A Doença de Alzheimer (DA) é o tipo mais comum de demência em idosos, a etiologia é multifatorial e a fisiopatologia da doença é complexa, com um novo caso acontecendo a cada sete segundos; globalmente, a doença está se tornando em uma lenta pandemia. Bioquimicamente, a DA é caracterizada pela presença das placas neuríticas (PNs) e os novelos neurofibrilares (NNFs). O peptídeo beta peptide1-42 (A?(1-42)) é o principal componente das placas neuríticas e tem sido fortemente associado ao estresse oxidativo, desregulação colinérgica e morte celular. Os múltiplos mecanismos envolvidos na patogênese criam consideráveis dificuldades para identificar alvos terapêuticos apropriados. As abordagens terapêuticas atuais melhoram temporariamente os sintomas da DA; no entanto, apesar de esforços intensivos, nenhum dos tratamentos disponíveis hoje conseguiu alterar o curso da doença. Porém, algumas das terapias mais relevantes para o tratamento da doença estão baseadas na atividade inibidora da acetilcolinesterase (AChE). Nos últimos anos, os alcaloides pertencentes à família Amaryllidaceae têm recebido muita atenção devido à atividade anticolinérgica e antioxidante. A galantamina foi o primeiro alcaloide isolado a partir de diferentes espécies de Amaryllidaceas e é o mais recente inibidor da AChE aprovado para o tratamento sintomático da DA. Este fato tem motivado a pesquisa de outros alcaloides como possíveis moduladores da doença em adição à atividade inibitória da AChE. Diante disso, o objetivo deste estudo foi investigar se o extrato de Caliphruria subedentata e a galantamina modulam a neurotoxicidade induzida pelo A?(1-42) na linhagem celular SH-SY5Y indiferenciada. Para compreender os mecanismos de neuroproteção, um conjunto de ensaios foi realizado tais como atividade inibitória da AChE, ensaios clonogênico, micronúcleos com bloqueio na citocinese celular (CBMNcyt), cometa; análises por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e de metilação. Os resultados mostraram que tanto o extrato quanto a galantamina diminuíram significativamente a citotoxicidade e genotoxicidade induzida pelo A?(1-42). Além disso, ambos os tratamentos modularam alterações morfológicas mitocondriais induzidas pelo peptídeo. Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram que, em adição à atividade inibitória da AChE, tanto o extrato de C. subedentata quanto a galantamina exercem propriedades antigenotóxicas. Essas propriedades relevantes da Amaryllidaceaes e o fármaco tornam-se um potencial valioso para continuar sendo explorado. / Alzheimer´s disease (AD) is the most common type of dementia in elderly population, the etiology is multifactorial and the pathophysiology of the disease is complex, with a new case occurring every seven seconds; globally, the disease itself is becoming a slowly pandemic. Biochemically, the AD is characterized by presence of the neuritic plaques and neurofibrillary tangles. Amyloid beta peptide1-42 (A?(1-42)) is the principal component of neuritic plaques and it has been strongly associated with oxidative stress, cholinergic deregulation and cell death. The multiple mechanisms involved in the pathogenesis create considerable difficulty to identify appropriate targets. The current therapeutics approaches for AD improve temporally the symptoms; and despite intensive efforts, none of the treatments available today alter the course of disease. Nervertheless, some of the most relevant therapies for the treatment of disease are based on acetylcholinesterase (AChE) inhibitor activity. In recent years, alkaloids belonging Amaryllidaceae family have received great attention due to the well-known anticholinergic and antioxidant activity and the galanthamine was the first alkaloid isolated from different species of Amaryllidacea and it is the most recently AChE inhibitor approved for the symptomatic treatment of AD. This fact has motivated the screening of other alkaloids as possible modulators of disease in addition acetylcholinesterase activity. Purpose this study was to investigate whether C. subedentata extract and galanthamine modulate A?(1-42)- induced neurotoxicity in the undifferentiated SH-SY5Y cell line. To understand the mechanisms of the neuroprotection, a set of biomarkers such as AChE activity, clonogenic, cytokinesis block micronucleus cytome (CBMNcyt) and comet assays; beside transmission electron microscope (TEM) and methylation analyses were realized. The results showed that C. subedentata extract and galanthamine were capable to significantly reduce the A?(1-42)- induced cytotoxicity and genotoxicity. Furthermore both treatments modulated A?(1-42)- induced mitochondrial morphological alterations. In conclusion, this study demonstrated that in addition to inhibition of acetylcholinesterase (AChE), the extract of C. subedentata and galanthamine exert antigenotoxic properties. This relevant property of Amaryllidaceaes and galanthamine are worthwhile exploring further which may improve the development of new diseases-modifying agents.

S'ha desenvolupat una nova estratègia per la síntesi ràpida i eficient de L-[metil-11C]metionina basada en el captive solvent method. La reacció de L-homocisteína (dissolució bàsica en aigua/etanol 1:1) amb [11C]CH3I en un loop de HPLC va permetre la formació del radiotraçador desitjat amb elevat rendiment radioquímic (38.4 ± 4.1%) en un temps curt (< 12 min). Tots el paràmetres analítics compleixen les especificacions requerides per la versió actual de la Farmacopea Espanyola, tot i que els valors d'activitat específica obtinguts van ser relativament baixos. Degut a això, es van estudiar i quantificar les principals fonts que contribueixen a la contaminació de carboni-12 durant les síntesis de [11C]CH3I efectuades segons el "wet" method. Es va observar que la principal font de contaminació de CO2 no radioactiu (contribució>90%) és el propi procés de bombardeig, probablement degut a la combustió (causada per les altes temperatures i pressions assolides durant la irradiació) dels compostos que contenen carboni i que es troben al gas irradiat (o a l'interior del blanc). Es van establir procediments generals per realitzar abans, durant i després de la radiosíntesi per prevenir la contaminació exterior i, d'aquesta manera, augmentar l'activitat específica dels radiotraçadors sintetitzats.En quant al marcatge amb nitrogen-13, s'ha desenvolupat un procés totalment automàtic per a la producció de [13N]NO2- a partir de [13N]NO3- generat en el ciclotró. El precursor radioactiu [13N]NO2- s'ha utilitzat per la radiosíntesi de compostos amb interès biològic com ara S-nitrosotiols (donadors de NO.), N-nitrosamines (molècules amb potencials efectes carcinogènics) i azo compostos (amb possible aplicació com a radiotraçadors per a la detecció in vivo de plaques de &#946;-amiloide). En tots els casos es van obtenir excel·lents conversions radioquímiques (48.7% - 74.5% per S-[13N]nitrosotiols, 45.6% - 53.4% per N-[13N]nitrosamines i 40.0% - 58.3% per 13N-azo compostos) i bons rendiments radioquímics (33.8% - 60.6% per S-[13N]nitrosotiols, 34.0% - 37.8% per N-[13N]nitrosamines i 20.4% - 47.2% per 13N-azo compostos). A més a més, s'ha dissenyat i implementat un mòdul automàtic amb control remot pel marcatge de molècules amb 13N. / Se ha desarrollado una nueva estrategia para la síntesis rápida y eficiente de L-[metil-11C]metionina basada en el captive solvent method. La reacción de L-homocisteína (disolución básica en agua/etanol 1:1) con [11C]CH3I en un loop de HPLC permitió la formación del radiotrazador deseado con elevado rendimiento radioquímico (38.4 ± 4.1%) en un tiempo corto (< 12 min). Todos los parámetros analíticos cumplían las especificaciones requeridas por la versión actual de la Farmacopea Española, aunque los valores de actividad específica obtenidos fueron relativamente bajos. Por ello, se estudiaron y cuantificaron las principales fuentes que contribuyen a la contaminación de carbono-12 durante las síntesis de [11C]CH3I efectuadas según el "wet" method. Se observó que la principal fuente de contaminación de CO2 no radiactivo (contribución>90%) es el propio proceso de bombardeo, probablemente debido a la combustión (causada por las altas temperaturas y presiones alcanzadas durante la irradiación) de los compuestos que contienen carbono y que se encuentran presentes en el gas irradiado (o en el mismo cuerpo del blanco). Se establecieron procedimientos generales para realizar antes, durante y con posterioridad a la radiosíntesis para prevenir la contaminación exterior y, de esta manera, aumentar la actividad específica de los radiotrazadores sintetizados.Respecto al marcaje con nitrógeno-13, se ha desarrollado un proceso totalmente automático para la producción de [13N]NO2- a partir del [13N]NO3- generado en el ciclotrón. El precursor radiactivo [13N]NO2- se ha utilizado para la radiosíntesis de compuestos con interés biológico tales como S-nitrosotioles (donadores de NO.), N-nitrosaminas (moléculas con potenciales efectos carcinogénicos) y azo compuestos (con posible aplicación como radiotrazadores para la detección in vivo de placas de &#946;-amiloide). En todos los casos se obtuvieron excelentes conversiones radioquímicas (48.7% - 74.5% para S-[13N]nitrosotioles, 45.6% - 53.4% para N-[13N]nitrosaminas y 40.0% - 58.3% para 13N-azo compuestos) y buenos rendimientos radioquímicos (33.8% - 60.6% para S-[13N]nitrosotioles, 34.0% - 37.8% para N-[13N]nitrosaminas y 20.4% - 47.2% para 13N-azo compuestos). Además, se ha diseñado e implementado un módulo automático con control remoto para el marcaje de moléculas con 13N. / A new strategy for the fast and efficient synthesis of L-[methyl-11C]methionine based on the captive solvent method has been developed. The in loop reaction of a basic water/ethanol 1:1 solution of L-homocysteine with [11C]CH3I led to the formation of the desired radiotracer with high radiochemical yield (38.4 ± 4.1%) in short production time (< 12 min). All analytical parameters were within the specifications of the current version of the Spanish Pharmacopoeia, although specific radioactivity values were relatively low. Thus, the main sources of carbon-12 during the synthesis of [11C]CH3I by the "wet" method were studied and the contribution attributable to each individual source was quantified. The most relevant contamination of non-radioactive CO2 (contribution>90%) was shown to be generated during the bombardment process, probably due to the combustion (caused by high temperature and pressure during irradiation) of carbon carrier compounds present in the irradiated gas (or target body). General procedures to be performed before, during and after the radiosynthesis were established to prevent external contamination and to improve the specific radioactivity of 11C-labeled radiotracers synthesized from [11C]CH3I produced via the "wet" method. Concerning 13N-labeling, a fully automatic process for the production of [13N]NO2- from cyclotron generated [13N]NO3- has been developed. The radioactive precursor [13N]NO2- has been used for the synthesis of biologically interesting 13N-labeled compounds such as S-nitrosothiols (well-known NO. donors), N-nitrosamines (molecules with potent carcinogenic effects) and azo compounds (with putative application as imaging probes for in vivo detection of &#946;-amyloid plaques). In all cases, excellent radiochemical conversion (48.7% - 74.5% for S-[13N]nitrosothiols, 45.6% - 53.4% for N-[13N]nitrosamines and 40.0% - 58.3% for 13N-labeled azo compounds) and good radiochemical yields (33.8% - 60.6% for S-[13N]nitrosothiols, 34.0% - 37.8% for N-[13N]nitrosamines and 20.4% - 47.2% for 13N-labeled azo compounds) were achieved. An automatic remote controlled synthesis module for the preparation of 13N-labeled structures has been designed and implemented.

A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência na população idosa e tende a se tornar um grave problema de saúde pública com o aumento da expectativa de vida da população mundial. A perda progressiva de memória, principal sintoma da demência em pacientes com DA, é atribuída a danos sinápticos e à perda neuronal desencadeadas pelo desequilíbrio entre a produção e a depuração do peptídeo A?. Evidências surgidas nos últimos 20 anos apontam os oligômeros solúveis de A? (A?O), produtos de agregação do peptídeo A?, como as principais espécies neurotóxicas na DA. Por conta disso, e também pela ausência de métodos diagnósticos pre-mortem e tratamento eficientes para essa demência, a busca por anticorpos conformacionais específicos para A?O está em ascensão. Testes clínicos com IgG anti-A? resultaram em efeitos colaterais inflamatórios mediados pela porção não variável Fc. Então, anticorpos conformacionais artificiais do tipo scFv, desprovidos de porção Fc, foram selecionados contra A?O. Dentre eles, está NUsc1, que é neuroprotetor contra A?O em cultura primária de neurônios. Neste trabalho, avaliamos a toxicidade de A?Os na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada em neurônios maduros e comparamos a neuroproteção conferida por diferentes anticorpos contra A?Os, por ensaio de viabilidade celular com MTT. Também avaliamos a especificidade de NUsc1 por A?O comparativamente a lisozima monomérica e oligomérica em ensaio de ELISA, já que outros anticorpos conformacionais reconhecem epítopo compartilhado por estados oligoméricos de outras proteínas amiloidogênicas. Para a validação de células SH-SY5Y como modelo in vitro de neurônios maduros, a diferenciação foi induzida com ácido retinoico e BDNF e as células foram marcadas para as proteínas MAP2 e NeuN em ensaio de imunofluorescência. Células submetidas ao protocolo de diferenciação apresentaram aumento dos níveis dessas proteínas, mudança morfológica condizente com o esperado na maturação neuronal. Posteriormente, o desafio da cultura com A?O indicou morte celular dose-dependente e reversão desta morte segundo a dose administrada dos anticorpos 6E10 e NU-4. Obtivemos um sinal cerca de 400 vezes maior no reconhecimento de A?O por NUsc1 que para oligômeros de lisozima, quando presentes na mesma concentração, indicando forte especificidade de NUsc1 por A?O. Além disso, NUsc1 purificado em sistema de gelfiltração em HPLC não apresenta citotoxicidade em concentração equivalente a dos anticorpos 6E10 e NU-4 em ensaios de neuroproteção em cultura de SH-SY5Y diferenciada, sugerindo que, se NUsc1 for tão eficiente quanto estas IgG\'s, este poderá ser usado em dose não citotóxica. Portanto, podemos concluir que NUsc1 apresenta grande potencial como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA, mas que mais experimentos para expandir sua validação e potencial ainda são necessários. / Alzheimer\'s Disease (AD) is the leading cause of dementia in the elderly population and tends to become a serious public health problem with increasing life expectancy of the world\'s population. Progressive memory loss, the main symptom of dementia in patients with AD, is attributed to synaptic damage and neuronal loss triggered by imbalance between production and clearance of the A? peptide. Evidence from the last 20 years indicates that soluble A? oligomers (A?O), A? peptide aggregation products, as the main neurotoxic species in AD. Because of this, and also because of the absence of efficient pre-mortem diagnostic and treatment methods for this dementia, the search for conformational antibodies specific for A?O is on the rise. Clinical tests with anti-A? IgG\'s resulted in inflammatory side effects mediated by the non-variable Fc portion. Then, artificial conformational antibodies of the scFv type, lacking the Fc portion, were selected against A?O. Among them is NUsc1, which is neuroprotective against A?O in primary neuronal culture. In this work, we evaluated the toxicity of A?Os in the differentiated SH-SY5Y human neuroblastoma line in mature neurons and compared the neuroprotection conferred by different antibodies against A?O types by MTT cell viability assay. We also evaluated the specificity of NUsc1 for A?O compared to monomeric and oligomeric lysozyme in the ELISA assay, since other conformational antibodies recognize epitope shared by oligomeric states of other amyloidogenic proteins. For the validation of SH-SY5Y cells as an in vitro model of mature neurons, differentiation was induced with retinoic acid and BDNF and the cells were labeled for MAP2 and NeuN proteins in immunofluorescence assay. Cells submitted to the differentiation protocol presented increased levels of these proteins, a morphological change consistent with the expected neuronal maturation. Subsequently, the challenge of culture with A?O indicated dose-dependent cell death and reversion of this death according to the administered dose of 6E10 and NU-4 antibodies. We obtained a 400-fold higher signal in the recognition of A?O by NUsc1 than for lysozyme oligomers, when present at the same concentration, indicating strong specificity of A?O by NUsc1. In addition, NUsc1 purified on HPLC gel-filtration system does not exhibit cytotoxicity at concentration equivalent to 6E10 and NU-4 antibodies in neuroprotection assays in differentiated SH-SY5Y culture, suggesting that, if NUsc1 is as efficient as these IgG\'s, it may be used in a non-cytotoxic dose. Therefore, we can conclude that NUsc1 presents great potential as a diagnostic and therapeutic tool for AD, but that further experiments to expand its validation and potential are still necessary.

A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência na população idosa e tende a se tornar um grave problema de saúde pública com o aumento da expectativa de vida da população mundial. A perda progressiva de memória, principal sintoma da demência em pacientes com DA, é atribuída a danos sinápticos e à perda neuronal desencadeadas pelo desequilíbrio entre a produção e a depuração do peptídeo A?. Evidências surgidas nos últimos 20 anos apontam os oligômeros solúveis de A? (A?O), produtos de agregação do peptídeo A?, como as principais espécies neurotóxicas na DA. Por conta disso, e também pela ausência de métodos diagnósticos pre-mortem e tratamento eficientes para essa demência, a busca por anticorpos conformacionais específicos para A?O está em ascensão. Testes clínicos com IgG anti-A? resultaram em efeitos colaterais inflamatórios mediados pela porção não variável Fc. Então, anticorpos conformacionais artificiais do tipo scFv, desprovidos de porção Fc, foram selecionados contra A?O. Dentre eles, está NUsc1, que é neuroprotetor contra A?O em cultura primária de neurônios. Neste trabalho, avaliamos a toxicidade de A?Os na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada em neurônios maduros e comparamos a neuroproteção conferida por diferentes anticorpos contra A?Os, por ensaio de viabilidade celular com MTT. Também avaliamos a especificidade de NUsc1 por A?O comparativamente a lisozima monomérica e oligomérica em ensaio de ELISA, já que outros anticorpos conformacionais reconhecem epítopo compartilhado por estados oligoméricos de outras proteínas amiloidogênicas. Para a validação de células SH-SY5Y como modelo in vitro de neurônios maduros, a diferenciação foi induzida com ácido retinoico e BDNF e as células foram marcadas para as proteínas MAP2 e NeuN em ensaio de imunofluorescência. Células submetidas ao protocolo de diferenciação apresentaram aumento dos níveis dessas proteínas, mudança morfológica condizente com o esperado na maturação neuronal. Posteriormente, o desafio da cultura com A?O indicou morte celular dose-dependente e reversão desta morte segundo a dose administrada dos anticorpos 6E10 e NU-4. Obtivemos um sinal cerca de 400 vezes maior no reconhecimento de A?O por NUsc1 que para oligômeros de lisozima, quando presentes na mesma concentração, indicando forte especificidade de NUsc1 por A?O. Além disso, NUsc1 purificado em sistema de gelfiltração em HPLC não apresenta citotoxicidade em concentração equivalente a dos anticorpos 6E10 e NU-4 em ensaios de neuroproteção em cultura de SH-SY5Y diferenciada, sugerindo que, se NUsc1 for tão eficiente quanto estas IgG\'s, este poderá ser usado em dose não citotóxica. Portanto, podemos concluir que NUsc1 apresenta grande potencial como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA, mas que mais experimentos para expandir sua validação e potencial ainda são necessários. / Alzheimer\'s Disease (AD) is the leading cause of dementia in the elderly population and tends to become a serious public health problem with increasing life expectancy of the world\'s population. Progressive memory loss, the main symptom of dementia in patients with AD, is attributed to synaptic damage and neuronal loss triggered by imbalance between production and clearance of the A? peptide. Evidence from the last 20 years indicates that soluble A? oligomers (A?O), A? peptide aggregation products, as the main neurotoxic species in AD. Because of this, and also because of the absence of efficient pre-mortem diagnostic and treatment methods for this dementia, the search for conformational antibodies specific for A?O is on the rise. Clinical tests with anti-A? IgG\'s resulted in inflammatory side effects mediated by the non-variable Fc portion. Then, artificial conformational antibodies of the scFv type, lacking the Fc portion, were selected against A?O. Among them is NUsc1, which is neuroprotective against A?O in primary neuronal culture. In this work, we evaluated the toxicity of A?Os in the differentiated SH-SY5Y human neuroblastoma line in mature neurons and compared the neuroprotection conferred by different antibodies against A?O types by MTT cell viability assay. We also evaluated the specificity of NUsc1 for A?O compared to monomeric and oligomeric lysozyme in the ELISA assay, since other conformational antibodies recognize epitope shared by oligomeric states of other amyloidogenic proteins. For the validation of SH-SY5Y cells as an in vitro model of mature neurons, differentiation was induced with retinoic acid and BDNF and the cells were labeled for MAP2 and NeuN proteins in immunofluorescence assay. Cells submitted to the differentiation protocol presented increased levels of these proteins, a morphological change consistent with the expected neuronal maturation. Subsequently, the challenge of culture with A?O indicated dose-dependent cell death and reversion of this death according to the administered dose of 6E10 and NU-4 antibodies. We obtained a 400-fold higher signal in the recognition of A?O by NUsc1 than for lysozyme oligomers, when present at the same concentration, indicating strong specificity of A?O by NUsc1. In addition, NUsc1 purified on HPLC gel-filtration system does not exhibit cytotoxicity at concentration equivalent to 6E10 and NU-4 antibodies in neuroprotection assays in differentiated SH-SY5Y culture, suggesting that, if NUsc1 is as efficient as these IgG\'s, it may be used in a non-cytotoxic dose. Therefore, we can conclude that NUsc1 presents great potential as a diagnostic and therapeutic tool for AD, but that further experiments to expand its validation and potential are still necessary.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Memory is considered to be a process that has several stages, including acquisition, consolidation and retrieval. Memory impairment occurs when important synapses are modified. Alzheimer s disease (DA) is the most common cause of dementia. DA is characterized by cognitive damage, accumulation of the pathogenic amyloid-β (Aβ) peptide, and cholinergic dysfunction. Moreover, oxidative stress is associated with DA. Therapies used for dementia are still palliative rather than curative. Consequently, new therapies are urgently required. Biological effects of tellurium compounds have been studied, leading to a set of interesting and promising applications. Accordingly, 2-phenylethinyl-butyltellurium (PEBT), an organotellurium compound, has been reported as antioxidant. The purpose of this study was to characterize PEBT as a promising alternative for memory improvement and prevention of cognitive deficits, using experimental models of DA in mice. Initially, the present study was conducted to evaluate the effect of a single oral administration (p.o.) of PEBT at a dose of 10 mg/kg on memory, employing the step-down inhibitory avoidance task. PEBT administered 1 h before training, immediately after training or 1 h before the test session of the step-down inhibitory avoidance task increased the step-down latency time in comparison to the control mice, improving acquisition, consolidation, and retrieval of memory, respectively. The glutamate uptake, but not glutamate release, by cerebral cortex and hippocampal slices of mice was inhibited after 1 h of treatment with PEBT. After 24 h of PEBT exposure, the inhibition of cerebral cortex glutamate uptake disappeared. The improvement of memory by PEBT seems most likely to be mediated through an interaction with the amino acid transporters of the glutamatergic system. Thereafter, a subchronic PEBT treatment (1 mg/kg, p.o., for 10 days) after injection of Aβ(25-35) (3 nmol/3 μl/per site, intracerebroventricular) reversed Aβ-induced learning and memory deficits in the Morris water maze and step-down inhibitory avoidance tasks. In addition, PEBT (10 mg/kg, p.o.), administered 30 min before scopolamine (1 mg/kg, intraperitoneal), ameliorated memory deficit induced by this amnesic agent in the Morris water maze. Further, scopolamine was given 30 min before training and test or immediately post-training of step-down inhibitory avoidance task, inducing damage on acquisition, retrieval, and consolidation of memory, respectively. PEBT, administered 30 min before scopolamine, improved consolidation and retrieval stages, but not acquisition. General locomotor and exploratory activities, evaluated in the open-field test, were similar in all mice. Finally, the antiapoptotic effect of PEBT was evaluated. Human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19 cell line) were exposed to in vitro oxidative stress by 10 ng/ml tumor necrosis factor-α and 600 μM H2O2. One hour PEBT incubation at concentrations of 7.5 and 10 μM attenuated the apoptosis induced by oxidative stress. This effect lasted up to 6 hours after oxidative stress induction. PEBT (5 and 10 μM) inhibited oxidative stress-induced poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage and restored extracellular-signal-related kinase (ERK) phosphorylation decreased by oxidative stress. The protective mechanism exerted by PEBT against oxidative stress may involve PARP cleavage, regulation of ERK pathway, as well as its known antioxidant properties. In conclusion, the finds of the present thesis point out the ameliorative effect of PEBT on memory stages (acquisition, consolidation and retrieval). Likewise, PEBT improved memory impairment in mice. These effects seem to be due to strengthen the physiological glutamatergic tonus by PEBT and the antiapoptotic effect of PEBT. Therefore, PEBT could be considered a candidate for the prevention of memory deficits such as those observed in DA. / memória inclui pelo menos três tipos de processamento relacionados entre si: aquisição, consolidação e evocação. A memória é afetada quando as sinapses encarregadas de fazer ou evocar memórias encontram-se alteradas. A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência. A DA é caracterizada por danos cognitivos, acúmulo de peptídeo β-amiloide (Aβ) e disfunção colinérgica. Além disso, o estresse oxidativo está associado à DA. Uma vez que ainda não há cura para a DA e as terapias atuais são apenas paliativas, torna-se importante a busca de novos compostos para melhorar danos cognitivos. Com o estudo dos efeitos biológicos de compostos de telúrio, muitas aplicações estão sendo descobertas. Neste sentido, o composto orgânico de telúrio 2-feniletinil-butiltelúrio (PEBT) apresenta efeito antioxidante. O objetivo deste estudo foi caracterizar o PEBT como uma alternativa promissora para a melhora e prevenção de danos cognitivos, usando modelos experimentais da DA em camundongos. Primeiramente, avaliou-se o efeito de uma única dose oral (p.o) de PEBT (10 mg/kg) na memória, utilizando a tarefa da esquiva inibitória. O tratamento com PEBT 1 h antes do treino, imediatamente após o treino ou 1 h antes do teste da esquiva inibitória aumentou a latência comparada com os animais controles, melhorando a aquisição, consolidação e evocação da memória, respectivamente. A captação de glutamato, mas não a liberação deste neurotrasmissor, foi inibida em córtex e hipocampo de camundongos após 1 h de tratamento com PEBT. Após 24 h, a inibição da captação de glutamato no córtex não foi mais evidenciada. A melhora da memória causada pelo PEBT parece ser mediada através da interação com os transportadores de glutamato. Além disso, o tratamento subcrônico com PEBT (1 mg/kg, p.o., por 10 dias) após a injeção de Aβ(25-35) (3 nmol/3 μl/per site, intracerebroventricular) reverteu o prejuízo no aprendizado e na memória causados por Aβ nas tarefas do labirinto aquático de Morris e na esquiva inibitória. O PEBT (10 mg/kg, p.o.), adminstrado 30 min antes da escopolamina (1 mg/kg, intraperitoneal), também protegeu do dano de memória causado por este agente anticolinérgico no labirinto aquático de Morris. Quando a escopolamina foi administrada 30 min antes do treino ou teste, ou imediatamente após o treino da esquiva inibitória houve dano na aquisição, evocação e consolidação da memória, respectivamente. O PEBT, administrado 30 min antes da escopolamina, protegeu do dano na consolidação e evocação da memória, mas não na aquisição. Não houve diferença nas atividades locomotora e exploratória dos animais tratados com o PEBT no teste do campo aberto. Finalmente, o efeito antiapoptótico do PEBT foi avaliado. Células do epitélio pigmentado da retina humana (linhagem ARPE-19) foram expostas ao estresse oxidativo induzido pelo fator de necrose tumoral-α (10 ng/ml) e H2O2 (600 μM). O PEBT (7.5 e 10 μM), quando pré-incubado por 1 h, protegeu contra a apoptose induzida pelo estresse oxidativo e este efeito permaneceu até 6 h após a indução. O PEBT (5 e 10 μM) inibiu a clivagem da poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) induzida por estresse oxidativo e, também, restaurou a fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular (ERK). O efeito protetor do PEBT contra o estresse oxidativo parece envolver a clivagem da PARP e a regulação da fosforilaçao de ERK, além de sua atividade antioxidante. Nesse sentido, os resultados apresentados nesta tese destacam o efeito do PEBT na melhora das três fases da memória, bem como em modelos de dano cognitivos em camundongos. Estes resultados parecem estar relacionados ao aumento do tônus glutamatérgico causado pelo PEBT e seu efeito antiapoptótico. Assim sendo, estes dados sugerem que o PEBT poderá, futuramente, ser considerado candidato para a prevenção de danos de memória, como aqueles observados na DA.

En aquest treball de tesis doctoral s'estudia el paper de l'estrès oxidatiu tant a la etiologia com a la patofisiologia del dany vascular associat a la malaltia d'Alzheimer. Es demostra la capacitat de les cèl·lules musculars llises vasculars de produir pèptid &#946;-amiloide (A&#946;). L'estrès oxidatiu associat a edats avançades, estimula el processament amiloidogènic de l' APP a cèl·lules musculars llises vasculars portant a un augment de producció d' A&#946;1-40 i A&#946;1-42 contribuint així, a la formació dels depòsits amiloides vasculars. Alhora, els depòsits amiloides vasculars indueixen dany vascular a través d'estrès oxidatiu, a on la nitrotirosinació de proteïnes juga un paper clau en la inactivació d'enzimes essencials per la viabilitat cel·lular. La vitamina E i els estrogens tenen un efecte protector a neurones i cèl·lules musculars llises vasculars mentre que la vitamina E, però no els estrogens, és capaç de protegir les cèl·lules endotelials davant la toxicitat induïda pel pèptid A&#946;. / In this thesis we study the effect of oxidative stress in the etiology and pathophysiology of the vascular damage associated to Alzheimer's disease. We demonstrate the production of amyloid-&#946;-peptide (A&#946;) by vascular smooth muscle cells. Oxidative stress related to advance ages, induces the amyloidogenic APP cleavage producing an increase of A&#946;1-40 and A&#946;1-42 by vascular smooth muscle cells, which in tum contribute to vascular amyloid deposits generation. Vascular amyloid deposits induce oxidative stress, in which protein nitrotyrosination plays a key role in essential enzymes inactivation. Vitamin E and estrogens are able to protect neurons and vascular smooth muscle cells while vitamin E, but not estrogens, is able to protect endothelial cells against A&#946;-mediated toxicity.

Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit produït com a conseqüència del pèptid beta-amiloide (A&#61538;) contribueix l'augment de la relació A&#61538;42/A&#61538;40 que ocorre a la malaltia d'Alzheimer. L'A&#61538;42 contribueix a l'aparició de la malaltia degut a la seva major toxicitat (quan es compara amb l'A&#61538;40) que resulta d'una gran estabilitat i capacitat agregativa. A més el peroxinitrit incrementa la toxicitat d'aquest degut a què potencia la seva agregació en forma d'oligomers altament tòxics. De fet els oligomers formats de nitro-A&#61538;42 presenten una major toxicitat que aquells formats de A&#61538;42 . En conjunt aquest resultats senyalen l'important paper que l'A&#61538;42 té en la malaltia d'Alzheimer. Per altra banda, des de la identificació dels agregats d'A&#61538; i la subseqüent formació dels cabdells neurofibrilars (NFT) com a els dos trets distintius de la malaltia, un gran esforç s'ha dedicat a establir els mecanismes moleculars que uneixen ambdós processos. Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit format a partir de l'agregació de d'A&#61538;&#61472;i la conseqüent nitrotirosinació de proteïnes, potencia l'agregació de la proteïna tau en forma de fibres. D'aquesta forma, la nitrotirosinació de la proteïna triosafosfat isomerasa (TPI) podria ser el vincle entre la toxicitat derivada del agregats d'A&#61538;&#61472;i la patologia derivada de la proteïna tau. Per tant, la nitrotirosinació de la TPI podria explicar la progressió temporal que ocorre als cervells de pacients amb la malaltia d'Alzheimer des de la toxicitat induïda per l'A&#61538;&#61472;i l'aparició dels NFT. Els resultats presentats en aquesta tesi podrien obrir nous aspectes en la recerca de la malaltia d'Alzheimer així com en altres malalties que cursin amb estrès oxidatiu i plegament erroni de proteïnes. / This thesis demonstrates that amyloid ß-peptide (Aß)-induced peroxynitrite contributes to the switch of the A&#946;42/A&#946;40 ratio that occurs in Alzheimer's disease (AD). Since A&#946;42 is more toxic due to its higher aggregation and stability, it contributes to the trigger of the disease. In addition the aggregation of A&#946;42 in form of the highly toxic oligomers is incremented by the presence of peroxynitrite. Moreover, these nitro-Aß42 oligomers are more toxic than those non-nitrated. All these results support the important role of peroxynitrite in AD etiology. Furthermore, since the identification of Aß accumulation and the subsequent formation of neurofibrillary tangles (NFT) as the two defining pathological hallmarks of AD, a fair amount of research on AD has been driven by the need to find the molecular mechanism linking Aß and NFT. This thesis shows the Aß-induced peroxynitrite, and the consequent nitrotyrosination of proteins, promotes tau fibrillization. Thus triosephosphate isomerase (TPI) nitrotyrosination could be the link between Aß-induced toxicity and tau pathology. Therefore, TPI nitrotyrosination may explain the temporal progression from Aß toxicity to NFT formation in AD brain. The work presented in this thesis could open a novel angle in the research of the pathophysiology of AD and could also have an impact to the research in other neurodegenerative diseases involving oxidative stress and protein misfolding.