La limitation des ressources énergétiques fossiles et les lourds impacts environnementaux pouvant résulter de leur exploitation, entraînent un regain d’intérêt pour la digestion anaérobie. Face aux enjeux énergétiques et sanitaires, la conduite d’un méthaniseur implique l’optimisation de la production de méthane, mais aussi d’assurer la qualité sanitaire du digestat du point de vue des micropolluants. C’est dans ce cadre que s’inscrit ce projet de thèse réalisé en partenariat avec la ferme expérimentale de la Bouzule. L’optimisation de la co-digestion de substrats a montré que l’ajout d’herbe ensilée durant 36 semaines, améliorait le rendement du procédé de 20%. Le suivi des micropolluants (métaux lourds et HAPs) contenus dans les herbes provenant des bordures de route a montré que la qualité du digestat ne serait pas affectée si elles sont incorporées au digesteur. L’étude en réacteur batch de l’impact des antibiotiques sur la production de méthane a montré que : à 8 mg/L et 16 mg/L de tétracycline on observe une baisse de 23% et 28% respectivement, à 14 mg/L de spiramycine on observe une baisse de 40%, et à 20 mg/L de tylosine on observe une baisse de 30%. En réacteur continu, les faibles concentrations de tétracycline (0,2 mg/L et 2 mg/L) amélioraient d’environ 5% de la production de méthane au bout de 7 jours. A 200 mg/L et 2000 mg/L de tétracycline, on atteint des baisses de 30% et 40%, et le système ne récupère pas au bout de 7 jours. Quant à la spiramycine, à 1,4 mg/L, 14 mg/L et 140 mg/L, les baisses ont été de 14%, 24% et 39% respectivement, et au bout de 7 jours, une baisse résiduelle est toujours observable. Par ailleurs, les digestats issus des tests avec les antibiotiques sont en accord avec la réglementation / The limitation of fossil energy resources and heavy environmental impacts arising from their operation, there is a renewed interest for anaerobic digestion. According to the energy, and health issues, the monitoring of an anaerobic digester involves the maximization of the methane production, but also to ensure a good quality of digestate from the perspective of micropollutants. It is within this framework that this project of thesis is realized in partnership with the experimental farm of “La Bouzule”. The optimization of the co-digestion of substrates, showed that the use of 36 weeks grass silage improved the process yield by 20%. The monitoring of heavy metals and PAHs content in the grasses from roadsides showed that these grasses – if used as co-substrate in the digester – will not affect the digestate quality. The study of the impact of antibiotics on methane production in batch reactor showed that: 8 mg/L and 16 mg/L of tetracycline led to 23% and 48% decrease respectively, 14 mg/L of spiramycin led to 40% decrease, and 20 mg/L tylosin to 30% decrease. The monitoring of the continuous reactor showed that low levels of tetracycline (0.2 mg/L and 2 mg/L) led to an improvement of about 5% of the methane production. At 200 mg/L and 2000 mg/L of tetracycline, reductions of 30% and 40% are achieved, and the system did not recover after 7 days. The addition of spiramycin to the continuous reactor at 1.4 mg/L, 14 mg/L and 140 mg/L resulted in decreases of 14%, 24% and 39% respectively. For the latter, after one week, a residual drop is still observable. Furthermore, the digestate resulting from the monitoring of the continuous reactor during the tests with antibiotics is in accordance with current regulations

La résistance bactérienne aux antibiotiques est un problème de santé publique mondial principalement lié à un mésusage des antibiotiques (surconsommation et prescription inadéquate).Pour lutter contre cette menace, des recommandations diffusées par les sociétés savantes et des plans d’action ont été mis en place. Même si ils sont nécessaires, ils ne sont pas suffisants pour assurer une amélioration significative de l’usage des antibiotiques. Un fort taux de non-conformité de la prescription antibiotique au regard des recommandations est observé dans les établissements de santé (ES). La mise en place de programmes volontaristes de bon usage antibiotique au sein de chaque ES s’avère essentiel pour améliorer l’usage des antibiotiques : une action sur les comportements des prescripteurs est indispensable, par le biais de différentes stratégies. Qu’elles soient persuasives ou restrictives, celles-ci ont toutes montré leur efficacité, sans entraîner d’effets cliniques néfastes pour les patients (pas d’augmentation de la mortalité ni de la durée de séjour), tout en permettant une réduction des coûts liés aux anti-infectieux.Par le biais de nos travaux, nous avons cherché à étudier le bon usage antibiotique en milieu hospitalier, à l’échelle de différents types d’ES (hôpital local, centre hospitalier régional universitaire, cohorte de 259 ES), et en évaluant l’impact de recommandations nationales ou de programmes et de guides locaux. Ces travaux nous ont permis de constater que la diffusion de recommandations nationales pouvait permettre de réduire les consommations de carbapénèmes, et qu’un programme mené dans un hôpital local pouvait être très efficace pour réduire les consommations de fluoroquinolones, mais également la résistance bactérienne à plus long terme. Des audits ciblés sur la prescription des aminosides et l’antibioprophylaxie chirurgicale ont permis de mettre en évidence des non-conformités récurrentes orientant sur des actions d’amélioration ciblées à mener.En conclusion, ce travail souligne l’importance des programmes de bon usage antibiotique au sein de chaque ES, quel que soit le type et le nombre de lits. En effet, ces programmes venant en appui aux recommandations ont démontré leur efficacité pour réduire les consommations et améliorer la qualité des prescriptions antibiotiques, grâce à leur impact positif sur les comportements des prescripteurs. / Bacterial resistance to antibiotics is a worldwide public health issue which is mainly linked to antibiotic misuse (overconsumption and inappropriate prescription).To fight this threat, recommendations from learned societies and national action plans have been set up. Even if they are necessary, they are not sufficient to provide a significant improvement in the antibiotic use. A high rate of non-compliance with the recommendations is observed among healthcare facilities (HCFs). The setting up of proactive antimicrobial stewardship programs (ASP) among every HCF is essential to improve antibiotic use: an action on prescribers’ behavior is necessary, by using various strategies. These strategies, however persuasive or restrictive, have been shown to be effective, with no clinical negative effects for the patients (no increase in mortality and in length of stay), while reducing anti-infective costs.With this work, we aimed to study the appropriateness of antibiotic use in hospitals, at different HCFs levels (local hospital, university hospital, 259 French HCFs cohort), by assessing the impact of national recommendations or local ASP and guidelines. These studies showed that national recommendations could lead to a reduction in carbapenem consumptions, and that an ASP conducted in a local hospital could be very effective to reduce fluoroquinolones consumptions, and bacterial resistance at a longer term. Targeted audits on aminoglycosides prescription and on surgical antibioprophylaxis have permitted to highlight recurrent non-compliances, guiding improvement measures to set up.In conclusion, this work supports the weight of ASPs among each HCF, whatever type and size. Indeed, these ASPs, set up in support of the national recommendations, have demonstrated their effectiveness in reducing antibiotic consumptions and improving prescription appropriateness, by their positive impact on prescribers’ behaviors.

Le diagnostic, la caractérisation et l'identification rapides et précis des agents pathogènes sont essentiels pour guider le traitement, détecter les événements de transmission ou les échecs de traitement. Cependant le monde biomédical est confronté à des pathogènes émergents et ré-émergents. Ainsi certaines souches bactériennes cliniques présentent des spécificités de virulence, contagiosité et/ou de résistance aux antibiotiques. Le séquençage génomique à haut débit et l’analyse comparative des génomes bactériens constituent une bonne stratégie pour étudier rapidement les caractéristiques de ces pathogènes émergents. En à peine un peu plus de 20 ans, la génomique a connu un développement considérable grâce aux nouvelles technologies de séquençage à haut débit et à l’intérêt des scientifiques, qui ont permis l’augmentation exponentielle du nombre de génomes bactériens séquencés et disponibles dans les bases de données publiques. La génomique en temps-réel consiste en une analyse rapide du génome d’une souche bactérienne clinique pour identifier les déterminants génétiques de ses caractéristiques phénotypiques inhabituelles. C’est ainsi que les objectifs de ce projet de thèse étaient : d’exploiter rapidement les données de séquençage de génomes complets pour déterminer les répertoires de résistance et de virulence ; de comparer les génomes provenant des bactéries cliniques atypiques à ceux d’autres bactéries des mêmes espèces pour identifier leurs caractéristiques spécifiques ; d’utiliser les génomes comme outil taxonomique pour décrire rapidement les nouvelles espèces bactériennes isolées dans le laboratoire par culturomique. / Rapid and accurate diagnosis, characterization and identification of pathogens are essential to guide treatment and detect transmission events or treatments failures. However, the biomedical field is confronted with emerging and re-emerging pathogens. Some of these clinical bacterial strains exhibit specificities concerning the virulence, contagiousness and / or resistance to antibiotics. High-throughput sequencing and comparative analysis of bacterial genomes is a reliable strategy enabling the rapid study of the characteristics of these emerging pathogens. In a short period, not exceeding 20 years, genomics has known a considerable revolution. In effect the introduction of the new high-throughput sequencingtechnologies and the increased concern of the scientist into this field, led to an exponential increase of number of available sequenced bacterial genomes in public databases. Real-time genomics is a strategy consisting on rapid analysis of the genome of a clinical bacterial strain in order to identify the genetic determinants justifying its unusual phenotypic characteristics. Thus, the objectives of this thesis project were: to rapidly exploit whole-genome sequencing data for identification of the virulence or resistance repertoire; to compare genomes from atypical clinical bacteria to those of other bacteria of the same species in order to identify their specific features; to use genomes as a taxonomic tool to rapidly describe the new bacterial species isolated in the laboratory by culturomics approach.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste impliqué dans les infections nosocomiales. Sa multi résistance aux antibiotiques s’exerce notamment grâce à l’activation de pompes d’efflux membranaires. Il s’agit de systèmes tripartites composés d’une porine de la famille OMF (Outer Membrane Factor) ancrée dans la membrane externe, d’un transporteur de la famille des RND (Resistance Nodulation Division) localisé dans la membrane interne et d’un adaptateur périplasmique de la famille des MFP (Membrane Fusion Protein) qui consolide l’ensemble. Le travail réalisé au cours de cette thèse apporte une contribution à la compréhension des mécanismes d’assemblage et d’ouverture des pompes d’efflux ainsi qu’à leur régulation grâce au développement de nouveaux outils empruntés à la physique, à la biochimie et à la microbiologie. Une première étude a permis de déterminer la stoechiométrie d’interaction entre MexA et OprM par gel bleu natif (Ferrandez, Monlezun et al. 2012). Une deuxième étude a été consacrée, dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de B. Le Pioufle (ENS Cachan), à la caractérisation par électrophysiologie de l'ouverture de la porine OprM, insérée dans une membrane artificielle reconstituée sur une biopuce (Wang, Monlezun et al. 2012). Puis, afin d’étudier cette fois ci, le mécanisme d’ouverture de la porine OprM in vivo, une étude fonctionnelle par complémentation chez Pseudomonas aeruginosa a été initiée. Enfin, dans le cadre d'une collaboration avec l’équipe de P. Plésiat (Laboratoire de Bactériologie, Besançon), deux analyses de mutants cliniques par modélisation ont été réalisées sur le régulateur MexZ de la pompe MexXY/OprM et de la porine d’influx des carbapénèmes OprD. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen involved in nosocomial infections. This bacteria has developed various strategies to resist antibiotics treatments, one of them being the activation of membrane efflux pumps. These tripartite systems consist of an OMF (Outer Membrane Factor) family porin, localized in the outer membrane, an active transporter in the inner membrane, belonging to the RND (Resistance Nodulation Division) family and a periplasmic adaptator protein, member of the MFP (Membrane Fusion Protein) family which consolidates the whole complex. Results obtained during this thesis contribute to a better understanding of efflux pumps’ assembly and opening thanks to the development of new research tools borrowed from physic, biochemistry and microbiology. The first study describes the binding stoechiometry of MexA with its cognate partner OprM by Blue Native Polyacrylamide gel Electrophoresis (Ferrandez, Monlezun et al. 2012). Secondly, a study, in collaboration with B. Le Pioufle’s team (ENS Cachan), was dedicated to the electrophysiologic caracterization of OprM opening using a microfluidic device incorporated with a miniaturized artificial bilayer membrane (Wang, Monlezun et al. 2012). Then, to complete this analysis in vivo, in the third part of this thesis, complementation experiments were initiated in a Pseudomonas aeruginosa strain deleted of its chromosomal oprM gene. Finally, in collaboration with P. Plésiat’s team (Laboratoire de Bactériologie, Besançon), modelling of MexZ, the MexXY/OprM pump’s regulator and modelling of the carbapenems’ porin OprD were made in order to link structural modifications to mutations observed in clinical strains.

La résistance aux antibiotiques est devenue un problème majeur de santé publique à travers le monde pouvant conduire à l’impasse thérapeutique. L’utilisation abusive et inappropriée des antibiotiques en médecine humaine mais également en médecine vétérinaire est en grande partie responsable de la multiplication et de la propagation des bactéries multirésistantes (BMR). Les entérobactéries, hôtes naturels du tube digestif de l’homme et des animaux, ont particulièrement subi ces pressions de sélection antibiotiques et ont pu, grâce à leur capacité à échanger du matériel génétique, acquérir de plus en plus de mécanismes de résistance aux antibiotiques. L’environnement joue un rôle de diffuseur par l’intermédiaire des déchets humains et animaux qu’il reçoit mais est également un pourvoyeur de gènes de résistance grâce aux bactéries naturellement résistantes qu’il héberge. En Guadeloupe, à l’exception des données de surveillance hospitalière des BMR, aucune étude portant sur la résistance aux antibiotiques n’avait été réalisée. Les objectifs de ce travail de thèse étaient donc (i) d’évaluer l’importance de la résistance en milieu communautaire en étudiant la résistance aux antibiotiques des entérobactéries isolées des infections urinaires communautaires et (ii) d’étudier la diffusion environnementale des entérobactéries résistantes aux antibiotiques (ERAs) dans les rivières et les eaux de mer recevant des effluents de stations d’épuration (STEPs) mais également au sein de la faune sauvage terrestre de Guadeloupe.Nous avons donc pu grâce à ce travail mettre en évidence une diffusion environnementale de souches d’ERAs en lien avec les activités humaines. Les rejets de STEPs ont été identifiés comme une des sources d’ERAs et en particulier d’EBLSEs dans l’environnement. Néanmoins, nos résultats montrent que d’autres activités humaines, qui feront l’objet de futures investigations, peuvent être des sources potentielles d’ERAs. La prévention passe donc par une amélioration globale de la gestion des déchets avec notamment une remise à niveau des STEPs et le rejet au large des eaux usées. / Antibiotic resistance has become a major public health concern worldwide that could lead to therapeutic impasse. The overuse and misuse of antibiotics in human medicine but also in veterinary medicine is largely responsible for the proliferation and spread of multi-drug resistant (MDR) bacteria. Enterobacteriaceae are subject to this selective pressure, as the digestive tract is their main reservoir. Moreover, thanks to their ability to exchange genetic material, they can acquire new antibiotic resistance determinants. Through human and animal waste, antimicrobial resistant bacteria can spread in the environment. However, the environment is also a supplier for antibiotic resistance since environmental bacteria naturally harbor antibiotic resistance determinants.In Guadeloupe, except for data from MDR bacteria surveillance in the hospital, no studies concerning antibiotic resistance had been carried out. The objectives of this thesis were (i) to evaluate the antimicrobial resistance in the community by studying antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae strains isolated from community-acquired urinary tract infection and (ii) to study the environmental spread of antimicrobial resistant Enterobacteriaceae (AREs) in river and sea waters receiving effluents from wastewater treatment plants but also in terrestrial wildlife.Our work highlighted the environmental spread of AREs linked to human activities. WWTPs discharge has been identified as a source of AREs, especially ESBLEs, in the environment. Nevertheless, other human activities may release ARB in the environment, and some will be explored in further studies. Thus, prevention requires an overall improvement in waste management, and wastewater discharge should occur in open sea as often as possible

La survie des Primates Non Humains (PNHs) est menacée par les activités humaines et les maladies infectieuses. Pour contribuer à leur conservation au Gabon, plusieurs structures dont les sanctuaires et centres de primatologie ont été mises en place. Cependant, si la gestion des risques sanitaires n’est pas prise en compte et les conditions d’accompagnement réglementées, ces structures qui visent la sauvegarde des PNHs pourraient constituer de véritables carrefours d’échanges de parasites entre espèces de PNH, Homme et/ou microfaune. Ainsi, pour mieux comprendre la nature et l’ampleur du problème, notre travail de thèse avait pour but d’évaluer les risques sanitaires et zoonotiques chez des groupes d’hôtes de deux (2) sanctuaires et d’un (1) centre de primatologie au Sud-est du Gabon. En combinant les études épidémiologiques sur le terrain à la fois chez l’Homme et l’animal, le séquençage, les analyses phylogénétiques ainsi que la modélisation statistique, nos travaux se sont attelés à comprendre (i) la circulation d’agents infectieux entre espèces et (ii) les stratégies parasitaires dans ces nouveaux contextes de communautés créés par les activités humaines. Nous nous sommes intéressés à trois (3) modèles parasitaires, à savoir ; un (1) procaryote (Staphylococcus aureus) et deux (2) eucaryotes dont un agent pathogène à transmission vectorielle (Plasmodium spp) et un groupe viral à transmission directe ou indirecte (paramyxovirus). Nos résultats révèlent une grande diversité plasmodiale circulant chez les PNHs (9 espèces) et montrent que la spécificité d’hôtes observée jusqu’à présent en milieu naturel est rompue. Si aucun plasmodium simien n’a été trouvé chez l’Homme, le spectre d’hôtes de P. falciparum s’agrandit avec sa mise en évidence pour la première fois chez le Mandrill (Mandrillus sphinx). Nos résultats révèlent également une large diversité génétique de Stahylococcus aureus composée de souches généralistes et spécialistes, la circulation de souches SARM (S. aureus résistant à la méticilline) principalement via les souches généralistes, entre groupes d’hôtes traités et non traités aux antibiotiques et décrivent quinze (15) nouvelles souches. Pour les paramyxovirus, aucune infection n’a été identifiée mais la question du patron de circulation épidémique ou endémique est posée. En conclusion, cette étude montre que dans ces structures (i) les conditions écologiques de franchissement inter-espèces des parasites sont réunies et (ii) que ces dernières permettent le développement d’infections encore jamais observées en milieu naturel. Ces conditions de promiscuité entre espèces favorisent la sélection d’espèces parasitaires à large spectre d’hôtes (i.e., généralistes) mais aussi l’occurrence de souches bactériennes résistantes à la méticilline qui se propagent via la communautarisation des parasites, notamment dans la microfaune interagissant avec les PNHs traités aux antibiotiques ou à partir de l’Homme / The survival of Non-human Primates (NHPs) is threatened by human activities and infectious diseases. To participate in their conservation in Gabon, several facilities among which sanctuaries and the Centre De Primatologie (CDP) of the Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF) have been created. However, if the management of health risks is not taken into account and the supportive conditions are not regulated, these facilities which aim to preserve NHPs could become real crossroads for the transmission of parasites between NHP species, humans and/or microfauna. Therefore, to better understand the nature and the extent of the problem, our thesis work aimed to evaluate the health and zoonotic risks in groups of hosts from two (2) sanctuaries and one (1) primatology center in the south-east of Gabon. By combining epidemiological studies on the field both in humans and animals, sequencing and phylogenetic analyses as well as statistical modelling, our work aimed to understand (i) the circulation of infectious agents between species and (ii) the parasitic strategies in the new context of these communities created by human activities. We focused on three (3) parasitic models, namely: one (1) prokaryote (Staphylococcus aureus) and two (2) eukaryotes among which one pathogenic agent with vectorial transmission (Plasmodium spp) and a viral group with direct or indirect transmission (paramyxovirus). Our results highlight a great plasmodial diversity circulating in NHPs (9 species) and show that the specificity of hosts observed up until now in their natural habitat is broken. No simian plasmodium was found in humans, however the specter of hosts of P. falciparum grows with the new addition of mandrills (Mandrillus sphinx). Our results also reveal a large genetic diversity of Staphylococcus aureus composed of general and specialized strains, the circulation of SARM strains (S. aureus resistant to methicillin) mainly via the general strains, between groups of treated and non-treated hosts to antibiotics. Fifteen (15) new strains are described. Regarding paramyxoviruses, no infection was identified but we raise the question of epidemic or endemic circulation models. To conclude, this study shows that in these facilities (i) the ecological conditions required for inter-species crossing of parasites are gathered and (ii) these conditions allow the development of infections previously never observed in the natural environment. These conditions of promiscuity between species favor the selection of parasitic species with a large specter of hosts (i.e., generalists) but also the occurrence of bacterial strains resistant to methicillin which spread via the communitarisation of parasites, especially in microfauna interacting with NHPs treated with antibiotics or humans

Les ADN topoisomérases (Topos) sont des éléments essentiels de la vie cellulaire eucaryote et procaryote. Ces enzymes interviennent lors de la réplication, de la réparation et également lors de la transcription en modulant la topologie de l'ADN. L'ADN gyrase, une Topoisomérase IIA (TopoIIA) bactérienne particulière, est la seule topoisomérase capable de surenrouler l’ADN négativement en présence d’ATP, une activité indispensable au génome bactérien. Les différentes études structurales et fonctionnelles sur ces enzymes ont permis de proposer un mécanisme catalytique de surenroulement très sophistiqué mais la vision morcelée de ces complexes multi-­‐conformationnels laisse aujourd’hui de nombreuses questions mécanistiques en suspens. Ce travail de thèse a combiné une approche structurale et fonctionnelle pour essayer de répondre aux questions fondamentales mécanistiques encore non élucidées à propos des ADN topoisomérases de type II et à la découverte de nouveaux inhibiteurs « anti-­‐Topo » face à l’émergence de populations bactériennes résistantes aux traitements. / Type II DNA topoisomerases (Topo2A) remodel DNA topology during replication, transcription and chromosome segregation. Most TopoIIA are able to perform ATP-­‐dependent DNA relaxation or decatenation but the bacterial DNA gyraseis the sole type II DNA topoisomerase able to introduce negative supercoils. Several biochemical and structural studies haverevealed a highly sophisticated supercoiling catalytic mechanism but despite a wealth of information, the full architectureof Topo2A and the structural basis for DNA supercoiling remain elusive. Due to their physiological roles, topoisomerasesare also important targets for antibiotics targeting the bacterial enzyme but also anti-­‐cancer molecules inhibiting the humanprotein. This presented work has combinedboth structural and functional approach to answer the fundamental mechanisticquestions still unveiled and to discover new inhibitors against the emergence of resistant bacterial population.

Le phénomène de résistance aux antibiotiques est un grave problème de santé publique. Afin de lutter contre l’émergence continue de résistances, le développement de nouveaux agents antibactériens s’avère nécessaire. La translocase bactérienne MraY, enzyme transmembranaire impliquée dans la biosynthèse du peptidoglycane, est essentielle à la survie de la bactérie. Sans équivalent chez les eucaryotes, elle n’est actuellement la cible d’aucun médicament et constitue donc une cible de choix pour le développement de nouveaux antibiotiques. Des molécules naturelles de structure complexe telles que les muraymycines ou les liposidomycines, inhibent cette enzyme avec, de plus, une bonne activité anti-bactérienne.L’objectif de ce travail est de développer la synthèse d’analogues simplifiés de ces inhibiteurs naturels, de structure originale. Un squelette carboné de type aminoribosyluridine, motif central rencontré dans la plupart des inhibiteurs naturels, a été retenu comme châssis moléculaire. L’objectif a été de fonctionnaliser le squelette sur le carbone 5’ de l’uridine par un motif éthynyle permettant l’accès à de nombreuses molécules, grâce à la réaction de cycloaddition azoture-alcyne catalysée par le cuivre. L’étape clé envisagée dans l’approche de synthèse proposée est une réaction de glycosylation entre deux intermédiaires clefs, préparés à l’échelle de plusieurs grammes au cours de cette thèse : - un dérivé du D-ribose fluoré en position anomérique. - un dérivé alkylé en position 5’ de l’uridine, dont l’obtention stéréocontrôlée a été optimisée au cours de l’étude. L’étape clé entre les deux intermédiaires précédents, conduisant au pharmacophore visé sous sa forme protégée, a été réalisée à l’échelle de la millimole. La réaction de cycloaddition a été testée et a permis l’accès à une première famille de molécules. De manière complémentaire, la synthèse de deux autres familles de composés comportant un groupement méthylène supplémentaire entre le triazole et le squelette aminoribosyluridine a été réalisée à partir d'un même époxyde clé. L'activité biologique de toutes les molécules a été évaluée sur l'enzyme MraY purifiée et sur différentes souches bactériennes Gram (+) et Gram (-). / The antibiotic resistance phenomenon is a serious public health problem. To fight against the continuous emergence of resistant strains, the development of new antibacterial agents is of critical importance. The bacterial translocase MraY, a transmembrane enzyme involved in the peptidoglycan biosynthesis, is essential to the survival of the bacteria. Unparalleled in eukaryote cells, this enzyme is currently untargeted by any medication and is therefore a druggable target for the development of future new antibiotics. Natural structuraly complex molecules such as liposidomycins or muraymycines inhibit this enzyme and exhibit also a good anti-bacterial activity. This work aimed to develop the synthesis of simplified analogs of these natural inhibitors. A key aminoribosyluridine scaffold, motif encountered in the most of natural inhibitors, has been selected as molecular frame. The objective was to functionalize this backbone on the 5 'carbon of uridine by a terminal alkyne goup, allowing access to many molecules through the reaction of copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition. The critical step envisaged in the proposed synthetic approach is a glycosylation reaction between two key intermediates prepared at the multi-gram scale during this thesis : - A D-ribose derivative, fluorinated in anomeric position. - A 5'-alkylated uridine derivative. The key step between these two intermediates, leading directly to the refered pharmacophore in its protected form, was conducted at the millimole scale. The cycloaddition reaction has been then tested and has provided access to a first family of molecules. In a complementary manner, two others small library of compounds, bearing an additional methylene group between the triazole and the aminoribosyluridine core, were prepared from the same key epoxide. The biological activity of all molecules was evaluated on purified MraY and on different bacterial strains Gram (+) and Gram (-).

Secretion is the passage of macromolecules across cellular membranes. In bacteria, secretion is essential for virulence and survival. Gram-negative bacteria use specialized envelope-spanning multiprotein complexes to secrete macromolecules called type IV secretion system (T4SS). T4SSs mediate the secretion of monomeric proteins, multisubunit protein toxins and nucleoprotein complexes. Also, they contribute to the horizontal spread of plasmid-encoded antibiotic resistance genes. Consequently, they are potential targets for antivirulence drugs. Gram- negative bacteria have two membranes that the secretion complex spans. As a result, the T4SS consists of proteins inserted in the membranes and of soluble proteins that face into or out of the bacterial cell. The details of channel assembly and structure are not known, although recent advances have revealed the structure of the core secretion channel. VirB8 is an inner membrane protein of the complex that interacts with many other T4SS subunits and works as nucleation factor for T4SS channel assembly. Biophysical studies and NMR experiments in particular were conducted to characterize the structural aspects of VirB8 interactions. Dynamic regions of VirB8 during monomer-to-dimer transition were identified by NMR spectroscopy. X-ray crystal and NMR analyses revealed structural differences at the helical regions (α-1 and α-4) of wild-type VirB8 and its monomeric variant VirB8M102R. Fragment screening identified small molecules binding to the wild-type and monomeric variant. In silico docking analyses suggested that the surface groove in the VirB8 structure is important for effective binding of the small molecules. NMR experiments and biochemical assays demonstrated that the β-sheet domain (β1 in particular) is the binding interface of VirB8 for the interaction with VirB10. The identified interface has functional importance for T4SS-mediated conjugation. In addition, I used NMR spectroscopy to identify changes in the structure of VirB8 upon interaction with VirB5. Altogether, structural and biochemical studies on periplasmic and full length VirB8 enabled us to characterize the sequence of interactions between VirB8 and other VirB proteins during T4SS complex assembly and function. The results of this research may lead to an innovative strategy for the development of novel antimicrobial drugs. / La sécrétion est le passage de macromolécules à travers les membranes cellulaires. Chez les bactéries, la sécrétion est essentielle pour la virulence et la survie. Les bactéries à Gramnégatif utilisent le système de sécrétion de type IV (SST4) pour la sécrétion de toxines et de nucléoprotéines. Les SST4 contribuent notamment à la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques. Pour cette raison, les composants du SST4 sont des cibles potentielles pour le développement de médicaments antivirulence. Le SST4 est un complexe protéique qui s’étend entre la double membrane de la bactérie à Gram-négatif. Les protéines qui le composent sont insérées dans les membranes cellulaires ou solubles. Bien que la structure du pore central du SST4 ait été résolue récemment, les détails de l'assemblage et la structure de ce complexe ne sont pas connus. VirB8 est une protéine de la membrane interne qui interagit avec de nombreuses autres sous-unités du SST4. Il s’agit d’un acteur central de l'assemblage du SST4. Des études biophysiques, et notamment des expériences de RMN ont ainsi été réalisées pour caractériser les aspects structuraux des interactions avec VirB8. Des regions dynamiques dans la structure de VirB8 ont été identifiées par spectroscopie RMN lors de la transition entre la forme monomérique et dimérique. Les analyses de cristallographie et de RMN ont révélé des différences structurales dans les régions hélicoïdales (α1 et α4) de VirB8 wild-type et du variant monomérique VirB8M102R. Le criblage de fragments a permis d’identifier de petites molécules capables de se lier à VirB8 ainsi qu’au variant monomérique. Les analyses d’arrimage moléculaire in silico suggèrent que la rainure de surface dans la structure VirB8 est importante pour laliaison de ces petites molécules. Les expériences de RMN et les essais biochimiques révèlent que le feuillet β (β1 en particulier) constitue l'interface d’interaction entre VirB8 et VirB10. Cette interface d’interaction est d’ailleurs importante pour la conjugaison du SST4. De plus, j'ai identifié des changements dans la structure de VirB8 lors de l'interaction avec VirB5. Les études sur la protéine VirB8 nous ont permis de caractériser la séquence d'événements entre VirB8 et d'autres protéines VirB, régulant l'assemblage et la fonction du SST4.

Parmi les plus grandes menaces de la santé publique dans le monde entier, la résistance aux antibiotiques est à la pointe. Ceci en partie est dû à l'augmentation des infections causées par des bactéries pathogènes résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution du nombre actuel de nouveaux antibiotiques. Dans le souci de remédier à cette situation malheureuse, il y a eu récemment la ré-surfaçage des antibiotiques anciens et abandonnés comme les polymyxines. Colistine, un membre des antibiotiques de polymyxine, est maintenant considéré comme un antibiotique de «dernier recours» pour le traitement des infections bactériennes à Gram-négatives graves en raison de son action puissante contre ces agents pathogènes. Cependant, la résistance à la colistine parmi ces agents pathogènes a émergé dans plusieurs pays et est actuellement en augmentation. En raison de la nouvelle réintroduction relative de cet antibiotique, il ya un manque d'information complètes sur ses propriétés pharmacologiques ainsi que des mécanismes par lequel les bactéries développent une résistance contre celle-ci.Afin de combler ce manque d'information en ce qui concerne le mécanisme de résistance, nous avons donc entrepris ce projet. Tout d'abord, pour procéder à une surveillance épidémiologique des bactéries résistantes à la colistine chez les humains et les animaux domestiques et d'autre part, de décrypter les mécanismes moléculaires de résistance à la colistine parmi les bactéries résistantes isolées. / Among one of the greatest threats facing public health worldwide, antibiotic resistance is at the forefront. This is partly due to increase in infections caused by antibiotic-resistant pathogenic bacterial as well as the current dwindling number of new antibiotics. In a way to address this unfortunate situation, there have been recent resuscitation of old and abandoned antibiotics such as polymyxins. Colistin, a member of polymyxin antibiotics, is now regarded as a 'last-resort' antibiotic for the treatment of severe Gram-negative bacterial infections owing to its potent action against these pathogens. However, resistance to colistin among these pathogens has emerged in several countries and is currently on increase. Due to the relatively new reintroduction of this antibiotic, there is a lack of comprehensive information on its pharmacological properties as well as mechanisms by which bacteria develop resistance against it.In order to bridge this information gap in relation to the mechanism of resistance, we therefore undertook this project. First, to carry out an epidemiological surveillance of colistin-resistant bacteria in humans and domesticated animals and secondly, to decipher the molecular mechanisms mediating colistin resistance among the isolated resistant bacteria.