Le phénomène de résistance des bactéries à Gram négatif aux antibiotiques est aujourd’hui un problème sanitaire mondial majeur. La production de β-lactamases, et plus particulièrement de carbapénémases, enzymes capables d’hydrolyser la plupart des agents antibactériens de la classe des β-lactames, est le mécanisme de résistance le plus répandu. Dans ce mémoire, nous décrivons la conception et la synthèse de nouveaux inhibiteurs fluorés de carbapénémases. Notre objectif a été la synthèse de monobactames trifluorométhylés en position C4.Nous avons développé une nouvelle voie de synthèse diastéréosélective par expansion de cycle d’aziridines pour l’accès à des 3-bromo-4-CF3-azétidin-2-ones. Ces composés ont été fonctionnalisés par substitution nucléophile, réactions radicalaires et organométalliques en position C3. Dans une seconde partie, des essais de cyclisation de β-hydroxyaminoesters et acides ainsi que de β-hydroxy-hydroxamates ont été entrepris. Pour obtenir ces intermédiaires β-hydroxyaminoesters et acides, nous avons étudié la réactivité des hydroxylamines sur des accepteurs de Michael trifluorométhylés.Enfin, l’évaluation biologique des composés a été réalisée par des tests enzymatiques en suivi par spectroscopie UV. L’évaluation par RMN 19F a également été entreprise, et a permis le développement d’outil de diagnostique et de screening, toujours en cours d’optimisation. / Multidrug resistant gram-negative pathogens are emerging worldwide. β-lactamases production, especially carbapenemases, enzymes with broad hydrolytic capabilities towards β-lactams, is a global spread mechanism of resistance among gram-negative bacteria. We report here the design and the synthesis of new fluorinated inhibitors of carbapenemases. Our aim was to synthesize trifluoromethylated monobactams in C4 position. We have developed a new diastereoselective pathway by ring expansion of aziridines to access to 3-bromo-4-CF3-azetidin-2-ones. These compounds have been successfully functionalized in C3 position via nucleophilic substitution, radical and organometallic reactions.In a second part, cyclisation attempts of β-hydroxyaminoesters and acids, as well as β-hydroxy-hydroxamates have been conducted. A study of Michael addition of hydroxylamines on trifluoromethylated Michael acceptors have been achieved in order to obtain the β-hydroxyaminoesters and acids derivatives.Finally, biological evaluations of synthesized compounds have been realized through enzymatic tests. 19F NMR evaluation have been accomplished and led to development of diagnostic and screening tools, and it is still in under optimisation.

La résistance bactérienne aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Un moyen de la combattre est de viser des cibles non encore exploitées pour retarder l’apparition de la résistance. Dans ce contexte, nous avons entrepris la caractérisation sur les plans biochimique et structural de l’enzyme MraY, une protéine intégrale de membrane, membre d’une famille de transférases membranaires. MraY catalyse la première étape membranaire de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien à savoir, le transfert du motif N-acétylmuramoyl-pentapeptide du précurseur cytoplasmique UDP-MurNAc-pentapeptide sur le transporteur membranaire, l’undécaprényl-phosphate aboutissant à la formation du lipide I. Aucune structure 3D de cette enzyme n’est disponible actuellement et aucun antibiotique en utilisation clinique ne la cible. D’une part nous avons entrepris la caractérisation structurale de cette enzyme par des approches de biophysique. Des essais de cristallisation 2D dans des systèmes membranaires ont permis d’observer au microscope électronique des dimères de MraY (taille de 70Å/50Å). Des expériences de diffusion des rayons X (SAXS) montrent un rayon de giration d’environ 42Å. Les résultats issus des expériences de SAXS ont été combinés à des approches de modélisation afin déterminer l’état d’oligomérisation de cette protéine en présence de détergents. Enfin, en vue de faciliter la cristallogenèse 3D, des chimères de MraY en fusion avec des protéines hydrosolubles de structure 3D résolues (mCherry et GFP) ont été construites. Des essais de cristallisation de la protéine seule et des chimères construites ont été effectués.D’autre part, nous avons élucidé le mécanisme catalytique de l’enzyme MraY et de son paralogue WecA. Au cours de ma thèse, j’ai pu montrer que cette famille de transférase membranaire présente un mécanisme catalytique commun qui procède en une seule étape par attaque directe d’un oxyanion du substrat lipidique, préalablement déprotoné par un résidu aspartate invariant, sur le phophate Beta du substrat nucléotidique. Cela conduit à la formation du produit lipidique et libération de l’UMP. / The growing emergence of multiresistance of pathogenic bacteria to currently used antibiotics is a major public health problem that requires the development of new therapeutic compounds and the identification and exploitation of novel targets. In this context, we undertook the biochemical and structural characterization of MraY enzyme, an integral membrane protein, member of the polyprenyl-phosphate N-acetylhexosamine 1-phosphate transferase superfamily. The MraY transferase catalyzes the first membrane step of bacterial cell wall peptidoglycan biosynthesis, namely the transfer of the N-acetylmuramoyl-pentapeptide moiety of the cytoplasmic precursor UDP-MurNAc-pentapeptide to the membrane transporter undecaprenyl phosphate, yielding C55-PP-MurNAc-pentapeptide (lipid I). To date, no crystal structure has been reported for this enzyme. On the one hand we have undertaken the structural characterization of this enzyme by differents biophysical approaches. Electron microscopic images after two-dimensional crystallization of the protein displayed a dimeric organisation of the MraY enzyme (size 70Å/50Å). Small X-ray scattering (SAXS) experiments have shown a radius of gyration of about 42A. The results of SAXS experiments were combined with modeling approaches to determine the oligomerization state of the protein in the presence of detergents. Finally, in order to facilitate 3D crystallisation of MraY, fusion proteins of MraY and mCherry/GFP were constructed. Crystallization trials of MraY alone and the constructed chimeras were made. On the other hand, we have elucidated the catalytic mechanism of the MraY transferase and its paralog WecA. In this study, we have shown that this family of membrane transferases has a common catalytic mechanism that proceeds by a single step displacement. During this “one-step” mechanism, the oxyanion of the poly-prenyl phosphate attacks the β phosphate of the nucleotide substrate, leading to the formation of lipid product and the liberation of UMP.

L’usage des antibiotiques en médecine vétérinaire peut entrainer la présence de résidus d’antibiotiques dans les denrées alimentaires d’origine animale. Ces résidus peuvent présenter des risques (eg. toxicologiques, allergies, antibiorésistance) pour la santé du consommateur. La fixation de limites réglementaires pour ces résidus et un contrôle adapté sont primordiaux pour garantir la sécurité des consommateurs. Les méthodes de dépistage sont utilisées en première intention et représentent donc l’étape critique du contrôle. La validation d’une méthode va permettre de garantir qu’elle est adaptée à l’usage souhaité, aux attentes réglementaires et attester de sa performance. La validation constitue une exigence normative (ie. ISO 17025) et réglementaire (ie. Décision européenne 2002/657/CE). Dans une première partie, la diversité des méthodes de dépistage est présentée. Les méthodes dites conventionnelles de type microbiologique ou immunologique, développées dans les années 1980, sont toujours couramment utilisées, en raison de leur faible coût. Des méthodes innovantes, appelées biocapteurs, sont constituées d’un biorécepteur (eg. anticorps, aptamère) et d’un transducteur (eg. électrochimique, optique, massique, calorimétrique) pour la détection du signal. Ces méthodes sont en développement permanent et les progrès technologiques permettent de développer des méthodes de plus en plus sensibles, portables, parfois économiques. Dans une deuxième partie, différentes approches de validation, sous forme de réglementations, de lignes directrices ou de normes, sont discutées. La validation d’une méthode comporte deux étapes : tout d’abord la caractérisation des performances, puis la validation proprement dite par rapport à des critères préétablis. Les approches peuvent être absolue (une seule méthode) ou relative (comparaison de méthodes), globale (combinaison de plusieurs caractéristiques en une seule) ou critère par critère. L’objet de cette thèse est de comparer ces différentes approches de validation, afin de statuer sur leur application possible aux différentes méthodes de dépistage des résidus et déterminer si leurs conclusions sont équivalentes ou non. Différentes approches ont été testées en les appliquant pour valider des méthodes de dépistage de différents types : conventionnelles microbiologique et immunologique, innovantes par biocapteurs optiques. L’approche par comparaison de méthodes n’est pas adaptée aux méthodes de dépistage des résidus d’antibiotiques. En effet, le choix de la méthode de référence est compliqué car il n’existe pas de méthodes normalisées. De plus, les méthodes de référence choisies ont souvent des principes très différents de la méthode alternative et sont le plus souvent moins performantes. L’approche globale, telle que la Probabilité de détection (POD) et le profil d’exactitude sont applicables aux méthodes de dépistage. Ces approches récentes sont de plus en plus utilisées dans d’autres domaines et présentent un intérêt à être développées pour les méthodes de dépistage des résidus d’antibiotiques. Enfin, l’approche critère par critère de la décision européenne 20002/657/CE et du guide de validation européen de 2010, couramment appliquée aux résidus d’antibiotiques, comporte une caractéristique majeure et une avancée dans la validation qui est la capacité de détection (CCβ). En conclusion, les méthodes de dépistage sont en constante évolution, grâce au développement des biocapteurs. L’amélioration de leurs performances permet de répondre de mieux en mieux à la problématique du contrôle des résidus d’antibiotiques dans les denrées alimentaires. La validation des méthodes est primordiale pour garantir un contrôle efficace. Nous avons pu observer l’évolution de la validation ces 20 dernières années, à travers les travaux de cette thèse. Cette évolution doit continuer et des perspectives d’évolution des référentiels de validation sont présentées dans cette thèse. / The use of antibiotic residues for animal treatment could lead to the presence of antibiotic residues in food of animal origin. The consumer could face some risks (eg. toxicological, allergies, bacterial resistance), due to these residues. The setting of regulatory limits or these residues and an adapted control of food products are thus essential to guarantee the safety of the consumers. Screening methods are used in first intention and represent the critical stage of the control. The validation of a method will guarantee that the method if fitted for purpose, adapted to the regulatory expectations and give evidence of its performance. The validation is mandatory due to international standards (ie. ISO 17025) and regulatory requirements (ie. European decision 2002/657/EC). In a first part, the diversity of screening methods is presented. The conventional methods, microbiological or immunological types, developed in the 1980s, are always used, because of their moderate cost. Innovative methods, called biosensors, consist of a bioreceptor (eg. antibody, aptamer) and a transducer (eg. electrochemical, optical, mass sensitive, calorimetric) for the detection of the signal. These methods are in continuous development and the technological progress allows developing more, more sensitive, portable and sometimes economic methods. In a second part, various approaches of validation, in the form of regulations, guidelines or standards, are discussed. The validation of a method contains two stages: first of all the characterization of the performances, then the validation itself with regard to preestablished criteria. The approaches can be absolute (a single method) or relative (comparison of methods), global (combination of several characteristics in only one) or criterion by criterion. The object of this thesis is to compare these various approaches of validation, to conclude on their potential application for different residue screening methods and to determine if their conclusions are equivalent or not. Various approaches have been tested by applying them to the validation of screening methods of various types: conventional methods (microbiological and immunological) and innovative optical biosensors. The approach by comparison of methods is not fitted to screening methods for antibiotic residues. Indeed, the choice of the reference method is complicated because there are no standardized methods. Furthermore, the chosen reference methods often have very different principles from the alternative method and are less sensitive most of the time. The global approach, such as the Probability of detection (POD) and the accuracy profile are applicable to the screening methods. These recent approaches are more and more used in other fields and present an interest to be developed for the screening methods for antibiotic residues. Finally, the criterion by criterion approach of the European decision 20002/657/EC and the European guideline for the validation of screening methods of 2010, usually applied to the screening methods for antibiotic residues, introduced a major characteristic and an improvement in the validation which is the detection capability (CCß). In conclusion, the screening methods are constantly evolving, thanks to the development of new biosensors. The improvement of their performances allows answering better and better to the issue of the control of antibiotic residues in foodstuffs. The validation of the methods is essential to guarantee an effective control. We were able to observe the evolution of the validation these last 20 years, through the works of this thesis. This evolution has to continue and perspectives of evolution of guidelines, regulations and standards of validation are presented in this thesis.

Saccharothrix algeriensis est une bactérie filamenteuse productrice de plusieurs molécules de la famille des dithiolopyrrolones aux propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Ces composés sont constitués d'un noyau bicyclique commun, la pyrrothine, lié par une liaison amide à différents radicaux acyls (R). Lors de ce projet de thèse, la réaction enzymatique d'acylation du noyau pyrrothine, dite pyrrothine N-acyltransférase, a été étudiée chez Sa. algeriensis pour mieux comprendre la régulation exercée par les acides organiques sur la biosynthèse des dithiolopyrrolones et synthétiser par voie enzymatique de nouveaux composés avec différents radicaux R. Deux activités enzymatiques pyrrothine Nacétyltransférase et N-benzoyltransférase catalysant la formation de deux dithiolopyrrolones, la thiolutine (R= CH3) et la benzoyl-pyrrothine (BEP, R= C6H5) ont d'abord été mise en évidence dans l'extrait cellulaire brut de Sa. algeriensis. Ensuite la régulation exercée par les acides organiques a été étudiée en mesurant ces activités enzymatiques dans des extraits cellulaires de Sa. algeriensis obtenus au cours de cultures sur différents milieux supplémentés en acides organiques. Les résultats obtenus montrent que l'augmentation de la production de BEP en présence d'acide benzoïque à 1,25 mM est en partie due à l'induction de l'activité benzoyltransférase. Par ailleurs, les activités acétyltransférase et benzoyltransférase ont montré des profils d'expression très différents qui laissent supposer que deux enzymes catalysent le transfert de l'acétyl- et du benzoyl-. Leur purification a aussi été entreprise et l'extrait cellulaire de Sa. algeriensis, sous une forme brute ou semi-purifiée, a été utilisé pour catalyser la synthèse enzymatique de 9 dérivés dithiolopyrrolones, susceptibles de posséder des activités biologiques innovantes et/ou accrues. / Saccharothrix algeriensis is a filamentous bacterium that produces many dithiolopyrrolone compounds with antibiotic and anti-tumour properties. These metabolites possess a common bicyclic nucleus, the pyrrothine, amide linked with variable acyl groups R. During this PhD project, the enzymatic reaction of pyrrothine acylation, identified as pyrrothine N-acyltransferase, was studied in Sa. algeriensis to further our understanding of the regulation exerted by organic acids on the dithiolopyrrolone biosynthesis and to produce new dithiolopyrrolone compounds by enzymatic catalysis. Evidence for the presence in the crude cell free extract of Sa. algeriensis of two enzymatic activities, pyrrothine Nacetyltransferase and N-benzoyltransferase is provided. They catalyze respectively the formation of the two dithiolopyrrolones, thiolutin (R= CH3) and benzoyl-pyrrothine (BEP, R = C6H5). To study the regulation exerted by organic acids, these enzymatic activities were then assayed in crude cell free extracts of Sa. algeriensis obtained during cultures on media supplemented with organic acids. The results show that BEP-production is enhanced in the presence of benzoic acid partly because of an induction of pyrrothine N-benzoyltransferase. Differences in the expression time courses of pyrrothine N-acetyltransferase and Nbenzoyltransferase activities were also observed. It supports the idea that the transfer reactions of acetyl-CoA and benzoyl-CoA on pyrrothine are catalyzed by two different enzymes. Their purification was undertaken and the cell free extract, crude or semi-purified was used as catalyst to synthetize nine dithiolopyrrolones with biological activities potentially new and better

L’agriculture est un secteur qui connaît de forts bouleversements depuis plusieurs années en France. Face à cette instabilité croissante, les firmes ont besoin de moyens pour caractériser leur environnement externe et ainsi être en capacité de saisir les opportunités qui se créent. Cette thèse a pour objectif de développer une méthode d’intelligence technologique qui pourra être intégrée au sein du groupe Avril. Pour cela, nous nous appuyons sur le cas de la moindre utilisation des antibiotiques dans l’élevage.Dans un premier temps, nous montrons en quoi les méthodes d’intelligence technologique peuvent effectivement apporter un soutien au management de l’innovation chez Avril. Nous étudions l’agro-industrie et plus particulièrement l’élevage à travers les concepts de paradigmes, de trajectoires ou encore de régimes technologiques qui se retrouvent dans la littérature évolutionniste. Nous montrons que le paradigme de l’antibiotique dans la santé animale est toujours d’actualité mais qu’un changement de trajectoire est en cours. Cela justifie le recours aux méthodes d’intelligence technologique.Dans un second temps, nous développerons une méthode d’intelligence technologique pour le groupe, appliquée à la caractérisation des solutions scientifiques et techniques pour une diminution de l’utilisation des antibiotiques dans l’élevage. A l’issue de ce cas, un travail plus poussé sur le cas précis des phages est réalisé. Nous montrons à travers ce travail comment ces méthodes peuvent s’intégrer au sein du processus organisationnel de la firme. / Agriculture is a sector with major upheavals for several years in France. Faced with this growing instability, firms need to characterize their external environment to be able to seize opportunities. This thesis aims to develop a method of competitive technical intelligence that can be integrated in the Avril group. For this, we rely on the case of the lower use of antibiotics in livestock farming.First, we show how competitive technical intelligence methods support the management of innovation in the Avril group. We study agro-industry and more particularly livestock farming through the concepts of technological paradigms, trajectories and regimes that are found in evolutionary literature. We show that the antibiotic’s paradigm in animal health is still relevant, but changes of technological trajectories are in progress. That is why we can use the competitive technical intelligence methods.Secondly, we develop a method of competitive technical intelligence for the Avril group, applied to the characterization of scientific and technical solutions for a decrease in the use of antibiotics in livestock farming. At the end of this case, we work on the case of phages for more precisions. We show through this work how these methods can be integrated in the organizational process of the firm.

Parmi les stratégies d'amélioration des traitements des infections bactériennes chroniques, visant à accroître l'activité bactéricide ou à limiter la sélection de résistances, le développement de combinaisons d'antibiotiques existants constitue une stratégie prometteuse. L'objectif de cette thèse était d'évaluer l'efficacité d'une combinaison d'antibiotiques sur un biofilm bactérien dans un système in vitro dynamique qui permet de simuler les concentrations d'antibiotiques observées chez les patients traités. Nous avons montré que pour des infections complexes dues à de fortes charges bactériennes ou à la présence d'un biofilm, les études dans le système in vitro dynamique menées sur plusieurs jours apportaient plus d'informations sur l'efficacité d'une combinaison d'antibiotiques que des techniques standardisées menées avec des concentrations d'antibiotiques stables au cours du temps. Nous avons aussi montré que sur un biofilm, même si certaines associations n'ont pas d'impact sur la biomasse du biofilm elles permettent en revanche de maintenir des populations moins sensibles aux antibiotiques à des seuils relativement bas, alors que les mêmes antibiotiques utilisés seuls favorisent l'émergence de résistances au cours du traitement. Enfin, des essais préliminaires pour mimer des infections comme les mammites bovines ou les cystites ont montré que ce système pouvait être plus largement utilisé pour l'optimisation des schémas thérapeutiques en médecine humaine et en médecine vétérinaire. / Among strategies to improve the treatment of chronic bacterial infections by increasing the bactericidal activity or by limiting the selection of resistance, the development of combinations of existing drugs is a promising strategy. The aim of this thesis was to evaluate the efficacy of a combination of antibiotics on a bacterial biofilm in a dynamic in vitro system which allows to simulate the concentrations observed in patients. We have shown that for complicated infections due to large bacterial loads or to biofilms, in vitro dynamic studies over several days provided more information on the efficacy of a combination of antibiotics than classical methods conducted with constant antibiotic concentrations over time. We have also shown that on a biofilm, even if associations do not have an impact on the overall size of the biofilm, they maintain less-susceptible populations at relatively low levels, whereas the same antibiotics promote the emergence of resistance during treatment when used alone. Finally, preliminary trials to mimic infections such as bovine mastitis or cystitis have shown that this system could be more widely used for the optimization of dosage regimens in human medicine and veterinary medicine.

L’objectif de cette thèse a été d’élaborer une stratégie de détoxification la quantité d'un composé intracellulaire en permettant sa sortie hors de la cellule via l'utilisation d'un système d’efflux.L’hôte choisi pour cette étude est un nouvel organisme modèle, Deinococcus geothermalis. Nous avons utilisé les pompes d'efflux comme outils biologique pour permettre la sortie d'un composé devenu toxique en intracellulaire. Pour ce faire, nous avons dans un premier temps inséré par recombinaison homologue une sélection de gènes codant pour des pompes d’efflux hétérologues dans le chromosome de D. geothermalis. Puis la seconde étape a été de déterminé la susceptibilité des recombinants obtenus vis à vis de composés à forte valeur ajoutée. Un certain nombre de recombinants présentant une résistance plus élevée que la souche sauvage à plusieurs composés ont alors été sélectionnés. L'étape suivante a été de vérifier que le gain de résistance observé était effectivement dû à l’insertion dans l’enveloppe bactérienne d’une pompe d’efflux fonctionnelle. Pour ce faire, des tests d’efflux employant un marqueur fluorescent, le composé Hoechst 33342 ou avec un antibiotique fluorescent ont été réalisés. Nous avons réussi à obtenir la preuve de concept qu' un gène codant pour une pompe d'efflux hétérologue pouvait conduire à l'expression d'une protéine fonctionnelle chez D. geothermalis et cette protéine membranaire permettait la diminution la quantité intracellulaire d'un composé donné. / The objective of this thesis was to develop a strategy for detoxifying the amount of an intracellular compound by allowing its exit from the cell through the use of an efflux system.The host chosen for this study is a new model organism, Deinococcus geothermalis. We used efflux pumps as biological tools to allow the release of a compound that became toxic intracellularly. To do this, we first inserted by homologous recombination a selection of genes encoding heterologous efflux pumps into the D. geothermalis chromosome. Then the second step was to determine the susceptibility of the recombinants obtained to high value-added compounds. A number of recombinants with higher resistance than the wild multi-compound strain were then selected. The next step was to verify that the observed resistance gain was indeed due to the insertion of a functional efflux pump into the bacterial shell. To do this, efflux tests using a fluorescent marker, Hoechst compound 33342 or with a fluorescent antibiotic were performed. We were able to obtain proof of concept that a gene encoding a heterologous efflux pump could lead to the expression of a functional protein in D. geothermalis and that this membrane protein allowed the intracellular amount of a given compound to be decreased.

Les concentrations sous-inhibitrices (sub-CMI) de antibiotiques jouent un rôle important dans la sélection et le développement des résistances. Contrairement à Escherichia coli, Vibrio cholerae induit la réponse SOS en présence de sub-CMI d'aminosides. SOS est également impliquée dans la plasticité du génome et dans l'acquisition de la résistance aux antibiotiques. Afin de sélectionner des mutants de V. cholerae qui n'induisent pas SOS en présence de sub-CMI d'aminosides, nous avons développé un crible génétique pour l'isolement de mutants dans lesquels l'induction de la réponse SOS est perdue. L'un de ces mutants est inactivé pour le gène radD, qui code pour une hélicase ADN/ARN putative. RadD est impliquée dans la résolution de cassures d'ADN double brin (DSB) provoquées par des sub-CMI de tobramycine. Nous avons montré que les R-loops sont à l'origine des DSB formés en absence de radD en tobramycine. Nous suggérons que les lésions de l'ADN formées lors du traitement par aminoglycosides soient réparées par la formation d'intermédiaires ssDNA induisant SOS. L’ARNPol bloquée sur ces lésions peut faciliter la formation de R-loops qui, si elles ne sont pas réparées, peuvent entraîner la formation de DSB et l'instabilité du génome. RadD pourrait jouer un rôle dans la résolution des R-loops. Ces résultats ont mis en évidence le fait que les sub-CMI de tobramycine conduisent à DSB, dues en partie aux R-loops. La tobramycine est un aminoside qui cible le ribosome. La formation de DSB par un tel antibiotique peut être surprenante car la formation de lésions de l'ADN par un antibiotique qui cible la traduction n'est pas attendue. Afin de comprendre les voies impliquées dans la réponse à de sub-CMI de tobramycine, nous avons adopté une approche Tn-seq à haut débit pour déterminer quels gènes sont importants pour maintenir l'intégrité de la cellule en présence d'antibiotiques à faibles doses. / Sub-inhibitory concentrations (sub-MIC) of antibiotics play an important role in selection and development of resistances. Unlike Escherichia coli, Vibrio cholerae induces its SOS response in presence of sub-MIC aminoglycosides. SOS is also involved in genome plasticity and in the acquisition of resistance to antibiotics. In order to select for V. cholerae mutants that do not induce low aminoglycoside-mediated SOS induction, we developed a genetic screen for the isolation of mutants in which induction of the SOS response by sub-MICs of aminoglycosides is lost. One of these mutants is inactivated for the radD gene, which encodes a putative DNA/RNA helicase. RadD is involved in the resolution of double strand DNA breaks caused by treatment with sub-MIC of tobramycine. We demonstrate that R-loops are at the origin of DSBs formed in the absence of radD in tobramycine.We propose that DNA lesions formed upon aminoglycoside treatment are repaired through the formation of ssDNA intermediates, inducing SOS. RNAP could stalls on these lesions and forms R-loops, that, if not repaired, can lead to the formation of DSB and genome instability. RadD could play a role in the resolution of R-loops. These results highlighted the fact that sub-MIC of tobramycine leads to DNA double strand breaks, at least partly through R-loop formation. Tobramycin is an aminoglycoside that targets the ribosome. The formation of DSBs by such an antibiotic can be surprising as DNA damage formation by an antibiotic that targets translation is not expected. In order to understand the pathways involved in the response to low doses of tobramycin we adopted a high throughput Tn-seq approach to determine which genes are important in maintaining the integrity of the cell in the presence of antibiotics at low doses.

Sur les 10500 t d'antibiotiques consommés en Europe chaque année, la moitié sont à usage vétérinaire. Ceux utilisés en pisciculture dulçaquicole sont généralement administrés aux poissons via un aliment distribué directement dans les bassins d'élevage. Leur devenir et leurs effets dans l'environnement aquatique notamment pour l'acide oxolinique (AO), la fluméquine (FLU) et l'oxytétracycline (OTC) suscitent donc un intérêt grandissant. L'objectif de cette thèse est d'étudier le devenir de ces trois antibiotiques dans l'eau, les sédiments et les bryophytes dulçaquicoles. La démarche a été de mettre au point et de valider des méthodes de dosage originales, sensibles, fidèles et précises dans les sédiments et les bryophytes afin de réaliser des études expérimentales finalement validées sur le terrain. Les études de stabilité dans l'eau indiquent que l'AO et la FLU ne sont pas sensibles aux phénomènes d'hydrolyse et de biodégradation et sont peu sensibles à la lumière alors que l'OTC est biodégradable, photosensible et hydrolysable. Une approche intégrant les caractéristiques physico-chimiques sédimentaires met en évidence l'influence de la fraction organique et de la nature minérale de la fraction argileuse des sédiments sur les phénomènes d'adsorption, de désorption et de dégradation de ces antibiotiques. Expérimentalement, Fontinalis antipyretica s'est révélé être un excellent bioaccumulateur des trois antibiotiques. Des études sur l'Elorn (Finistère, France) montrent son intérêt comme espèce sentinelle, notamment pour l'OTC. Des concentrations élevées en FLU, OTC et plus faibles en AO sont relevées à la fois dans les bryophytes et les sédiments. L'utilisation de mousses transférées a prouvé que cette contamination de l'environnement ne provient pas seulement des piscicultures. La stabilité et les concentrations des trois antibiotiques dans l'environnement dulçaquicole posent donc de réelles interrogations quant au risque écotoxicologique qu'ils représentent.

L'enveloppe bactérienne est une cible majeure d'un grand nombre d'antibiotiques naturels. Certains provoquent d'importantes perturbations de la membrane cytoplasmique, d'autres ciblent spécifiquement les différentes étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, constituant majeur de la paroi. Pour contrer l'action de ces antibiotiques, les bactéries ont développé divers systèmes de résistance leur conférant un avantage sélectif dans leur niche écologique. Le rejet de l'antibiotique est un des principaux mécanismes de résistance rencontré chez les bactéries. Il implique parfois des transporteurs membranaires de type ABC (pour ATP Binding Cassette) pouvant hydrolyser l'ATP pour exporter ou importer un allocrite. Les bactéries possèdent également divers systèmes leur permettant, d'une part, de détecter un signal environnemental (antibiotique ou stress de la paroi qu'il engendre), et, d'autre part, d'assurer la transduction du signal qui aboutit à une réponse adaptée. Deux types de systèmes sont impliqués dans les réponses aux stress de la paroi : les phosphorelais et les facteurs sigma à fonction extracytoplasmique.<br /><br />Le groupe des Firmicutes, dont la bactérie modèle est Bacillus subtilis, est un groupe ubiquitaire producteur d'antibiotiques et contenant de nombreux organismes pathogènes. Les analyses effectuées au laboratoire ont permis d'identifier chez les Firmicutes des systèmes associant un phosphorelais et un transporteur ABC. Dans chacun des cas, les gènes codant les différents partenaires du système sont à proximité sur le chromosome et le phosphorelais régule l'expression des gènes codant le transporteur ABC. On trouve trois de ces systèmes chez B. subtilis nommés BceRSAB (anciennement YtsABCD), YvcPQRS et YxdJKLM. L'objectif de notre étude était de tester l'hypothèse selon laquelle ces systèmes pouvaient être impliqués dans la résistance aux antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.<br /><br />La bacitracine est un antibiotique qui se complexe à l'undécaprényl pyrophosphate (UPP) et inhibe la dernière étape de la biosynthèse du peptidoglycane : la régénération de l'undécaprényl phosphate (UP). Nos résultats indiquent que le système BceRSAB est le composant majeur de la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. L'expression de l'opéron bceAB est activée, en présence de bacitracine, par le phosphorelais BceRS. Nous avons également identifié une protéine, nommée BcrC, qui participe à la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. Nous avons démontré que cette dernière est une UPP phosphatase impliquée dans la régénération de l'UP et s'oppose ainsi à l'action de la bacitracine. L'expression du gène bcrC ne dépend pas du phosphorelais BceRS mais de trois facteurs sigma à fonction extracytoplasmique. En conclusion, B. subtilis possède deux types de systèmes de résistance à la bacitracine indépendants et complémentaires.<br />Nous avons par la suite analysé le mécanisme de régulation de l'induction du système BceRSAB par la bacitracine. Nos résultats sont surprenants et montrent clairement que le transporteur ABC BceAB participe à l'activation de l'expression de ses propres gènes de structure avec le phosphorelais BceRS. De plus, lorsque le pool cellulaire d'UPP diminue (lorsque la phosphatase BcrC est surproduite), et en présence de bacitracine, l'expression du gène bceA diminue également. Ceci montre que l'UPP participe, avec la bacitracine, au stimulus du système BceRSAB. Notre hypothèse de travail est que le transporteur ABC, prédit comme étant un exporteur, prend en charge le complexe UPP/bacitracine et agit comme une flippase pour créer une dissymétrie membranaire ressentie par le senseur BceS. Il n'est pas exclu, qu'en présence de bacitracine, le transporteur BceAB puisse interagir avec le senseur BceS pour permettre l'activation du système.<br /><br />La majeure partie des bactéries du groupe des Firmicutes possède, d'une part, des protéines similaires à BcrC, et, d'autre part, des systèmes similaires au système BceRSAB. Toutes les protéines « BcrC-like » ont un motif caractéristique permettant de les classer dans la famille des phosphatases de type PAP2. Il est tentant de penser qu'elles sont toutes des UPP phosphatases assurant une des étapes clés de la synthèse du peptidoglycane. <br />Par ailleurs, les deux autres systèmes « Bce-like » de B. subtilis, YvcPQRS et YxdJKLM, sont également activés en présence d'antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne et nous savons que le transporteur ABC YvcRS est aussi impliqué dans le mécanisme de régulation. Nous proposons donc que les systèmes « Bce-like » des Firmicutes sont tous des systèmes de détoxification dirigés contre des antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.