines can trigger NF-κB pathway in immunocompetent cells, and are produced after activation. It is well known that the nocturnal surge of noradrenaline in the pineal gland is responsible for the dark phase melatonin synthesis. We hypothesized that catecholamines, like in pineal gland, could induce melatonin synthesis by macrophages. We evaluated if adrenergic agonists could regulate melatonin production in RAW 264.7 macrophages. We also analyzed the effect of melatonin together with adrenergic agonist in the experimental model of acute lung injury. Both catecholamines were able to increase the expression of total or phosphorylated AA-NAT enzyme, and induce melatonin synthesis through β-adrenoceptor activation; in a NF-κB-dependent way, but not by the cAMP signaling. LPS instillation in the mice lungs induces Tnf and Aa-nat expression, which is inhibited by the β2-adrenergic agonist. Melatonin exerts an anti-inflammatory effect in cytokine production both in vivo and in vitro, besides the inhibition of Nos2 in MH-S macrophages, without changing arginase-1. The presented data suggests that the NF-κB signaling pathway fulfill the integration of adrenergic signaling with melatonin synthesis in macrophages

A ativação de receptores adrenérgicos alfa2 do núcleo parabraquial lateral (NPBL) com injeções bilaterais de moxonidina (agonista de receptores adrenérgicos alfa2/imidazólicos) induz um potente aumento da ingestão de NaCl 0,3 M e água induzidos pelo protocolo de desidratação extracelular FURO/CAP [diurético furosemida (10 mg/kg) combinado a uma baixa dose do inibidor da enzima conversora de angiotensina captopril (5 mg/Kg)]. Estudos prévios demonstraram também que o NPBL está envolvido na modulação das respostas renais e hormonais em situações de hiperosmolaridade e expansão isotônica de volume. Entretanto, os efeitos da moxonidina no NPBL sobre as respostas renais e hormonais e os parâmetros cardiovasculares ainda não haviam sido estudados em ratos submetidos à desidratação extracelular, com e sem acesso a ingestão de água e de sódio. Ratos Wistar (290- 320g) com cânulas implantadas bilateralmente em direção ao NPBL foram submetidos ao tratamento FURO/CAP 45 minutos antes da administração de injeções bilaterais de moxonidina (0,5 nmol/0,2 μl) ou veículo no NPBL. Após 15 min iniciou-se a coleta de urina para avaliar a excreção de sódio e volume urinário durante 2 horas. Em outro experimento, os ratos foram mantidos com livre acesso à água e NaCl 0,3 M durante o período de coleta de urina. Outro grupo de ratos tratados com FURO+CAP sc recebeu sobrecargas intragástricas de soluções de concentrações semelhantes a da mistura de água e de NaCl 0,3 M ingerida pelos ratos tratados com moxonidina no NPBL (6 ml de NaCl 0,17 M cada sobrecarga aos 20 e 35 min e 9 ml de NaCl 0,13 M aos 45 min após as injeções no NPBL, respectivamente), ao invés do livre acesso a água e sódio durante a coleta de urina. Injeções bilaterais de moxonidina no NPBL não alteraram a excreção de sódio (488 ± 135, vs. veículo: 376 ± 75 μEq/1 h) ou o volume urinário (2,5 ± 0,7, vs. veículo: 2,5 ± 0,3 ml/1 h) em animais desidratados sem acesso aos líquidos. Quando os ratos tiveram livre acesso à água e sódio, a moxonidina no NPBL promoveu um aumento da ingestão de NaCl 0,3 M (18,83 ± 2,69, vs. veículo 1,68 ± 0,79 ml/2 h) e de água (17,47 ± 1,33 vs. veículo 8,63 ± 1,68 ml/2 h) e um aumento do volume urinário (7,38 ± 1,06 vs. veículo 3,13 ± 0,56 ml/2 h) e excreção urinária de sódio (1277,3 ± 237,85 vs. veículo 462,88 ± 84,27 μEq/ 2 h). Esse aumento da ingestão de água e de sódio não foi compensado pelo aumento da diurese e natriurese, resultando assim num balanço positivo de sódio e de água. Contudo, no grupo de animais tratados com FURO+CAP que receberam a reidratação através das sobrecargas intragástricas, moxonidina injetada no NPBL diminuiu a excreção de sódio (462 ± 127, vs. veículo: 888 ± 122 μEq/1 h) e o volume urinário (2,5 ± 0,5 vs. veículo: 4,5 ± 0,5 ml/1 h) em comparação aos ratos que receberam veiculo no NPBL. Para estudar se a moxonidina poderia alterar os níveis plasmáticos de vasopressina (AVP) e ocitocina (OT) durante a desidratação extracelular, ratos Wistar com cânulas implantadas bilateralmente em direção ao NPBL foram submetidos ao tratamento FURO/CAP 45 minutos antes da administração de injeções bilaterais de moxonidina (0,5 nmol/0,2 μl) ou veículo no NPBL. Após 15 min, foram oferecidos a um grupo de animais água e NaCl 0,3 M por 30 min, enquanto outro grupo permaneceu sem acesso aos mesmos. Os animais foram decapitados 45 min após o tratamento no NPBL. Foi verificado um aumento nos níveis plasmáticos de AVP nos animais tratados com FURO/CAP com injeções de moxonidina no NPBL que não tiveram acesso aos líquidos, enquanto que esse aumento de AVP não foi mais observado quando os ratos tiveram livre acesso ao sódio e água. Não foram observadas alterações nos níveis plasmáticos de OT entre os diferentes tratamentos estudados. Análise dos parâmetros cardiovasculares em protocolos semelhantes aos realizados nos experimentos anteriores mostrou que a moxonidina não alterou a pressão arterial nos ratos desidratados sem acesso a água e NaCl 0,3 M, enquanto que em ratos com livre acesso a água e sódio ocorreu um aumento da pressão arterial média (PAM) em relação ao basal. Esses resultados sugerem que a grande ingestão de sódio observada pelos ratos desidratados tratados com moxonidina não é devido a grandes alterações na PAM, mas que o comportamento ingestivo aumentado pode influenciar os níveis de PAM. Em suma, os presentes resultados mostram que a injeção de moxonidina do NPBL promove um aumento da ingestão e diminuição da excreção de água e de sódio, sugerindo que os receptores adrenérgicos alfa2/imidazólicos deste núcleo ativariam mecanismos que facilitariam a retenção de sódio e água e a expansão de volume dos líquidos corporais durante uma desidratação extracelular. / Alpha2 adrenergic receptor activation with bilateral injections of moxonidine into the lateral parabrachial nucleus (LPBN) strongly increases 0.3 M NaCl intake by rats treated with the diuretic furosemide (FURO, 10 mg/kg b.w.) combined with low dose of the angiotensin converting enzyme inhibitor captopril (CAP, 5 mg/kg b.w.) injected subcutaneously (sc). Previous studies have shown that the LPBN participates in the modulation of renal and hormonal responses during increased plasma osmolarity and isotonic volume expansion. However, the effects of LPBN moxonidine injection on urinary volume and sodium excretion, hormonal responses and cardiovascular changes were not yet evaluated in fluid depleted rats, with or without free access to fluids. Male Wistar rats (290-310 g) with bilateral stainless steel guide-cannulas implanted into the LPBN were treated with sc FURO + CAP 45 min before bilateral injections of vehicle or moxonidine (0.5 nmol/0.2 ìl) into the LPBN. Urine collection started 15 min after LPBN injections and sodium excretion and urinary volume were evaluated for 2 hours, with or without free access to water and sodium during this period. Another group of FURO + CAP-treated rats received intragastric loads of NaCl solutions at concentrations similar to the mix of water and 0.3 M NaCl ingested by rats treated with FURO + CAP and moxonidine into the LPBN (6 ml of 0.17 M NaCl each load at 20 and 35 min and 9 ml of 0.13 M NaCl at 45 min after LPBN injections), instead of free access to water and sodium during urine collection. Bilateral injections of moxonidine into the LPBN did not change sodium excretion (488 ± 135, vs. vehicle: 376 ± 75 ìEq/1 h) or urinary volume (2.5 ± 0.7, vs. vehicle: 2.5 ± 0.3 ml/1 h) in fluid depleted rats without access to fluids. When rats had available water and sodium, moxonidine into the LPBN increased sodium (18.83 ± 2.69, vs. vehicle 1.68 ± 0,79 ml/2 h) and water intake (17.47 ± 1.33 vs. vehicle 8.63 ± 1.68 ml/2 h) and also sodium excretion (1277.3 ± 237.85 vs. vehicle 462.88 ± 84.27 ìEq/2 h) and urinary volume (7.38 ± 1.06 vs. vehicle 3.13 ± 0.56 ml/2 h). This increase in ingestion was not counterbalanced by the excretion, thus resulting in a positive sodium and water balance. However, moxonidine injected into the LPBN decreased sodium excretion (462 ± 127, vs. vehicle: 888 ± 122 ìEq/1 h) and urinary volume (2.5 ± 0.5, vs. vehicle: 4.5 ± 0.5 ml/1 h) in fluid depleted rats that received fluid loads. In order to evaluate if moxonidine into the LPBN could change arginine vasopressin (AVP) and oxytocin (OT) plasma levels, male Wistar rats were treated with sc FURO + CAP 45 min before bilateral injections of vehicle or moxonidine (0.5 nmol/0.2 ìl) into the LPBN. Fifteen minutes later, some rats had 30 min-period free access to water and 0.3M NaCl while others were maintained without access to fluids during the same period. Blood samples were collected 45 min after LPBN treatment. The results show that plasma levels of AVP are increased in FURO+CAP- treated rats with moxonidine into LPBN and no access to fluids, but not when the rats had access to fluids. There are no changes in OT plasma levels among the different treatments. Analysis of the cardiovascular parameters in similar protocols shows that moxonidine did not change mean arterial pressure (MAP) in rats without access to fluids, while in rats with free access to water and sodium, moxonidine increased MAP when compared to basal levels. This result suggests that the increase in water and sodium intake is not due to important changes in MAP in rats treated with moxonidine, but that the increased ingestive behavior may affect MAP. Therefore, present results suggest that moxonidine injected into the LPBN in fluid depleted rats produces strong 0.3 M NaCl and water intake and decreases renal sodium excretion and urinary volume, suggesting that moxonidine into this area activates mechanisms that facilitate sodium/water retention and body fluid volume expansion during extracellular dehydration. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

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REGADAS, R. P. Efeito da associação da tadalafila com a tansulosina no trato urinário inferior de ratos e de humanos. 2012. 73 f. Tese (Doutorado em Cirurgia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-08-24T15:34:48Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_rpregadas.pdf: 1365090 bytes, checksum: 6485e4a8c68645d8acbc95a7b3e5c8a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-08-24T15:34:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_rpregadas.pdf: 1365090 bytes, checksum: 6485e4a8c68645d8acbc95a7b3e5c8a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-24T15:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_rpregadas.pdf: 1365090 bytes, checksum: 6485e4a8c68645d8acbc95a7b3e5c8a5 (MD5) Previous issue date: 2012-05-02 / Recently, it has been observed an association between BPH and ED. It was reported that patients with ED treated with inhibitory phosphodiesterase type 5 (IPDE5) improves erection and LUTS. The pathophysiology of lower urinary tract symptoms (LUTS) is not completely known, so it is necessary that clinical and experimental studies are made to clarify the mechanisms involved in its origin. However, despite the knowledge that there is improvement in LUTS, it is not known whether IPDE5 works during storage, emptying, or both. It is not yet known if the association IPDE5 with alpha blocker is better than its use alone or whether this association is safe. The aim of this study was to evaluate the safety of the combination of tamsulosin with daily tadalafil as well as its effect on lower urinary tract in human and rats by urodynamic study. Methods: it was an experimental study using rats with chronic bladder outlet obstruction induced by L-NAME and a randomized clinical trial, double-blind, placebo-controlled study. In the experimental study, the animals were divided into 05 groups. Group 1: six rats were treated without medication; Group 2: six rats were treated with L- NAME (60 mg/Kg/dia); Group 3: six rats were treated with L- NAME and tansulosin (1mg/kg); Group 4: seven rats were treated with L- NAME and tadalafil (5mg/kg); grupo 5: six rats were treated with L- NAME, tadalafil and Tansulosina. After thirty days of oral treatment, the animals underwent urodynamic study. The urodynamic variables were evaluated. In the filling phase: non-void contractions (NVC), volume threshold (VT), pressure threshold (TP) and in the voiding phase: peak pressure (PP), micturition frequency (FM), basal pressure (PB) and residual volume. In the clinical study, it was performed a randomized clinical trial, double-blind, placebo-controlled study during the period October 2010 to September 2011. All patients had LUTS associated with BPH and were evaluated with International Prostate Symptom Score (I-PSS) and urodynamic study at baseline and 30 days after treatment. Patients were separated into two groups: Group 1 (20 patients) - daily tadalafil 5mg and placebo and Group 2 (20 patients) tamsulosin 0.4 mg and tamsulosin 0.4 mg. Results: it was found that the animals in group 2 showed a significant increase in the frequency of detrusor contraction (p <0.05), frequency micturition cycles (p <0.05) and residual volume (p <0.01) when compared to group 1. Animals in group 3 showed a significant reduction of non-voiding contractions, when compared to group 2. The group 4 animals showed significant reduction in frequency of micturition cycles (p <0.05) and residual volume (p <0.05) compared to group 2. Animals in group 5 showed a significant reduction in non-voiding contractions (p <0.05), frequency of micturition cycles (p <0.05) and residual volume (p <0.01) compared to group 2. In the clinical study, the age of patients (p=0.19) and the average volume of the prostate (P=0.28) were similar. The association of tamsulosin with tadalafil 5mg was more effective in improving the total score of the I-PSS and voiding sub-score. But comparing the groups there is no difference between the storage sub-score, Quality of Life, maximum flow and detrusor pressure at maximum flow. There were no major side effect Conclusion: The combination of tamsulosin and tadalafil daily is safe and better than the isolated use of tamsulosin to treat patients with lower urinary tract symptoms associated with benign prostatic hyperplasia and rats with chronic bladder outlet obstruction. / Recentemente, foi observado que pacientes com DE tratados com inibidores da fosfodiesterase tipo 5 (IPDE5) melhoram não somente a ereção, mas também os sintomas do trato urinário inferior (STUI). A fisiopatologia dos STUI é desconhecida e há um número crescente de estudos que objetiva compreender suas bases fisiopatológicas. Entretanto, a despeito do conhecimento que existe sobre a melhora dos STUI, não se sabe se IPDE-5 atua durante o armazenamento, esvaziamento ou ambos. Não se tem conhecimento se a associação do IPDE-5 com alfabloqueador é melhor que o uso isolado e se esta associação é segura. O objetivo deste estudo foi avaliar a segurança da associação da tansulosina com tadalafila tomados diariamente, bem como seu efeito no trato urinário inferior de humanos e de ratos por meio de estudo urodinâmico Metodo: foi realizado um estudo experimental utilizando ratos com obstrução infra-vesical crônica, induzida por L-NAME e um estudo clínico randomizado, duplo-cego e placebo-controlado durante o período de outubro de 2010 a janeiro de 2012. No estudo experimental, os animais foram distribuídos em 05 grupos; Grupo 1: seis ratos foram tratados sem medicação; Grupo 2: seis ratos foram tratados com L- NAME, na dose oral de 60 mg/Kg/dia; Grupo 3: seis ratos foram tratados com L- NAME e tansulosina (1mg/kg); Grupo 4: sete ratos foram tratados com L- NAME e tadalafila (5mg/kg); Grupo 5: seis ratos foram tratados com L- NAME, tadalafila e tansulosina. Após trinta dias de tratamento, os animais foram submetidos a estudo urodinâmico. As seguintes variáveis urodinâmicos foram avaliadas. Na fase de enchimento: freqüência de contrações não-miccionais (hiperatividade detrusora), limiar de volume (LV), limiar de pressão (LP) e na fase miccional: pressão de pico (PP), freqüência dos ciclos de micção por minuto (FM), pressão basal (PB) e volume residual. No estudo clínico, os pacientes foram distribuídos em dois grupos: Grupo 1 (20 pacientes) receberam dose diária de tansulosina 0,4mg e placebo e Grupo 2 (20 pacientes) receberam tansulosina 0,4mg e tadalafila 5mg, durante 30 dias. Foram avaliados com aplicação do International Prostate Score Symptom (IPSS) e com estudo urodinâmico antes e após o tratamento. Resultado: No estudo experimental, verificou-se que os animais do grupo 2 apresentaram aumento significativo das contrações não-micionais do detrusor (p < 0,05), na frequência de micção (p < 0,05) e no volume residual (p < 0,01), quando comparados ao grupo 1. Os animais do grupo 3 apresentaram redução significativa das contrações não miccionais, quando comparado ao grupo 2. Os animais do grupo 4 apresentaram redução significativa da freqüência de ciclos miccionais (p < 0,05) e do volume residual (p < 0,05), quando comparado ao grupo 2. Os animais do grupo 5 apresentaram redução significante das contrações não-miccionais (p < 0,05), da freqüência de ciclos miccionais (p < 0,05) e do volume residual (p < 0,01), quando comparado ao grupo 2. No estudo clínico, observou-se significativa melhora do IPSS e da qualidade de vida quando comparado com o Grupo 1 e da pressão detrusora no fluxo máximo no Grupo 1 quando comparado ao início do tratamento (p<0,001). Houve melhora significante das hiperatividades detrusoras e do fluxo máximo nos Grupos 1 e 2 quando comparado ao início do tratamento, porém não houve diferença quando feito comparação entre os grupos após o tratamento. Não foi observado nenhum efeito colateral importante Conclusão: a terapia combinada diária foi bem tolerada com pequena incidência de efeitos colaterais. Mostrou -se, tanto no estudo clínico quanto no experimental, melhor que o uso isolado de tansulosina para o tratamento dos sintomas do trato urinário inferior.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 329869.pdf: 1529858 bytes, checksum: 4b10ecec8cf1737337330d36fc9276a3 (MD5) Previous issue date: 2014 / A serotonina (5HT) é um neurotransmissor envolvido no controle da ingestão de alimentos. O tronco encefálico é uma região importante para a produção da 5HT, sendo que, uma região de concentração desses neurônios são os núcleos da rafe. Dados da literatura apontam o núcleo mediano da rafe (MnR) como uma região de neurônios serotoninérgicos. Estes neurônios projetam-se para o hipotálamo, região de controle importante para o controle ingestivo. Dados de nosso laboratório revelam que a ativação de receptores adrenérgicos no MnR produz diferentes resultados dependendo do status energético. Injeções de adrenalina no MnR em animais com livre acesso ao alimento provocou o aumento da ingestão de alimentos. Enquanto que a injeção de adrenalina no MnR de animais com alimentação restrita provocou diminuição da ingestão. Essas ações são mediadas por receptores alfa 1 e alfa 2 presentes no MnR. Este trabalho se propõe ao estudo da participação dos subtipos de receptores alfa (a1A, a1B e a1D) na ingestão de alimentos e comportamento em 1 hora ou sobre a ingestão de alimentos em 4 horas após a injeção de antagonista específic no MnR, avaliar a expressão de proteína Fos por imunohistoquímica após injeção de antagonista a1 no MnR em regiões do hipotálamo e amígdala e identificar o tipo de célula da área hipotalâmica lateral está expressando a proteína Fos. Animais saciados receberam injeção intra-MnR de diferentes doses de RS100329, um antagonista específico do receptor a1A, de Rec 15/2615, um antagonista específico de receptores a1B ou de BMY 7378 um antagonista a1D. A dose de 20 nmol de RS100329 aumentou a ingestão de alimentos e a duração e frequência, bem como diminuiu a latência, do comportamento de comer. A injeção de Rec 15/2615 aumentou, na dose de 4 nmol, a duração do comportamento de comer e a ingestão de alimentos na segunda hora de avaliação. A injeção de BMY 7378 aumentou a ingestão de alimentos na primeira hora e também diminui latência e aumentou frequência e duração do comportamento de comer, bem como diminuiu a ingestão de água na segunda hora de experimento. A injeção de prazosina aumentou a ingestão de alimentos e a expressão de proteína Fos na área hipotalâmica lateral e amígdala basolateral. O aumento de expressão de proteína Fos se deu em neurônios orexina reativos. Em conjunto esses dados corroboram os encontrados em trabalhos anteriores da nossa linha de pesquisa, mostrando que a ação da prazosina se dá através de receptores a1A e a1D, uma resposta hiperfágica mais lenta envolvendo o receptor a1B, e ainda que o bloqueio dos receptores a1D diminui a ingestão de água 2h após a injeção. Os dados de imunohistoquimica sugerem que a hiperfagia gerada pelo bloqueio adrenérgico a1 é gerada a partir de regiões relacionadas ao controle motivacional da ingestão de alimentos.<br> / Abstract: The serotonin (5HT) is a neurotransmiter enrolled in the control of food intake. The brainstem is an important site for the production of 5HT, particularly the raphe nuclei. According to literature the median raphe nucleus (MnR) is an important source of prosencephalic 5HT. Data from our laboratory revealed that activation of adrenergic receptors in the MnR evoke different results depending on nutritional status. Adrenaline injections into the MnR in free feeding animals results in hyperphagia. While in food restricted animals adrenaline injections into the MnR evoked hypophagia. This actions seem to be mediated by alfa receptors in the MnR. The purpose of this work is to study the participation of alfa1 subtypes (a1A, a1B e a1D) in food intake and behavior (for 1h after injection) and food intake for up 4h after injection. Also, we proposed to evaluate Fos protein expression after a1 antagonist injection into the MnR on regions of hypothalamus and amygdala, and identify the type of cell in the hypothalamic area to express the Fos protein. Free feeding animals received intra-MnR injection of different doses of RS100329, an a1A antagonist, Rec 15/2615 an a1B antagonist or BMY 7378 an a1D antagonist. The 20 nmol dose of RS 100329 increased food intake, duration and frequency of eating and decreased latency to start eating. The 4 nmol dose of Rec 15/2615 increased the duration of eating behavior and food intake 2h after injection. BMY 7378 increased food intake during the first hour and decreased latency, and increased duration and frequency, of eating behavior. BMY 7378 also decreased water intake 2h after the injection. Prazosin injection into MnR increased food intake and Fos protein expression in lateral hypothalamic area and basolateral amygdala. The increase of Fos protein was specifically higher in orexin reactive neurons. Collectively, our results corroborates data from previous work, showing that prazosin actions occur through a1A and a1D receptors, that a1B blockade is responsible for a slowly hyperphagic response and that blockade of a1D receptor is involved in the decreased water intake. Immunohistochemistry data suggest that hyperphagia observed by a1 blockade is related to motivational control of food intake.

ALVES, Renata de Sousa. Efeitos biológicos induzidos pelo veneno total de Tityus serrulatus e suas frações TsTx-V, toxina gama e peptídeo natriurético. 2008. 188 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdde de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-10-01T12:57:50Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_rsalves.pdf: 5032108 bytes, checksum: 5ea41178c3160a3542ecbbb0db2c7c2d (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-10-01T16:30:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_rsalves.pdf: 5032108 bytes, checksum: 5ea41178c3160a3542ecbbb0db2c7c2d (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-01T16:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_rsalves.pdf: 5032108 bytes, checksum: 5ea41178c3160a3542ecbbb0db2c7c2d (MD5) Previous issue date: 2008 / The venom of Tityus serrulatus has a mixture of toxic and non toxic peptides presenting diverse systemic and local effects. The aim of this work was to investigate the cardiovascular and renal effects promoted by the crude venom of the scorpion Tityus serrulatus and its isolated components such as Tityus serrulatus toxin V (TsTx-V), Gamma Toxin and the newly isolated Natriuretic Peptide. The experiments of isolated perfused rat kidney, isolated mesenteric bed, arterial pressure and in vivo perfusion were performed using male Wistar rats weighing 250-300g. The assays with vas deferens were done using Swiss mice weighing 30-40g. The crude venom presented autonomic nervous system effects showed by the contraction of vas deferens. Adrenergic effects were demonstrated specially with the decrease of renal vascular resistance (RVRVTs = 7.51 ± 0.96 vs RVRPz = 5.51 ± 0.43 mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0.05) and renal perfusion pressure (PPVTs = 150.1 ± 18.40 vs PPPz = 118.1 ± 4.00 mmHg*,*p<0.05) induced by the crude venom after kidneys pre-treatment with prazosin. The venoms isolated components showed kidney addictional effects, where TsTx-V caused diuresis while Gamma Toxin increased perfusion pressure. We could also observe the presence of protein inside the tubules and in glomerular spaces after renal histopathologic evaluation in the groups treated with the isolated components. However, only Gamma Toxin promoted an increase of the mesenteric bed perfusion pressure. The Natriuretic Peptide (0.03 and 0.1µg/mL) increased renal perfusion pressure. In addition, the natriuretic peptide increased cyclic guanosine monophosphate (cGMP) urinary excretion, but reduced electrolytes reabsorption in a dependent-concentration manner. The crude venom and the natriuretic peptide increased the arterial blood pressure, but decreased the hematocrit values, evaluated after in vivo experiments. However, the natriuretic peptide increased urinary flow and heartbeat frequency. In vivo renal function was evaluated by the clearance of inulin. The scorpion crude venom decreased the clearance of inulin, but this parameter was increased after natriuretic peptide treatment. The renal cortex blood flux, estimated by the clearance of p-aminohippurate, was reduced after the crude venom treatment. In conclusion, we demonstrated that Tityus serrulatus venom induced renal hemodynamic effects that were blocked in vitro by prasozin. In vivo experiments showed how the crude venom and its isolated components act increasing arterial blood pressure, heartbeat frequency and altered renal function. / O veneno do escorpião Tityus serrulatus é uma mistura de peptídeos tóxicos e não tóxicos com diversas ações locais e sistêmicas. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos cardiovasculares e renais induzidos pelo veneno total do escorpião T. serrulatus e de suas frações TsTx-V, Toxina γ e Natriurética. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g) para os experimentos de perfusão de rim isolado, leito mesentérico, pressão arterial e perfusão in vivo. Para os ensaios de canal deferente foram utilizados camundongos Swiss (30-40g). O veneno de T. serrulatus apresentou efeito sobre o sistema nervoso autônomo observado através da contração do vaso deferente. O veneno total mostrou efeito adrenérgico demonstrado pela reversão dos seus efeitos renais após pré-tratamento dos rins com antagonista α-adrenérgico prazosin, especialmente sobre a resistência vascular renal (RVRVTs = 7,51 ± 0,96 vs RVRPz = 5,51 ± 0,43 mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0,05) e pressão de perfusão (PPVTs = 150,1 ± 18,40 vs PPPz = 118,1 ± 4,00 mmHg*,*p<0,05). As frações isoladas mostraram efeitos renais somatórios, haja visto que TsTx-V promoveu aumento da diurese e a Toxina γ causou efeitos pressóricos. Após avaliação histopatológica dos efeitos renais das frações isolados do veneno de T. serrulatus, observamos a presença de material protéico nos espaços urinários glomerulares e nos túbulos. Entretanto, no leito vascular mesentérico, somente a toxina γ mostrou-se ativa. Os efeitos renais induzidos pela fração natriurética (0,03 e 0,1µg/mL) revelaram aumento da pressão e, de maneira concentração-dependente, diminuição da reabsorção de eletrólitos e aumento da excreção urinária de guanosina monofosfato cíclico (GMPc). Nos experimentos in vivo, tanto o veneno total quanto a fração natriurética causaram aumento da pressão arterial média (PAM) e diminuição do hematócrito. Em adição, a fração natriurética causou ainda a elevação do fluxo urinário e da freqüência cardíaca. O clearance de inulina foi utilizado para a avaliação da função renal in vivo. O veneno total diminui significativamente o clearance da inulina, enquanto a fração natriurética causou elevação. O fluxo plasmático renal cortical, avaliado através do clearance de p-aminohipurato, foi reduzido por ação do veneno total de T. serrulatus. Em conclusão, o veneno de Tityus serrulatus promoveu efeitos hemodinâmicos renais que foram prontamente revertidos in vitro pelo prazosin. Os experimentos in vivo mostraram que o veneno de Tityus serrulatus induziu a elevação da pressão arterial média, taquicardia e alteração da função renal.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2013-07-16T04:03:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 286695.pdf: 10729319 bytes, checksum: c4103197044e04fcd1a0cc6fecd62b51 (MD5) / O condicionamento de medo é um modelo capaz de testar várias etapas das reações comportamentais de animais expostos a situações de perigo. As memórias para odores são geralmente associadas com experiências emocionais, e a associação entre cinco choques elétricos nas patas (estímulo incondicionado, EI) com o odor neutro (estímulo condicionado, EC) é capaz de estabelecer o condicionamento olfatório de medo (COM). O núcleo pré-mamilar dorsal do hipotálamo (PMd) dos roedores é uma estrutura chave para o processamento neural das reações de defensa decorrentes da exposição ao predador, e adrenoceptores beta no PMd estão relacionados com estas respostas de medo. O PMd também está envolvido com a expressão das respostas de medo para o odor pareado com choque nas patas. Assim, no presente trabalho o modelo do COM foi utilizado para verificar a participação de adrenoceptores beta no PMd durante a aquisição e a expressão das respostas de medo em ratos. O atenolol (ATE, antagonista adrenérgico beta1, 80 nmol) microinjetado no PMd 10 min antes da fase de aquisição do COM impediu a associação entre o odor neutro (acetato de amila) e o EI. O ATE (10 e 40 nmol) microinjetados 10 min antes da exposição ao odor (EC1) reduziu as respostas de medo provocadas pelo estímulo olfatório, e impediu o condicionamento de segunda ordem associado ao contexto (EC2). Estes resultados sugerem a participação de adrenoceptores beta na aquisição e expressão do COM, de modo similar à redução nas respostas de medo observada ao odor de gato. Foi então investigado se a estimulação farmacológica do PMd promoveria um estado emocional semelhante às mudanças provocadas pela exposição ao predador, e se esta estimulação poderia ser usada como EI, buscando o entendimento da modulação da aquisição do condicionamento de medo e sua expressão comportamental. Ratos foram condicionados pelo pareamento entre a microinjeção de isoproterenol (ISO, agonista beta) no PMd e o odor. O ISO (10 e 40 nmol) induziu a aquisição do COM e o condicionamento de segunda ordem pela ativação de receptores beta1 no PMd, uma vez que o ATE (40 nmol), mas não a butoxamina (antagonista adrenérgico beta2, 10 nmol), microinjetado antes do ISO impediu a associação ISO-EC. De maneira semelhante que no COM decorrente da associação entre odor e choques nas patas, o ATE (40 nmol) no PMd também impediu a expressão do comportamento defensivo ao EC1 no condicionamento promovido por ISO. A injeção sistêmica de nadolol, um antagonista beta adrenérgico periférico, não impediu o COM promovido por ISO no PMd. Considerando as densas projeções glutamatérgicas do PMd para a matéria cinzenta periaquedutal dorsal (MCPd), foi verificado se o bloqueio de receptores NMDA na MCPd poderia interferir com o condicionamento de medo. O antagonista de receptores NMDA (AP5, 6 nmol) na MCPd foi capaz de impedir a aquisição e a expressão do COM promovido por ISO no PMd. Assim, a ativação de adrenoceptores beta1 no PMd é um modelo adequado para mimetizar as mudanças emocionais a ponto de funcionar como EI e promover o COM. Além disso, a ativação do PMd é capaz de mobilizar os mesmo sistemas neurais envolvidos na aquisição e expressão do condicionamento contextual relacionado com o predador.