Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde et voient leur incidence augmenter avec l’expansion de leurs principaux facteurs de risque, tels que le vieillissement, l’obésité et le diabète. Parmi ces maladies l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA), dont on sait aujourd’hui que le système immunitaire favorise le développement. Il est parmi les pathologies les plus courantes de l’aorte abdominale et représente un problème de santé publique. Le rôle des macrophages dans l’AAA a été récemment mis en évidence. Ces cellules inflammatoires sont les plus représentées dans l’adventice anévrismale, et ont tendance à s’accumuler au cours du temps dans l’AAA. Des données récentes montrent que leur accumulation est particulièrement accrue dans les premiers jours de la formation de l’AAA chez la souris, et que l’inhibition de la voie CCR2/MCP1 ou la déplétion précoce des monocytes circulants ont un effet protecteur. Il semble donc essentiel de comprendre les mécanismes d’infiltration des monocytes lors de l’initiation et du développement de l’AAA. Mon travail de thèse se focalise sur le rôle des sous-types monocytaires et l’impact de leur trafic sur le développement de l’AAA. En utilisant un modèle d’induction d’anévrisme chez des souris ApoE-/-, nous avons montré que l’angiotensine-II (Ang II) entraine la mobilisation des monocytes ‘Ly-6Chigh’, et des monocytes ‘Ly-6Clow’ à un moindre degré, à partir de la rate, puis leur recrutement au niveau de l’aorte. La splénectomie ou la déficience en lymphocyte B inhibe cette mobilisation monocytaire et protège de l’anévrisme. En revanche, la reconstitution de souris immuno-déficientes Apoe-/-Rag2-/- par des splénocytes totaux, contrairement aux splénocytes déplétés en lymphocytes B, restaure la mobilisation monocytaire et restitue la susceptibilité de ces souris à l’AAA. Cette thèse apporte de nouveaux indices sur les événements précoces impliqués dans la formation d’AAA, en mettant l’accent sur le rôle du réservoir monocytaire splénique dans ce processus. Elle identifie également une fonction jusque-là méconnue des lymphocytes B dans la mobilisation rapide et transitoire des monocytes en réponse à l’Ang II. Il conviendra par la suite d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces interactions, ce qui devrait permettre d’envisager de nouvelles voies thérapeutiques visant à moduler l’effet de ces types cellulaires dans l’AAA. / Cardiovascular diseases are the first cause of mortality around the industrialized world with a continuous increase in their incidence along with the expansion of the major risk factors such as aging, obesity and diabetes. In abdominal aortic aneurysm (AAA), the presence of inflammatory infiltrates, and particularly monocytes/macrophages, has underscored the contribution and importance of immuno-inflammatory responses in aneurysmal degeneration. It is one of the most common diseases of the abdominal aorta and presents a major health problem. The importance of macrophages has recently been highlighted by a number of evidence, which are the main population observed within the site of aneurysm, are believed to derive from circulating monocytes although no direct evidence has been provided to date. Recent evidence has shown that their accumulation is particularly enhanced in the early onset of AAA in mice, and that the inhibition of CCR2/ MCP1 signaling as well as the early depletion of circulating monocytes, are protective. Hence, it seems crucial to understand the mechanisms of monocyte recruitment in the initiation and progression of AAA. In this PhD project with a particular interest in abdominal aortic aneurysm, we were particularly interested in understanding the trafficking behavior of monocyte subsets in AAA and their role in disease pathogenesis. Using a mouse model of aneurysm induction in ApoE-/- mice, we showed that Ang II triggered the mobilization of Ly-6Chigh, and to a lesser extent Ly-6Clow monocytes, from the spleen and their consequent recruitment in the aorta. Spleen removal or B lymphocyte deficiency in Apoe-/- mice similarly impaired early monocyte mobilization in response to Ang II and protected against AAA development, independently of blood pressure. Reconstitution of Apoe-/- Rag-/- mice with total splenocytes but not with B-Cell depleted splenocytes restored monocyte mobilization in response to Ang II and enhanced susceptibility to AAA. Taken together, this study provides novel mechanistic insights on the early events involved in AngII-induced AAA formation. It highlights the role of the splenic monocyte reservoir in this process and identifies an intriguing role for B lymphocytes in mediating AngII-induced early and transient mobilization of splenic monocytes. Nevertheless, further understanding of the molecular mechanisms that underlie such interactions is likely to lead to the identification of effective therapeutic targets.

L'angiotensine II (Ang II) joue un rôle important dans la régulation du système cardiovasculaire par l’activation de plusieurs voies de signalisation. L’activation de ces voies passe par le récepteur de l'angiotensine II de type 1 (AT1R). Ce récepteur fait partie de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). De plus, il est maintenant connu que certains ligands peuvent lier le récepteur et induire une conformation qui permet d'activer certaines voies de signalisation tout en n’étant pas favorable à l'activation d'autres voies. Il est alors question de sélectivité fonctionnelle, aussi appelée signalisation biaisée. Ainsi, avec cette approche, il est possible de cibler les voies qui produiront les effets thérapeutiques désirés sans toutefois activer les voies qui seraient responsables des effets indésirables. Nous avons émis l’hypothèse que de cycliser des ligands va restreindre les conformations possibles lors du couplage avec AT1R et induire un agonisme biaisé. Ainsi, des analogues cycliques de l’AngII substitués aux positions 3 et 5 par des cystéines et des homocystéines ont été synthétisés: [Sar1Hcy3,5]AngII, [Sar1Cys3Hcy5]AngII et [Sar1Cys3,5]AngII. D’abord, la capacité de ces analogues cycliques à activer la voie Gq a été évaluée par la mesure de la production des inositol phosphates. Puis, la capacité à activer les voies G12, le recrutement des β-arrestines (1 et 2) ainsi que l’activation de ERK1/2 a également été évaluée. Nos travaux ont montré que l’analogue cyclique [Sar1Hcy3,5]AngII a une puissance et une efficacité maximales sur toutes les voies testées à l'exception de la voie Gq. Des simulations de dynamique moléculaire ont été effectuées pour nous permettre de comprendre comment la conformation du ligand influence la structure d’AT1R et donc l’activation des différentes voies de signalisation. Les simulations en dynamique moléculaire ont montré que la barrière énergétique associée à l'insertion du résidu Phe8 de l’AngII dans le coeur hydrophobe d'AT1R est augmentée avec [Sar1Hcy3,5]AngII, pouvant expliquer que cet analogue active moins bien la voie Gq. D’autres analogues cyclisés aux positions 3 et 5 de l’AngII ont été synthétisés; [Sar1Hcy3Ile4Hcy5]AngII, [Sar1Hcy3,5Ile8]AngII et [Sar1Hcy3Cys5]AngII. Leur capacité à activer les voies Gq, ERK1/2 et le recrutement des β-arrestines (1 et 2) a été évaluée. L’analogue [Sar1Hcy3Cys5]AngII semblait bien activer la voie ERK1/2, mais pas les voies G12 et β-arrestines. Ces résultats suggèrent que le fait de contraindre les mouvements des déterminants moléculaires d’un ligand en introduisant des structures cycliques peut entraîner un biais dans la signalisation en stabilisant différentes structures du récepteur. / Abstract: Angiotensin II (Ang II) has an important role in the regulation of the cardiovascular system by its ability to activate several signaling pathways. The activation of these pathways occurs via the angiotensin II receptor type 1 (AT1R). This receptor belongs to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). Moreover, it is now known that certain ligands can bind to the receptor and induce a conformation that allow the activation of certain signaling pathways while not promoting the activation of other pathways. This concept is known as functional selectivity or biased signaling. With this approach, it is possible to target the signaling pathways that produce the desired therapeutic effects rather than activating the pathways responsible for adverse effects. We hypothesized that cyclizing ligands would restrict possible conformations when coupled with AT1R and induce biased agonism. Thus, cyclic AngII analogs substituted at positions 3 and 5 by cysteines and homocysteines were synthesized: [Sar1Hcy3,5]AngII, [Sar1Cys3Hcy5]AngII and [Sar1Cys3,5]AngII. First, the ability of these cyclic analogs to activate the Gq pathway was measured by the inositol phosphates production. Then, the G12 pathway activation, β-arrestin (1 and 2) recruitment and the ability of these analogs to activate the ERK1/2 pathway was evaluated. Our work has shown that [Sar1Hcy3,5]AngII has maximum potency and efficacy on all of the evaluated pathways, except for the Gq pathway. Molecular dynamic simulations were used to understand how a distinct ligand conformation influences the AT1R structure and the activation of signaling pathways. These studies have shown that the energy barrier associated with the insertion of the Phe8residue of AngII within the hydrophobic core of AT1R is increased with [Sar1Hcy3,5]AngII, possibly explaining why this analog is less potent in activating the Gq pathway. Other analogues cyclized at positions 3 and 5 of AngII were synthesized; [Sar1Hcy3Ile4Hcy5]AngII, [Sar1Hcy3,5Ile8]AngII and [Sar1Hcy3Cys5]AngII. Their ability to activate Gq, ERK1/2 and recruitment of β-arrestins (1 and 2) was evaluated. The analog [Sar1Hcy3Cys5]AngII appeared to activate the ERK1/2 pathway but not the G12 and β-arrestin pathways. These results suggest that constraining the movements of molecular determinants of a ligand by introducing cyclic structures can lead to a signaling bias by stabilizing different structures of the receptor.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le trouble de stress post-traumatique (TSPT) affecte plus de 9% de la population, et les traitements pharmacologiques disponibles sur le marché ont une efficacité limitée. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles avenues thérapeutiques. Bien que de nombreuses études suggèrent un rôle pour l'angiotensine II (Ang II) dans la réponse au stress, la littérature concernant l'impact du système rénine-angiotensine (SRA) périphérique dans le développement d'un TSPT demeure insuffisante. Nous avons émis l'hypothèse qu'à la suite de l'expérience d'un trauma psychologique, la liaison de l'Ang II aux récepteurs à l'angiotensine de type 1a situés au niveau des cellules endothéliales ($\mathrm{eAT_{1a}R}$) mène à une augmentation de l'inflammation périphérique, un dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE), à l'infiltration de molécules inflammatoires et contribue au développement d'un TSPT. Pour tester cette hypothèse, des souris déficientes en $\mathrm{eAT_{1a}R}$ ($\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$) et sauvages (WT) ont été exposées à un stress de prédation. Nous montrons une réduction de l'anxiété chez les souris $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ des deux sexes, ainsi qu'une réduction des comportements d'évitement chez les souris $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ mâles. Chez les souris femelles, le génotype $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ est aussi associé à une expression accrue de la protéine de jonction claudine-5 dans le cortex préfrontal et une réduction de l'inflammation périphérique. Ces résultats montrent pour une première fois une implication directe de la signalisation de l'Ang II par les $\mathrm{AT_{1a}R}$s endothéliaux dans la perméabilisation de la BHE et le développement de comportement de type TSPT. La délétion des $\mathrm{eAT_{1a}R}$s n'affecte pas l'expression des protéines de jonction et l'inflammation chez les mâles, suggérant que les mécanismes par lesquels l'angiotensine II affecte le comportement diffèrent selon le sexe. Les résultats présentés ici nous permettent de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l'implication du SRA dans le TSPT et suggèrent que le SRA périphérique représente une cible potentielle pour son traitement. / Posttraumatic stress disorder (PTSD) affects over 9% of the population. Moreover, approved pharmacological treatments have limited effectiveness and a high relapse rate. In order to develop new therapeutic avenues, research focusing on the pathophysiological mechanisms of PTSD is therefore necessary. Although numerous studies support a role for angiotensin II (Ang II) in stress response, literature regarding the impact of the peripheral renin-angiotensin system (RAS) on the development of PTSD remains insufficient. We hypothesized that following the experience of a psychotrauma, Ang II binding to endothelial angiotensin receptors ($\mathrm{eAT_{1a}R}$) leads to increased peripheral inflammation, dysfunction of the blood-brain barrier (BBB), passage of inflammatory molecules into the brain and susceptibility to PTSD. To test this hypothesis, $\mathrm{eAT_{1a}R}$-deficient ($\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$) and wild-type (WT) mice were exposed to predator stress. Anxiety-like and avoidance behaviors as well as biological parameters such as blood pressure, BBB integrity and neuroinflammation were assessed. We show a reduction in anxiety in $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ mice for both sexes, as well as less avoidance behaviors in male $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ mice. In female mice, $\mathrm{eAT_{1a}R\scriptscriptstyle^{-/-}}$ genotype is also associated with increased expression of the tight-junction protein claudin 5 in the prefrontal cortex and decreased peripheral inflammation. For the first time, these results show a direct involvement of Ang II signaling through endothelial $\mathrm{AT_{1a}R}$s in BBB permeabilization and the development of anxiety-like and PTSD-like behavior. Deletion of $\mathrm{eAT1aR}$s does not affect tight-junction protein levels in males, suggesting that the mechanisms by which angiotensin II affects behavior differ in a sex-dependent manner. Overall, this study enhances our understanding of the mechanisms by which the RAAS is linked to PTSD and shine a light on the peripheral RAAS as a potential target for PTSD treatment.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Contexte : les hormones œstrogéniques ont de nombreux effets protecteurs au niveau cardiovasculaire et rénal mais leurs mécanismes sont très complexes. Le récepteur aux œstrogènes ERα est le principal effecteur des effets bénéfiques de ces hormones. Il possède deux voies d’action. Dans le noyau, il a des effets génomiques via ses fonctions d’activation AF. A la membrane, il a des effets non-génomiques via une signalisation membranaire MISS. Première étude : dans une première étude, nous avons exploré le mécanisme protecteur d’ERα dans l’hypertension artérielle, un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires. Nous avons mis en évidence le rôle protecteur des effets génomiques d’ERα via sa fonction AF-2 contre l’hypertension. Nous avons également observé que la stimulation de cette fonction par l’Estétrol suffisait à reproduire les effets protecteurs des œstrogènes, ce qui ouvre une perspective thérapeutique potentielle. Deuxième étude : dans une deuxième partie, nous avons étudié l’effet protecteur d’ERα dans le vieillissement cardiovasculaire et rénal. Cette étude, toujours en cours, a pu mettre en évidence que la souris femelle ne présentait pas d’altération majeure de la fonction vasculaire et rénale . Toutefois, le récepteur ERα ne semble pas impliqué dans cette protection vis-à-vis du vieillissement. Cette étude a toutefois permis de mettre en évidence que les œstrogènes agissaient sur la biogénèse mitochondriale, d’une manière inattendue. Ces résultats seront approfondis dans de prochaines expériences.Conclusion En conclusion, ce travail de thèse a permis de mieux cerner l’implication des hormones œstrogéniques et de leur récepteur ERα dans le système cardiovasculaire. / Context : estrogenic hormones have numerous beneficial effects in the cardiovascular and renal systems but the underlying mechanisms are extensively complex. Estrogen receptor ERα is described as the main effector of the positive actions of estrogens. This receptor acts in the cell using two different pathways. In the nucleus, ERα acts as a transcription factor with genomic effects, through its activating functions AF. At the membrane, it exerts non-genomic effects, called MISS. First Study : in a first study, we have explored the protective mechanism of ERα in hypertension, a main risk factor in cardiovascular diseases. Using genetically modified mice, we have been able to highlight the involvement of AF-2 genomic actions against angiotensin II-induced hypertension. On the other hand, ERα-dependant MISS was not involved in ERα protection. Confirming our hypothesis, we found that AF-2 stimulation with estetrol was sufficient to completely prevent hypertension, thus providing a possible therapeutic perspective. Second Study : in a second project, we have investigated the protective actions of ERα against aging-related cardiovascular and renal alterations. This work is still ongoing but we found that 16 months-old female mice presented no obvious vascular or renal dysfunctions. Those results are surprising considering past published data on the subject. Aging mice lacking ERα-/-did not exhibit any particular alterations either. However, we were able to find that estrogens and ERs were involved in the mitochondria biogenesis in a surprising manner. These results will be further investigated in the future. Conclusion : to conclude, this work has allowed a better understanding of the estrogens receptors actions in the cardiovascular and renal systems

Les NOX Homologues représentent une nouvelle famille de protéines transmembranaires dont la caractéristique commune est d'être le cœur catalytique de la production d'anions superoxydes. Elles ont toutes une structure proche de NOX2 (ou gp91Phox selon l'ancienne nomenclature), la mieux caractérisée d'entre elles, et sont organisées en 6 ou 7 domaines transmembranaires. Cette famille compte actuellement 7 membres, NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5 et DUOX 1 et DUOX2 ; elles ont une distribution tissulaire, cellulaire et intracellulaire spécifique les rendant quasi ubiquitaires dans l'organisme. Les fonctions de ces enzymes sont essentiellement rattachées à celles des espèces réactives de l'oxygène (ERO) mais dépendent aussi de leurs localisations. NOX2 est l'enzyme à l'origine de la production des ERO des phagocytes activés et a donc une fonction antimicrobienne. NOX3 est impliquée dans les pathologies du système vestibulaire et les DUOX1 et 2 sont des éléments clés de la biosynthèse des hormones thyroïdiennes. Les autres NOX, (NOX1, NOX4, NOX5), individualisées depuis quelques années seulement, ont une distribution tissulaire et cellulaire d'expression ARNm bien caractérisée, mais les données sur leurs fonctions physiologiques ou physiopathologiques restent fragmentaires ; Ces données sont le plus souvent issues d'expérimentations in vitro ou ex vivo n'évaluant leurs fonctions que de façon indirecte ou dans des systèmes simplifiés. Ainsi, en utilisant un modèle animal de souris déficientes pour le gène NOX1 établi dans le laboratoire, nous avons évalué directement la fonction de NOX1 dans le colon et dans le système vasculaire. <br />La première partie de ce travail a eu pour objectif de déterminer si NOX1 exerce une activité antibactérienne au niveau du colon et participe au contrôle de la translocation bactérienne à travers la muqueuse colique. NOX1 participe à la sévérité de la colite au Dextran Sulfate Sodium par l'intermédiaire de la flore colique et protège de la translocation bactérienne dans un modèle de neutropénie induite. Cependant, ces résultats devront être confirmés car les expérimentations ont toutes été réalisées avec des souris dont le fond génétique n'avait une homologie que de 87.5%. La seconde partie de notre travail devait déterminer si NOX1 exerce une activité régulatrice de la pression artérielle systolique et participe à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II. Nous montrons, avec des souris de génération F6 (homologie>98.5%), que NOX1 participe à la régulation physiologique de la pression artérielle, à la survenue de l'hypertension artérielle induite par l'angiotensine II et à la survenue de dissection aortique. NOX1 agit dans le tissu vasculaire par au moins 3 mécanismes, en favorisant l'accumulation de matrice extracellulaire, en régulant l'expression génique et en diminuant la biodisponibilité du NO.

Le Syndrome d’Ehlers-Danlos vasculaire (SEDv) est une pathologie génétique rare à transmission autosomique dominante. Les patients sont prédisposés à la survenue de ruptures vasculaires, digestives et utérines induisant une létalité précoce. Cette pathologie est due à des mutations du gène COL3A1 (codant le collagène de type III), majoritairement de type faux-sens, agissant via un mécanisme dominant négatif. Plus rarement, de larges délétions ou des mutations non-sens induisent une haplo-insuffisance. In fine, les conséquences de ces mutations portent essentiellement sur la synthèse du collagène de type III, aboutissant à une fragilité artérielle importante. A ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible. L’inactivation du gène Col3a1 chez la souris entraine une mortalité in utero et néonatale quasi-systématique en cas d’homozygotie, mais les souris Col3a1+/- sont exemptes de phénotype vasculaire évident. Afin d’obtenir un modèle de dissection artérielle liée à un défaut de collagène de type III, une perfusion chronique d’Angiotensine II (Ang II) à dose pressive a été utilisée. Nos résultats montrent que l’haplo-insuffisance en collagène de type III confère une sensibilité artérielle majeure à l’Ang II. Cette fragilité est caractérisée par le développement de dissections/ruptures de l’aorte ascendante et induit des décès prématurés de ces animaux. Ce phénotype est lié non seulement à l’élévation de pression artérielle mais aussi à l’activation des voies de signalisation de l’Ang II. Enfin, nous montrons qu’un traitement associant un bêtabloquant (propranolol) et un vasodilatateur artériel (hydralazine) permet de réduire la mortalité induite par l’Ang II. Ces résultats suggèrent l’intérêt de l’ajout d’un traitement préventif par inhibiteur de l’Ang II au traitement bêtabloquant (Celiprolol) recommandé dans la pathologie humaine.Parallèlement, nous avons généré un modèle murin knock-in génétiquement plus proche des patients SEDv, par l’introduction d’une mutation ponctuelle faux-sens (Gly183Ser) observée chez un patient. L’analyse préliminaire de ce modèle montre que les souris Col3a1+/G183S décèdent spontanément, dès 4 semaines, de ruptures/dissections de l’aorte ascendante. Cependant, ces souris ne présentent de modification ni de leurs paramètres hémodynamiques, ni de leurs diamètres aortiques. En revanche, environ 20 % des souris Col3a1+/G183S présentent des plaies au niveau du dos et des pattes. Ce nouveau modèle de souris est actuellement le seul à récapituler aussi fidèlement le phénotype des patients SEDv. Il devrait donc permettre de tester différentes approches thérapeutiques. / Vascular Ehlers-Danlos (vEDS) syndrome is a rare, inherited, autosomal dominant disease that results from mutations in the COL3A1 gene, encoding type III collagen. Patients are mostly affected by missense mutations probably acting through a dominant negative mechanism. A few patients present large deletions or nonsense mutations leading to a haploinsufficient mechanism. These mutations are supposed to lead to a defect in the synthesis and secretion of collagen type III, resulting in arterial wall fragility. Consequently, vEDS is mostly characterized by ruptures/dissections in arteries at a young age, which ultimately lead to premature death. While there is currently no surgical or therapeutic treatments available, a recent study reported the beneficial effect of the beta-blocker celiprolol, which prevents vascular complications in patients.To investigate the vascular phenotype of vEDS, a mouse model of this disease has been generated by the complete and ubiquitous inactivation of the COL3A1 gene. Col3a1-/- mice exhibit severe perinatal mortality and die prematurely from spontaneous vascular rupture. However, Col3a1+/- mice are viable and exhibit no obvious vascular phenotype. To determine the susceptibility of Col3a1+/- mice to develop vascular rupture/dissection, an experimental model of aneurysm induction was used, through the chronic infusion of Angiotensin II (Ang II). Our results showed that Ang II infusion led to severe premature mortality in Col3a1+/- compared to wild type. This fragility was characterized by the development of rupture/dissection in the ascending aorta. These lesions could be caused by the elevation of blood pressure and/or the activation of Ang II signaling pathways. We showed that treatment with a beta-blocker (propranolol) and an arterial vasodilator (hydralazine) reduced the mortality induced by Ang II in Col3a1+/- mice. These results suggest the beneficial effect of adding a preventive treatment inhibitor of Ang II to the beta-blocker treatment recommended in human pathology.Meanwhile, given that a majority of human vEDS cases is caused by missense mutations in the COL3A1 gene, we established a knock-in mouse model bearing a point mutation (Gly183Ser) found in vEDS patients. The preliminary characterization of this model showed that Col3a1+/G183S mice die spontaneously as early as 4 weeks of age from a dissection or rupture of the ascending aorta. However, these mice do not showed any changes of their hemodynamic parameters or aortic diameter. Furthermore, about 20 % of mouse Col3a1+/G183S display wounds in the back and legs. This new mouse model is currently the only that mimic more closely the human disease and could therefore be used to test different therapeutic strategies.

L’hypertension artérielle est une maladie induite par de multiples facteurs génétiques et environnementaux. De nombreuses pathologies y sont associées. A travers ce travail, j’ai abordé trois aspects de la régulation de la pression artérielle in vivo et in vitro. Dans une première partie, j’ai étudié le rôle de l’activation du récepteur AT1 de l’angiotensine II dans le développement de la fibrose, indépendamment de l’hypertension artérielle. Un modèle animal exprimant un récepteur constitutivement actif et des modèles cellulaires (MEF, HEK293, H295) exprimant le récepteur constitutivement actif de façon inductible ont été utilisés. Contrairement aux souris sur fond mixte, les souris mutées sur fond pur C57Bl6 ne développent pas de fibrose cardiaque et rénale et ont une hypertension modérée, qui est difficile à réduire par les anti-hypertenseurs. De plus, les cellules fibroblastiques MEF ne sont pas un bon modèle pour étudier la fibrose induite par l’angiotensine II. Seule l’ostéopontine est un marqueur induit par l’expression du récepteur AT1 contitutivement actif. Ces différents modèles, étudiés extensivement, ne sont donc pas adaptés pour répondre aux questions posées. Dans la seconde partie de ma thèse, un travail collaboratif a permis de mettre en évidence le rôle majeur de Wnk1 au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire induits par une infusion chronique d’angiotensine II. En effet, les souris Wnk1+/- (haplo-insuffisantes pour le gène Wnk1) présentent une résistance transitoire à l’hypertension induite par l’angiotensine II, particulièrement au cours de la première semaine d’infusion. Cette résistance est associée à une altération du remodelage hypertrophique cardiovasculaire mais la fonction rénale et la sécrétion d’aldostérone sont préservées. Au niveau mécanistique, nos résultats ont identifié Wnk1 comme un activateur important de la phosphorylation de Mypt1, un marqueur connu de l’activité de la voie Rho-kinase. Les aortes de souris Wnk1+/- présentent une diminution transitoire de la phosphorylation de Mypt1 après une semaine d’infusion d’angiotensine II. De façon importante, nous montrons aussi que l’infusion chronique d’angiotensine II induit une activation de l’expression du gène Wnk1 au niveau aortique, et la surexpression de Wnk1 in vitro active de façon importante et reproductible la phosphorylation de Mypt1, indépendamment de l’activation de Spak (substrat bien caractérisé de Wnk1). En conclusion, ce travail a permis d’identifier Wnk1 comme un nouveau gène cible de l’angiotensine II au niveau vasculaire et a révélé un nouveau mécanisme mis en jeu au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire qui lui est associé. Cette étude fait l’objet d’un article que je signe en premier auteur et qui est actuellement soumis pour publication. Dans une dernière partie, j’ai étudié le rôle de la culline3 dans la régulationde la voie RhoKinase. Les mutations du gène Cul3 ont très récemment été identifiées comme responsables du syndrome de Gordon. Ce gène code une protéine d’échafaudage d’un complexe d’ubiquitination important et ubiquitaire (CRL3) conduisant à la dégradation protéique. La voie des Rho-kinases joue un rôle majeur dans le tonus vasculaire et sa régulation par les agents relaxants ou constricteurs. Des travauxrécents suggèrent que la dégradation de RhoA implique le complexe culline3-ring-ligase (CRL3). Nous avons voulu établir les liens structuraux et fonctionnels entre ce complexe d’ubiquitination et la voie Rho-kinase dans des modèles cellulaires, pour ainsi expliquer tout ou partie du mécanisme moléculaire conduisant des mutations constitutionnelles du gène Cul3 à produire une hypertension artérielle. Les interactions protéiques entre deux adaptateurs différents et la culline3 nous ont permis de montrer que la culline3 mutée entraine une modification d’affinité spécifique selon ses partenaires. Les interactions entre RhoA et le CRL3 n’ont pas pu être démontré. (...) / Hypertension is a disease due to multiple genetic and environmental factors. Many cardiovascular diseases are associated. During my PhD thesis, I addressed three aspects of the regulation of blood pressure in vivo and in vitro. In the first part, I studied the role of angiotensin II AT1 receptor activation in the development of fibrosis, independently of hypertension. I used animal and cellular models (MEF, HEK293, H295) expressing a constitutively active receptor. The results show that the mutant mice did not develop cardiac or renal fibrosis in a pure C57Bl6 strain. Furthermore, their moderate hypertension has not been normalized with two antihypertensives. The pure C57BL6 genetic background seems to be the cause of this moderate phenotype. Furthermore, MEF cells are not a good model to study fibrosis induced by angiotensin II. Only osteopontin is a marker induced by expression of the mutant receptor. As the mouse models and despite of their originality, these cellular models appear to be inappropriate to study AngII-dependent fibrosis. These limitations together with the weakness of the AT1 mutant phenotype lead to us to stop this project. In the second part of my thesis, a collaborative study allows us to show that Wnk1-haploinsufficiency in mice is responsible for a strong and transitory resistance to angiotensin II (AngII)-induced hypertension associated with a significant reduction of cardiovascular remodeling and a preservation of renal function and aldosterone release. Mechanistically, we unravel a critical role for Wnk1 in the activation of the phosphorylation of Mypt1, a known marker of the Rho-kinase pathway activity. Wnk1-haploinsufficient mice display a significant and transitory decrease of AngII-induced phospho- Mypt1 in the aorta, concomitant to the hypertension-resistance. Importantly, we further evidence that, in the vasculature, AngII chronic infusion induces a significant upregulation in Wnk1 gene expression which causes in vitro a significant increase in Mypt1 phosphorylation independently of spak activation. Our results provide new insight into the downstream vascular signaling pathway of AngII and unravel a previously unsuspected mechanism linking Wnk1 to hypertension and vascular remodeling. In the last part, I studied the role of vascular Cullin3 (Cul3) in the development of hypertension. Mutations in this gene have been recently identified as responsible for a familial hypertension with hyperkalaemia, FHHt. The Cul3 gene encodes an important and ubiquitous ubiquitin scaffold protein participating to a protein degradation complex (CRL3). The Rho-kinase pathway plays a major role in vascular tone and its regulation by relaxing or vasoconstricting agents. Recent studies suggest that the degradation of RhoA involves the CRL3 complex. I started to analyze the structural and functional links between this ubiquitination complex and the Rho kinase pathway in cellular models to explain all or part of the molecular mechanisms leading constitutional mutations of Cul3 gene to produce hypertension. I have shown that the Cul3Δ9 mutant presents an increased neddylation compared to the wild form and mofications of its affinity for some adaptors. However, in this preliminary work, its interactions with and its role in the degradation of RhoA have not been demonstrated yet. This PhD thesis has helped to address several aspects of the pathophysiology of the vessels and the role of angiotensin II in these regulations using modern tools, original mouse and cell line models. This has particularly highlighted a new target of angiotensin II and a new WNK1 vascular role.