Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T13:11:08Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 20042 bytes, checksum: 4c0e17a929ef619a16b7f24b5f37a259 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T13:11:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 20042 bytes, checksum: 4c0e17a929ef619a16b7f24b5f37a259 (MD5) Previous issue date: 2003-04-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os genes plg1 e plg2, que codificam pectina liase em Penicillium griseoroseum, foram isolados e caracterizados. A região estrutural do gene plg1 possui 1341 pares de bases (pb) e é interrompida por 2 íntrons, de 101 e 115 pb, confirmados pela seqüência do cDNA. A proteína deduzida a partir da seqüência de nucleotídeos possui 374 aa, com massa molecular estimada em 40,1 KDa, um potencial sítio de glicosilação na posição N 112 e pI calculado de 9,46. O gene plg2 possui 1400 pb, sendo interrompido por quatro íntrons contendo 56, 60, 52 e 39 pb. Estes íntrons estão nas mesmas posições dos íntrons do gene pelD de Aspergillus niger, embora as seqüências de nucleotídeos sejam diferentes. A proteína deduzida possui 383 aa, massa molecular estimada de 40,5 KDa e pI de 5,55. Três possíveis sítios de glicosilação foram encontrados nas posições N 38 , N 128 e N 257 . Análise por hibridização do DNA total de P. griseoroseum e dos respectivos plasmídeos que contêm as seqüências genômicas dos genes plg1 e plg2, revelaram que estes genes estão presentes em cópias únicas no genoma do fungo. Esses resultados sugerem que P. griseoroseum possui somente dois genes que codificam pectina liase. A avaliação da regulação da expressão dos genes plg1 e plg2 foi conduzida por hibridização do RNA total e por RT-PCR. Os genes plg1 e plg2 apresentam diferente regulação em nível de transcrição. A expressão do gene plg1 é induzida por pectina cítrica e sacarose/extrato de levedura, sendo expresso ao longo de 96 horas de crescimento de P. griseoroseum. No entanto, o maior acúmulo do transcrito foi detectado com 24 horas de crescimento. A adição de glicose, frutose, galactose ou xilose no meio de cultura, reprimem a transcrição de plg1 substancialmente. O transcrito do gene plg2 foi detectado somente por RT-PCR, demonstrando que a sua expressão, mesmo induzida, é muito menor do que a de plg1. O gene plg2 foi transcrito em nível muito baixo em pectina cítrica e em pectina de maçã, não sendo transcrito em sacarose/extrato de levedura. As regiões 5' terminal dos genes plg1 e plg2 foram sequenciadas, e potenciais cis-elementos para ligação dos fatores de transcrição CreA e PacC foram identificados. Foram também detectados os cis - elementos CAAT box e TATA box. A presença dos dois primeiros cis-elementos explica a regulação de plg1, considerando que este está sujeito à repressão catabólica (CreA) e à influência do pH do meio (PacC). O gene plg1 é induzido na presença de sacarose/extrato de levedura. Análise por RT-PCR mostrou que este não foi expresso em meio contendo sacarose somente, e quantidades pequenas do transcrito foram detectadas quando o fungo foi crescido apenas em meio contendo extrato de levedura. Os resultados evidenciam que a expressão do gene plg1 depende conjuntamente de sacarose e extrato de levedura. Com o objetivo de verificar se o efeito de sacarose e extrato de levedura na expressão de plg1 depende do envolvimento do AMPc, o fungo foi crescido em meios contendo sacarose e extrato de levedura, acrescidos de substâncias que atuam na cascata de transdução de sinais via AMPc. Foi verificado que há expressão diferencial de plg1 nas diferentes substâncias testadas e nos tempos de crescimento analisados, 18 e 24 horas. A presença de cafeína e extrato de levedura provocou aumento na expressão do gene plg1 em relação ao controle contendo sacarose e extrato de levedura, e a combinação de sacarose/cafeína e extrato de levedura levou a um maior aumento. Somente sacarose e dibutiril-AMPc não promoveram o acúmulo do transcrito do gene plg1, como observado em sacarose e extrato de levedura. Este acúmulo só foi detectado na presença de extrato de levedura, o que nos leva a inferir que somente um aumento do AMPc endógeno não seria capaz de induzir a transcrição do gene plg1. / Two pectin lyase-enconding genes from Penicillium griseoroseum were isolated and characterized. The coding region of the plg1 gene consists of 1341 base pairs (bp) and is interrupted by two introns of 101 and 115 bp, confirmed by cDNA sequencing. The deduced amino acid (aa) sequence (374 aa) of PLG1 has an estimated molecular mass of 40.1 KDa and a calculated pI of 9.46. One putative N-glycosylation site was found at N 112 . The plg2 coding sequence (1400 bp) is interrupted by four small introns which sizes vary from 36 to 60 bp. These introns were found at identical positions of those of the pelD gene from A. niger although a detailed comparison revealed sequence divergence. The calculated pI and predicted molecular mass of PLG2 protein are 5.55 and 40.5 KDa, respectively. Three putative glycosylation sites were detected at N 38 , N 128 , and N 257 . Quantitative Southern blot revealed that the plg1 and plg2 genes exist as single copies in the P. griseoroseum genome. Our results indicate that they are the only members of the pectin lyase gene family in this fungus. Northern hybridization analysis and RT-PCR were conducted to study the regulation of plg1 and plg2 expression. Both genes are regulated at the transcription level although they are controlled in different ways. Citric pectin and sucrose/yeast extract induces plg1 expression when P. griseoroseum is xiicultivated during 96 h. However the highest transcript accumulation was detected at 24 h. Transcription of plg1 is substantially repressed when glucose, fructose, galactose and xylose are added to the medium culture. plg2 transcripts were only detected by RT-PCR demonstrating that this gene is expressed at lower levels when compared to plg1. The plg2 transcription was seen in sucrose/yeast extract while transcript levels were low in citric pectin and apple pectin. The 5’-flanking regions of plg1 and plg2 genes were sequenced and putative CAAT and TATA boxe were identified as well a putative consensus binding sites for CreA and PacC. These cis-elements explain the regulation of these genes since both undergo catabolite repression (CreA) and are influenced by the medium pH (PacC). The plg1 gene is induced by sucrose/yeast extract. RT-PCR analysis showed that sucrose alone doesn’t trigger its expression and low amounts of plg1 transcript were detected when the fungus was cultivated only in yeast extract. These results provide strong evidence that plg1 expression relies on both sucrose and yeast extract. P. griseoroseum was grow on medium containing sucrose and yeast extract in order to analyze if plg1 expression also depends on cAMP. Differential expression was seen when different substances were added and at the time points sampled, 18 and 24 h. Caffeine and yeast extract raised the expression of plg1 gene when compared to the control, sucrose and yeast extract. Even higher expression was seen from combination of sucrose/caffeine and yeast extract. No transcript accumulation was detected when the fungus was cultivated on sucrose and dibutyril-cAMP in opposition to cultivation on sucrose and yeast extract. This accumulation was only observed in the presence of yeast extract and provides evidence that a simple raise in the endogen cAMP level would not be able to induce plg1 transcription.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T14:45:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 282625 bytes, checksum: 1e1c48c9480ac4efd3e2ae6aca4983db (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T14:45:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 282625 bytes, checksum: 1e1c48c9480ac4efd3e2ae6aca4983db (MD5) Previous issue date: 2003-02-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A diversidade genética entre 113 culturas de bactérias psicrotróficas proteolíticas isoladas de amostras de leite cru granelizado foi avaliada utilizando- se a técnica de RAPD. Foi constatada uma grande diversidade genética entre os isolados, indicando fontes de contaminação diversas. A presença do gene apr, que codifica metaloproteases termorresistentes, foi avaliada por PCR em 26 culturas controle e em 133 isolados psicrotróficos proteolíticos de leite cru resfriado e granelizado. Detectou-se a presença do amplificado do gene apr apenas nas culturas de referência Serratia marcescens ATCC 8100, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 e estirpes de P. aeruginosa ATCC 15442 e ATCC 27853. A presença do gene apr foi detectada na mistura de DNA dos isolados psicrotróficos proteolíticos que apresentaram características fenotípicas de espécies do gênero Pseudomonas, quais sejam, Gram-negativas, não fermentadoras, catalase e oxidase positivas. Os demais isolados Gram-negativos e os Gram-positivos, embora tenham apresentado atividade proteolítica, não apresentaram o amplificado do gene apr. A técnica de PCR permitiu identificar a presença de população acima de 10 5 UFC/mL de P. fluorescens inoculada em leite desnatado reconstituído após a extração do DNA total das bactérias. Entretanto, quando amostras de leite pasteurizado inoculado com populações variando de 10 5 a 10 8 UFC/mL foram analisadas por PCR, sem a etapa de extração do DNA total, o limite de detecção foi de 10 8 UFC/mL. / The genetic diversity of 113 cultures of proteolytic psychrotrophic bacteria isolated from raw milk collected from cooling tanks was analyzed by RAPD. A great genetic diversity was detected among these isolates indicating different sources of contamination. The presence of the apr gene, which codes a heat- resistant metalloprotease, was assessed by PCR in 26 type strains and in 136 proteolytic psychrotrophic bacteria isolated from raw milk. The presence of the apr gene was only detected in Serratia marcescens ATCC 8100, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 and, strains of P. aeruginosa ATCC 15442 and ATCC 27853. The apr gene was detected in total DNA extracted from proteolytic psychrotrophics that showed phenotypic characteristics belonging to Pseudomonads such as Gram-negative, non-fermentative, positive-catalase and positive-oxidase. The apr gene was not detected in the other Gram-negative and Gram-positive isolates studied although they have displayed proteolysis. The PCR technique identified the presence of Pseudomonas fluorescens when total DNA was extracted from skim milk previously inoculated with a bacterial population containing 10 5 CFU/mL. However, the detection limit of apr gene without the DNA extraction step was 10 8 CFU/mL in pasteurized milk.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T17:06:16Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 183969 bytes, checksum: 54f3ae2567e427aa5cdc5063341ebea0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T17:06:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 183969 bytes, checksum: 54f3ae2567e427aa5cdc5063341ebea0 (MD5) Previous issue date: 2003-12-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da produção micelial de Agaricus blazei em meio líquido com diferentes composições, para uso em produção de semente-inóculo e composto miceliado. Observou-se que a taxa de crescimento micelial dos isolados AB51, LF e SO em meio BDA e em composto comercial foi semelhante. Quando esses isolados foram cultivados em meio de cultura líquido, à base de batata, acrescido de glicose, também não foi observada diferença entre o crescimento dos isolados. Porém, quando esse meio foi acrescido de sacarose (açúcar comercial não refinado), o isolado SO foi o que produziu maior massa micelial seca. Ao cultivar o isolado LF em meios de cultura à base de farelos de arroz, farinha de mandioca e,ou fubá, observou-se que nos meios que continham o farelo de arroz, houve maior produção de massa micelial seca. O inóculo líquido, preparado com a mistura de 2% de farelo de arroz e 2% de farinha de mandioca, foi muito eficiente na produção de semente-inóculo à base de grãos de arroz, permitindo uma colonização uniforme do substrato, quando comparado ao inóculo sólido, devido a uma melhor distribuição do micélio fúngico. Entretanto, ao utilizar o inóculo líquido para a inoculação do composto comercial pasteurizado ou esterilizado, mesmo nos casos em que o fungo foi cultivado em meio contendo extrato do composto, não houve crescimento micelial. Pode-se concluir que a produção de pré-inóculo utilizando meio líquido enriquecido com farelos de arroz e,ou farinha de mandioca é uma técnica viável e promissora para a produção de inóculo-semente, por favorecer o crescimento micelial e também pelo baixo custo desses substratos. / The objective of this work was to evaluate the viability of mycelial production of Agaricus blazei in liquid culture with different compositions to be used both as pre- inoculum and as inoculum for compost. The mycelial growth rate of isolates AB51, LF, and SO in PDA and in commercial compost was similar. When these isolates were cultivated in potato dextrose broth (PD), no difference was observed among isolates. However, when commercial sugar (sucrose) was added to the medium, isolate SO produced the highest mycelial dry mass. When isolate LF was grown in culture media based on rice bran, cassava flour and,or corn bran, the highest mycelial dry mass was observed when rice bran was present. The liquid inoculum prepared with a mixture of 2% rice bran and 2% cassava flour was more efficient than solid culture for the production of inoculum/spawn based on rice grains, allowing xa uniform colonization of substrate due to a better distribution of the fungal mycelium through the pores spaces between the grains. However, when the liquid inoculum was used to inoculate commercial compost, either pasteurized or sterilized, no mycelial growth was observed, even in cases when the mycelium was cultivated in medium containing compost extract. The production of pre-inoculum using liquid medium, enriched with rice bran and,or cassava flour, is a viable and promising technique for inoculum/spawn production, not only by improving mycelial growth but also because of the low cost of substrates.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T18:17:32Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17263 bytes, checksum: 8e51a65fe7d8eecb448411acb64cf05b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T18:17:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17263 bytes, checksum: 8e51a65fe7d8eecb448411acb64cf05b (MD5) Previous issue date: 2003-02-20 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A estirpe probiótica Lactobacillus UFV H2b20, previamente classificada como Lactobacillus acidophilus por suas características de fermentação de açúcares, apresentou-se mais semelhante à espécie Lactobacillus delbrueckii, quanto à seqüência de rDNA 16S, o que levou ao questionamento acerca da identidade da linhagem. Para o esclarecimento da real classificação da linhagem, o método de hibridização DNA-DNA foi empregado. A linhagem apresentou 75,2% e 77,4% de reassociação com L. delbrueckii subsp. lactis (ATCC 12315) e L. delbrueckii subsp. delbrueckii (ATCC 9649), respectivamente. Dado que a homologia de 70% ou mais, por esse método, tem sido usada como padrão para agrupamento de bactérias em uma mesma espécie, sugere-se, aqui, que Lactobacillus UFV H2b20 seja, daqui para frente, denominado L. delbrueckii UFV H2b20. Identificada a linhagem, outro objetivo do trabalho era desenvolver um protocolo para detecção in situ de L. delbrueckii. Uma sonda de 26 nucleotídeos (SA) foi construída e testada com outras espécies de Lactobacillus relacionadas geneticamente entre si. Estes estudos demonstraram que a seqüência de assinatura (SA) estava presente em L. delbrueckii UFV H2b20, L. delbrueckii UFV H2b21, L. delbrueckii subsp. delbrueckii e L. delbrueckii subsp. lactis, o que indica ser ela eficaz para ser usada como sonda para rRNA 16S espécie-específica pelo método de FISH. A hipótese de existência de polimorfismos, levantada em trabalhos prévios no rDNA 16S da linhagem, foi confirmada após as análises dos segmentos de DNA clonados e selecionados do banco genômico construído para a linhagem L. delbrueckii UFV H2b20. As seqüências analisadas demonstraram, também, presença de segmentos correspondentes a quatro genes codificadores de rRNA 16S distintos, e seis segmentos distintos para uma mesma região de rRNA 23S, indicando seis operons putativos. Há evidência de, pelo menos, um operon putativo completo seguido de região codificadora de seis tRNAs. Não se detectou região espaçadora longa entre rDNA 16 e 23S. / Lactobacillus UFV H2b20, a probiotic strain, previously identified as Lactobacillus acidophilus due to its sugar fermentation pattern, was found to be more closely related to Lactobacillus delbrueckii regarding its 16S rDNA sequence. It was demonstrated by DNA-DNA hybridization that this strain presented 75.2% and 77.4% of reassociation with L. delbrueckii subsp. lactis ATCC 12315 and L. delbrueckii subsp. delbrueckii ATCC 9649, respectively. These results place Lactobacillus UFV H2b20 within the L. delbrueckii species, for 70% reassociation as measured by the method used has been a standard to cluster bacteria within the same species. A protocol for in situ detection of L. delbrueckii was developed by means of Fluorescent in situ Hybridization, FISH. A probe consisting of 26 nucleotides labeled with rhodamine was designed based on the signature sequence within the rDNA, and was tested against genetically related Lactobacillus species. A species- specific method was obtained capable of discriminating L. delbrueckii strains from other Lactobacillus species. Previous studies raised the hypothesis of polymorphism among the copies of 16S rDNA in L. delbrueckii UFV H2b20. This was confirmed by sequence analysis of rDNA from a gene library of this strain cloned in phage lambda and subcloned in pBluescript. Sequence analyses of cloned fragments demonstrated the presence of at least four distinct genes encoding 16S rRNAs. Distinct fragments containing 23S rRNA related genes indicated six putative rrn operons. One complete putative rrn operon displays a region encoding 6 different tRNAs. Long spacer regions between 16S and 23S rDNA were not detected.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T11:25:50Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17567 bytes, checksum: 5e91367d9657bfdf1b270599b24d4f36 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T11:25:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17567 bytes, checksum: 5e91367d9657bfdf1b270599b24d4f36 (MD5) Previous issue date: 2004-08-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Métodos alternativos ao uso de ionóforos têm sido sugeridos para a manipulação da fermentação ruminal. Ácidos orgânicos têm sido utilizados com sucesso para esse objetivo, mas a baixa disponibilidade destes compostos pode inviabilizar a sua aplicação in vivo. Entretanto, o uso de substratos baratos e de alta disponibilidade para a produção de ácido propiônico e outros produtos fermentativos usados como substratos gliconeogênicos pode reduzir este problema. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bactérias produtoras de ácido propiônico do rúmen de bovinos que fossem capazes de usar soro de queijo como substrato para a fermentação. Dezenove bactérias foram isoladas do rúmen de bovinos capazes de fermentar lactose e converter lactato em ácido propiônico. Um dos dezenove isolados, isolado P01, apresentou elevada produção de biomassa e alto rendimento de propionato, sendo selecionado para posterior caracterização. O isolado P01 foi caracterizado como bactéria Gram-positiva, de forma esférica e que apresenta arranjos em diplococos ou cadeias longas. O isolado P01 apresentou velocidade específica de crescimento em lactato de aproximadamente 0,300 h -1 , utilizou vários substratos (lactose, sacarose, celobiose, maltose, xilose e glicose) como fonte de carbono e mostrou-se resistente a altas concentrações de lactose, lactato e ácido propiônico. Esse microrganismo foi capaz de crescer mesmo em concentrações de até 160 μmol/L de monensina ou lasalocida. O isolado P01 produziu até 17,8 g/L de ácido propiônico e 11,2 g/L de acético a partir de soro de queijo ultrafiltrado contendo cerca de 4,0 % de sólidos (36 g/L de lactose). A incorporação de soro fermentado ao líquido de rúmen aumentou a digestibilidade de forrageiras em até 11 %, elevou a concentração de ácidos orgânicos totais em até 15 % e reduziu a relação acetato/propionato em cerca de 23 %. A presença do soro fermentado não teve efeito significativo sobre a concentração de proteína microbiana, mas promoveu o aumento da produção de amônia in vitro. / Organic acids have been used as an alternative to ionophores to manipulate ruminal fermentation, but some organic acids tested as feed additives are not readily available and their application in vivo may be limited. However, the use of abundant, low-cost substrates to produce propionic acid and other fermentation products that are used as gluconeogenic substrates by the ruminant could lessen this problem. This work aimed to isolate and characterize propionic acid-producing bacteria from the rumen of cattle that used cheese whey as substrate for fermentation. Nineteen bacteria were isolated from the bovine rumen that could convert lactose and lactate to propionic acid as their major fermentation product. The isolate showing the greatest biomass and propionate production (isolate P01) was selected for further characterization. The isolate P01 was Gram-positive cocci, arranged as diplococcus or in long chains. The isolate P01 had a growth rate in lactate and lactose around 0,300 h -1 , could use several sugars as carbon source (sucrose, cellobiose, maltose, xylose e glucose), and was not severely affected by high concentrations of substrates (lactose and lactate) or propionic acid. The isolate P01 grew at concentrations of monensin and lasalocid that inhibited other Gram-positive ruminal bacteria, and even concentrations as high as 160 μmol/L did not prevent cell xiiigrowth. The isolate P01 fermented cheese whey containing approximately 36 g/L of lactose and produced up to 17,8 g and 11,2 g per liter of propionate and acetic acid, respectively. Addition of fermented cheese whey (10% ratio) to ruminal fluid increased forage digestibility by 11 %, decreased the acetate to propionate ratio up to 23 % and increased total volatile fatty acids approximately 15 %. The fermented cheese whey had no significative impact on microbial protein concentration, but increased ammonia production in vitro. These results indicate that isolate P01 can ferment cheese whey lactose and the fermented product generated might improve ruminal fermentation in vitro.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T12:23:21Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15048 bytes, checksum: d5744efbeb8efb56f92d1090f9969ae5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T12:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15048 bytes, checksum: d5744efbeb8efb56f92d1090f9969ae5 (MD5) Previous issue date: 2004-07-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da inoculação dos fungos micorrízicos arbusculares (FMA), Glomus clarum e Gigaspora decipiens, multiplicados monoaxenicamente em raízes de cenoura transformadas, sobre a atividade das enzimas do estresse oxidativo, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase (POD), sobre a colonização micorrízica, a sobrevivência e o desenvolvimento de mudas de morangueiro micropropagadas durante a fase de aclimatização. Foram conduzidos dois experimentos. No primeiro, fez-se a inoculação de mudas micropropagadas em casa de vegetação, utilizando-se dois tipos de inoculação: (a) somente esporos e (b) fragmentos de Fitagel contendo hifas, esporos e micorrizas. As plantas colonizadas apresentaram maiores atividades específicas de SOD, CAT e POD, quando comparadas às não inoculadas na fase de aclimatização. O segundo método proporcionou maiores percentagens de colonização após 4 semanas e, também, maior índice de sobrevivência. No segundo experimento, utilizou-se o cultivo in vitro tripartite, onde as mudas micropropagadas foram colocadas em placas de Petri contendo raízes transformadas e colonizadas por G. clarum e G. decipiens, em ambiente enriquecido com 2.000 ppm de CO 2 . O sistema foi estabelecido com sucesso, sendo observado 100 % de sobrevivência e alta percentagem de colonização micorrízica. As plantas micorrizadas apresentaram maiores valores de atividades específicas das enzimas SOD e CAT e não foi detectada a presença da POD. Pode- se concluir que tanto o método de inoculação quanto a espécie de FMA a ser inoculado devem ser levados em consideração para inoculação de plantas micropropagadas e que o sistema de cultivo tripartite pode ser uma ferramenta eficiente para o sucesso da micorrização in vitro. / This study was conducted to evaluate the inoculation effect arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), Glomus clarum and Gigaspora decipiens multiplied on transformed carrot roots, on the activity of enzymes involved in oxidative stress central, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD), on mycorrhizal colonization and on the survival and development of micropropagated strawberry plantlets phase. Two experiments were conducted. Firstly, micropropagated seedlings were inoculated under green-house conditions, using two types of inoculation: (a) spores and (b) gel fragments containing hyphae, spores and mycorrhiza. Colonized plants presented higher specific activity of SOD, CAT, and POD compared to non-inoculated controls. After 4 weeks of acclimatization, greater colonization and survival percentages were observed when the second method was used. In the second experiment, micropropagated plantlets were inoculated in Petri dishes containing transformed carrots roots colonized by G. clarum or G. decipiens, and incubated in a growth chamber the room enriched with 2.000 ppm of CO 2 . The mycorrhization was well succeeded and the survival in the acclimatization phase was 100 %. Mycorrhizal plantlets presented higher values of specific activitie for SOD and CAT, and no activity for POD. Both inoculation methods, as well theAMF species to be inoculated, have to be considered during inoculation programs of micropropagated strawberry ixseedlings. Tripartite cultivation system can be a fundamental tool to guarantee mycorrhization of micropropagated seedlings.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T12:38:14Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 25134 bytes, checksum: d1f28b726d8703c03b84e1bff5ffec94 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T12:38:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 25134 bytes, checksum: d1f28b726d8703c03b84e1bff5ffec94 (MD5) Previous issue date: 2004-03-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A seqüência de nucleotídeos contendo o gene ple1 que codifica pectina liase em Penicillium expansum foi clonada. Esta seqüência contém 874 nucleotídeos da região promotora, 1342 nucleotídeos da região codificadora e 469 nucleotídeos da região terminadora. A região codificadora do gene ple1 é interrompida por dois íntrons, de 101 e 116 nucleotídeos, confirmados pela seqüência do cDNA. Na seqüência da região promotora de ple1 foi observado cis-elementos envolvidos na regulação da expressão desse gene, como TATA box (TATATAA) na posição -91 do códon de início da tradução, sendo esta seqüência precedida por uma região rica em pirimidinas e CAAT box (CCAATT) a -568 do códon de inicio da tradução. A proteína PLE1, deduzida a partir da seqüência de nucleotídeos possui 374 resíduos de aminoácidos, com massa molecular estimada de 40,1 KDa e pI calculado de 9,46. Análise por hibridização do DNA total de P. expansum e P. griseoroseum com um fragmento de DNA de 2,1 Kb que corresponde ao gene pelA de A. niger, indicou organização semelhante dos genes de PL no genoma destes fungos. A expressão do gene ple1, avaliada pela hibridização do RNA total com um fragmento de DNA que corresponde à região estrutural do gene ple1 mostrou que o transcrito foi detectado durante todo tempo de cultivo em presença de pectina. No entanto, quando cultivado em presença de sacarose, o transcrito somente foi detectado em 12 e 24 horas de cultivo, com adição de extrato de levedura. A caracterização morfológica de P. expansum e P. griseoroseum mostrou diferenças nítidas tanto no diâmetro quanto na coloração do verso das colônias destes fungos. Diferenças na organização da região subtelomérica dos cromossomos de P. expansum e P. griseoroseum, foram observadas quando o plasmídeo pTEL13 foi utilizado como sonda. A região ITS do rDNA de P. expansum tem 600 pb e de P. griseoroseum 594 pb. As linhagens transformantes obtidas com os plasmídeos pPlg1 e pNPG1, apresentaram aumentos na atividade de PL de no máximo 3 vezes. Análise por hibridização do DNA total dos transformantes indicou a ocorrência de integrações homólogas e heterólogas de pelo menos duas cópias do gene plg1. Foi construído um vetor de expressão, denominado pAN52-Plg1 que continha o gene plg1 sob o controle do promotor forte constitutivo do gene (gpdA) de A. nidulans. A transformação da linhagem mutante PG63 utilizando este vetor e o pNPG1, resultou na obtenção de uma linhagem recombinante (105) com aumento de 58 vezes na atividade de PL, quando cultivada em presença de glicose como fonte de carbono. Seis linhagens recombinantes foram avaliadas por hibridização apresentando integração heteróloga de mais de uma cópia do gene plg1 no genoma. Avaliação das proteínas extracelulares por eletroforese (SDS-PAGE) mostrou a presença de uma banda nítida e forte de aproximadamente 40 KDa presente no sobrenadante de cultivo da linhagem recombinante 105 que corresponde a PLG1. A atividade específica aparente de PL sintetizada por esta linhagem foi 44 e 27 vezes maior do que aquela obtida para linhagem mutante PG63 e de uma preparação comercial de pectinases “Citrus Clear”, respectivamente. O cultivo da linhagem recombinante 105 em meio contendo caldo de cana promoveu uma atividade de PL 132 vezes maior do que a atividade obtida pela linhagem PG63 cultivada nesta mesma fonte de carbono. A atividade de PL da linhagem recombinante 105, cultivada em diferentes volumes de meio, aumentou linearmente com o tempo. Pectina cítrica, quando utilizada como substrato, promoveu maior atividade de PL. A enzima mostrou ser estável em ampla faixa de pH e temperatura de armazenamento. Estes resultados mostram que a linhagem recombinante 105 é promissora para produção de PL em escala industrial, principalmente, para aplicação na indústria de sucos e vinhos, onde o emprego apenas da PL apresenta várias vantagens na qualidade do produto final. / The sequence of the pectin lyase-enconding gene ple1, from Penicillium expansum, was cloned. This sequence consists of 874 nucleotides of the promoter region, 1342 nucleotides of the coding region, and 469 nucleotides of the terminator region. The coding region of ple1 is interrupted by two introns of 101 and 116 nucleotides, confirmed by cDNA sequencing. Two cis-elements, TATA box (TATATAA) and CAAT box (CCAATT), were found at the positions 91 and 568 upstream from the translation start code, respectively. The deduced amino acid (aa) sequence (374 aa) of PLE1 has an estimated molecular mass of 40.1 KDa and a calculated pI of 9.46. One putative N- glycosylation site was found at Asn 112 . Southern blot analysis of genomic DNA from P. expansum and P. griseoroseum with a 2.1 kb-DNA fragment of the gene pelA from A. niger indicated that this gene is similarly organized in the genomes of these fungi. The hibridization of total RNA with a fragment of the coding region of ple1 showed that the transcript was detected diring the whole of cultivation in a medium containing pectin. However, when the fungus was cultivated in the presence of sucrose with addition of yeast extract, the transcript was detected only at 12 and 24 hours of cultivation. The morphologic characterization of P. expansum and P. griseoroseum showed clear differences in the xdiameter and in the coloration of the botton of the colonies. Differences in the organization of the subtelomeric region of chromosomes of P. expansum and P. griseoroseum, were observed when the plasmid pTEL13 was used as a probe. The ITS region of the rDNA of P. expansum has 600 bp and that of P. griseoroseum 594 bp. The transformants obtained with the plasmids pPlg1 and pNPG1 presented increases in the activity of PL of at the least 3 times the active of the wild type. The hibridization profile of the genomic DNA of the transformants showed the occurrence of homologous and heterologous integrations of at least two additional copies of the gene plg1 in the genome. It was not possible to define the exact number of copies and correlate it with PL activity. An expression vector was built, designated pAN52-Plg1 that contained the gene plg1 under the control of the strong constitutive promoter gpdA of A. nidulans. The transformation of the mutant strains PG63 using this vector and the pNPG1 resulted in the isolation of a recombinant strain (105) with a PL activity 58 times higher than that of the wild type, when cultivated in glucose as the sole carbon source. Six recombinants were analised by hybridization that presented heterologous integration of more than one copy of plg1. Evaluation of the extracellular proteins by electrophoresis (SDS-PAGE) showed the presence of a clear and strong band of approximately 40 KDa in the cultivation filtrate of the recombinant 105. This band corresponded to PLG1. The apparent specific activity of PL synthesized by this strain was 44 and 27 times higher than that obtained for the strain PG63 and for a commercial preparation of pectinolytic enzymes (Citrus Clear), respectively. The cultivation of the recombinant strain 105 in a medium containing sugar cane juice promoted a PL activity that was 132 times higher than that for the strain PG63 cultivated with the carbon source. PL activity of the recombinant strain 105, cultivated in different volumes of medium, increased linearly with time. Citric Pectin, when used as substrate, supported higher PL activity. The enzyme was stable in a wide range of pH and storage temperature.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T17:59:02Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 18745 bytes, checksum: 7ee376e06a739b581d4acfc31ab665e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T17:59:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 18745 bytes, checksum: 7ee376e06a739b581d4acfc31ab665e1 (MD5) Previous issue date: 2005-07-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A adequação das etapas de processamento para produção de A. blazei desidratado foram avaliadas. Verificou-se que a centrifugação de porções de 250 g de cogumelos por um minuto removeu, parcialmente, a água superficial acrescentada ao produto durante as etapas de processamento. A imersão dos cogumelos em solução de clorado orgânico e ácido lático resultou em uma diminuição de, respectivamente, 0,7 e 1,25 ciclos logarítmicos no número de mesófilos aeróbios e de 0,5 ciclo logarítmico na população de fungos e leveduras, quando comparado ao tratamento controle, lavado em água. A população estimada de aeróbios mesófilos nos cogumelos sanitizados com clorado orgânico e liofilizados foi de 9,3 x 10 2 UFC g -1 . Bactérias do grupo coliformes não foram verificadas nessas amostras. Coliformes totais estiveram presentes em todas as amostras de cogumelos frescos lavados com água e desidratados em estufa. Não foi verificada a presença de E. coli em nenhuma das amostras avaliadas. As amostras controle apresentaram coliformes termotolerantes em número de 9,3 x 10 1 NMP g -1 e, após sanitização com clorado orgânico, este valor foi de 1,5 x 10 1 NMP g -1 de cogumelo. Não se constatou a presença de estafilococos coagulase positivo e de Salmonella em nenhuma das amostras analisadas. Os cogumelos sanitizados com clorado orgânico e aqueles sanitizados e tratados com ácido cítrico apresentaram uma diminuição de 1,81 e 2,26 ciclos logarítmicos de mesófilos aeróbios respectivamente. Os cogumelos sanitizados com ácido lático tornaram-se mais escuros após o processamento e a desidratação, em relação aos demais e, em razão disso, optou-se pela utilização do produto a base de clorado orgânico no processamento dos cogumelos. Não se observou diferença significativa (P>0,05) na cor dos cogumelos submetidos ao tratamento com antioxidantes. A atividade de polifenoloxidases após 6 horas e 21 horas de processamento foi maior nos cogumelos frescos lavados apenas com água. Após desidratação osmótica dos cogumelos, utilizando 40 % e 60 % (p/p) de polietilenoglicol 400 (PEG) verificou-se perda de peso após (6, 12 e 24) horas. O pré-tratamento por 6 horas em 40 % e 60 % de PEG 400 reduziu em quatro horas o tempo de secagem dos cogumelos em estufa, que geralmente atingiu 10 a 12 horas. A liofilização dos cogumelos por 16 horas promoveu a manutenção das características originais do produto que se apresentaram mais claros do que aqueles tratados com antioxidantes. A atividade de água dos cogumelos desidratados variou de 0,30 a 0,44 e a umidade de 13,0 % a 16,6 %, sendo os maiores valores encontrados nas amostras submetidas à desidratação osmótica. Os cogumelos que apresentaram melhor textura foram os do tratamento controle, submetidos a um minuto de centrifugação. O pré- tratamento de desidratação osmótica promoveu uma alteração na concentração de minerais dos cogumelos, o que não é desejável do ponto vista nutricional. Não se observou a presença de cloro residual livre na água de imersão dos cogumelos sanitizados com clorado orgânico. / The adaptation of processing stages for production of dehydrated A. blazei was evaluated. It was verified that the centrifugation of 250 g portions of mushrooms for one min removed, partially, the superficial water incorporated to the product during the processing stages. The immersion of mushrooms in organic chloride solution and in lactic acid solution resulted in a decrease of 0.7 and 1.25 logarithmic cycles in the number of mesophilic aerobic and of 0.5 logarithmic cycle in the population of fungi and yeasts, when it was compared to the control, washed in water. The freeze-dried mushrooms sanitized with organic chloride presented 9,3 x 10 2 CFU g -1 of mesophilic aerobic, and the presence of coliforms was not verified. Coliforms were present in all samples of fresh and dehydrated mushrooms washed in water. E. coli was absent in all samples evaluated. The control samples presented 9.3 x 10 1 MPN g -1 thermotolerants coliforms. After sanitizing -1 contamination dropped to 1.5 x 10 MPN g with organic chloride, this of mushroom. Staphylococcus coagulase positive and Salmonella were not verified in the analyzed samples. xThe mushrooms treated with organic chloride and those treated with organic chloride added of citric acid as antioxidant presented a decrease of 1.81 and 2.26 logarithmic cycles of mesophilic aerobic, respectively, when they were compared to the control. The mushrooms sanitized with lactic acid became more darkness after processing and dehydration, in relation to the other treatments. Therefore, the use of organic chloride was chosen for the processing of the mushrooms. Significant difference (P>0,05) was not observed in the color of the mushrooms submitted to the treatment with antioxidants. The polyphenol oxidase activity in fresh mushrooms was larger in the control after 6 and 21 hours of processing, when it was compared to the other treatments. In osmotic dehydration of mushrooms, using 40 % and 60 % (w/w) polyethyleneglycol 400 (PEG), it was verified loss of weight after (6, 12 and 24) hours. Then, the pre-treatment of 6 hours using 40 % and 60 % PEG 400, which reduced four hours the time for drying of mushrooms in stove, was chosen. Drying of mushrooms in stove took of 10 to 12 hours. The freeze-drying of mushrooms for 16 hours promoted the maintenance of initial characteristics of the product that became clearer than those treated with antioxidants. The water activity of the dehydrated mushrooms varied from 0.30 to 0.44 and the humidity varied from 13.0 % to 16.6 %. The largest values of humidity were found in osmotically dehydrated samples. The best texture was observed in control samples after one min of centrifugation. The pre-treatment of osmotic dehydration promoted an undesirable reduction in the concentration of minerals of mushrooms. The presence of free residual chlorine was not observed in the immersion water of mushrooms treated with organic chloride.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T18:16:32Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 38144 bytes, checksum: 79678cb9a936baa34af6a9a600570e58 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T18:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 38144 bytes, checksum: 79678cb9a936baa34af6a9a600570e58 (MD5) Previous issue date: 2005-08-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Com o objetivo de avaliar o processo de conversão de xilose em xilitol por um novo isolado de Debaryomyces hansenii em meio semi-sintético, foi determinada a influência de diferentes variáveis de cultivo, a relação entre o crescimento da biomassa e a produção de xilitol, e a recuperação do produto final, utilizando ferramentas matemáticas e modelagem metabólica. Avaliando a influência do pH inicial do meio e da temperatura de cultivo na conversão de 50 g L -1 de xilose (S o ), foi observado que o pH ótimo está entre 4,0 e 8,0, com a produção de xilitol (P m ) entre 37,5±1,7 e -1 41,8±0,78 g L e o rendimento (Y P/S ) ente 0,70±0,01 e 0,76±0,01/0,02 g g -1 , enquanto, a temperatura ótima está entre 30°C e 35°C com P m entre 41,0±1,1 e 41,6±1,1 g L -1 e Y P/S entre 0,75±0,02 e 0,77±0,04 g g -1 . A conversão também foi estudada sob forte limitação de oxigênio, sendo observada uma produção de xilitol desprezível, e sob condição semi- aeróbia, quando foram obtidos os melhores valores de produção de xilitol (P max > 70 g L -1 e Y P/S > 0,65 g g -1 , para S o ≅ 100 g L -1 ). Foi determinado que o acúmulo de xilitol no meio de cultivo está associado ao estado fisiológico característico de fase de crescimento desacelerado e à concentração de biomassa que influencia a disponibilidade de oxigênio dissolvido e a manutenção da capacidade de conversão, limitada apenas pela disponibilidade de substrato e nitrogênio. Aplicando design fatorial (3 3 e 3 2 ), foi observado que a combinação de maior concentração de xilose (S o = 165 g L -1 ), na presença de alta concentração inicial de células (X o = 6,4 g L -1 ) e alta aeração (300 rpm) beneficiou o processo de conversão. Na simulação da composição do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, as células suportaram as condições impostas pela presença de inibidores e de outros açúcares. A cristalização de xilitol em meio semi-sintético fermentado tratado com carvão ativo (20 g L -1 ) foi favorecida pelo aumento na concentração de xilitol (675 ≤ P o Xyt ≤ 911 g L -1 ). Baixa temperatura (-10 ≤ T c ≤ 15°C) foi mais eficiente em termos de rendimento de cristalização, enquanto o grau de pureza apresentou um comportamento contrário. a presença simultânea de xilose residual reduziu o conteúdo de xilitol dos cristais de 97,7 para 85,3%, porém aumentou 1,6 vezes o rendimento de cristalização de 0,27 para 0,42. Finalmente, o estudo cinético da cristalização de xilitol revelou o efeito positivo da presença de xilose residual (168±8.0 g L -1 ) que aumentou a velocidade constante de crescimento de cristais, assim permitindo a operaração a maiores temperaturas e menor P o Xyt . Os resultados obtidos nas etapas do processo de conversão de xilose em xilitol, confirmaram o potencial da levedura Debaryomyces hansenii UFV-170 na conversão de xilose em xilitol. / Two hundred fifty-two yeast isolated from a dairy industry environment, eighteen yeast isolated from coffee fruits and eleven filamentous fungi from the Universidade Federal de Viçosa, Microbiology Department fungal collection were screened for xylitol production by growing them in mineral medium supplemented with 1% D-xylose and 0.5% yeast extract, at 30°C and 100 rpm. Nineteen yeast that presented volumetric productivities (Q P ) between 0.06 and 0.12 g L -1 h -1 and yields (Y P/S ) from 0.14 to 0.57 g g -1 were selected. Xylitol production by the filamentous fungi was low, varying from 0.14 to 0.52 g L -1 presenting volumetric productivities (Q P ) from 0.002 to 0.006 g L -1 h - . In a second screening of the nineteen yeast selected, for six isolated, xylitol production varied from 4.60 to 6.23 g L -1 when starting with 10.73 g L -1 D-xylose. Specific productivities (q P ) varied between 0.17 and 0.26 mmol g -1 h -1 , Q P from 0.10 to 0.13 g L -1 h -1 and Y P/S from 0.43 to 0.58 g g -1 . Yeast 1.70 stood out, producing 6.23 g L - xylitol (Q P =0.13 g L -1 h -1 , q P =0.26 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.58 g g -1 ). Yeast 1.70 proved promising for xylitol production and its optimal growth conditions were therefore determined. The best D-xylose concentration was 51.35 g L -1 , resulting in production of 32.70 g L -1 xylitol (Q P =0.49 g L -1 h -1 , q P =0.49 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.64 g g -1 ). The best fermentation parameters were obtained using 1.45 g L -1 of cellular mass xiiias initial inoculum (36.2 g L -1 xylitol from 56.80 g L -1 D-xylose, Q P =0.60 g L -1 h -1 , q P =0.58 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.65 g g -1 ). The best aeration rate was obtained at 200 rpm, producing 27.20 g L -1 xylitol from 46.70 g L -1 D-xylose (Q P =0.90 g L -1 h -1 , q P =0.74 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.57 g g -1 ). The addition of 0.5% MERCK ® yeast extract produced 33.00 g L -1 xylitol from 49.40 g L -1 D-xilose (Q P =0.64 g L -1 h -1 , q P =0.67 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.65 g g -1 ) while the addition of 0.5% DIFCO ® yeast extract produced 33.65 g L -1 xylitol from 47.00 g L -1 D-xylose (Q P =0.67 g L -1 h -1 , q P =0.60 mmol g -1 h -1 and Y P/S =0.72 g g -1 ). Yeast 1.70 was characterized through physiological, biochemical and morphological tests, in an attempt to identify it. However, in spite of a morphological similarity to the genus Pichia, results were inconclusive.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T18:25:04Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15350 bytes, checksum: dfb862c1ae844570018456c3a9ff28f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T18:25:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15350 bytes, checksum: dfb862c1ae844570018456c3a9ff28f4 (MD5) Previous issue date: 2005-02-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O objetivo deste trabalho foi padronizar as condições de obtenção e regeneração de protoplastos de Epulorhiza repens e Ceratorhiza sp. e determinar o cariótipo eletroforético de Ceratorhiza sp. Para o fungo Epulorhiza repens, a maior produção de protoplastos, 8,0 x 10 6 protoplastos/mL, foi obtida em KCl 0,6 M, na presença de 15 mg/mL de “Lysing Enzymes” e 0,5 g de micélio fúngico com 2 dias idade, após fragmentação em liquidificador. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 8,5 % quando sacarose 0,5 M foi utilizada como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 58,6 % eram uninucleados, 21,4 % binucleados e 20 % anucleados. Para o fungo Ceratorhiza sp., a maior produção de protoplastos, 4,0 x 10 7 protoplastos/mL, foi obtida em NaCl 0,6 M, na presença de 15 mg/mL de “Lysing Enzymes” e 15mg/mL de Glucanex, 0,5 g de micélio fúngico com 2 dias de idade, após fragmentação em liquidificador. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 6,7 % utilizando sacarose 0,5 M como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 61 % eram uninucleados, 24,6 % binucleados, 3,2 % trinucleados e 11,2 % anucleados. O cariótipo eletroforético do fungo Ceratorhiza sp. apresentou no mínimo, 3 cromossomos cujos tamanhos foram estimados em 4,6; 3,5 e 2,2 Mb. A maior intensidade da banda de 4,6 Mb sugere que esta possa estar representando dois cromossomos, sendo o tamanho do genoma estimado em pelo menos 14,9 Mb. O estabelecimento de protocolos otimizados para obtenção e regeneração de protoplastos dos fungos Epulorhiza repens e Ceratorhiza sp. é importante, permitindo o estabelecimento de técnicas de transformação genética, o isolamento de mutantes, a determinação de cariótipo eletroforético e o cruzamento de linhagens. O cariótipo de Ceratorhiza sp. é importante para a determinação do número e do tamanho dos cromossomos, para se estimar o tamanho do genoma e a localização de genes relacionados à formação de micorrizas. / This study was conducted in order to standardize the formation conditions and regeneration of Epulorhiza repens and Ceratorhiza sp. protoplasts and also to determine the electrophoretic karyotype of Ceratorhiza sp. For Epulorhiza repens, the highest production of protoplasts, 8,0 x 10 6 protoplasts/mL, was obtained in KCl 0,6 M, with 15 mg/mL of “Lysing Enzymes” and 0,5 g of mycelium at 2 days, after fragmentation in the liquefier. The best regeneration frequency, 8,5 %, was achieved when sucrose 0,5 M was used as an osmotic stabilizer. From total protoplasts obtained, 58,6 % were uninucleate, 21,4 % binucleate and 20 % anucleate. For Ceratorhiza sp. the highest production of protoplasts, 4,0 x 10 7 protoplasts/mL, was obtained in NaCl 0,6 M, with 15 mg/mL of “Lysing Enzymes” and 15 mg/mL of Glucanex, and 0,5 g of mycelium at 2 days, after fragmentation in the liquefier. The best regeneration frequency, 6,7 %, was achieved when sucrose 0,5 M was used as an osmotic stabilizer, and from total protoplasts obtained, 61 % were uninucleate, 24,6 % binucleate, 3,2 % trinucleate and 11,2 % anucleated. The electrophoretic karyotype of Ceratorhiza sp. showed at least 3 chromosomes around 4,6; 3,5 and 2,2 ixMb. The highest intensity of the band 4,6 Mb suggests that it represents two chromosomes, and the genome height was estimated in, at least, 14,9 Mb. It is important to establish optimized protocols for obtaining and regenerating protoplasts of Epulorhiza repens and Ceratorhiza sp. to allow the establishment of techniques of genetic transformation, mutant isolation, electrophoretic karyotype determination and crossings between strains. Ceratorhiza sp. karyotype is important to determine chromosomes number and height, to estimate genome height and gene localization related to mycorrhizas formation.