Le trouble de stress post-traumatique (TSPT) affecte plus de 9% de la population, et les traitements pharmacologiques disponibles sur le marché ont une efficacité limitée. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles avenues thérapeutiques. Bien que de nombreuses études suggèrent un rôle pour l'angiotensine II (Ang II) dans la réponse au stress, la littérature concernant l'impact du système rénine-angiotensine (SRA) périphérique dans le développement d'un TSPT demeure insuffisante. Nous avons émis l'hypothèse qu'à la suite de l'expérience d'un trauma psychologique, la liaison de l'Ang II aux récepteurs à l'angiotensine de type 1a situés au niveau des cellules endothéliales ($\mathrm{eAT_{1a}R}$) mène à une augmentation de l'inflammation périphérique, un dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE), à l'infiltration de molécules inflammatoires et contribue au développement d'un TSPT. Pour tester cette hypothèse, des souris déficientes en $\mathrm{eAT_{1a}R}$ ($\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$) et sauvages (WT) ont été exposées à un stress de prédation. Nous montrons une réduction de l'anxiété chez les souris $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ des deux sexes, ainsi qu'une réduction des comportements d'évitement chez les souris $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ mâles. Chez les souris femelles, le génotype $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ est aussi associé à une expression accrue de la protéine de jonction claudine-5 dans le cortex préfrontal et une réduction de l'inflammation périphérique. Ces résultats montrent pour une première fois une implication directe de la signalisation de l'Ang II par les $\mathrm{AT_{1a}R}$s endothéliaux dans la perméabilisation de la BHE et le développement de comportement de type TSPT. La délétion des $\mathrm{eAT_{1a}R}$s n'affecte pas l'expression des protéines de jonction et l'inflammation chez les mâles, suggérant que les mécanismes par lesquels l'angiotensine II affecte le comportement diffèrent selon le sexe. Les résultats présentés ici nous permettent de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l'implication du SRA dans le TSPT et suggèrent que le SRA périphérique représente une cible potentielle pour son traitement. / Posttraumatic stress disorder (PTSD) affects over 9% of the population. Moreover, approved pharmacological treatments have limited effectiveness and a high relapse rate. In order to develop new therapeutic avenues, research focusing on the pathophysiological mechanisms of PTSD is therefore necessary. Although numerous studies support a role for angiotensin II (Ang II) in stress response, literature regarding the impact of the peripheral renin-angiotensin system (RAS) on the development of PTSD remains insufficient. We hypothesized that following the experience of a psychotrauma, Ang II binding to endothelial angiotensin receptors ($\mathrm{eAT_{1a}R}$) leads to increased peripheral inflammation, dysfunction of the blood-brain barrier (BBB), passage of inflammatory molecules into the brain and susceptibility to PTSD. To test this hypothesis, $\mathrm{eAT_{1a}R}$-deficient ($\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$) and wild-type (WT) mice were exposed to predator stress. Anxiety-like and avoidance behaviors as well as biological parameters such as blood pressure, BBB integrity and neuroinflammation were assessed. We show a reduction in anxiety in $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ mice for both sexes, as well as less avoidance behaviors in male $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ mice. In female mice, $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ genotype is also associated with increased expression of the tight-junction protein claudin 5 in the prefrontal cortex and decreased peripheral inflammation. For the first time, these results show a direct involvement of Ang II signaling through endothelial $\mathrm{AT_{1a}R}$s in BBB permeabilization and the development of anxiety-like and PTSD-like behavior. Deletion of $\mathrm{eAT1aR}$s does not affect tight-junction protein levels in males, suggesting that the mechanisms by which angiotensin II affects behavior differ in a sex-dependent manner. Overall, this study enhances our understanding of the mechanisms by which the RAAS is linked to PTSD and shine a light on the peripheral RAAS as a potential target for PTSD treatment.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Contexte : les hormones œstrogéniques ont de nombreux effets protecteurs au niveau cardiovasculaire et rénal mais leurs mécanismes sont très complexes. Le récepteur aux œstrogènes ERα est le principal effecteur des effets bénéfiques de ces hormones. Il possède deux voies d’action. Dans le noyau, il a des effets génomiques via ses fonctions d’activation AF. A la membrane, il a des effets non-génomiques via une signalisation membranaire MISS. Première étude : dans une première étude, nous avons exploré le mécanisme protecteur d’ERα dans l’hypertension artérielle, un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires. Nous avons mis en évidence le rôle protecteur des effets génomiques d’ERα via sa fonction AF-2 contre l’hypertension. Nous avons également observé que la stimulation de cette fonction par l’Estétrol suffisait à reproduire les effets protecteurs des œstrogènes, ce qui ouvre une perspective thérapeutique potentielle. Deuxième étude : dans une deuxième partie, nous avons étudié l’effet protecteur d’ERα dans le vieillissement cardiovasculaire et rénal. Cette étude, toujours en cours, a pu mettre en évidence que la souris femelle ne présentait pas d’altération majeure de la fonction vasculaire et rénale . Toutefois, le récepteur ERα ne semble pas impliqué dans cette protection vis-à-vis du vieillissement. Cette étude a toutefois permis de mettre en évidence que les œstrogènes agissaient sur la biogénèse mitochondriale, d’une manière inattendue. Ces résultats seront approfondis dans de prochaines expériences.Conclusion En conclusion, ce travail de thèse a permis de mieux cerner l’implication des hormones œstrogéniques et de leur récepteur ERα dans le système cardiovasculaire. / Context : estrogenic hormones have numerous beneficial effects in the cardiovascular and renal systems but the underlying mechanisms are extensively complex. Estrogen receptor ERα is described as the main effector of the positive actions of estrogens. This receptor acts in the cell using two different pathways. In the nucleus, ERα acts as a transcription factor with genomic effects, through its activating functions AF. At the membrane, it exerts non-genomic effects, called MISS. First Study : in a first study, we have explored the protective mechanism of ERα in hypertension, a main risk factor in cardiovascular diseases. Using genetically modified mice, we have been able to highlight the involvement of AF-2 genomic actions against angiotensin II-induced hypertension. On the other hand, ERα-dependant MISS was not involved in ERα protection. Confirming our hypothesis, we found that AF-2 stimulation with estetrol was sufficient to completely prevent hypertension, thus providing a possible therapeutic perspective. Second Study : in a second project, we have investigated the protective actions of ERα against aging-related cardiovascular and renal alterations. This work is still ongoing but we found that 16 months-old female mice presented no obvious vascular or renal dysfunctions. Those results are surprising considering past published data on the subject. Aging mice lacking ERα-/-did not exhibit any particular alterations either. However, we were able to find that estrogens and ERs were involved in the mitochondria biogenesis in a surprising manner. These results will be further investigated in the future. Conclusion : to conclude, this work has allowed a better understanding of the estrogens receptors actions in the cardiovascular and renal systems

La signalisation cellulaire induite par les r écepteurs à sept domaines transmembranaires (R7TM) contrôle les principales fonctions physiologiques humaines. Ces R7TMs sont cibles de m édicaments et initient de larges réseaux d'interactions. Nous avons modélisé dynamiquement les réseaux de signalisation du récepteur à l'hormone folliculo-stimulante (FSH) régulant la fonction de reproduction et du récepteur angiotensine, un R7TM modèle régulant la tension pour comprendre le fonctionnement de ces réseaux et prédire des données inaccessibles expérimentalement. Notre modélisation a utilisé des équations différentielles ordinaires, en assimilant une variable par espèce et un paramètre par constante cinétique. Les paramètres manquant ont été déterminés par optimisation paramétrique. Puis, nous avons d éveloppé un environnement afin de comparer plusieurs algorithmes d'optimisation et de créer une nouvelle méthode hybride plus performante et adaptée à la paramétrisation des réseaux de signalisation.

Les NOX Homologues représentent une nouvelle famille de protéines transmembranaires dont la caractéristique commune est d'être le cœur catalytique de la production d'anions superoxydes. Elles ont toutes une structure proche de NOX2 (ou gp91Phox selon l'ancienne nomenclature), la mieux caractérisée d'entre elles, et sont organisées en 6 ou 7 domaines transmembranaires. Cette famille compte actuellement 7 membres, NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5 et DUOX 1 et DUOX2 ; elles ont une distribution tissulaire, cellulaire et intracellulaire spécifique les rendant quasi ubiquitaires dans l'organisme. Les fonctions de ces enzymes sont essentiellement rattachées à celles des espèces réactives de l'oxygène (ERO) mais dépendent aussi de leurs localisations. NOX2 est l'enzyme à l'origine de la production des ERO des phagocytes activés et a donc une fonction antimicrobienne. NOX3 est impliquée dans les pathologies du système vestibulaire et les DUOX1 et 2 sont des éléments clés de la biosynthèse des hormones thyroïdiennes. Les autres NOX, (NOX1, NOX4, NOX5), individualisées depuis quelques années seulement, ont une distribution tissulaire et cellulaire d'expression ARNm bien caractérisée, mais les données sur leurs fonctions physiologiques ou physiopathologiques restent fragmentaires ; Ces données sont le plus souvent issues d'expérimentations in vitro ou ex vivo n'évaluant leurs fonctions que de façon indirecte ou dans des systèmes simplifiés. Ainsi, en utilisant un modèle animal de souris déficientes pour le gène NOX1 établi dans le laboratoire, nous avons évalué directement la fonction de NOX1 dans le colon et dans le système vasculaire. <br />La première partie de ce travail a eu pour objectif de déterminer si NOX1 exerce une activité antibactérienne au niveau du colon et participe au contrôle de la translocation bactérienne à travers la muqueuse colique. NOX1 participe à la sévérité de la colite au Dextran Sulfate Sodium par l'intermédiaire de la flore colique et protège de la translocation bactérienne dans un modèle de neutropénie induite. Cependant, ces résultats devront être confirmés car les expérimentations ont toutes été réalisées avec des souris dont le fond génétique n'avait une homologie que de 87.5%. La seconde partie de notre travail devait déterminer si NOX1 exerce une activité régulatrice de la pression artérielle systolique et participe à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II. Nous montrons, avec des souris de génération F6 (homologie>98.5%), que NOX1 participe à la régulation physiologique de la pression artérielle, à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II et à la survenue de dissection aortique. NOX1 agit dans le tissu vasculaire par au moins 3 mécanismes, en favorisant l'accumulation de matrice extracellulaire, en régulant l'expression génique et en diminuant la biodisponibilité du NO.

L’hématopoïèse est assurée par une population de cellules souches hématopoïétiques (CSH) générées au cours du développement embryonnaire. L’objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes qui régulent l’émergence des CSH dans la niche hématopoïétique intra-embryonnaire. Nous avons démontré la présence dans cette région d’un Système Rénine- Angiotensine local et fonctionnel qui agit via la production de l’Angiotensine II sur les précurseurs pré-hématopoïétiques et les CSH émergentes. Egalement, nous avons mis en évidence la présence d’une accumulation de macrophages d’origine vitelline et démontré que ces cellules ont un rôle crucial dans l’émergence de l’hématopoïèse définitive en permettant la migration des précurseurs pré-hématopoïétiques. Une étude moléculaire nous a permis de démontrer que l’ACE - un marqueur des précurseurs pré-hématopoïétiques et CSH humaines - est une cible du facteur de transcription CDX2 qui en régule l’expression. Ces travaux contribuent à une meilleure compréhension de la mise en place du système hématopoïétique au cours du développement et sont prometteurs pour des fins thérapeutiques. / The continuous generation of blood cells throughout life relies on the existence of hematopoietic stem cells (HSC) generated during embryogenesis. The aim of my thesis was to understand the mechanisms underlying HSC emergence in the intra-embryonic hematopoietic niche. Many effectors have been detected in this region, including a functional and local Renin- Angiotensin System which acts directly on pre-HSC precursors and HSC emergence through the production of Angiotensin II . We have also observed an accumulation of yolk sac-derived macrophages in the same region and demonstrated that these cells have a crucial role in the establishment of definitive hematopoiesis, allowing the migration of the pre-HSC precursors in the mesenchyme. In addition, by a molecular study, we have demonstrated that ACE - a cell surface marker of human HSC also expressed on pre-hematopoietic cells - is a transcriptional target of the CDX2 homeoprotein. All these results contribute to a better understanding of the hematopoietic system during development and are promising for therapeutic purposes.

Le Syndrome d’Ehlers-Danlos vasculaire (SEDv) est une pathologie génétique rare à transmission autosomique dominante. Les patients sont prédisposés à la survenue de ruptures vasculaires, digestives et utérines induisant une létalité précoce. Cette pathologie est due à des mutations du gène COL3A1 (codant le collagène de type III), majoritairement de type faux-sens, agissant via un mécanisme dominant négatif. Plus rarement, de larges délétions ou des mutations non-sens induisent une haplo-insuffisance. In fine, les conséquences de ces mutations portent essentiellement sur la synthèse du collagène de type III, aboutissant à une fragilité artérielle importante. A ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible. L’inactivation du gène Col3a1 chez la souris entraine une mortalité in utero et néonatale quasi-systématique en cas d’homozygotie, mais les souris Col3a1+/- sont exemptes de phénotype vasculaire évident. Afin d’obtenir un modèle de dissection artérielle liée à un défaut de collagène de type III, une perfusion chronique d’Angiotensine II (Ang II) à dose pressive a été utilisée. Nos résultats montrent que l’haplo-insuffisance en collagène de type III confère une sensibilité artérielle majeure à l’Ang II. Cette fragilité est caractérisée par le développement de dissections/ruptures de l’aorte ascendante et induit des décès prématurés de ces animaux. Ce phénotype est lié non seulement à l’élévation de pression artérielle mais aussi à l’activation des voies de signalisation de l’Ang II. Enfin, nous montrons qu’un traitement associant un bêtabloquant (propranolol) et un vasodilatateur artériel (hydralazine) permet de réduire la mortalité induite par l’Ang II. Ces résultats suggèrent l’intérêt de l’ajout d’un traitement préventif par inhibiteur de l’Ang II au traitement bêtabloquant (Celiprolol) recommandé dans la pathologie humaine.Parallèlement, nous avons généré un modèle murin knock-in génétiquement plus proche des patients SEDv, par l’introduction d’une mutation ponctuelle faux-sens (Gly183Ser) observée chez un patient. L’analyse préliminaire de ce modèle montre que les souris Col3a1+/G183S décèdent spontanément, dès 4 semaines, de ruptures/dissections de l’aorte ascendante. Cependant, ces souris ne présentent de modification ni de leurs paramètres hémodynamiques, ni de leurs diamètres aortiques. En revanche, environ 20 % des souris Col3a1+/G183S présentent des plaies au niveau du dos et des pattes. Ce nouveau modèle de souris est actuellement le seul à récapituler aussi fidèlement le phénotype des patients SEDv. Il devrait donc permettre de tester différentes approches thérapeutiques. / Vascular Ehlers-Danlos (vEDS) syndrome is a rare, inherited, autosomal dominant disease that results from mutations in the COL3A1 gene, encoding type III collagen. Patients are mostly affected by missense mutations probably acting through a dominant negative mechanism. A few patients present large deletions or nonsense mutations leading to a haploinsufficient mechanism. These mutations are supposed to lead to a defect in the synthesis and secretion of collagen type III, resulting in arterial wall fragility. Consequently, vEDS is mostly characterized by ruptures/dissections in arteries at a young age, which ultimately lead to premature death. While there is currently no surgical or therapeutic treatments available, a recent study reported the beneficial effect of the beta-blocker celiprolol, which prevents vascular complications in patients.To investigate the vascular phenotype of vEDS, a mouse model of this disease has been generated by the complete and ubiquitous inactivation of the COL3A1 gene. Col3a1-/- mice exhibit severe perinatal mortality and die prematurely from spontaneous vascular rupture. However, Col3a1+/- mice are viable and exhibit no obvious vascular phenotype. To determine the susceptibility of Col3a1+/- mice to develop vascular rupture/dissection, an experimental model of aneurysm induction was used, through the chronic infusion of Angiotensin II (Ang II). Our results showed that Ang II infusion led to severe premature mortality in Col3a1+/- compared to wild type. This fragility was characterized by the development of rupture/dissection in the ascending aorta. These lesions could be caused by the elevation of blood pressure and/or the activation of Ang II signaling pathways. We showed that treatment with a beta-blocker (propranolol) and an arterial vasodilator (hydralazine) reduced the mortality induced by Ang II in Col3a1+/- mice. These results suggest the beneficial effect of adding a preventive treatment inhibitor of Ang II to the beta-blocker treatment recommended in human pathology.Meanwhile, given that a majority of human vEDS cases is caused by missense mutations in the COL3A1 gene, we established a knock-in mouse model bearing a point mutation (Gly183Ser) found in vEDS patients. The preliminary characterization of this model showed that Col3a1+/G183S mice die spontaneously as early as 4 weeks of age from a dissection or rupture of the ascending aorta. However, these mice do not showed any changes of their hemodynamic parameters or aortic diameter. Furthermore, about 20 % of mouse Col3a1+/G183S display wounds in the back and legs. This new mouse model is currently the only that mimic more closely the human disease and could therefore be used to test different therapeutic strategies.

L’hypertension artérielle est une maladie induite par de multiples facteurs génétiques et environnementaux. De nombreuses pathologies y sont associées. A travers ce travail, j’ai abordé trois aspects de la régulation de la pression artérielle in vivo et in vitro. Dans une première partie, j’ai étudié le rôle de l’activation du récepteur AT1 de l’angiotensine II dans le développement de la fibrose, indépendamment de l’hypertension artérielle. Un modèle animal exprimant un récepteur constitutivement actif et des modèles cellulaires (MEF, HEK293, H295) exprimant le récepteur constitutivement actif de façon inductible ont été utilisés. Contrairement aux souris sur fond mixte, les souris mutées sur fond pur C57Bl6 ne développent pas de fibrose cardiaque et rénale et ont une hypertension modérée, qui est difficile à réduire par les anti-hypertenseurs. De plus, les cellules fibroblastiques MEF ne sont pas un bon modèle pour étudier la fibrose induite par l’angiotensine II. Seule l’ostéopontine est un marqueur induit par l’expression du récepteur AT1 contitutivement actif. Ces différents modèles, étudiés extensivement, ne sont donc pas adaptés pour répondre aux questions posées. Dans la seconde partie de ma thèse, un travail collaboratif a permis de mettre en évidence le rôle majeur de Wnk1 au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire induits par une infusion chronique d’angiotensine II. En effet, les souris Wnk1+/- (haplo-insuffisantes pour le gène Wnk1) présentent une résistance transitoire à l’hypertension induite par l’angiotensine II, particulièrement au cours de la première semaine d’infusion. Cette résistance est associée à une altération du remodelage hypertrophique cardiovasculaire mais la fonction rénale et la sécrétion d’aldostérone sont préservées. Au niveau mécanistique, nos résultats ont identifié Wnk1 comme un activateur important de la phosphorylation de Mypt1, un marqueur connu de l’activité de la voie Rho-kinase. Les aortes de souris Wnk1+/- présentent une diminution transitoire de la phosphorylation de Mypt1 après une semaine d’infusion d’angiotensine II. De façon importante, nous montrons aussi que l’infusion chronique d’angiotensine II induit une activation de l’expression du gène Wnk1 au niveau aortique, et la surexpression de Wnk1 in vitro active de façon importante et reproductible la phosphorylation de Mypt1, indépendamment de l’activation de Spak (substrat bien caractérisé de Wnk1). En conclusion, ce travail a permis d’identifier Wnk1 comme un nouveau gène cible de l’angiotensine II au niveau vasculaire et a révélé un nouveau mécanisme mis en jeu au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire qui lui est associé. Cette étude fait l’objet d’un article que je signe en premier auteur et qui est actuellement soumis pour publication. Dans une dernière partie, j’ai étudié le rôle de la culline3 dans la régulationde la voie RhoKinase. Les mutations du gène Cul3 ont très récemment été identifiées comme responsables du syndrome de Gordon. Ce gène code une protéine d’échafaudage d’un complexe d’ubiquitination important et ubiquitaire (CRL3) conduisant à la dégradation protéique. La voie des Rho-kinases joue un rôle majeur dans le tonus vasculaire et sa régulation par les agents relaxants ou constricteurs. Des travauxrécents suggèrent que la dégradation de RhoA implique le complexe culline3-ring-ligase (CRL3). Nous avons voulu établir les liens structuraux et fonctionnels entre ce complexe d’ubiquitination et la voie Rho-kinase dans des modèles cellulaires, pour ainsi expliquer tout ou partie du mécanisme moléculaire conduisant des mutations constitutionnelles du gène Cul3 à produire une hypertension artérielle. Les interactions protéiques entre deux adaptateurs différents et la culline3 nous ont permis de montrer que la culline3 mutée entraine une modification d’affinité spécifique selon ses partenaires. Les interactions entre RhoA et le CRL3 n’ont pas pu être démontré. (...) / Hypertension is a disease due to multiple genetic and environmental factors. Many cardiovascular diseases are associated. During my PhD thesis, I addressed three aspects of the regulation of blood pressure in vivo and in vitro. In the first part, I studied the role of angiotensin II AT1 receptor activation in the development of fibrosis, independently of hypertension. I used animal and cellular models (MEF, HEK293, H295) expressing a constitutively active receptor. The results show that the mutant mice did not develop cardiac or renal fibrosis in a pure C57Bl6 strain. Furthermore, their moderate hypertension has not been normalized with two antihypertensives. The pure C57BL6 genetic background seems to be the cause of this moderate phenotype. Furthermore, MEF cells are not a good model to study fibrosis induced by angiotensin II. Only osteopontin is a marker induced by expression of the mutant receptor. As the mouse models and despite of their originality, these cellular models appear to be inappropriate to study AngII-dependent fibrosis. These limitations together with the weakness of the AT1 mutant phenotype lead to us to stop this project. In the second part of my thesis, a collaborative study allows us to show that Wnk1-haploinsufficiency in mice is responsible for a strong and transitory resistance to angiotensin II (AngII)-induced hypertension associated with a significant reduction of cardiovascular remodeling and a preservation of renal function and aldosterone release. Mechanistically, we unravel a critical role for Wnk1 in the activation of the phosphorylation of Mypt1, a known marker of the Rho-kinase pathway activity. Wnk1-haploinsufficient mice display a significant and transitory decrease of AngII-induced phospho- Mypt1 in the aorta, concomitant to the hypertension-resistance. Importantly, we further evidence that, in the vasculature, AngII chronic infusion induces a significant upregulation in Wnk1 gene expression which causes in vitro a significant increase in Mypt1 phosphorylation independently of spak activation. Our results provide new insight into the downstream vascular signaling pathway of AngII and unravel a previously unsuspected mechanism linking Wnk1 to hypertension and vascular remodeling. In the last part, I studied the role of vascular Cullin3 (Cul3) in the development of hypertension. Mutations in this gene have been recently identified as responsible for a familial hypertension with hyperkalaemia, FHHt. The Cul3 gene encodes an important and ubiquitous ubiquitin scaffold protein participating to a protein degradation complex (CRL3). The Rho-kinase pathway plays a major role in vascular tone and its regulation by relaxing or vasoconstricting agents. Recent studies suggest that the degradation of RhoA involves the CRL3 complex. I started to analyze the structural and functional links between this ubiquitination complex and the Rho kinase pathway in cellular models to explain all or part of the molecular mechanisms leading constitutional mutations of Cul3 gene to produce hypertension. I have shown that the Cul3Δ9 mutant presents an increased neddylation compared to the wild form and mofications of its affinity for some adaptors. However, in this preliminary work, its interactions with and its role in the degradation of RhoA have not been demonstrated yet. This PhD thesis has helped to address several aspects of the pathophysiology of the vessels and the role of angiotensin II in these regulations using modern tools, original mouse and cell line models. This has particularly highlighted a new target of angiotensin II and a new WNK1 vascular role.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Angiotensinogen (ANG) is a single peptide glycoprotein that contains 452 amino acids in human (453 amino acids in rodents). ANG releases a 10-amino acids peptide known as angiotensin l (Ang I) from it's N-terminal when acted by renin, a acidic protease. Ang I can be fiirther converted into angiotensin II (Ang II) by angiotensin converting enzyme (ACE). Ang II is one of the most potent vasoconstrictors known. Ang II also acts on the brain to mcrease blood pressure. Ang II acts on the adrenal cortex to increase the secretion of aldosterone. The levels of ANG in plasma or local tissues diïectly contribute to the levels ofAng II. Therefore the studies of regulation ofANG gene expression is important to understand the molecular mechanisms of some related diseases, such as hypertension. Previous studies m which the transfection of the fusion genes that were generated with various lengths of 5'-flanking region of the rat ANG gene linked to a bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene as a reporter into mouse hepatoma (Hepa 1- 6) ceUs and opossum kidney (OK) cells, identified a putative cyclic AMP responsive element (CRE) in the rat ANG gene 5'-regulatory region (N-806/-779). Compared with palindromic CRE octamer (TGACGTCA), the putative CRE of the ANG gene (ANG-CRE) is almost identical except the last two bases were in reversed order (TGACGTAC). In the present study, we isolated a fuU-length cDNA of 1345 base pairs from mouse liver cDNA library, which encodes a nuclear DNA-binding protein consisting of 436 amino acids with an apparent molecular weight of 52 kilodalton (kDa). This protein binds to the ANG-CRE, and was designated as 52-kDa protein. Southwestern blot revealed that this 52 kDa protein was present in the following tissues, such as liver, kidney, testis, brain, but not in spleen. Analysis of the deduced amino acid sequence shows no apparent basic regionleucine zipper (bZIP) stmcture, indicatmg ANG-CREB is structurally distinct fi-om bZIP family members. The antiserum against 43-kDa-CREB or ATF-2 can not interact with this 52-kDa protein, further supporting that the 52-kDa protem is immunologically different fi-om the bZIP family. The 52-kDa protein may represent a new group of CRE-binding proteins. Competitive gel mobility shift assays and Southwestern blot analysis revealed that the ANG-CREB binds to ANG-CRE, and this bindmg is not displaceable by excess amounts of CREs fi-om somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxyl kmase PEPCK), and tyrosine ammo transferase (TAT) genes in vitro. These data suggest that the 52-kDa protein binds specifically to ANG-CRE and may regulate the ANG gene expression. The biological function of the 52-kDa protein is not known at present. The primary data from transient gene transfection assays showed that this protein has represser activity on the ANG gene promoter when ANG gene was stimulated by isoproterenol, but showed no effect on the ANG basal level (without any stimulation). Further experiments will be needed to study the biological function of the 52-kDa protein. / L'angiotensinogène (ANG) est une glycoprotéine fonnée de 452 acide aminés chez l'humain (453 acide aminés chez les rongeurs). Une protéase acide, la rénine, clive l'ANG de son côté N-tenninal en libérant un peptide de 10 acide aminés connu sous le nom de l'angiotensine I (Angl). Ce dernier, peut être converti en angiotensine II (AngII) sous Faction d'une enzyme de conversion dite ACE. L'Ang II est un puissant vasocoiisticteur. Il agit au niveau du cerveau en augmentant la pression sanguine et au niveau du cortex rénal en augmentant la sécrétion de l'aldostérone. Les niveaux de l'ANG daiis le plasma ou dans les tissus locaux sont directement proportionnels aux niveaux de Ang II. Ainsi les études de regulation de l'expression du gène d'Ang II sont importantes pour comprendre les mécanismes moléculaires de certames maladies, comme l'hypertension. Des études antérieiu-es par transfection en utilisant des gènes de fusion générés avec différentes longueurs de région flanquées en 5' du gène ANG de rat lié au gène rapporteur de bactérie, le chloramphénicol acetyl transférase (CAT), dans les ceUules hépatome (Hepa 1-6) de souris et dans les ceUules rénales de sarigue, ont permis d'identifier un présumé élément réponse (CRE) d'AMP cyclique dans la région régulatrice en 5' du gène ANG de rat (N- 806/-779). En comparant l'octamère palindromique de CRE (TGACGTCA) avec le présumé CRE du gène ANG (ANG-CRE), il semble qu'ils sont identiques à l'exception des deux dernières bases qui sont dans un ordre inversé (TGACGTAC). Dans cette étude, nous avons isolé à partir d'une banque de cDNA du foie de souris, une cDNA de 1345 paire de bases qui code pour une protéine de liaison à l'ADN nucléaire. Cette protéine est fonnée de 436 acide aminés avec un poids moléculaire apparent de 52 kilodalton (kDa). En se liant à ANG-CER, cette protéme est désignée comme la 52-kDa protéine. Le "Southwestern blot" a révélé que la 52-kDa protéine de 52 kDa est présente dans les tissus suivants: foie, rein, testicule et cerveau; mais absente dans la rate. L'analyse de cette séquence déduite d'acide aminés ne montre pas du stmcture apparent à la région basique de la fermeture éclaire à leucine, bzip (basic region-leucme zipper), indiquant que la 52-kDa protéine est structurellement distincte des membres de la famille bzip. L'antisérum dérigé contre le 43- kDa-CREB ou contre ATF-2 n'intéragit pas avec la 52-kDa protéme confermant amsi que la 52-kDa protéine est immunologiquenient dififérente des membres de famille bzip. La 52-kDa protéine représente donc, un nouveau groupe des protéines de liaison à CRE. Les essais sur gel à mobilité compétitive et les analyses de "southwestern blot" ont révélé que la 52-kDa protéine lié ANG-CRE et que cette liaison n'était pas déplaçable par un excès du gène CRE de somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxy kmase (PEPCK) et tyrosme ammo transférase (TAT) m vitro, suggérant que la 52-kDa protéine se lié spésifiquement à ANGCRE et qu'il peut réguler l'expression du gène ANG. Les fonctioiis biologiques de la 52- kDa protéine ne sont pas encore connus. Les premiers résultats obtenus à partir des essais de transfections des gènes transitoirs montrent que cette protéine a une activité represseur sur le promoteur du gène d'ANG quand ce dernier est stimulé par l'isoprotérénol, et que, sans stimulation, elle a aucun effet sur le niveau basai d'ANG. Les expériences futures seront nécessaires poiir étudier les fonctions biologiques d'AND.