Le diabète de type 2 et le cancer représentent des problèmes majeurs de santé publique. Une cible thérapeutique importante de ces affections est la protéine tyrosine phosphatase PTP1B. Cette dernière est connue pour réguler la voie de l’insuline en déphosphorylant le récepteur de l’insuline, IR ou le substrat du récepteur de l’insuline, IRS. Cependant lesfonctions de PTP1B, le mécanisme par lequel cette phosphatase est régulée restent très ou pas connus. Deux études ont notamment décrites des effets opposés de l’activité de PTP1B suite à la phosphorylation sur résidu de Ser50 de PTP1B par CLK1/CLK2, des kinases LAMMER d’une part et AKT d’autre part. AKT a aussi été montré de phosphoryler la kinase LAMMER CLK1. Par ailleurs, le rôle de PTP1B dans la régulation de la voie Ras/MAPK et donc dans le cancer est un sujet très controversé. L’objectif premier de ce travail de thèse a été d’analyser, le rôle de Ptp61F (l’orthologue de Drosophile de PTP1B) dans la voie de l’insuline de Drosophile, l’interaction entre la phosphatase et la kinase LAMMER de Drosophile, DOA, le rôle de cette phosphatase dans la voie RAS/MAPK. Pour se faire, nous avons utilisé la puissance génétique de laDrosophile pour générer un mutant du gène Ptp61F qui a été caractérisé et son rôle dans les voies de signalisation a été étudié. Cette étude a montrée que, Ptp61F interagit avec IR comme PTP1B chez les mammifères. Elle montre que Ptp61F régule les acteurs clés de la voie de l’insuline Pi3K/Akt. Elle a également montrée que Ptp61F pouvait réguler les fonctions du gène de la kinase LAMMER de Drosphile, Doa. Elle montre enfin que Ptp61F interagit avec nombreuses composantes de la voie RASMAPK de Drosophile (Egfr, Ras, rl (ERK humain)) en réprimant la fonction de chacun de ces gènes et que Rl serait un substrat direct de PTP61F. Les informations selon lesquelles, Ptp61F interagit avec Akt et le gène de la kinaseLAMMER de Drosophile, Doa ont été utilisées dans la deuxième étude pour montrer le rôle que les kinases LAMMER (notamment CLK2, Cdc-like kinase 2) pouvaient jouer dans la voie de signalisation de l’insuline au niveau moléculaire en utilisant les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y. Il en ressort que la kinase CLK2 joue un rôle importantdans cette voie de signalisation. CLK2 est induit par l’insuline et son expression augmente avec le temps. PTP1B interagit in vitro et in vivo avec CLK2. La surexpression de CLK2 induit la baisse de la phosphorylation de AKT par un mécanisme qui pourrait passer par PTP1B, puisque in vitro, CLK2 phosphoryle PTP1B et ce dernier interagit avec AKT in vivo. C’est le résidu de Ser50 de PTP1B qui est phosphorylé et cette phoshphorylation réprime l’activité de PTP1B in vitro. On n’observe cependant pas AKT capable de phosphoryler PTP1B in vitro suggérant que la phosphorylation de PTP1B par AKT serait dépendante du contexte cellulaire. / Type 2 diabetes and cancer represent the major public health problems. One important therapeutic target for these pathologies is the protein tyrosin phosphatase PTP1B. The phosphatase is known to negatively regulates the insulin signaling pathway by dephosphorylating the insulin receptor, IR or the insulin receptor substrate, IRS. However,PTP1B functions and its regulation mechanism remain poorly known. Two studies has notably described opposite effects of PTP1B activity following phosphorylation of its Ser50 residue either by CLK1/CLK2, LAMMER kinases or by AKT. Furthermore, AKT, a main insulin signaling pathway component, has been shown to phosphorylate the LAMMER kinaseCLK1 following insulin stimulation. In addition, the role of PTP1B in the regulation of the RAS/MAPK signaling pathway and hence in cancer is a very controversial subject. The first objective of this work was to analyse, the role of Ptp61F (the Drosophila ortholog of human PTP1B) in the Drosophila insulin pathway, the interaction between the phosphatase and the Drosophila LAMMER kinase gene, Doa, the role of Ptp61F in the RAS/MAPK signaling pathway. To achieve these, we took advantage of the genetic powerful of Drosophila to generate a Ptp61F gene mutant which has been characterized and its role in signaling pathways has been studied. This study showed that Ptp61F interacts with IR like PTP1B in mammals. It shows that Ptp61F regulates key components of insulin signaling pathway Pi3K/Akt. It also shows that Ptp61F is able to regulate the Drosophila LAMMER kinase gene, Doa. Finally, we noted that Ptp61F interacts by inhibiting the activity of severalcomponent of the RAS/MAPK signaling pathway of Drosophila (Egfr, Ras, rl (human ERK)) and conclude that Rl coud be a direct substrate of PTP61F. The data showing that Ptp61F interacts with Akt and the Drosophila LAMMER kinase gene, Doa, were the basis for the second study in order to show the role that the mammal LAMMER kinase CLK2 (Cdc-like kinase 2) could play in the insulin signaling pathway at molecular level using the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. From this second study, we show that CLK2 play an important role in insulin signaling. CLK2 is induced by insulin and its expression increases with time. PTP1B interacts in vivo and in vitro with CLK2. Overexpression of CLK2 impairs AKT phosphorylation by a mechanism which could involved PTP1B, since in vitro, CLK2 phosphorylates PTP1B and the latter interacts withAKT in vivo. It is the Ser50 residue of PTP1B being phosphorylated by CLK2 and this phosphorylation event represses PTP1B activity in vitro. AKT cannot phosphorylates PTP1B in vitro, suggesting that the phosphorylation of PTP1B by AKT could be cellular environment dependant.

Le chondrosarcome (CHS) est caractérisé par une grande chimio et radiorésistance ; il y a un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette tumeur. Parmi celles-ci, certaines approches d'immunothérapie pourraient être d'un grand intérêt. Nous étudions actuellement l'implication du système immunitaire dans la progression du CHS et la réponse thérapeutique à la fois sur des échantillons humains et dans le modèle de chondrosarcome de rat (SRC).Dans le CHS humain et de rat, des infiltrats immunitaires composés de lymphocytes et macrophages ont été identifiés dans la zone péritumorale. L’infiltration immunitaire est en corrélation avec l’évolution de la tumeur (grade, envahissement et taille). L'expression de PD1 et PDL1 ont été détectée dans les infiltrats immunitaires et cellules tumorales du CHS chez l’homme et le rat. Le niveau d'expression PD-L1 en corrélation avec la survie des patients et le taux de rechute. Dans le model SRC, la déplétion sélective de lymphocytes T a entrainé une accélération de la progression tumorale, tandis que la déplétion de macrophages l’a ralenti. Les splénocytes isolés de rats porteurs de CHS ont montré une cytotoxicité spécifique dirigée contre les cellules de chondrosarcome (27%), qui a diminué de manière significative avec des rats appauvrie en CD3 (11%). La voie de signalisation PI3K/mTOR ne peut pas être associée à une immunothérapie car elle induit une action immunosuppressive in vivo.L'environnement immunitaire contribue à la progression du CHS à la fois chez l’homme et chez le rat, ce qui suggère que une approche immunomodulatrice avec des anticorps bloquant PDL1 pourrait être testée pour le CHS / Chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiation and there is an urgent need in developing new therapeutic strategies for this malignancy; among these, some immunotherapy approaches could be of great interest. We are currently investigating the immune system implication in chondrosarcoma progression and therapeutic response both on human samples and in rat chondrosarcoma model (SRC). In human and rat chondrosarcoma, immune infiltrates composed of lymphocytes and macrophages were identified in the peritumoral area. Immune infiltrates composition was found correlated with tumors characteristics and evolution (grade, invasiveness and size). Expression of PD-1 and PD-L1 was detected in CHS immune infiltrates, both in human and rat (and on tumor cells). PD-L1 expression level correlated with patients survival and relapse rate. In SRC, T lymphocytes depletion resulted in an accelerated tumor progression, while CD163+ macrophages depletion slowed down tumor progression. Splenocytes isolated from CHS bearing SRC showed a specific cytotoxicity directed against chondrosarcoma cells (27%), which significantly decreased in CD3 depleted SRC (11%). The immune environment contributes to CHS progression in both human and animal models, this associated with expression of immune checkpoint PD1/PDL1 suggest that immunomodulatory approaches with PD-L1 blocking antibody could be applied in CHS; this approach is currently being tested in SRC

L'objectif principal de ma thèse a été la caractérisation de l'histoire évolutive des voies de signalisation au travers d'une double approche: (i) l'analyse phylogénétique de leurs composés; et (ii) l'identification et la caractérisation de leurs interactions par l'analyse des interactomes d'organismes modèles. Or, bien que de nombreux outils soient disponibles pour la reconstruction d'arbres de gènes individuels, peu de méthodes ont été développées pour l'étude d'un ensemble de protéines impliquées dans un même processus cellulaire. Pourtant, au sein de la cellule, la plupart des protéines agissent en interaction avec d'autres protéines. Dans un premier temps, j'ai étudié l'histoire évolutive de la famille des PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinases). Cette première analyse phylogénétique détaillée m'a permis de mettre en place une méthodologie applicable aux voies de signalisation. Un problème important rencontré dans cette étude a consisté en la sélection de transcrits alternatifs et ceci m'a conduit à développer un logiciel dédié nommé BATfinder (\Best Aligned Transcript finder). Dans le but d'étudier la voie de signalisation AKT/mTOR, j'ai effectué l'implémentation de la méthodologie validée avec les PI3K. Cette implémentation a pris la forme d'un pipeline automatique nommé EPINe (Easy Phylogenetics for Interaction Networks). Ce pipeline est théoriquement utilisable pour l'analyse phylogénétique de tout réseau métabolique eucaryote / The main goal of my thesis was the characterization of the evolutionary history of signalling pathways through a twofold approach: (i) the phylogenetic analysis of their components; and (ii) the identification and characterization of their interactions by the analysis of model organisms interactomes. While many tools are available for single genes tree reconstruction, only a few methods have been developed for the study of a set of proteins involved in the same cellular process. However, inside the cell, most of proteins interact with others.Initially, I studied the evolutionary history of the PI3K family (Phosphati-dylinositol 3-kinases). This first detailed phylogenetic analysis allowed me to set up a methodology suitable for signalling pathways. One of the important problems encountered in this study was the selection of alternative transcripts and this led me to develop a software called BATfinder (Best Aligned Transcript finder ). In order to study the AKT/mTOR signalling pathway, I have implemented the methodology previously validated with PI3Ks. This implementation was carried out as an automated pipeline called EPINe (Easy Phylogenetics for Interaction Networks). This pipeline is theoretically usable for the phylogenetic analysis of any eukaryotic metabolic network

A desnutrição proteica (DP) pode ocasionar alterações na matriz extracelular (MEC) de diferentes órgãos e tecidos, inclusive o hematopoético, com comprometimento funcional. Estudos do nosso laboratório demonstraram, em modelo murino de DP, aumento da expressão proteica de fibronectina (FN) no estroma medular ósseo in vivo, principalmente na região subendosteal (local de fixação da célula tronco progenitora hemopoética). Já in vitro, no estroma medular ósseo, observou-se tanto o aumento quanto a diminuição de FN e a presença de suas isoformas. Essas alterações de FN parecem estar envolvidas com a hipoplasia da medula óssea (MO) em camundongos desnutridos. As modificações quantitativas de FN podem ser devidas: (i) à ação das metaloproteinases de matriz (MMP) responsáveis pela degradação das proteínas da MEC; (ii) aos inibidores de metaloproteinases (TIMP) que regulam a degradação da MEC; (iii) às alterações transcricionais, reguladas pela via de AKT/mTOR, que controla os splicing alternativos na FN, resultando em isoformas dessa proteína; (iv) a processos pós-transcricionais modulados por LC3, que aumenta a tradução do RNAm de FN. Assim, o objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos que alteram o turnover de FN no estroma medular ósseo em modelo murino de DP. Utilizamos camundongos, C57BL/6J machos, adultos, separados em dois grupos: controle e desnutrido, alimentados, ad libitum, com ração contendo 12% e 2% de proteína, respectivamente. Após cinco semanas de indução à desnutrição os camundongos foram eutanasiados, e coletado o material biológico. Avaliamos: o estado nutricional, o hematológico, a histologia da MO femoral bem como a determinação imunohistoquímica da FN, MMP-2 e MMP-9, determinação da expressão de FN e suas isoformas em células totais da MO, o estabelecimento do estroma medular ósseo in vitro, por 28 e 35 dias de cultivo. A partir das culturas foram avaliadas a expressão de RNAm de FN e suas isoformas, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR e LC3α e β, quantificação de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ e IL-1β e determinação de LC3β e proteínas da via de AKT/mTOR. Não observamos alterações na expressão do RNAm de FN e suas isoformas ex vivo e in vitro, mas um aumento da deposição de FN na MO.Também não observamos modificações na imunolocalização de MMP-2 e MMP-9 na MO e na atividade dessas proteínas no sobrenadante de culturas de células estromais in vitro, mas houve aumento da expressão do RNAm de MMP-9 em 28 dias de cultivo. Não detectamos alterações na expressão de RNAm e na concentração de TIMP-1 e TIMP-2 no sobrenadante das culturas. Houve redução significativa de TNFα e TGFβ no sobrenadante das culturas de 28 dias. Observamos aumento da expressão do RNAm de mTOR em culturas de 28 dias e LC3α e LC3β em 35 dias de células estromais. Encontramos menor fosforilação de PI3K, AKT, PTEN, mTOR e mTOR total e aumento de LC3β em culturas de 28 dias, mas redução de LC3β em 35 dias. Em função dos dados inferimos que a DP conduz a alterações da FN que não estão relacionadas à ação de MMPs e TIMPs e sim a modificações de LC3β e da via de AKT/mTOR. / Protein malnutrition (PM) can lead changes in extracellular matrix (ECM) from several organs and tissues, including hematopoietic, with functional impairments. Research from our laboratory demonstrated, in a murine model of protein malnutrition, increase in proteic expression of fibronectin (FN) in vivo bone marrow stroma, principally in subendosteal region (attachment site of hematopoietic stem/progenitor cell - HSPC). It was observed as both an increase and a decrease in the presence of FN and its isoforms in vitro bone marrow stroma. These FN changes seem to be related to bone marrow (BM) hypoplasia in malnourished mice. Quantitative FN changes may be due to: (i) action of matrix metalloproteinases (MMP) responsible for ECM proteins degradation; (ii) tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) that regulate ECM degradation; (iii) transicional changes regulated by AKT/mTOR pathway, which controls alternative splicing in FN, resulting in isoforms from this protein; (iv) post-transcriptional processes modulated by LC3 that increases FN mRNA translation. Therefore, the aim of this study was to elucidade the mechanisms that changes the FN turnover in bone marrow stroma in a murine model of PM. C57BL/6J, adult and male mice were used and divided into two groups: control and malnourished, fed ad libitum with ration containing 12% and 2% of protein, respectively. After five weeks of induction malnutrition, mice were euthanized and the biological material was collected. We evaluated: nutritional and hematologic status, the femoral BM histology, immunohistochemistry determination of FN, MMP-2 and MMP-9, the FN and its isoforms expression determination in total BM cells, establishment of in vitro bone marrow stroma for 28 and 35 days of culture. From the cultures were evaluated FN mRNA expressions and its isoforms, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR, LC3α and β, quantification of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ and IL-1β and determination of LC3β and AKT/mTOR proteins. No changes were observed, ex vivo and in vitro, in the expression of FN mRNA and its isoforms, but there was a FN deposition increase in BM. We did not observe modifications in MMP-2 e MMP-9 immunolocalization in BM and in these proteins activity in the supernatant of in vitro stromal cell culture, but there was an increase in MMP-9 mRNA expression after 28 days of culture. We did not detect changes in mRNA and in TIMP-1 and TIMP-2 expressions in the supernatant of cultures. There was significant reduction of TNFα and TGFβ in the cultures supernatant of 28 days. We observed an increase of mTOR RNAm in 28 days cultures and also LC3α and LC3β in stromal cells with 35 days. We found lower phosphorylation of PI3K, AKT, PTEN, mTOR e total mTOR and an LC3β increase in 28 days cultures, yet an LC3β reduction in 35 days. According to the data we conclude that PM leads to FN changes that are not related to MMPs and TIMPs actions, but the LC3β and AKT/mTOR pathway modifications.

PTEN é um gene supressor de tumor, que resulta na proteína citoplasmática de mesmo nome, e possui a capacidade de modular a apoptose e o ciclo celular, assim como de inibir a migração celular. Por outro lado, o oncogene Akt promove a sobrevida celular e impede a apoptose. A ativação de Akt é inversamente relacionada com a ausência de PTEN em uma variedade de neoplasias malignas. Neste estudo, linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermóide bucal (HN6, HN30, HN31 e uma linhagem de células controle, HaCat) foram submetidas ao método de invasão in vitro e clones celulares altamente invasivos foram isolados. Através das técnicas de imunofluorescência e Western blot foi verificada a expressão de ambas as proteínas nos novos clones (denominados HN6.1, HN30.1, HN31.1 e HaCat.1) e comparada às linhagens controle. A técnica da zimografia também foi realizada, desde que várias metaloproteinases (MMPs) têm demonstrado possuir papel importante no processo de invasão e metástase dos CEB. Nossos resultados revelaram que todas as linhagens celulares e seus respectivos clones invasivos mostraram marcação citoplasmática e nuclear para PTEN e pAkt, respectivamente. A exceção foi a HaCat.1 que apresentou marcação predominantemente citoplasmática para pAkt. A análise do Western blot revelou que os clones invasivos expressam menor quantidade de PTEN, não significantes estatisticamente. Essa diminuição foi expressiva somente na linhagem HaCat.1 (p<0.05). Em relação ao pAkt, foi observado uma discreta superexpressão dessa proteína nas linhagens invasivas de CEB. Contrariamente, a linhagem HaCat.1 sofreu uma significante diminuição de pAkt (p<0,05). Finalmente, a zimografia mostrou um discreto aumento de MMP-2 latente e/ou um significante aumento de MMP-9 ativa em todos os clo nes invasivos. Nossos resultados sugerem que não há uma relação inversa consistente e significativa entre as proteínas PTEN e Akt no processo de invasão in vitro com células derivadas de CEB. Não há somente um padrão de sinalização PTEN-PI3K-Akt no processo de carcinogênese desta neoplasia. A linhagem celular HaCat.1 se comportou diferente das linhagens derivadas de CEB e provavelmente sofreu diferenciação. Um aumento estatisticamente significante de secreção de MMP-9 ativa foi observado em 2 das 3 linhagens de CEB estudadas / PTEN is a tumor suppressor gene that encodes a dual phosphates protein capable to modulate apoptosis and cell cycle and prevent cellular migration. On the other hand, Akt oncogene promotes both cell cycle progression and inhibits apoptosis. Akt activation is inversely correlated with PTEN lost in a variety of cancers. In this study, highly invasive clones of OSCC cell lines (HN6, HN30, HN31 and a control cell line, HaCat) were isolated using an in vitro assay method. The expression of both proteins in these cells was compared by immunofluorescence and western blot technique. The metalloproteinase activation was analyzed by gelatin zimography, since several MMPs have been shown to play an important role in the invasion and metastasis of OSCC. All OSCC cell lines and its new clones showed cytoplasmatic and nuclear staining for PTEN and pAkt, respectively. The western blot analysis revealed no significant decrease of PTEN expression in the most invasive clones (named HN6.1, HN30.1 and HN31.1). Only HaCat.1 had a significant decrease (p<0,05). However, there was no significant increase of Akt in the invasiveness clones and oppositely the expression of Akt was strongly reduced (p<0,05) in the HaCat.1. Finally, the zimography showed a discrete increase of inactive MMP-2 and/or a significant increase of active MMP-9 in all the most invasive cell lines. In conclusion, no correlation was seen between PTEN and pAkt in the process of invasion in vitro. There is not only a linear PTEN-PI3K-Akt pathway in OSCC. The HaCat.1 had a different behavior in relation to OSCC cell lines and probably allowed cellular differentiation. In addition, a significant increase of active MMP-9 was seen in 2 of 3 lines of cells derived from OSCC

Como neoplasia maligna que mais acomete a cavidade oral, o carcinoma epidermóide gera infinidade de estudos acerca de sua gênese e progressão. O variado perfil genético e protéico observado leva a freqüente insucesso nas terapias adotadas, contribuindo para pobres prognósticos. Este estudo visa compreender melhor o papel da proteína Akt, tida como chave para a proliferação de diversas neoplasias, frente ao estímulo das células derivadas de carcinoma epidermóide humano em cultura (HaCat, HN6, HN19, HN30, HN31) com EGF 10ng/ml e TGF &#946; 5ng/ml. Para tanto, analisou-se a expressão de pAkt, ciclina D1, Bad, caspase-3 e PTEN, através de imunofluorescência, western-blot e imunoprecipitação. Os resultados mostraram aumento da expressão de pAkt e ciclina D1 frente ao tratamento com EGF, bem como diminuição de Bad e PTEN, com exceção de HN31. A imunoprecipitação revelou neste caso que pAkt previne a apoptose através de inativação direta de Bad. Já nas células tratadas com TGF &#946; , obtivemos resultados diferentes do esperado para este supressor de tumor. A expressão de pAkt mostrou-se aumentada nas linhagens celulares, mas estável em HN19 e HN31. Ciclina D1 mostrou aumento em HN6 e HN30, manutenção em HaCat e HN19 e diminuição em HN31. HaCat mostrou queda dos níveis de caspase-3 e Bad, manutenção em HN6, aumento em HN30, aumento somente de Bad em HN31 e HN19 com níveis inalterados após o tratamento para ambas as proteínas. Estes achados sugerem o importante papel desempenhado pelo EGF nas linhagens de carcinoma epidermóide estudadas, e como esta via é importante candidata a ser visada em tratamentos quimioterápicos. A ação do TGF &#946; mostrou discrepâncias, revelando seu comportamento dúbio frente os diversos tipos celulares, e sugerindo possível relação entre este receptor e a via do pAkt, o que requer estudos mais apropriados. A baixa ocorrência de apoptose também reforça esta possibilidade, mostrando como a via do Akt é essencial para a progressão neoplásica e pode estar relacionada a mais eventos celulares do que já sabido. / Squamous cell carcinoma raises a great interest regarding carcinogenesis and its proliferative pathways, due to the high incidence and poor prognosis. The broad genetic and proteic profiles contribute to this poor prognosis. The present study aims to better comprehend the role played by pAkt, key protein for the development of many neoplasms. Cell lines derived from oral squamous cell carcinoma (HaCat, HN6, HN19, HN30 and HN31) were induced with 10ng/ml EGF and 5ng/ml TGF &#946; . The expressions of pAkt, cyclin D1, Bad, caspase-3 and PTEN were analyzed through immunofluorescence, western-blot and immunoprecipitation. Results showed higher pAkt and cyclin D1 expression after EGF treatment, as well as a decrease in Bad and PTEN levels, except for HN31. Immunoprecipitation revealed that pAkt prevents apoptosis through Bad direct inactivation. However, TGF &#946; treatment revealed different results, from what expected for this tumor supressor. pAkt expression revealed to be increased in all cells lines, but stable for HN19 and HN31. HaCat exhibited decreased levels of caspase-3 and Bad, which were unaltered in HN6, augmented in HN30. HN31 revealed only Bad increased levels, and no alterations in HN19. These findings suggest the crucial role played by EGF stimulation in the studied cell lines, and a good candidate to be targeted by chemotherapeutical approaches. TGF &#946; treatment showed discrepancies, revealing diverse behaviors in the different cell lines. An exhisting relation between TGF &#946; receptors and pAkt pathway may not be discharged, requiring further studies. The low occurrence of apoptosis reinforces this possibility, showing how important is Akt and related pathways for neoplastic progression, and its possible relation to cellular events not described to date.

O carcinoma de cabeça e pescoço é uma neoplasia maligna de origem epitelial que resulta em aproximadamente 500.000 novos casos por ano ao redor do mundo. Diversos estudos têm sido conduzidos de maneira a elucidar os mecanismos de proliferação e invasão desta doença, sendo a via de sinalização Akt/mTOR e proteínas relacionadas, apontada como uma das principais vias envolvidas em sua progressão. Sabe-se que células neoplásicas, bem como células de diferentes tecidos, podem ter seu comportamento modificado após terem sido irradiadas com laser em baixa intensidade (LLLT). Porém, os mecanismos de atuação da luz laser de baixa potência sobre estas células permanecem ainda não completamente esclarecidos. Portanto, o objetivo deste estudo foi o de analisar a viabilidade celular e expressão das proteínas Akt, pAkt, Hsp90, S6, pS6 e Ciclina D1 em duas linhagens celulares de carcinoma de boca (SCC9 e SCC25), bem como em uma linhagem de queratinócitos orais humanos com displasia (DOK) após irradiação com laser em baixa intensidade. O laser utilizado foi um diodo semicondutor de arseneto de Gálio e Alumínio (GaAlAs) operando nos comprimentos de onda vermelho (660nm) e infravermelho (780nm), com potência fixa em 40mW e três densidades de energia para cada comprimento de onda disponível: 2.05J/cm², 3.07J/cm² e 6.15J/cm². A análise de apoptose foi realizada por meio do teste de TUNEL e a expressão proteica foi obtida com imunofluorescência e western blotting. Após análise estatística por meio do método ANOVA dois critérios e testes de Tukey ou teste T de estudante, todos com nível de significância de 5%, pôde-se concluir que a LLLT induziu comportamentos distintos em cada uma das linhagens celulares utilizadas. Foi notado aumento, bem como diminuição da viabilidade celular, dependendo do comprimento de onda utilizado e das células irradiadas. A densidade de energia de 2.05J/cm² foi a que produziu efeitos mais significativos em SCC9. Para a linhagem celular SCC25, a dose mais relevante foi a de 3.07J/cm², enquanto que para a linhagem DOK, a dose de 6.15J/cm² causou efeitos mais proeminentes. Estas respectivas doses foram escolhidas para cada uma das linhagens para dar continuidade aos experimentos de Western Blotting e Imunofluorescência. Dentre os resultados mais relevantes obtidos com estas técnicas, pode-se citar a variação dos níveis de pS6 e Ciclina D1 para a linhagem DOK em determinados períodos. Já a linhagem SCC9 apresentou variação dos níveis de pAkt e Ciclina D1 nos períodos estudados. A linhagem SCC25 também teve as expressões de pAkt, pS6 e Ciclina D1 modificadas por LLLT. De maneira interessante, o aparecimento ou manutenção de uma isoforma de Hsp90 foi encontrado em SCC9 e SCC25 após irradiação laser. Por fim, a indução de apoptose foi detectada na linhagem SCC25. Em conclusão, pode-se dizer que a LLLT, como empregada neste estudo, foi capaz de aumentar a expressão de proteínas relacionadas à progressão e invasão em todas as linhagens estudadas. Além disso, a irradiação laser foi única, apesar de ter causado efeitos prolongados, algumas vezes até o último período estudado. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is an epithelial malignant neoplasm that accounts for approximately 500.000 new cases yearly around the world. Several studies have been conducted to elucidate the mechanisms of proliferation and invasion of this lesion, whereas the Akt/mTOR signaling pathway with its related proteins is being pointed out as one of the main pathways involved in HNSCC`s progression. Neoplastic cells, as well as cells that originate from different tissues may have their behavior modified by low level laser therapy (LLLT); however, the mechanisms through which the low level laser light interacts with these cells remain poorly understood. Thus, this study sought to evaluate the cell viability and the expression levels of Akt, pAkt, Hsp90, S6, pS6 and Cyclin D1 proteins in two oral squamous cell carcinoma cell lineages (SCC9 and SCC25) and in one oral dysplastic human keratinocyte cell line (DOK) after they had been treated with LLLT. The laser device was a semiconductor diode of Gallium and Aluminum Arsenate (GaAlAs), operating with wavelengths of 660nm (red) and 780nm (infrared), with a fixed power of 40mW and giving three different energy densities: 2.05J/cm², 3.07J/cm² and 6.15J/cm². Apoptosis was analyzed through TUNEL test and the protein expression was accessed with Immunofluorescence and Western blotting. After statistical analysis through two-way ANOVA and Tukey or Student`s T test, all of them with a level of significance of 5%, it was concluded that LLLT induced distinct behaviors to each of the studied cell lines. Increases and inhibitions in cell viabilities were detected depending on the wavelength and also on the irradiated cell line. The energy density of 2.05J/cm² produced the most significant findings over SCC9. On the other hand, in SCC25 the most relevant results were detected with 3.07J/cm², while the most prominent findings were seen with 6.15J/cm² when the cell line DOK was evaluated. In that way, these respective doses were chosen for each cell line to continue with Western blotting and Immunofluorescence. Among the most relevant findings, the variation of pS6 and Cyclin D1 levels can be cited for DOK in some evaluated periods. SCC9 presented both pAkt and Cyclin D1 variations in the studied periods. Besides that, SCC25 also had pAkt, pS6 and Cyclin D1 levels modified by LLLT. Interestingly, the appearance and maintenance of an Hsp90 isoform was found in SCC9 and SCC25 after laser irradiation. Moreover, the induction of apoptosis was detected for the SCC25 cell line. Finally, the LLLT employed herein was able to enhance the expression of proteins related to progression and invasion in all of the studied cell lines. In addition, there was a single laser irradiation, although it caused prolonged effects, sometimes through the latest evaluated period.

A disfunção cardíaca, decorrente de um prejuízo na contratilidade miocárdica, tem sido reconhecida como um fator importante que contribui para as altas taxas de mortalidade na sepse. Outro fato importante aponta para o envolvimento das calpaínas na inibição da via de sinalização PI3K/mTOR levando a uma diminuição potencial das taxas globais de síntese proteica através da redução da maquinaria de tradução disponível, o que reforça o envolvimento destes elementos na progressão da disfunção cardíaca na sepse. Metodologia: Foram utilizados camundongos da linhagem C57/BL6 para indução de sepse através da técnica de ligadura e perfuração do ceco separados em quatro grupos: controle com e sem tratamento e sepse moderada com e sem tratamento, o tratamento foi realizado 2 horas antes da cirurgia com inibidor da via mTOR, rapamicina. Foi realizada análise histopatológica em metacrilato e coloração picrosirius para colágeno, western blotting para quantificação da expressão proteica e real-time PCR para quantificação da expressão gênica, por fim realizamos análise funcional através da ecocardiografia. Resultados: Foi encontrado aumento das lesões teciduais e depósito de colágeno no grupo séptico tratado com rapamicina. A análise por western blotting e real-time PCR demonstrou redução das proteínas envolvidas na via mTOR nos grupos sépticos com e sem tratamento com ênfase no grupo tratado e por fim a avaliação funcional mostrou redução dos parâmetros débito cardíaco e fração de ejeção nos grupos sépticos com e sem tratamento. Conclusão: Nossos resultados demonstram que a via mTOR é de extrema importância na estrutura e função cardíacas, visto que sua inibição ocasionou o aumento de lesões e deposição de colágeno juntamente com alterações funcionais, podendo se transformar em um possível alvo terapêutico para futuras pesquisas clínicas em animais e humanos. / Cardiac dysfunction, due to impairment in myocardial contractility, has been recognized as an important factor contributing to the high mortality rates in sepsis. Another important fact is the involvement of the calpain in the inhibition of the PI3K / mTOR signaling pathway leading to a potential decrease in the overall rates of protein synthesis through the reduction of available translation machinery, which reinforces the involvement of these elements in the progression of cardiac dysfunction in sepsis. Methods: C57 / BL6 mice were used for induction of sepsis through the technique of ligation and perforation of the cecum separated into four groups: control with and without treatment and moderate sepsis with and without treatment, treatment was performed 2 hours before surgery with mTOR pathway inhibitor, rapamycin. Histopathological analysis was performed on methacrylate and picrosirius staining for collagen, western blotting for quantification of protein expression and real-time PCR for quantification of gene expression. Finally we performed functional analysis through echocardiography. Results: Increased tissue lesions and collagen deposition were found in the septic group treated with rapamycin. Western blotting and real-time PCR analysis showed reduction of the proteins involved in the mTOR pathway in the septic groups with and without treatment with emphasis in the treated group and finally the functional evaluation showed a reduction of the parameters cardiac output and ejection fraction in the septic groups with and without treatment. Conclusion: Our results demonstrate that the mTOR pathway is extremely important in cardiac structure and function, since its inhibition has resulted in increased lesions and collagen deposition along with functional alterations, and may become a possible therapeutic target for future clinical research in animals and humans.

O Celecoxib, antiinflamatório não esteroidal, inibidor seletivo da COX-2, tem se mostrado um importante agente anticarcinogênico, mas o seu papel no carcinoma epidermóide de boca (CEB) não é totalmente compreendido. Sabe-se que diversas alterações genéticas estão associadas à patogênese do CEB, a neoplasia maligna mais comum de cabeça e pescoço. Algumas dessas alterações comprometem proteínas pertencentes à via de sinalização do Akt, envolvida em diferentes fenômenos celulares. É sabido que Akt pode ativar o fator de transcrição NF-kB, o qual tem importante participação na fisiologia normal e no câncer. A proteína COX-2, descrita inicialmente em processos inflamatórios, está associada com a oncogênese e recentemente tem sido associada com a via de sinalização do Akt e com o NF-kB. Portanto, o objetivo deste estudo foi analisar o efeito do Celecoxib sobre linhagens celulares de carcinoma epidermóide de boca e verificar a localização intracelular e a expressão das proteínas pAkt, NF-kB e COX-2 em linhagens celulares de carcinoma epiermóide de boca após o tratamento com o Celecoxib.Através da técnica de imunofluorescência, foram analisados os padrões de expressão das proteínas pAkt, NFkB e COX-2 em quatro linhagens celulares de carcinoma epidermóide bucal submetidas ao tratamento com Celecoxib, cuja a dose e o tempo foram obtidos a partir de ensaios de viabilidade celular. Também se realizou ensaio de apoptose celular. Como controle utilizou-se células não tratadas com o medicamento. O Celecoxib na dose de 30 M por 24 horas causa apoptose.Na técnica de western blot, somente a linhagem SCC15 apresentou uma diminuição significativa para a COX-2. Entretanto, para p-Akt e NF-kB nenhuma alteração na expressão foi observada entre os grupos controle e tratado.Na imunofluorescência, houve alteração no padrão de expressão das proteínas pAkt, NF-kB e COX-2, quando se comparou os grupos contrele e tratado. Portanto, o Celecoxib pode ser um eficaz agente terapêutico, uma vez que demonstrou grande eficácia na inibição da proliferação celular de linhagens celulares de CEB. / Celecoxib, nonsteroidal anti-inflammatory COX-2 selective inhibitor, has proven to be an important anticancer agent. However its role in oral squamous cell carcinoma (OSCC) is not entirely understood. This is the most common malignancy of head and neck regionand it is known that various genetic alterations are associated with its pathogenesis. Some of these changes affect proteins belonging to the Akt signaling pathway, involved in different cellular processes. It is known that Akt can activate the transcription factor NF-kB, which has important role in normal physiology and cancer.The COX-2 proteinwas firstly described in the inflammatory processes, is associated with oncogenesis and has recently been related with the Akt signaling pathwayand with NF-kB. Therefore, the aim of this study was to analyze the effect of Celecoxib on squamous cell carcinoma cell lines and to determine pAkt, NF-kB and COX-2 intracellular localization and levels of expressionin this cell lines after treated with Celecoxib. By immunofluorescence, we analyzed the pAkt, NF-kB and COX-2 expression patterns in four oral squamous cell carcinoma cell lines treated with Celecoxib, which the dose and time were obtained from cell viability assays. Cellular apoptosis assay was also performed. As control the cells were not treated with this drug. Celecoxibcauses apoptosisin the dose of 30 M for 24 hours. In the western blottechnique, only the SCC15 cell line shows a significant decrease for COX-2. However, for p-Akt and NF-kB no change in expression was observed between control and treated groups. On immunofluorescence, there were changes in the pAkt, NFkB and COX-2protein expression pattern when the control group was compared with treated group. Therefore, the Celecoxib can be an effective therapeutic agent, since it has shown great efficacy in thecelular proliferation inhibition of the OSCC cell lines.

O processo da carcinogênese é provocado por múltiplos estágios, envolvendo desordens potencialmente malignas, iniciação, invasão, progressão e metástase. O prognóstico do carcinoma epidermoide de boca (CEB) ainda permanece desfavorável devido ao diagnóstico tardio. Para mitigar esta complicação, biomarcadores tem sido utilizados para ajudar no diagnóstico precoce e entender melhor a influência sobre a carcinogênese oral, onde vias de sinalização são ativadas, principalmente a PI3K/AKT. MIF foi relacionada a progressão de diversos tipos cânceres, porém pouco se sabe seu papel na evolução do CEB. Por isso, o objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar através do padrão de expressão imuno-histoquímico proteínas participantes da via de sinalização de PI3K/AKT: AKT1 e PAKT e sua associação com a expressão de MIF em fragmento de mucosa, hiperqueratose sem e com displasia e CEB correlacionando com a progressão da doença e características clinico-demográficos. Foram utilizados 73 blocos de parafina, avaliados quanto à porcentagem da expressão de cada marcador e coletados os dados clínicos epidemiológicos referentes para correlaciona-los à imunomarcação. A imunonopositividade ocorreu nos casos de mucosa normal, sem e com displasia e CEB. Nos casos de mucosa normal foram positivos para PAKT (50%), AKT (60%), MIF (80%). Em sem displasia, foi observado imunomarcação para PAKT (50%) e MIF (50%). Com displasia houve marcação PAKT (81,81%) e MIF (81%). Nos espécimes de CEB ocorreu em PAKT(100%), AKT (95,23%) e MIF (90,5%). Todos os anticorpos tiveram alta expressão no CEB em comparação com a mucosa normal (p<0,0001), sem displasia (p<0,0001) e com displasia (p<0,0001). Observou-se também influência sobre o fator de risco como tabagismo, etilismo e etnia, respectivamente para os grupos sem displasia, CEB e com displasia. Assim, estas proteínas podem ser consideradas potenciais marcadores preditores do CEB. / The carcinogenesis process is caused by multiple stages, involving potentially malignant disorders, initiation, invasion, progression and metastasis. The prognosis of squamous cell carcinoma (CEB) remains unfavorable due to late diagnosis. To mitigate this complication, biomarkers have been used to aid in early diagnosis and better understand the influence on oral carcinogenesis, which are activated signaling pathways, particularly PI3K / AKT. MIF was related to progression of many types cancers, but its role in the evolution of CEB is little known. Therefore, the aim of this study was to identify and characterize by the expression pattern of immunohistochemical participants proteins signaling pathway PI3K / AKT: AKT1 and PAKT and its association with MIF expression in normal mucosa, hyperkeratosis with and without dysplasia and CEB correlating with the progression of the disease and clinical and demographic characteristics. 73 paraffin blocks were used, in which evaluated the percentage of expression of each marker and collected epidemiological clinical data to correlate them to immunostaining. The imunonopositividade occurred in cases of normal mucosa, hyperkeratosis with and without dysplasia. In cases of normal mucosa were positive for PAKT (50%), AKT (60%), MIF (80%). In no dysplasia, immunostaining was observed PAKT (50%) and MIF (50%). With dysplasia was marking PAKT (81.81%) and MIF (81%). In CEB specimens occurred in PAKT (100%), AKT (95.23%) and MIF (90.5%). All antibodies had high expression in the CEB compared to normal mucosa (p <0.0001) without dysplasia (p <0.0001), and dysplasia (p <0.0001). It was also observed influence on the risk factors such as smoking, alcohol consumption and the ethnicity, respectively, for with dysplasia groups, CEB and without dysplasia. Thus, these proteins can be considered potential early diagnostic markers of CEB.