Au cours des dernières décennies, les capteurs et les biocapteurs électrochimiques ont connu un développement considérable en raison de leur simplicité, fiabilité, rapidité et sélectivité. Ils ont constitué les alternatives les plus séduisantes pour les méthodes analytiques classiques dans des domaines aussi variés que l'agro-alimentaire, la médecine et la biologie clinique, ou le contrôle de la qualité de l'environnement. Dans ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés, dans un premier volet, aux développements des immunocapteurs et capteurs électrochimiques à base des polymères à empreintes moléculaires (MIPs) pour le contrôle de la qualité des miels. La première partie de ce volet concerne le développement des immunocapteurs sur des structures dites Bio-MEMS basées sur des microélectrodes en or. L'élaboration de ces immunocapteurs a été dédiée à la détection des résidus d'antibiotiques à savoir la sulfapyridine (SPy) et la tétracycline (TC). Une nouvelle structure des nanoparticules magnétiques (MNPs) revêtues du copolymère poly (acide pyrrole-co-pyrrole-2-carboxylique) a été exploitée dans ces travaux pour leur réseau d'immobilisation tridimensionnel ainsi que pour leur stabilité pendant de longues périodes. La détection de la SPy et de la TC a été réalisée par différentes approches compétitives en utilisant des anticorps polyclonaux. Dans la deuxième partie de ce volet, nous avons fabriqué des capteurs à base des MIPs pour la détection de la sulfaguanidine, la doxycycline et le chloramphénicol dans le miel. Ces dispositifs ont été développés sur la surface des électrodes sérigraphiées en or en employant une matrice polymérique du polyacrylamide en présence des molécules empreintes. Les performances de ces capteurs et biocapteurs (limite de détection, sélectivité, reproductibilité, application dans les milieux réels) ont ensuite été évaluées. Dans un deuxième volet, nous nous sommes parvenus à appliquer un dispositif de la langue électronique voltammétrique (Langue-EV) pour des analyses agroalimentaires et biomédicales. Dans un premier temps, nous avons discriminé les miels issus de quatorze régions de la France et du Maroc par le dispositif de la Langue-EV. Nous nous sommes aussi parvenus à démontrer la fiabilité de ce dispositif à prédire les résultats des différents paramètres physico-chimiques d'après les réponses des méthodes analytiques utilisées. Dans un deuxième temps, nous sommes passés à l'application du dispositif de la Langue-EV en analyse biomédicale dans le but de discriminer les urines des patientes souffrants des infections urinaires avec celles des femmes saines / In recent decades, the use of electrochemical sensors and biosensors have grown considerably due to their simplicity, reliability, rapidity, and selectivity. They were the most attractive alternative tools for conventional analytical methods in various fields such as food control, medicine, and clinical biology or environmental control. In this research works, we focused, in the first part, on the development of immunosensors and electrochemical sensors based on molecularly imprinted polymers (MIPs) for the quality control of honey. In the second part, we managed to apply a voltammetric electronic tongue (VE-tongue) for food monitoring and biomedical analyzes. The first part of our research work concerns the development of immunosensors based on gold microelectrodes of the Bio-MEMS devices. The development of these immunosensors was dedicated to the detection of antibiotic residues namely sulfapyridine (SPy) and tetracycline (TC). A new structure of magnetic nanoparticles (MNPs) coated with the poly (pyrrole-co-pyrrole-2-carboxylic acid) copolymer has been exploited in this work for their three-dimensional immobilization network as well as for their stability for long periods. The detection of SPy and TC was performed by different competitive approaches using polyclonal antibodies. In this part, we have also synthesized the MIP sensors dedicated to the detection of sulfaguanidine, doxycycline, and chloramphenicol in honey. These devices have been developed on the surface of the screen-printed gold electrodes by employing a polyacrylamide matrix in the presence of the target molecules. The performances of these sensors and biosensors (limit of detection, selectivity, reproducibility, applications in real samples) were then evaluated. Regarding the second part of our research works, it involved the discrimination between honeys from fourteen regions from France and Morocco. We have succeeded in demonstrating the reliability of this device in predicting the results of the different physico-chemical parameters of honey samples according to the responses of the used analytical methods. In other steps, we proceeded to the application of the VE-tongue in biomedical analyzes to discriminate urine specimens of patients suffering from urinary tract infections and those of healthy subjects

Depuis quelques années et dans plusieurs pays, un nouveau type de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM), le séquence type (ST) 398, a été fréquemment retrouvé chez les porcs et chez les fermiers en contact avec ces porcs. Au Canada, très peu d’informations sont disponibles concernant le SARM d’origine porcine. Une première étude dans notre laboratoire a permis de récolter 107 isolats de SARM provenant de deux abattoirs porcins du Québec. Le présent travail vise à caractériser les gènes de virulence et de résistance aux antibiotiques de ces SARM, d’étudier leur formation de biofilm en relation avec la spécificité du groupe agr et de vérifier la localisation plasmidique et la transférabilité de ces gènes à des souches de SARM d’origine humaine. Plusieurs souches ont démontré différents patrons phénotypiques de résistance aux antibiotiques. Vingt-quatre souches représentatives de ces isolats ont été soumises à une caractérisation plus approfondie par une étude génotypique en utilisant une biopuce à ADN et un grand nombre de gènes de virulence a été détecté codant pour des entérotoxines staphylococcales, des leucocidines, des hémolysines, des auréolysines, des facteurs d’immunoévasion, des superantigènes, des facteurs d’adhésion et des facteurs impliqués dans la formation de biofilm. Des gènes de résistance envers les aminoglycosides, les macrolides, les lincosamides, les tétracyclines et les biocides ont été également détectés par biopuce et leur localisation plasmidique a par la suite été déterminée. La transférabilité de ces gènes de souches porcines à des souches de SARM d’origine humaine a été démontrée par conjugaison bactérienne; ainsi le transfert horizontal de certains gènes de résistance aux antibiotiques et de virulence a été observé. Ces travaux de recherche apportent une meilleure connaissance de la résistance aux antibiotiques et de la virulence des SARM d’origine porcine et de leur potentiel de contribution à l’émergence de certaines résistances et facteurs de virulence chez le SARM d’origine humaine. / In recent years and in several countries, a new type of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), the sequence type (ST) 398, has been frequently found in pigs and in farmers in contact with these pigs. In Canada, little information is available concerning MRSA from pigs. A previous study in our laboratory identified 107 MRSA isolates from two pig slaughterhouses in Quebec. This study was conducted to determine antimicrobial resistance and virulence genes of MRSA from abattoir pig, to study their biofilm formation in relation with agr specificity groups and to evaluate horizontal transfer of genes to a MRSA of human clinical origin. Different phenotypic patterns of antimicrobial resistance were observed in these MRSA and a representative subset of these isolates was selected for further characterization. Twenty-four porcine MRSA were characterized by a DNA microarray, the StaphyType of CLONDIAG. Our results demonstrated that the MRSA strains from the abattoirs contain several antimicrobial resistance genes responsible for macrolide and tetracycline resistance and virulence genes encoding staphylococcal enterotoxins, hemolysins, leukocidins, aureolysin, superantigens, immunoevasion, adhesion, and biofilm development. This study presents the first evidence that horizontal transfer of some of these genes can occur between MRSA of porcine and human origin. We also report for the first time biofilm formation in Livestock Associated-MRSA of porcine origin associated with agr group II. It is possible that biofilm formation favors colonization, persistence as well as zoonotic potential. This research provides a better understanding of antimicrobial resistance and virulence of MRSA from pigs and their potential contribution to the emergence of some resistance and virulence factors in MRSA of human origin.

L’émergence des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques est un phénomène inquiétant, qui se répand à travers le monde. Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa sont des bactéries pathogènes opportunistes multi résistantes qui peuvent causer plusieurs maladies. Cependant, ces bactéries deviennent difficiles à traiter avec des antibiotiques sans occasionner de toxicité. Alors pour trouver des solutions, c’est nécessaire de développer de nouvelles molécules afin de combattre les agents pathogènes résistants. Grâce à leur action pharmacologique, les fluorures exercent un certain effet antibactérien au niveau de l'émail des dents; donc, leur association aux antibiotiques pourrait bien a méliorer l’activité antimicrobienne. De ce fait, nous nous sommes proposés d’étudier les activités in vitro de la vancomycine (VAN), l’oxacilline (OXA), la ceftazidime (CFT) et la méropenème (MER) libre ou associée au fluorure de sodium (NaF) et fluorure de lithium (LiF) qui ont été évaluées sur des souches S.aureus et P.aeruginosa sensibles et résistantes, par la méthode de la microdilution en bouillon, déterminant leur concentration minimale inhibitrice (CMI), leur concentration minimale bactéricide (CMB), leur courbe cinétique (Time-Kill). Leur cytotoxicité sur les globules rouges humains, et leur stabilité à la température de 4°C et 22°C ont été étudiées. Les associations des antimicrobiens aux dérivés des fluorures ont montré une amélioration de l’effet des antibiotiques par la réduction des leurs concentrations et toxicité pour traiter correctement ces pathogènes résistants. Par conséquent, des antibiotiques associés aux dérivés de fluorure pourraient devenir une option de traitement contre des souches résistantes afin de diminuer la toxicité causée par de fortes doses des antibiotiques conventionnels. / The emergence of bacterial strains resistant to antibiotics is a worrying phenomenon, which has spread worldwide. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa are multi-resistant opportunistic pathogenic bacteria that can cause many diseases. However, they have become difficult to treat with antibiotics without causing toxicity to humans. It is therefore necessary to develop new molecules against resistant pathogens to combat this problem. Due to their pharmacological action, fluorides have an antibacterial effect on tooth enamel which suggests that their combination with antibiotics could improve antimicrobial activity. Thus, we proposed to study in vitro activities of vancomycin (VAN), oxacillin (OXA), ceftazidime (CFT) and meropenem (MER) alone or combined with sodium fluoride (NaF) and lithium fluoride (LiF ) that were evaluated against resistant and susceptible strains of S. aureus and P. aeruginosa by antimicrobial susceptibility testing , in determining their minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC), and kinetics (Time-Kill). The evaluation of cytotoxicity on human red blood cells, and determination of stability at two different temperatures (4°C, 22°C) were also performed. Associations of antibiotics with fluoride derivatives showed an improvement by increasing the effect of antibiotics with minimal levels necessary to achieve the same result by reducing their toxicity and to properly kill these resistant pathogens. Therefore, antibiotics associated with fluoride derivatives could become a treatment option against resistant strains and at the same time reduce the toxicity caused by high doses of conventional antibiotics.

Achromobacter xylosoxidans est un bacille à Gram négatif non fermentaire pathogène opportuniste. Il est de plus en plus fréquemment isolé chez les patients atteints de mucoviscidose, colonisant leur arbre bronchique et pouvant être responsable d'une dégradation de la fonction respiratoire. Il s'agit d'une espèce bactérienne naturellement résistante à de nombreux antibiotiques : aux céphalosporines (hors ceftazidime), à l'aztréonam et aux aminosides. Les résistances acquises sont fréquentes, en particulier dans les souches isolées d'expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Ces résistances acquises concernent des molécules antibiotiques très utilisées pour le traitement des exacerbations respiratoires de la maladie, ce qui conduit parfois à de véritables impasses thérapeutiques. Au début de notre travail, seuls quelques mécanismes de résistance acquise aux β-lactamines avaient été décrits, mais aucun mécanisme impliqué dans la multi-résistance naturelle d'A. xylosoxidans.La résistance aux antibiotiques par efflux actif de type Resistance-Nodulation-cell Division (RND) est très répandue chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires. Nous avons identifié dans le génome d'A. xylosoxidans trois opérons pouvant coder pour des systèmes d'efflux RND. Par une technique d'inactivation génique nous avons montré que les trois systèmes d'efflux (AxyABM, AxyXY-OprZ et AxyCDJ) pouvaient exporter des antibiotiques. Deux d'entre eux participent à l'antibio-résistance naturelle d'A. xylosoxidans : AxyABM (résistance à l'aztréonam et à plusieurs céphalosporines) et AxyXY-OprZ (résistance aux aminosides)

Les entérocoques font partie de la flore normale intestinale des animaux et des humains. Plusieurs études ont démontré que les entérocoques d’origine animale pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques pour la communauté humaine et animale. Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont importantes en santé publique; elles sont responsables d’environ 12% de toutes les infections nosocomiales aux États-Unis. Au Canada, les cas de colonisation et/ou d’infections à entérocoques résistants à la vancomycine ont plus que triplé de 2005 à 2009. Un total de 387 isolats E. faecalis et E. faecium aviaires, et 124 isolats E. faecalis porcins ont été identifiés et analysés pour leur susceptibilité aux antibiotiques. De hauts pourcentages de résistance envers les macrolides et les tétracyclines ont été observés tant chez les isolats aviaires que porcins. Deux profils phénotypiques prédominants ont été déterminés et analysés par PCR et séquençage pour la présence de gènes de résistance aux antibiotiques. Différentes combinaisons de gènes de résistance ont été identifiées dont erm(B) et tet(M) étant les plus prévalents. Des extractions plasmidiques et des analyses par hybridation ont permis de déterminer, pour la première fois, la colocalisation des gènes erm(B) et tet(M) sur un plasmide d’environ 9 kb chez des isolats E. faecalis porcins, et des gènes erm(B) et tet(O) sur un plasmide de faible poids moléculaire d’environ 11 kb chez des isolats E. faecalis aviaires. De plus, nous avons démontré, grâce à des essais conjugatifs, que ces plasmides pouvaient être transférés. Les résultats ont révélé que les entérocoques intestinaux aviaires et porcins, lesquels peuvent contaminer la viande à l’abattoir, pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance envers la quinupristine-dalfopristine, la bacitracine, la tétracycline et les macrolides. Afin d’évaluer l’utilisation d’un antisérum polyclonal SA dans l’interférence de la résistance à de fortes concentrations de bacitracine (gènes bcrRAB), lors d’un transfert conjugatif répondant aux phéromones, un isolat multirésistant E. faecalis aviaire a été sélectionné. Après induction avec des phéromones produites par la souche réceptrice E. faecalis JH2-2, l’agrégation de la souche donatrice E. faecalis 543 a été observée ainsi que des fréquences de transfert élevées en bouillon lors d’une courte période de conjugaison. Le transfert conjugatif des gènes asa1, traB et bcrRAB ainsi que leur colocalisation a été démontré chez le donneur et un transconjugant T543-1 sur un plasmide de 115 kb par électrophorèse à champs pulsé (PFGE) et hybridation. Une CMI de > 2 048 µg/ml envers la bacitracine a été obtenue tant chez le donneur que le transconjuguant tandis que la souche réceptrice JH2-2 démontrait une CMI de 32 µg/ml. Le séquençage des gènes asa1, codant pour la substance agrégative, et traB, une protéine régulant négativement la réponse aux phéromones, a révélé une association de cet élément génétique avec le plasmide pJM01. De plus, cette étude présente qu’un antisérum polyclonal SA peut interférer significativement dans le transfert horizontal d’un plasmide répondant aux phéromones codant pour de la résistance à de fortes doses de bacitracine d’une souche E. faecalis aviaire multirésistante. Des isolats cliniques E. faecium d’origine humaine et canine ont été analysés et comparés. Cette étude rapporte, pour la première fois, la caractérisation d’isolats cliniques E. faecium résistants à l’ampicilline (EFRA) d’origine canine associés à CC17 (ST17) au Canada. Ces isolats étaient résistants à la ciprofloxacine et à la lincomycine. Leur résistance envers la ciprofloxacine a été confirmée par la présence de substitutions dans la séquence en acides aminés des gènes de l’ADN gyrase (gyrA/gyrB) et de la topoisomérase IV (parC/parE). Des résistances élevées envers la gentamicine, la kanamycine et la streptomycine, et de la résistance envers les macrolides et les lincosamides a également été observées. La fréquence de résistance envers la tétracycline était élevée tandis que celle envers la vancomycine n’a pas été détectée. De plus, aucune résistance n’a été observée envers le linézolide et la quinupristine-dalfopristine. Les données ont démontré une absence complète des gènes esp (protéine de surface des entérocoques) et hyl (hyaluronidase) chez les isolats canins EFRA testés tandis qu’ils possédaient tous le gène acm (adhésine de liaison au collagène d’E. faecium). Aucune activité reliée à la formation de biofilm ou la présence d’éléments CRISPR (loci de courtes répétitions palindromiques à interespaces réguliers) n’a été identifiée chez les isolats canins EFRA. Les familles de plasmide rep6 and rep11 ont significativement été associées aux isolats d’origine canine. Les profils PFGE des isolats d’origine humaine et canine n'ont révélé aucune relation (≤ 80%). Ces résultats illustrent l'importance d'une utilisation judicieuse des antibiotiques en médecine vétérinaire afin d’éviter la dissémination zoonotique des isolats EFRA canins. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance aux antibiotiques et de leurs éléments mobiles ainsi qu’à de nouvelles stratégies afin de réduire le transfert horizontal de la résistance aux antibiotiques et des facteurs de virulence. / Enterococci are part of normal intestinal gut flora of animals and humans. Many studies have shown that enterococci from animal origin could represent an antimicrobial resistance genes reservoir for the human community. The two species Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium are important in public health; they are responsible for approximately 12% of all nosocomial infections in the United States. In Canada, cases of colonization and/or infections to vancomycin resistant enterococci have more than tripled from 2005 to 2009. A total of 387 poultry E. faecalis and E. faecium isolates, and 124 porcine E. faecalis isolates were identified and analyzed for their antibiotic susceptibilities. High percentages of resistance to macrolides and tetracyclines were found in both avian and porcine isolates. Two predominant phenotypic profiles were determined and analyzed by PCR and sequencing for the presence of antimicrobial resistance genes. Various combinations of antibiotic resistance genes were detected; erm(B) and tet(M) were the most common genes. For the first time, plasmid extraction and hybridization revealed colocalization of erm(B) and tet(M) on a plasmid of ~9 kb in porcine E. faecalis isolates, and of erm(B) and tet(O) on a low-molecular-weight plasmid of ~11 kb in poultry E. faecalis isolates. Furthermore, we demonstrated, through mating experiments, these plasmids could be transferred. Results indicate that the intestinal enterococci of healthy pigs and poultry, which can contaminate meat at slaughter, could be a reservoir for quinupristin-dalfopristin, bacitracin, tetracycline, and macrolide resistance genes. To assess the use of a polyclonal antiserum AS on the contact interference of a high level bacitracin resistant (bcrRAB genes) pheromone-responsive plasmid, a multiresistant E. faecalis isolate of poultry origin was selected. After induction with pheromones produced by the recipient strain E. faecalis JH2-2, clumping of the donor E. faecalis strain 543 was demonstrated as well as high transfer frequencies in short time broth mating. Conjugative transfer of asa1, traB and bcrRAB genes and their co-localization were also demonstrated in the donor strain and a transconjugant T543-1 on a plasmid band of 115 kb by PFGE and Southern blotting. A MIC to bacitracin of > 2 048 µg/ml was obtained for both strains 543 and T543-1 whereas the recipient strain JH2-2 demonstrated a MIC of 32 µg/ml. Sequencing of the asa1 gene encoding for an AS, and traB for a pheromone shutdown protein, confirmed the association of this genetic element to the pheromone-responsive plasmid related to pJM01. More significantly, this study presents the evidence that a polyclonal antiserum AS can significantly interfere with the horizontal transfer of a pheromone-responsive plasmid encoding high-level bacitracin resistance of a poultry multidrug resistant E. faecalis strain. Clinical isolates of E. faecium of human and canine origin were analyzed and compared. This report describes for the first time the characterization of canine clinical ampicillin-resistant E. faecium (AREF) isolates related to CC17 (ST17) in Canada. These isolates were resistant to ciprofloxacin and lincomycin. Resistance to ciprofloxacin was confirmed by amino acid substitutions in DNA gyrase (gyrA/gyrB) and topoisomerase IV (parC/parE) genes. High-level gentamicin, -kanamycin and -streptomycin resistances and macrolides resistance were also observed. The frequency of tetracycline resistance was high whereas vancomycin resistance was not detected. Also, no resistance was observed to linezolid and quinupristin-dalfopristin antibiotics. Data demonstrated the complete absence of enterococcal surface protein (esp) and hyaluronidase (hyl) genes among the canine AREF isolates tested while all were acm (collagen adhesin from E. faecium) positive. However, most of them were shown to harbor efaAfm gene, encoding for a cell wall adhesin. No biofilm formation or clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) elements were identified in these canine AREF isolates. rep6 and rep11 families of plasmids were significantly associated with isolates from dogs. The PFGE patterns of human and dog isolates were considered unrelated (≤ 80%). These findings also support the importance of prudent use of antibiotics in veterinary medicine to avoid zoonotic spread of canine AREF isolates. We are confident that our results may help to better understand the mechanisms of antibiotic resistance and mobile element carrying them as well as new strategies to reduce the horizontal transfer of antibiotic resistance and virulence traits.

Grâce à la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, l'identification des bactéries est maintenant possible en quelques minutes. Mais le taux de mortalité des patients augmente lorsqu'une antibiothérapie inappropriée est utilisée et les instruments MALDI-TOF ne sont pas capables d'analyser rapidement et exhaustivement la résistance bactérienne. Actuellement, 6 à 24 heures sont nécessaires pour déterminer le phénotype de résistance. En couplant une chromatographie liquide et un spectromètre de masse à ionisation électrospray (LC-MS/MS), nous avons identifié les marqueurs de résistance en 1 à 2 heures. En 30 min, nous avons pu détecter les mécanismes de résistance aux β-lactamines, aux glycopeptides, à la méthicilline et aux fluoroquinolones, à l'aide de méthodes de type "Suivi de Réactions Sélectionnées", ou "Selected Reaction Monitoring" (SRM). Au cours de la même analyse multiplexée, des dizaines de protéines peuvent être détectées de façon hautement spécifique et sensible. Comme l'illustre l'étude de la résistance multifactorielle chez Acinetobacter baumannii, cette approche permet en outre une analyse quantitative d'un grand intérêt pour certains mécanismes de résistance. Cependant, malgré ces perspectives attrayantes, la LC-MS/MS reste, aujourd'hui, loin d'une possible implantation en routine dans les laboratoires de microbiologie. Les instruments sont trop coûteux et la technologie trop complexe pour un usage pour du diagnostic in vitro. La spectrométrie de masse pourrait déjà avantageusement compléter les technologies actuelles de biologie moléculaire. Aujourd'hui, le séquençage de nouvelle génération est la méthode de référence pour la caractérisation moléculaire des bactéries. Mais, comme démontré dans ce travail, l'annotation des gènes est perfectible. Pour quelques dizaines d'euros et quelques heures d'analyse, les peptides identifies par spectrométrie de masse facilitent l'assemblage des séquences (« scaffolds ») et la détection des gènes. De surcroît, la spectrométrie de masse permet une quantification précise des protéines. Elle apporte ainsi une nouvelle dimension analytique et une vision moléculaire plus proche du phénotype. En conclusion, la spectrométrie de masse LC-MS/MS peut être une technologie complémentaire attractive, voir une future alternative, à la biologie moléculaire pour la caractérisation des bactéries / Thanks to MALDI-TOF mass spectrometry, identification of isolated bacteria is now possible within a few minutes. But doctors also need to rapidly know the phenotype of resistance of the bacteria. Indeed, the patient mortality rate increases when the antibiotherapy is not appropriate. However, MALDI-TOF instruments are not able to analyze antibacterial resistance rapidly and comprehensively.Today, 6 to 24 hours are nedded for antibiotic susceptibility testing. When combining a liquid chromatography and a mass spectrometer with electrospray ionization (LC-MSMS), the detection of resistance biomarkers was possible within 1 to 2 hours. Using a Selected Reaction Monitoring (SRM) method, resistance mechanisms to beta-lactams, methicillin, glycopeptides and fluoroquinolones were detected in strains within 30 minutes. Tens of resistance determinants can be analyzed in a single multiplexed assay, with high specificity and sensitivity. Illustrated by the study of multifactorial resistance in Acinetobacter baumannii, the technology allows furthermore a quantitative analysis, which is of great value for some resistance mechanisms. Similarly, we identified virulent strains of enterohemorrhagic Escherichia coli by targeting toxins and serotype biomakers in the same assay. Mass spectrometry offered deeper bacterial characterization than conventional serotyping using polyclonal antibodies. However, despite all these favorable prospects, LC-MS/MS remains today far from reaching a routine use in microbiological hospital laboratories. Instruments are too expensive and the technology is too cumbersome for a daily in vitro diagnostic use. Waiting for a more suitable use, mass spectrometry could yet advantageously complement current molecular technologies. Today, the gold standard to study bacteria at molecular level is next generation sequencing. However, as demonstrated during this work, gene annotation remains imperfect. For tens of euros and few hours of analysis, peptides identified by mass spectrometry analysis of a bacteria might improve scaffold assembly and gene detection. Moreover, mass spectrometry gives an accurate protein quantitation and brings a new analytical dimension, potentially closer to the phenotype than molecular techniques. In conclusion, LC-MS/MS mass spectrometry could be an attractive complementary, or alternative technology in a near future, to conventional molecular biology techniques for deep characterization of bacteria

L’administration par voie orale des médicaments reste encore de nos jours la voie royale de la prise des médicaments car moins onéreuse et plus adaptée au confort du patient. Mais cette voie reste toujours inaccessible pour certains médicaments comme les médicaments biologiques et les bio similaires voir certains anticancéreux et antirétroviraux.Le but de ce travail est d’améliorer la biodisponibilité par voie orale des médicaments à faible biodisponibilité par la mise au point d’un promoteur d’absorption. Pour y arriver nous avons adopté comme stratégie de développer un promoteur qui agit à la fois sur le passage passif et sur le passage actif des médicaments. Les études in vitro ont été réalisées en chambre de perméation d’Ussing adaptées par la société Biomécatronics SAS (BéthuneFrance). Dans la première partie de ce travail (Brevet), nous avons montré que l’utilisation d’une composition pharmaceutique et/ou diététique comprenant un extrait de plante(Hibiscus sabdariffa) pouvait augmenter la biodisponibilité in vitro des médicaments et des xénobiotiques qui passent par la voie paracellulaire comme le cisplatine (21 fois),l’oxaliplatine (11fois), la fluorescéine isothiocyanate-Dextran 4000 (3 fois), mais également les médicaments connus pour leur transport actif par la voie transcellulaire comme l’Efavirenz (7 fois) et l’Atazanavir (4 fois). Dans la seconde partie de ce travail, nous avons cherché à vérifier si notre promoteur d’absorption des médicaments a un effet sur la couche de mucus intestinale.Cette couche peut être un facteur limitant de passage des médicaments au travers de la barrière intestinale.Dans un premier temps (article 1), nous avons induit l’augmentation de la couche mucus au niveau du colon de rat après un prétraitement pendant une semaine avec le métronidazole. Puis nous avions confirmé (article 2) que l’administration par voie orale de deux antibiotiques le Cotrimoxazole (CTX) et le métronidazole (MTZ) pendant une semaine augmente la couche de mucus au niveau du côlon ; aussi nous avons montré qu’il existe une relation entre l’augmentation de la couche de mucus et la diminution de la conductance qui est l’index de transport passif des ions, des électrolytes et de certaines molécules à faibles poids moléculaires.De plus l’augmentation de la couche de mucus au niveau de l’intestin est responsable de la diminution du passage transépithélial des deux antirétroviraux dont l’utilisation est recommandée en première ligne par l’OMS (le.Ritonavir et l’Atazanavir) surles sujets porteurs du VIH (virus de l’immunodéficience humain). Après les traitements auMTZ et au CTX la sécrétion de l’Atazanavir augmente respectivement dans le côlon proximal de 2 et 4 fois et dans le côlon distal de 3 et 5 fois. On obtient également une sécrétion du Ritonavir de 5 et 10 fois dans le proximal et de 2 et 5 fois plus dans le distal.Le travail se poursuit par l’étude de l’effet de notre promoteur d’absorption des médicaments sur la couche de mucus intestinal.En conclusion, ce travail montre que l’on peut augmenter la biodisponibilité in vitroen utilisant les promoteurs de l’absorption des xénobiotiques qui agissent à la fois au niveau du transport passif et actif. / Oral dosing is still seen as the silver bullet of drug administration, as it is cheaper andbetter adapted to patient comfort. However, oral route is still inaccessible to many drugssuch as biologics and biosimilars respectively certain anticancer drugs and antiretrovirals(ARV).The aim of this present study was to find new drugs enhancers that improve the oralbioavailability of drugs and xenobiotics. All the studies were realized in vitro using Ussingchambers technic. To achieve the set objective we used the strategy to develop drugenhancer which can modulate at the same time transcellular and paracellular pathways.In the first part of this study (patent) we have shown that the use of a pharmaceutical and /or a dietetic formulation containing a plant extract (Hibiscus sabdariffa) could increase thebioavailability in vitro in rats not only of cisplatin (21 fold), oxaliplatin (11 fold) andFluorescein Isothiocyanate-Dextran 4000 (FD4, 3 fold). All that drugs were transportedthrough intestinal barrier using paracellular pathway. In addition the study showed thatthis formulated enhancer can increased the bioavailability of Efavirenz (7 fold) andAtazanavir (4 fold) which are active transported.In order to assess the effect of new drugs enhancer on mucus thickness that limits thetransport of xenobiotic through intestinal barrier, we decide to evaluate his effect on passiveand active transport of drugs.In the second part of this study we have shown that after a week of pre-treatment of ratswith Metronidazole (MTZ, publication 1) and Cotrimoxazole (CTX, publication 2), the twomost commonly used antibiotics in the prophylaxis against opportunistic infections in HIV /AIDS, both increase colonic mucus thickness that affect directly passive intestinalpermeability by reducing conductance an index of passive transport through intestinalepithelium. In addition those antibiotics also entail a change in the transepithelialconductance and ARV fluxes. After MTZ and CTX treatment the secretion of Atazanavir(ATZ) increases respectively in the proximal colon by 2 to 4 fold and in the distal colon by 3to 5 fold respectively. Ritonavir (RTV) is poorly absorbed in control, after a week of pretreatmentwith MTZ and CTX one rather notices a secretion of RTV 5 to 10 fold higher in theproximal and 2 to 5 fold higher in the distal colon. The next study will be conducted toevaluate the effect of new drugs enhancer on mucus thickness layer.In conclusion, oral bioavailability of drugs and xenobiotics can be enhanced bypharmaceutical composition that contains herbal extract which increase passive and activetransport of drugs through intestinal barrier.

Les écosystèmes aquatiques soumis à des pressions anthropiques sont des lieux d'évolution rapide des communautés microbiennes. Cet environnement participe certainement à l'émergence d'agents infectieux résistants aux antibiotiques. La ville de Montpellier est située dans un petit bassin versant qui subit d’une part des épisodes de pluies brutales et d’autre part de fortes pressions démographiques. Le principal hôpital est situé dans une zone de ruissellement comprenant deux petites rivières urbaines provenant d'eaux souterraines karstiques à quelques kilomètres en amont. L’objectif de cette étude est d'explorer les communautés bactériennes dans les rivières urbaines qui coulent près du centre hospitalier afin d'évaluer l'influence des ruissellements sur la résistance aux antibiotiques dans les communautés bactériennes. Les communautés bactériennes sont également décrites dans les aquifères karstiques en amont. Une section introductive présente les méthodes disponibles pour l'étude de la résistance aux antimicrobiens dans l'environnement et une revue de la littérature expose les données actuelles sur la résistance aux antibiotiques dans l’eau de ruissellement urbain. Cette partie justifie les stratégies expérimentales. La méthode développée ici, appelée détermination de la concentration inhibitrice à l’échelle de la communauté bactérienne (c-IC, pour community inhibitory concentration), est combinée à une description de la richesse taxonomique pour donner une description instantanée des communautés bactériennes résistantes dans les environnements aquatiques. Une stratégie dérivée de l'approche c-IC permet d'explorer la résistance bactérienne dans le système hydrologique urbain près de l'hôpital et dans les aquifères karstiques. Les données microbiologiques recueillies sont complétées par des données hydrologiques, hydrogéologiques, climatiques et physico-chimiques.L'impact de très faibles concentrations d'antibiotiques sur la structure de la communauté bactérienne dans divers environnements hydriques a été démontré et apparaît comme un indicateur de la vulnérabilité des écosystèmes face aux pressions antimicrobiennes. Le répertoire taxonomique des communautés fluviales urbaines a été décrit et sa dynamique a été confrontée aux conditions environnementales. Le voisinage des hôpitaux augmente significativement la prévalence des bactéries résistantes par rapport à une zone urbaine similaire éloignée de l'hôpital. Des bactéries d’intérêt médical résistantes aux céphalosporines et aux carbapénèmes ont été isolées. De façon surprenante, un Escherichia coli producteur de NDM-5, pathogène émergeant hautement résistant, a été signalé pour la première fois dans une rivière française. Le clone a été détecté dans deux échantillons indépendants montrant sa persistance. Le gène blaNDM-5 et son environnement génétique ont été décrits sur un plasmide IncX3 transférable, indiquant un transfert génétique horizontal possible. La résistance aux antimicrobiens dans l'eau souterraine karstique a varié dans le temps et dans l'espace et est difficilement comparable à celle décrite dans les rivières associées. En milieu urbain, la qualité de l'eau et le risque infectieux sont généralement évalués sur les eaux usées et les effluents des stations d'épuration. Cette étude montre que les eaux de ruissellement dans des zones urbanisées contribuent à l'émergence et à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens. Compte tenu de l'épidémiologie inquiétante des maladies infectieuses, cette étude invite à explorer les potentiels réservoirs environnementaux de bactéries résistantes afin de compléter les connaissances sur le cycle épidémiologique de la résistance aux antimicrobiens et essayer de l’interrompre ou de le ralentir. / Aquatic ecosystems subjected to anthropic pressures are places of rapid evolution of microbial communities. They are likely hotspots for emergence of infectious disease agents resistant to antibiotics. The city of Montpellier is located in a small watershed that undergoes brutal rainfall episodes and strong demographic pressures. A hospital is located in a runoff area including two small urban rivers originating from karstic groundwater few kilometers upstream. The aim of the study is to explore bacterial communities in urban rivers flowing near hospital settings in order to evaluate the influence of runoffs on antibiotics resistance in the bacterial communities. Bacterial communities are also described in upstream karstic aquifers.An introductive section presents the methods available for studying antimicrobial resistance in environment and then reviews comprehensively bibliography on antibiotics resistance in urban runoffs. This part supports the experimental strategies. The method developed herein, called community Inhibitory Concentration (c-IC) determination is combined to taxonomic richness description to provide a tool that gives a rapid snapshot of resistant bacterial communities in aquatic environments. A strategy derived from c-IC approach allows the exploration of bacterial resistance in the urban hydrologic system near the hospital and in karstic aquifers. The collected microbiological data has been completed by hydrological, hydrogeological, climatic and physico-chemical data.The impact of very low concentration of antibiotics on the bacterial community structure in various water bodies was demonstrated and appeared as an indicator of the vulnerability of ecosystems to antimicrobial pressures. The taxonomic repertory of the urban river communities was described and its dynamics was compared to environmental conditions. Hospital vicinity significantly increase the prevalence of resistant bacteria compared to a similar urban area remote from hospital. Diverse clinically relevant cephalosporins and carbapenems resistant bacteria have been isolated. Surprisingly, a NDM-producing Escherichia coli, which is a highly resistant and emerging pathogen was reported for the first time in a French River. The clone was detected in two independent sampling showing its persistence. The blaNDM-5 gene and its surrounding sequences were described on a transferable IncX3 plasmid, indicating possible genetic transfer to other bacteria. The antimicrobial resistance in karst groundwater varied in time and space and was hardly compared with that described in related rivers.In urban settings, water quality and infectious risk is generally assessed on sewers and wastewater treatment plants effluents. This study shows that runoff waters in urbanized area contribute to the emergence and dissemination of antimicrobial resistance. Considering the worrisome epidemiology of infectious diseases, it urges to decipher all environmental reservoirs for resistant bacteria in order to complete knowledges about the epidemiological cycle of antimicrobial resistance and try to break or slow down it.

Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliqués dans la synthèse protéique bactérienne. Dans un premier chapitre, les origines de la synthèse protéique au temps du monde ARN sont traitées en guise d'introduction. Ce travail théorique se poursuit par la présentation d'une structure à haute résolution du facteur d'élongation G (EF-G) en complexe avec le ribosome par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET). Grâce aux avancées techniques de la cryo-MET, nous avons observé pour la première fois EF-G lié au ribosome en l'absence de tout inhibiteur. Cet état particulièr d'EF-G permet de visualiser une flexibilité de son doamine III. Cette étude permet aussi de rationaliser le fonctionnement de l'antibiotique acide fusidique. Nous nous sommes ensuite intéressés aux voies de sauvetage de la synthèse protéique et plus particulièrement de la trans-traduction. Ce mécanisme fascinant permet le recyclage des ribosomes bloqués sur un ARN messager défectueux. Cette voie de sauvetage est généralement vitale ou alors indispensable pour la virulence bactérienne. Nous avons réalisé une étude structurale préliminaire de la dégradation de l'ARNm défectueux durant ce processus. Après une revue traitant du sujet, nous présentons une étude de la trans-traduction comme cible pour le développement de nouveaux antibiotiques. Pour cela, nous avons mis au point un système rapporteur avec contrôle interne de l'activité trans-traductionnelle bactérienne. Après avoir mis au point ce système et validé son utilisation, nous l'avons exploité en testant des molécules ciblant la trans-traduction. / The current PhD work brings together various studies linked to bacterial protein synthesis. The first chapter is about the origins of protein synthesis at the time of the RNA world. This theoretical work continues with the presentation of a high-resolution structure of the elongation factor G (EF-G) in complex with the ribosome by cryo-electron transmission microscopy (cryo-TEM). We describe for the first time EF-G bound to the ribosome in the absence of any inhibitor. This particular structure of EF-G displays a yet unseen positioning of its third domain, which becomes very flexible. This study helps to understand the way the antibiotic fusidic acid blocks translation. The work then switches to a study of trans-translation, the main rescuing system of stalled ribosomes in bacteria. Trans-translation is generally vital or at least necessary for bacterial virulence. We conducted a preliminary structural study on the way faulty mRNAs are degraded during this process. This is why we present a study of trans-translation as a target for the development of new antibiotics. For this we developed and validated a reporter system for trans-translation, which is used to screen molecules targeting trans-translation.

Le suivi de la viabilitié, la croissance et le métabolisme cellulaire des bactéries peut contribuer de manière significative au diagnostic précoce de la maladie, mais peut aussi aider à améliorer le rendement des produits bactériens dans des expériences industrielle ou à petite echelle. Les méthodes conventionnelles utilisées pour l'étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques sont basées principalement sur la culture, une technique qui prend au moins 12 heures pour rendre un résultat. Ce retard conduit au surtraitement d'un large éventail d'infections par des antibiotiques à large spectre, ce qui est coûteux et peut conduire à l'apparition de résistance à ces antibiotiques précieux, tandis que la détection rapide d'une infection virale ou l'absence de bactéries pourrait prévenir de tels traitements et, dans le cas d'une infection bactérienne, l'identification de la sensibilité aux antibiotiques pourrait permettre l'utilisation d'antibiotiques à spectre étroit. Le projet décrit dans le présent document vise à surveiller les activités biologiques des bactéries vivantes immobilisées sur les surfaces biofonctionnalisées de microstructures composées de semi-conducteurs quantiques (QS). Le procédé dépend de la sensibilité de la photoluminescence (PL) émise par des semi-conducteurs à la perturbation du champ électrique induit par la charge électrique des bactéries immobilisées sur la surface de ces structures. Dans la première phase du projet, nous avons étudié une méthode innovante impliquant la surveillance par PL de l'effet de photocorrosion dans des hétérostructures GaAs/AlGaAs. Le maintien d'un équilibre entre la sensibilité et la stabilité du biocapteur dans l'environnement aqueux nous a permis de détecter Escherichia coli K12 dans des solutions salines tamponnées au phosphate (PBS) avec une limite de détection attrayante de 103 UFC/ml en moins de 2 heures. Suite à cette recherche, nous avons émis l'hypothèse que ces hétérostructures pourraient être utilisés pour développer une méthode à faible coût et quasiment en temps reel de la croissance et de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. L'un des éléments clés dans le développement de cette plate-forme de biocapteurs était de démontrer que le GaAs (001), normalement utilisé pour recouvrir les hétérostructures de GaAs/AlGaAs, ne nuira pas à la croissance des bactéries. Dans la deuxième phase du projet, nous avons exploré la capture et la croissance de E. coli K12 sur des surfaces nues et biofonctionnalisées de GaAs (001). Il a été déterminé que la couverture initiale et les taux de croissance de bactéries dépendent de l'architecture de biofonctionnalisation utilisée pour capturer les bactéries: les surfaces biofonctionnalisées avec d'anticorps présentaient une efficacité de capture significativement plus élevée. En outre, on a trouvé que pour des suspensions contenant des bactéries à moins de 105 UFC/ml, la surface des plaquettes de GaAs ne supportait pas la croissance des bactéries, quel que soit le type d'architecture de biofonctionnalisation. Dans la troisième phase du projet, nous avons suivi la croissance et la sensibilité aux antibiotiques de E. coli K12 et E. coli HB101. Tandis que la présence de bactéries retardaient d’apparition du maximum de PL, la croissance des bactéries retardaient encore plus ce maximum. Par contre, en presence d’antibiotiques efficaces, la croissance des bactéries était arrêtée et le maximum de PL est arrivé plus tôt. Ainsi, nous avons pu distinguer entre des E. coli sensibles ou résistantes à la pénicilline ou à la ciprofloxacine en moins de 3h. En raison de la petite taille, du faible coût et de la réponse rapide du biocapteur, l'approche proposée a le potentiel d'être appliquée dans les laboratoires de diagnostic clinique pour le suivi rapide de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. / Abstract : Monitoring the viability, growth and cellular metabolism of bacteria can contribute significantly to the early diagnosis of disease, but can also help improve yield of bacterial products in industrial- or small-scale experiments. Conventional methods applied for investigation of antibiotic sensitivity of bacteria are mostly culture-based techniques that are time-consuming and take at least 12 h to reveal results. This delay leads to overtreatment of a wide range of infections with broad spectrum antibiotics which is costly and may lead to the development of resistance to these precious antibiotics, whereas rapid detection of a viral infection or absence of bacteria could prevent such treatments and, in the case of bacterial infection, identification of antibiotic susceptibility could allow use of narrow spectrum antibiotics. The project outlined in this document aims at monitoring biological activities of live bacteria immobilized on biofunctionalized surfaces of quantum semiconductor (QS) microstructures. The method takes advantage of the sensitivity of photoluminescence (PL) emitting semiconductors to the perturbation of the electric field induced by the electric charge of bacteria immobilized on the surface of these structures. Our hypothesis was that bacteria growing on the surface of biofunctionalized QS biochips would modify their PL in a different, and measurable way in comparison with inactivated bacteria. In the first phase of the project, we investigated an innovative method involving PL monitoring of the photocorrosion effect in GaAs/AlGaAs heterostructures. Maintaining the balance between device sensitivity and stability in the biosensing (aqueous) environment allowed us to detect Escherichia coli K12 in phosphate buffered saline solutions (PBS) at an attractive limit of detection of 103 CFU/mL in less than 2 hours. Following this research, we hypothesised that these heterostructures could be employed to develop a method for inexpensive and quasi-real time monitoring of the growth and antibiotic susceptibility of bacteria. One of the key elements in the development of this biosensing platform was to demonstrate that GaAs (001), normally used for capping PL emitting GaAs/AlGaAs heterostructures, would not inhibit the growth of bacteria. In the second phase of the project, we explored the capture and growth of E. coli K12 on bare and biofunctionalized surfaces of GaAs (001). It has been determined that the initial coverage, and the subsequent bacterial growth rates are dependent on the biofunctionalization architecture used to capture bacteria, with antibody biofunctionalized surfaces exhibiting significantly higher capture efficiencies. Moreover, for suspensions containing bacteria at less than 105 CFU/mL, it has been found that the surface of GaAs wafers could not support the growth of bacteria, regardless of the type of biofunctionalization architecture. In the third phase of the project, we used PL to monitor the growth and antibiotic susceptibility of E. coli K12 and E. coli HB101 bacteria. While immobilization of bacteria on the surface of GaAs/AlGaAs heterostructures retards the PL monitored photocorrosion, growth of these bacteria further amplifies this effect. By comparing the photocorrosion rate of QS wafers exposed to bacterial solutions with and without antibiotics, the sensitivity of bacteria to the specific antibiotic could be determined in less than 3 hours. Due to the small size, low cost and rapid response of the biosensor, the proposed approach has the potential of being applied in clinical diagnostic laboratories for quick monitoring of antibiotic susceptibility of different bacteria.