Os mastócitos, em associação com outras células inflamatórias se acumulam em locais de tumor. Entretanto, pouco é conhecido sobre o papel exato dos mastócitos e de seus mediadores na progressão tumoral e angiogênese. Resultados recentes do nosso laboratório mostraram que a expressão das triptases específicas de mastócitos está correlacionada com a progressão tumoral (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Além do mais, existe uma associação entre mastócitos e a angiogênese tumoral. Então, tornou-se interessante investigar o papel das quimases específicas de mastócitos (mMCP-4 e -5) neste processo. Visto que estas quimases não são disponíveis comercialmente, a primeira etapa deste estudo foi produzir as quimases mMCP-4 e -5 recombinantes. Assim, as sequências dos genes respectivos para mMCP-4 e -5, além das sequências para seis resíduos de His e do sítio suscetível a enteroquinase foram clonadas no vetor de expressão pPIC9. A cepa GS115 de Pichia pastoris foi transformada com o respectivo vetor para mMCP-4 ou -5. Os clones transformados foram crescidos em meio BMMY e induzidos com várias concentrações de metanol para a produção de mMCP-4 ou -5 recombinantes. Depois de 96 horas, o meio foi centrifugado e as quimases mMCP-4 ou -5 foram purificadas do sobrenadante usando resina de níquel. A identidade das proteínas foi confirmada por Western Blotting usando o anticorpo anti-his, assim como os anticorpos anti-mMCP-4 e -5. As proteases foram ativadas pela clivagem do sítio suscetível a enteroquinase por cinco horas, a 22°C. A ativação das enzimas foi confirmada através da degradação de seus substratos específicos. Estes resultados mostram que P. pastoris é um organismo eficiente para a expressão de ambas as proteases. Estas proteases recombinantes se constituem em ferramentas importantes para se elucidar o papel da mMCP-4 ou -5 na angiogênese. / Mast cells, in association with other inflammatory cells, are known to accumulate at tumor sites. However, little is known about the exact role that mast cells and their mediators play in tumor progression and angiogenesis. Recent results from our laboratory have shown that expression of mast cell specific tryptases correlates with tumor progression (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Furthermore, there is an association between mast cells and tumor angiogenesis. It then became of interest to investigate the role of mast cell specific chymases (mMCP-4 and -5) in this process. Since these chymases are not commercially available, the first step in this study was to produce recombinant mMCP-4 and -5. The gene sequences for these chymases along with the sequence for six His residues and an enterokinase susceptible peptide were cloned into the expression vector pPIC9. The GS115 strain of Pichia pastoris was transformed with the respective vector for either rmMCP-4 or -5. The transformed clones were grown in BMMY media and induced to produce rmMCP-4 or -5 with various concentrations of methanol. After 96 hours, the medium was centrifuged and rmMCP-4 or -5 was purified from the supernatant using nickel-nitrilotriacetic acid agarose beads. The identity of the proteins was confirmed by Western blotting using an anti-his antibody as well as anti-mMCP-4 and -5. These results show that P. pastoris is an efficient organism in which to express both proteases.

Angiogênese é o termo utilizado para descrever o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Vários estudos demonstraram a densidade microvascular (DMV) como um fator prognóstico nas leucemias, em particular, leucemia promielocítica aguda (LPA). Este subtipo de leucemia corresponde a cerca de 20 a 25% das leucemias mielóides agudas nos países latino-americanos e apresenta características clínicas, morfológicas e biológicas peculiares. A halofuginona (HF), originalmente descrita como um agente antifúngico apresenta capacidade de inibir o crescimento tumoral e formação de vasos em modelos animais de tumores sólidos. Estudos realizados por nosso grupo demonstraram que a HF inibiu a secreção do VEGF e a proliferação de linhagens celulares de LPA. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo determinar o potencial antiproliferativo e antiangiogênico da HF em um modelo experimental in vivo da LPA e avaliar os mecanismos subjacentes a sua ação. Primeiramente, a análise do ciclo celular em células NB4 tratadas com HF apresentou significativa diminuição da proliferação celular (2,093 ± 0,304 vs. 41,21 ± 3,25), juntamente com um aumento significativo da apoptose (12,53 ± 1,53 vs. 21,95 ± 0,79; p=0,0007). Por meio da técnica de Real Time Array foi possível identificar dois grupos de genes associados a apoptose celular diferencialmente expressos em células tratadas com HF: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 e CASP3, sugerindo que a HF induz a via extrínseca de apoptose. A análise in vivo da HF foi realizada em camundongos NOD/SCID previamente irradiados e transplantados com células leucêmicas PML-RAR murinas. Camundongos tratados com HF, por 21 dias após o transplante não apresentaram remissão molecular, determinada pela amplificação do gene PML-RARA por PCR, porém foi observada menor infiltração leucêmica em relação aos camundongos não tratados (Leucócitos: 4,2 ± 3,89 vs. 20,6 ± 21,9; p<0.0001); Hemoglobina: 12,0 ± 1,40 vs. 9,6 ± 1,67; p<0.0001; e Plaquetas: 932,0 ± 122,5 vs. 552,0 ± 83,2; p<0.001 respectivamente) e um menor peso relativo do baço (0,006 vs. 0,012, p=0,0415). Ademais, a contagem diferencial e imunofenotipagem da medula óssea evidenciaram menor porcentagem de células mielóides imaturas (16,88 ± 6,27 vs. 44,06 ± 27,06). A HF também foi capaz de inibir a fosforilação de SMAD2 e consequentemente bloquear a via do TGF- em células NB4. No entanto, animais leucêmicos apresentaram menor nível sérico de TGF- em relação aos saudáveis e tratados (475,58 vs. 1.378,45/1.146,82 pg/mL; p<0,0001), sugerindo que o blasto leucêmico produz esta citocina e a diminuição de células leucêmicas resultou em diminuição dos níveis séricos de TGF-. A HF não aumentou a sobrevida dos animais leucêmicos e a elevação das enzimas hepáticas sugeriu que o tratamento foi hepatotóxico. Por fim, com relação à angiogênese, a análise da expressão gênica mostrou que o tratamento com HF inibiu a expressão de VEGF e EGF e o estudo por imunohistoquímica de seções da medula óssea evidenciou menor expressão VEGF (30 vs. 80%, p=0,0227), porém não houve diminuição da DMV. O conjunto desses resultados mostrou que a angiogênese é um importante alvo terapêutico na LPA, e que apesar da toxicidade, a HF apresenta potencial antileucêmico, tanto por conta de seus efeitos antiproliferativos e próapoptóticos, quanto por sua capacidade de inibir a produção de fatores próangiogênicos. / Angiogenesis is the term used to describe the growth of new blood vessels from the existing ones. Several studies have demonstrated the microvascular density (MVD) as a prognostic factor in leukemia, particularly acute promyelocytic leukemia (APL). This subtype of leukemia corresponds to 20-25% of acute myeloid leukemia in Latin America and presents clinical, morphological and biological peculiar characteristics. The halofuginone (HF) originally described as an antifungal agent has ability to inhibit tumor growth and vessel formation in animal models of solid tumors. Our group demonstrated that HF inhibits the VEGF secretion and cell proliferation in APL cell lineages. Thus, this study aimed to determine the antiproliferative and antiangiogenic potential of HF in an experimental model of APL in vivo and evaluate the mechanisms underlying its action. First, the cell cycle analysis in NB4 cells treated with HF showed a significant decrease in cell proliferation (2.093 ± 0.304 vs. 41.21 ± 3.25), along with a significant increase in apoptosis (12.53 ± 1.53 vs . 21.95 ± 0.79, p = 0.0007). Through Real Time Array it was possible to identify two groups of apoptosis associated genes differentially expressed in HF treated cells: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 and CASP3, suggesting that HF induces apoptosis by extrinsic pathway. In vivo analysis of HF was performed in irradiated NOD/SCID mice transplanted with murine PML-RAR leukemic cells. Mice treated with HF for 21 days after transplantation showed no molecular remission as determined by amplification of PML-RARA gene by PCR, however minor leukemic infiltration was observed compared to untreated mice (leukocytes: 4.2 ± 3.89 vs . 20.6 ± 21.9, p <0.0001), hemoglobin: 12.0 ± 1.40 vs. 9.6 ± 1.67, p <0.0001, and Platelets: 932.0 ± 122.5 vs. 552.0 ± 83.2, p <0.001 respectively) and a lower relative weight of spleen (0.006 vs. 0.012, p = 0.0415). Furthermore, the differential count and immunophenotyping of bone marrow showed a lower percentage of immature myeloid cells (16.88 ± 6.27 vs. 44.06 ± 27.06). The HF was also able to inhibit the SMAD2 phosphorylation and consequently block the TGF- pathway in NB4 cells. However, leukemic animals presented lower serum TGF- compared to the healthy and treated (475.58 vs. 1378.45/1146.82 pg / mL, p <0.0001), suggesting that the leukemic blasts produces this cytokines and the decrease in leukemic cells resulted in decreased serum levels of TGF-. The HF did not increase the survival of leukemic animals and elevated liver enzymes suggested that the treatment was hepatotoxic. Finally, regarding angiogenesis, gene expression analysis showed that the HF treatment inhibited the expression of VEGF and EGF and the study by immunohistochemistry of sections of bone marrow showed less VEGF expression (30 vs. 80%, p = 0 0227), but there was no decrease in the MVD. Taken together, these results showed that angiogenesis is an important therapeutic target in APL, and despite the toxicity, HF has antileukemic potential, for both the antiproliferative and proapoptotic effects, and also for its ability to inhibit the production of proangiogenic factors.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da aplicação de bevacizumab (Avastin®) sobre a angiogênese corneal. Para tanto ratos Wistar, machos, com idade entre 8 e 10 semanas, pesando 300 a 350g, foram submetidos a cauterização química com nitrato de prata por 10 segundos. Após realização da lesão, cada grupo de 5 animais foi tratado com injeções subconjuntivais de 0,02 ml de bevacizumab (Avastin ®) pela via subconjuntival no momento da lesão, no 3° e 5° dia e submetidos à eutanásia ao 7° dia após cauterização corneal. A rede vascular neoformada foi quantificada após preenchimento do leito vascular com Tinta da China e análise das imagens em sistema computadorizado (Image Pro-Plus®). Para a segunda etapa do experimento, avaliou-se a atividade das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9 utilizando-se do mesmo modelo de angiogênese e dos mesmos tempos de tratamento. Transcorridos 7 dias de lesão corneal os animais foram eutanasiados e suas córneas submetidas a zimografia. Os resultados mostraram haver uma inibição da angiogênese quando se compara o grupo controle aos grupos tratados nos diferentes períodos de tempo. Quando a densidade vascular é comparada entre os tempos de aplicação, não se observa diferença estatisticamente significante. Estes resultados em conjunto indicam que o tempo de aplicação não influencia a inibição da angiogênese e que o bevacizumab foi eficiente na redução da formação de vasos quando se compara a densidade vascular do grupo controle. O modelo experimental produziu considerável aumento das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9. Houve uma tendência a diminuição da atividade das MMPs quando bevacizumab foi aplicado no momento da lesão e quando foi aplicado ao 3° dia após cauterização. A atividade das MMPs mostrou-se aumentada quando o tratamento foi realizado no 5° dia. Desta forma pode-se concluir que o bevacizumab foi capaz de inibir a angiogênese corneal, independentemente do período de tratamento e ainda que houve uma tendência a redução da atividade das MMPs carecendo, por enquanto, de mais investigações que possam elucidar a interação deste fármaco com a inibição de sua atividade. / The purpose of this study was to evaluate the effects of the use of the subconjunctival injection of bevacizumab (Avastin®) on angiogenesis and metalloproteinases activities in the rat cornea after cauterization. Wistar male rats, aging 8 to 10 weeks, were used. The animals were divided in four groups: control group (GC) that received subconjunctivally 0,02 ml of 0,9% saline solution; group GO that received subconjunctivally 0,02 ml of bevacizumab just after the lesion; group G3 that received bevacizumab at day 3 after lesion and G5 that received bevacizumab at day 5 after lesion. The animals were euthanized at day 7 after lesion. The new formed vessels were quantified after the China Ink perfusion and photographs were obtained and analyzed in computadorized system (Image Pro-Plus®). The activities of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 were evaluated by zimography in a pool of corneas obtained from animals submitted to the same model and treatment schedule. The results showed an inhibition of angiogesenis when the control group were compared with all treated groups. There were no statistic differences when vascular density was compared between the treated groups. These results may indicate that bevacizumab was able to inhibit corneal angiogenesis and that there was no influence of the injection day. This angiogenesis model promoted an increase of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 activity. Zymography also showed a slight reduction in matrix metalloproteinases activity when bevacizumab were administrated at the injury moment and most significant at day 3. At day 5 zymography showed an increase of the activity of these metalloproteinases. Together these results may indicate that the subconjunctival injection of bevacizumab may have a therapeutic potential as an antiangiogenic agent and that matrix metalloproteinases activity decreased, but not at significant levels, demanding more investigations regarding to the interaction of bevacizumab and activity of matrix metalloproteinases.

As células T regulatórias (Tregs) suprimem a população de células T efetoras e podem capacitar células tumorais a evadir a resposta imune do hospedeiro. Além disso, estas células têm sido correlacionadas com angiogênese em alguns tipos de câncer. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência de células Tregs e sua correlação com angiogênese em carcinomas espinocelulares (CEC) de boca. Amostras de um total de 61 pacientes com CEC de boca, localizados no lábio e na língua e assoalho bucal obtidos dos Departamentos de Patologia dos Hospitais de Base e Estadual da cidade de Bauru, São Paulo, Brasil, no período de 2005 a 2012 foram analisados quanto às características clínicas e demográficas. Avaliou-se também, o índice histopatológico de malignidade e a expressão imunoistoquímica de células Tregs (FOXP-3), densidade microvascular intratumoral (MVD) e VEGF-A. A associação da marcação do anticorpo anti-FOXP-3 e as variáveis clínicas e microscópicas foram avaliadas através do teste qui quadrado. A análise estatística da expressão dos marcadores entre CECs de lábio e CECs de Língua e assoalho bucal foi realizada através do teste t. As correlações entre a frequência de células Treg e MVD, células Tregs e VEGF-A, foram obtidas através do coeficiente de correlação de Pearson, bem como a correlação entre MVD e VEGF-A. Não houve associação da expressão de FOXP-3 com as características clínicas, demográficas e índice de malignidade tumoral. Foram observados valores similares da frequência de células Tregs, índices de MVD e expressão de VEGF-A em CECs de lábio e CECs de língua e assoalho bucal. Uma correlação positiva entre a frequência de células Tregs e a MVD foi observada, embora não estatisticamente significativa (P-valor=0,682). Além disso, uma correlação positiva estatisticamente significativa foi detectada entre a frequência de células Tregs e a expressão de VEGF-A (P-valor=0,029). Não foi observada correlação entre a MVD e a expressão de VEGF-A. Estes resultados sugerem que embora exista uma associação entre a frequência de células Tregs e a angiogênese em CECs de boca, a expressão de FOXP-3 parece não estar associada ao desenvolvimento tumoral. / Regulatory T (Treg) cells suppress effector T-cell populations and can enable tumor cells to evade the host immune response. Moreover, Tregs cells have been correlated with angiogenesis in certain types of cancers. The aim of this study was to evaluate the frequency of Treg cells and its correlation with angiogenesis in oral squamous cell carcinomas (OSCC), as well as its implication on growth and tumor aggressiveness. Samples from a total of 61 patients with OSCC, located on the lip and tongue and floor of the mouth were analyzed for clinical and demographic characteristics. The histopathological malignancy index and immunoexpression of Treg cells (FOXP-3), IMD (CD105) and VEGF-A were also evaluated. The association of FOXP-3 expression and the clinical and microscopic changes were evaluated using the chi square test. Statistical analysis of the expression of markers between SCCs lip and SCCs of the tongue and floor of the mouth was performed using the t test. Pearsons rank correlation was performed to evaluate the correlation between the frequencies of both, Tregs cells and VEGF-A expression and Tregs cells and IMD determinations, as well as between VEGF-A expression and IMD values. There was no association of FOXP-3 expression with clinical and demographic characteristics, and tumor malignancy index. Similar values were observed for the frequency of Treg cells, IMD values and VEGF-A expression in OSCCs of the lip and tongue and floor of mouth. A positive correlation between FOXP-3 expression with IMD values was also detected, however, statistically that was non-significant (P-value=0.682). Furthermore, a significant positive correlation was observed between the frequency of tumor-infiltrating Tregs with VEGF-A expression (P-value=0.029). No correlation was observed between IMD values and with VEGF-A expression. These results suggest that although there is an association between the frequency of Treg cells and angiogenesis in OSCC, FOXP-3 expression was not associated with increased tumor aggressiveness.

O reconhecimento de subtipos de carcinomas mamários baseados em suas características moleculares trouxe novas perspectivas na investigação do câncer de mama. Algumas proteínas chaves reguladoras da angiogênese e da infiltração tumoral foram avaliadas em carcinomas de mama de fenótipo basal (CK5+). Foi realizado estudo Imunoistoquímico com 14 anticorpos primários em 100 casos de carcinoma ductal. A positividade para citoqueratina 5 correlacionou-se com indicadores de mau prognóstico, incluindo idade precoce, alto grau histológico, linfonodos positivos, estádio patológico avançado, negatividade para receptores hormonais, e uma alta taxa de proliferação celular, avaliado pelo Ki67. A positividade para a CK5 também se correlacionou com a expressão do VEGF, mas não com a densidade da microvascularização. Considerando que a superexpressão de VEGF pelas células neoplásicas da mama leva a um aumento da atividade proliferativa in vitro independente de seu efeito angiogênico, a expressão diferencial do VEFG pode contribuir para o comportamento mais agressivo da neoplasia. Houve correlação do CK5 com TIMP1, mas não com MMP1, MMP2, EMMPRIN, TIMP2 and PAI, indicando que o estimulo antiproteolítico pode ser preponderante nesta neoplasia. / The recognition of subtypes of breast carcinomas based on their molecular features has brought new perspectives in breast cancer investigation. Some key regulators of angiogenesis and tumor infiltration were evaluated in breast carcinomas of basal-phenotype (CK5+). Immunohistochemistry with 14 primary antibodies was performed in 100 formalin-fixed paraffin-embedded samples of invasive ductal carcinomas. Cytokeratin 5 correlated with indicators of poor outcome, including precocious age, high histological grade, lymph node positivity, advanced pathological stage, negativity for hormonal receptors, and a high proliferative rate (Ki67 labeled index). CK5 also correlated with VEGF expression but not with the microvessel density. Considering that VEGF overexpressing neoplastic mammary cells display increased proliferative activity in vitro regardless its angiogenic effect, the differential expression of VEGF may contribute for the more aggressive behavior of these neoplasms. CK5 correlated with TIMP1, but not MMP1, MMP2, EMMPRIN, TIMP2 and PAI, indicating that anti-proteolytic stimuli may be preponderant in these neoplasms.

O papel da angiogênese na patogênese da doença renal crônica é incerto. De um lado, a formação de neovasos no tecido renal pode amenizar a rarefação capilar e a consequente hipóxia. De outro, a neoangiogênese podem suprir o tecido renal de células pró-inflamatórias. Investigamos o efeito do tratamento com sunitinibe (Su), um inibidor dos receptores do VEGF, no modelo de ablação renal de 5/6 (Nx) em ratos. Foram estudados os grupos: S+V, ratos submetidos a cirurgia simulada (S) e tratados apenas com veículo (V); S+Su, ratos S tratados com Su, 4 mg/kg/dia; Nx+V, ratos Nx tratados com V; e Nx+Su, ratos Nx tratados com Su. A administração de Su não provocou qualquer alteração no Grupo S. Sete e 45 dias após a remoção de massa renal, houve expansão do interstício cortical, associada a uma rarefação dos capilares peritubulares e a uma disseminação da hipóxia tecidual, normalmente confinada à região medular externa. Su não agravou essa expansão intersticial. A rarefação capilar e os sinais de hipóxia tampouco foram afetados, sugerindo pouca ou nenhuma atividade angiogênica nesse modelo. Su exacerbou a glomerulosclerose (GS) observada nos animais Nx. Esse efeito não pode ser explicado por uma redução no número ou na integridade dos podócitos, que não diferiram entre os grupos Nx+V e Nx+Su. Da mesma forma, não se encontraram evidências de que o agravamento da GS pelo Su nos ratos Nx tenha sido causado por hipertrofia do tufo glomerular ou proliferação exagerada de suas células. Entretanto, o tratamento de ratos Nx com Su associou-se ao desenvolvimento de microtrombos glomerulares, cuja organização pode explicar o agravamento da GS observado com a droga. Su não afetou a porcentagem de área endotelial no glomérulo, sugerindo que seu possível dano ao endotélio foi eminentemente funcional. A inibição do VEGF tem pouco efeito sobre ratos normais, mas pode afetar seriamente os glomérulos se administrada a animais com dano renal prévio / The role of angiogenesis in the pathogenesis of chronic kidney disease is unclear. Neovessel formation could ameliorate renal damage by mitigating capillary rarefaction and hypoxia. On the other hand, neoangiogenesis could facilitate the access of inflammatory cells to the renal tissue. We investigated the effect of treatment with sunitinib (Su), an inhibitor of VEGF receptors, in the 5/6 renal ablation model (Nx). Adult male Munich-Wistar rats were distributed among groups S+V, rats submitted to sham surgery (S) and treated with vehicle (V); S+Su, S rats treated with Su, 4 mg/kg /day; Nx+V, Nx rats treated with V; and Nx+Su, Nx rats treated with Su. Administration of Su caused no change in Group S. Seven and 45 days after renal mass ablation, there was expansion of the cortical interstitium associated with rarefaction of peritubular capillaries and dissemination of tissue hypoxia, which was confined to the outer medulla in S rats. Su did not worsen interstitial expansion, nor did it affect capillary rarefaction or hypoxia, suggesting that little angiogenic activity exists in this model. Nx animals exhibited glomerulosclerosis (GS), which was aggravated by Su. This effect could not be explained by changes in the number or vitality of podocytes. Worsening of GS by Su treatment could not be ascribed to tuft hypertrophy or hyperplasia, but was associated with the formation, and possible organization, of glomerular microthrombi. Su did not affect the fractional endothelial area in the glomerulus, suggesting functional damage of endothelial cells, rather than reduction of their number. VEGF inhibition has little effect on normal rats, but can seriously affect the glomerular endothelium in animals with previous renal injury

One strategy for bone regenerative engineering is to use matrices associated to osteogenic and angiogenic molecules to increase bone formation. The aim of the present study was to evaluate the efficacy of treatment of extensive cranial bone defects with the F1 protein obtained from latex adsorbed at different concentrations (0,01%, 0,025%, 0,05% e 1%) to two different bonesubstitutes biomaterials, deproteinized bovine bone (DBB) and biphasic calcium phosphate ceramics (pBCP) using a preclinical model in rats. Defects of 8-mm diameter were created in parietal bones of 72 rats filled with the pure biomaterial or carried with the different concentrations of F1 protein, in the microtomographic images a visual analysis of the microtomographic reconstructions of the skull through transverse, coronal and sagittal sections. Subsequently, the segmentation of the defect in the reconstructions will be done through an image processing algorithm to quantify the parameters. Analyzing, in the BP-G group, the total volume of bone (TV), in the CSBD-CG group, the total volume of new bone (TV-NB), and in the treated groups, the total volume of the grafted region (TV/GR), the total volume of new bone (TV-NB) and biomaterials (TV/DBB and TV/pBCP). In tissue sections stained with Hematoxylin and Eosin a descriptive histological analysis was performed to verify the tissue response to treatment with F1 protein and its association with osteoconductive biomaterial and correlate it with the histomorphometric determination to obtain percent values and volume of neoformed bone tissue, biomaterial, bone marrow and soft tissue. In the characterization of DBB and pBCP biomaterials, it was performed through the combined analytical methodology by SEM and SDD-EDS, to analyze external morphology and elemental chemical composition. All the results were compared between the groups by the ANOVA variance analysis and the Tukey tests at the 5% level of significance (Statistica v.5.1, StatSoft). After 12 weeks, defects treated with biomaterials without F1 presented greater bone formation in relation to the control group. The association of 0.025% and 0.05% of F1 plus DBB showed higher bone formation (32.6% and 25.1%, respectively) when compared to pBCP, being 19.3% and 15.1%, respectively. We conclude that the stimulation of angiogenesis and osteogenesis depends on its concentration of F1e and the physicochemical properties of the carrier material. / Uma estratégia da engenharia regenerativa óssea é usar matrizes associadas a moléculas osteogênicas e angiogênicas para aumentar a formação óssea. O objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia do tratamento de defeitos ósseos cranianos extensos com a proteína F1 obtida do látex adsorvido em diferentes concentrações (0,01%, 0,025%, 0,05% e 1%) a dois diferentes biomateriais ósseo-substitutos, osso bovino desproteinizado (DBB) cerâmica de fosfato de cálcio bifásica (pBCP) utilizando um modelo pré-clínico em ratos. Defeitos de 8 mm de diâmetro foram criados nos ossos parietais de 72 ratos preenchidos com o biomaterial puro ou carregados com as diferentes concentrações da proteína F1, nas imagens microtomográficas uma análise visual das reconstruções microtomográficas do crânio através de cortes transversais, coronais e sagitais. Subsequentemente, foi feito segmentação do defeito nas reconstruções através de algoritmo de processamento de imagem para quantificação dos parâmetros. Analisando, no grupo BP-G, o volume total de osso (TV), no grupo CSBD-CG o volume total de osso novo (TV-NB), e nos grupos tratados, o volume total da região enxertada (TV-GR), volume total de osso novo (TV-NB) e biomaterial (TV-DBB e TV-pBCP). Nos cortes teciduais corados pela Hematoxilina e Eosina foi realizado uma análise histológica descritiva para verificar a resposta tecidual frente ao tratamento com a proteína F1 e a sua associação com biomaterial osteocondutor e correlaciona-la com a determinação histomorfométrica para a obtenção dos valores percentuais e de volume de tecido ósseo neoformado, biomaterial, medula óssea e tecido conjuntivo. Na caracterização dos biomaterias DBB e pBCP, foi realizado através da metodologia analítica combinada por SEM e SDD-EDS, para analisar morfologia externa e composição química elementar. Todos os resultados foram comparados entre os grupos pela análise de variância ANOVA e o tests de Tukey ao nível de significância de 5% (Statistica v.5.1, StatSoft). Após 12 semanas, defeitos tratados com biomateriais sem F1 apresentaram maior formação óssea em relação ao grupo controle. A associação de 0,025% e 0,05% de F1 mais DBB mostraram maior formação óssea (32,6% e 25,1%, respectivamente) quando comparados com pBCP, sendo 19,3% e 15,1%, respectivamente.Nós concluímos que, a estimulação da angiogênese e osteogênese depende de sua concentração de F1e das propriedades físico-químicas do material carreador.

Propõe-se que a angiogênese represente um importante passo no processo de adesão, implantação, invasão e crescimento das células endometriais, visto que, semelhante aos tumores metastáticos, implantes endometrióticos dependem de neovascularização para se proliferarem. Tal constatação sugere que a supressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de fatores angiogênicos específicos pode ser uma nova oportunidade terapêutica na abordagem da endometriose. Estudos demonstram um efeito antiangiogênico do propranolol anticancerígeno em diferentes tipos de tumores. Tal achado sugere que o propranolol pode contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e tal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose. Foi estudado o efeito do propranolol sobre marcadores de diferenciação (Metalotioneínas MT1 e MT2), invasão (MMP9 e TIMP2), proliferação celular (PCNA) e apoptose (CASP8 - caspase 8) por coloração imunohistoquímica, e também a influência sobre a adesão, motilidade e angiogênese das lesões de endometriose por quantificação da expressão relativa (RQ) por PCR em tempo real dos genes Vegf, Cald1, Pcna, Tnf e Sparc. Foram utilizadas 30 ratas adultas Wistar, fêmeas, virgens que foram submetidas a laparotomia para indução de lesões de endometriose. As ratas foram separadas em três grupos, e sacrificados após 14 dias de tratamento de dose baixa (PB, n = 10) e dose elevada (PA, n = 10) de propranolol; e o grupo de controlo (C, n = 10) sem tratamento. As lesões foram excisadas para análise histológica com o corno uterino contralateral, com confirmação da presença de tecido glandular e estroma endometrial. No presente estudo foi observada uma redução na marcação imunohistoquímica para Metalotioneínas, com 60% de positividade no grupo controle, 10% e 11,1% para o PA, PB, respectivamente (p <0,05). Também observamos uma diminuição na expressão do gene de Pcna (C = 1,04; PA = 0,32; PB = 0,69). Em outros marcadores de imunohistoquímica e quantificação da expressão gênica nas lesões e no tecido uterino não foram observadas diferenças significativas. O tratamento com drogas antiangiogênicas como propranolol oferece novas perspectivas de abordagem terapêutica para pacientes com endometriose. / Since endometrial implants rely on neovascularization to proliferate, in a similar way to metastatic tumors, it is proposed that angiogenesis represents an important step in the process of adhesion, implantation, invasion and growth of ectopic endometrial cells. These findings suggest that the suppression of the development of blood vessels by inhibition of specific angiogenic factors may be a new therapeutic opportunity in endometriosis approach. Studies demonstrate an antiangiogenic anticancer effect of propranolol in different types of tumors. This drug can play a role in the inhibition of neoangiogenesis, which could interfere on the growth of endometriotic lesions. The effect of propranolol on markers of differentiation (Metallothionein, MT1 and MT2), invasion (MMP9 and TIMP2), cell proliferation (PCNA) and apoptosis (CASP8 - caspase 8) was evaluated by immunohistochemical staining, as well as the influence of propranolol on adhesion, motility and angiogenesis of both endometriotic lesions and endometrial tissue through quantification of relative expression (RQ) by real-time PCR of the genes Vegf, Cald1, Pcna, Tnf and Sparc. Thirty Wistar adult rats, females, virgins who underwent laparotomy for induction of endometriosis lesions were used. The rats were divided into three groups, and sacrificed after 14 days of low (BP, n = 10) and high dose treatment (AP, n = 10) of propranolol; and the control group (C, n = 10), untreated. The lesions were excised for histological analysis with the contralateral uterine horn, with confirmation of the presence of glandular tissue and endometrial stroma. In the present study we observed a reduction in immunostaining for Metallothioneins, with 60% positive in the control group, in comparison to 10% and 11.1% for PA and PB, respectively (p <0.05). Furthermore, there was a decrease in expression of Pcna gene (C = 1.04; PA = 0.32; PB = 0.69) which was statistically significant (p<0.05). However, quantification of gene expression regarding other immunohistochemical markers evaluated both in the endometriotic lesions and uterine tissue showed no statistically significant difference. In conclusion, antiangiogenic drugs like propranolol may offer new perspectives for the therapeutic approach of patients with endometriosis.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PAULO SAVIO PAIM DE MORAES.pdf: 2113586 bytes, checksum: 8c7536241e81f8bdafe3a673d0c7973d (MD5) Previous issue date: 2015-03-12 / Brazil has the worlds largest plant genetic diversity, with cataloging more than 55.000 species between an estimated 350-550 thousand, already in equivalence only 8% of the national flora was studied among these plants 1.100 were related to their properties medicinal. Among the many medicinal plants used in Brazil, is Tabebuia impetiginosa, popularly known as purple Ipe, typical of the Brazilian cerrado, and has anti-inflammatory, analgesic, antibiotic and anti-neoplastic. The most studied and constituent responsible for pharmacological activities of purple Ipe, as described in the literature is Lapachol. Based on the characteristics of the aqueous solution of purple ipe, the aim of this study was to evaluate its potential angiogenic, mutagenic and antimutagenic activity by testing the chorioallantoic membrane (MCA) and micronucleus in hematopoietic bone marrow of mice. The chemotherapy mitomycin (MMC), known for its mutagenic effect, was used as positive control. The results showed an increase of angiogenesis in vascular network (p<0.05) compared to the MCAs negative controls (p<0.05) and inhibitor (p<0.05) when using aqueous purple ipe at a concentration of 10 mg(ml). In the micronucleus test, it was observed that the aqueous solution of purple ipe at doses of 10, 20 and 30 mg (b.w.), showed no mutagenic activity and no protective effect on the genotoxicity induced by MMC. / A Tabebuia impetiginosa é uma importante planta medicinal utilizada no Brasil, conhecida popularmente como Ipê roxo, nativa das florestas tropicais chuvosas da América do Sul e Central, e amplamente distribuída no Cerrado brasileiro. Apresenta ação anti-inflamatória, analgésica, antibiótica e anti-neoplásica. Seu constituinte mais estudado e responsável por atividades farmacológicas é o Lapachol. Baseando-se nas características da solução aquosa do ipê roxo, o objetivo deste estudo foi avaliar sua potencial atividade angiogênica, mutagênica e antimutagênica, mediante os testes da membrana corio-alontoide (MCA) e micronúcleo da medula óssea hematopoiética de camundongos. O quimioterápico mitomicina (MMC), conhecido por seu potencial efeito mutagênico, foi usado como controle positivo. Os resultados da angiogênese evidenciaram um aumento da rede vascular (p<0,05) da MCAs em relação aos controles negativo e inibidor pelo uso da solução aquosa do ipê roxo na concentração de 10 mg(ml). No teste do micronúcleo, observou-se que nas doses de 10, 20 e 30 mg (p.c.), a solução aquosa do ipê roxo não apresentou atividade mutagênica e nem efeito protetor diante da ação genotóxica provocada pela MMC.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:54:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dwight Assis Chaves.pdf: 1963972 bytes, checksum: a15ea173ac93c1534367c22dfc6105bd (MD5) Previous issue date: 2015-02-05 / The barbatimão (Stryphnodendron adstringens) is a medicinal plant, rich in tannins, found in the cerrado, which has anti-inflammatory, analgesic activity and a protective activity of gastric mucosa. In this work we evaluated the angiogenic activity and result from antiangiogenic, genotoxic and non-genotoxic of the barbatimão bark aqueous solution. Data from recent studies of the angiogênise using the CAM of hens egg to the barbatimão were not found in the literature. The barbatimão shells for the preparation of ASB (aqueous solution of barbatimão) were acquired in the city of Goiânia. Were used 30 grams of crushed shells to one litre of water. Angiogenic activities and result from antiangiogenic were evaluated by the experimental method of the corioalantoide membrane (CAM) and as positive control was used the Regederm product, which features angiogenic activity known. Genotoxic activity was evaluated from the barbatimão from aqueous solution using experimental model the micronucleus test in bone marrow of mice, and non-genotoxic activity was evaluated by the simultaneous treatment of the ASB and the compound known to be genotoxic Mitomycin C (MMC). The presented ASB tests, was considered genotoxic, angiogenic and features not non-genotoxic on concentration tested compared with the controls. The ASB presented a high vascularization in MCA (50.4) compared with the positive control (52.9). The dose of the barbatimãos peel solution (30 mg.ml -1) analyzed presented difference (p<0,05) at the EPCMN frequency relative to the negative control group.Comparing the frequency of dose EPCMN SABMMC concurrent treatment with the positive control, there was no significant difference (p>0,05). The results were promising, cooperating with future research for developing new medicines. It is noticed that the genus presents promising active principles for the development of new herbal medicines, that becomes necessary more studies and research for consumer safety. / O barbatimão (Stryphnodendron adstringens) é uma planta medicinal, rica em taninos, encontrada no cerrado,a qual possui atividade anti-inflamatória, analgésica e uma atividade protetora da mucosa gástrica. Neste trabalho foram avaliadas as atividades angiogênica e antiangiogênica, genotóxica e antigenotóxica da solução aquosa da casca do Barbatimão.Dados dos estudos recentes da angiogênise utilizando a MCA de ovo de galinha para o barbatimão não foram encontrados na literatura.As cascas de barbatimão para o preparo da SAB(Solução aquosa de barbatimão) foram adquiridas na cidade de Goiânia. Foram utilizadas 30 gramas de cascas trituradas para um litro de água. As atividades angiogênica e antiangiogênica foram avaliadas pelo método experimental da membrana corioalantoide (MCA) e como controle positivo foi utilizado o produto Regederm, que apresenta atividade angiogênica conhecida. A atividade genotóxica foi avaliada a partir da solução aquosa do barbatimão utilizando como modelo experimental o teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos, sendo que a atividade antigenotóxica foi avaliada pelo tratamento simultâneo da SAB e do composto sabidamente genotóxico Mitomicina C (MMC). A SAB pelos testes apresentados foi considerada angiogênica, genotóxica e não possui características antigenotóxicas na concentração testada comparada com os controles. A SAB apresentou uma elevada vascularização na MCA (50.4%) quando comparada com o controle positivo(52,9%). A dose da solução da casca de barbatimão (30 mg.ml-1) analisada apresentou diferença (p<0,05) na frequência de EPCMN em relação ao grupo controle negativo.Comparando a frequência de EPCMN da dose do tratamento de SAB+MMC simultâneo com o controle positivo, não houve diferença significativa (p>0,05). Os resultados foram promissores, cooperando com pesquisas futuras para desenvolvimento de novos medicamentos.Percebe-se que o barbatimão apresenta princípios ativos promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos fitoterápicos, para isso tornam-se necessários mais estudos e pesquisas para segurança do consumidor final.