Orientador: Maria José Soares mendes Giannini / Coorientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Oscar Zaragoza / Banca: Marcia de Souza Carvalho Melhem / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Maristela Pereira / Banca: Christiane Pienna Soares / Resumo: A incidência de infecções fúngicas oportunistas tem aumentado nas últimas décadas devido à crescente proporção de pacientes imunocomprometidos em nossa sociedade. Candida krusei é descrita como um dos agentes de infecções fúngicas em pacientes susceptíveis. Embora sua prevalência seja baixa entre as infecções fúngicas (2-7%), a resistência intrínseca ao fluconazol torna esta levedura importante no contexto relacionado à epidemiologia e na procura de novas alternativas terapêuticas. Modelos de organismos não mamíferos são alternativas viáveis para estudar a virulência de fungos e eficácia de drogas. Neste trabalho utilizou-se Galleria mellonella e Caenorhabditis elegans como modelos para estudar a virulência e avaliar a eficácia antifúngica de anfotericina B e fluconazol durante a infecção por C. krusei, bem como cultura de macrófagos e testes de agrotransformação. No modelo de G. mellonella foi realizada a caracterização completa da interação de C. krusei por meio da determinação do índice de fagocitose, quantificação da densidade hemocitária, melanização, estudos de filamentação, carga fúngica e histopatologia. Além disso, foi realizado estudo de eficácia antifúngica entre G. mellonella e C. elegans mostrando resultados compatíveis entre os dois modelos. Além disso, utilizou-se cultura de macrófagos RAW 267.7 para verificar o efeito das duas drogas sobre a fagocitose e produção de citocinas quando as células foram infectadas com C. krusei. Não houve alterações quanto à fagocitose nesse modelo, entretanto a produção de TNF-α mostrou-se excessivamente aumentada com o tratamento com anfotericina sugerindo que além do efeito direto da droga existem também mecanismos de imunomodulação envolvidos nessa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The incidence of opportunistic fungal infections has increased in the last decades due to the increasing proportion of immunocompromised patients. Candida krusei is described as one of the agents of fungal infections in susceptible patients. Although its prevalence is low among fungal infections (2-7%), the intrinsic resistance to fluconazole makes this yeast important in this context related to epidemiology and new therapies. Models of non-mammalian are viable alternatives to study virulence of fungi and drug efficacy. In this work we used Galleria mellonella and Caenorhabditis elegans as models for studying virulence and evaluate the efficacy of antifungal agent's amphotericin B, fluconazole and caspofungin during infection by C. krusei, and C. albicans, as well as, macrophages and agrotransformation studies. The model of G. mellonella was done full characterization of the interaction with C. krusei by determining the phagocytosis index, measuring the density haemocytic, melanization, filamentation studies, fungal burden and histopathology. In addition, we conducted a study of antifungal efficacy between G. mellonella and C. elegans showing compatible results between the two models. Furthermore, we used macrophage culture RAW 267.7 to determine the effect of drugs amphotericin B and fluconazole on phagocytosis and production of cytokines when the cells were infected with C. krusei and C. albicans. There was no change on the phagocytosis in this model, however, the production of TNF-α was shown to be excessively increased with treatment with amphotericin suggesting that in addition to the direct effect of the drug, immunomodulation mechanisms are also involved in this response. The construction of transformants... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Coorientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Ana Helena Januario / Banca: Tais Maria Baub / Resumo: Piper umbellatum L. Miq. é uma planta pertencente à família Piperaceae encontrada em todas as regiões do Brasil e tradicionalmente usada para diversas enfermidades e afecções. O trabalho visou estudar a atividade antifúngica de P. umbellatum frente a isolados clínicos de Microsporum canis e Trichophyton rubrum, por meio da determinação da concentração inibitória mínima (CIM). O estudo fitoquímico dos extratos hexânico e etanólico de partes aéreas de Piper umbellatum levou ao isolamento de 2 substâncias, a sesamina e o 4-nerolidicatecol (4NC). Frente a M. canis, o extrato etanólico apresentou CIM de 39,1 μg/mL, o hexânico apresentou CIM de 1250 μg/mL, enquanto os extratos clorofórmico e acetato de etila apresentaram CIMs de 78,13 μg/mL, sendo 16 μg/mL para o fluconazol como controle positivo para ambos os fungos. O fracionamento do extrato etanólico levou à obtenção da fração 11 que apresentou o melhor valor de CIM entre as frações, de 9,77 μg/mL para o M. canis. O 4NC foi obtido desta fração 11 e apresentou os melhores CIMs observado deste estudo, de 2,4 μg/mL para M. canis e 4,88 μg/mL, para T. rubrum. Após tratamento com 4NC, Microsporum canis demonstrou uma alteração no perfil proteico avaliado por SDS-PAGE, com o aparecimento de bandas de aproximadamente 139 e 30 kDa entre as proteínas intracelulares e de 35 e 15 kDa entre as extracelulares, bandas que foram analisadas por LC-MS/MS (MALDI-TOF/TOF). O extrato etanólico não demonstrou citotoxicidade a 500 μg/mL, enquanto o 4NC apresentou valores de IC50 de 18,3 e 31,5 μg/mL frente às linhagens de Hep G2 e MRC-5. / Abstract: Piper umbellatum L. Miq. is a plant belonging to the Piperaceae family found in all regions of Brazil and traditionally used for various diseases and disorders. This work evaluates the antifungal activity of P. umbellatum against clinical isolates of Microsporum canis and Trichophyton rubrum by the determination of minimal inhibitory concentration (MIC).The phytochemical study of hexane and ethanol extracts of the aerial parts of Piper umbellatum led to the isolation of two substances, sesamin and 4-nerolidylcatechol (4NC). When tested against M. canis, the ethanol extracts showed MIC value of 39.06 μg/mL meanwhile the chloroform and ethyl acetate extracts showed MICs value of 78.13 μg/mL and the hexane extract showed MIC of 1250 μg/mL, the MIC value of fluconazole used as control was 16 μg/mL. The fractionation of the ethanol extract led to obtain of fraction 11 that presented the best MIC between the fractions, of 9.77 μg/mL to M. canis. 4NC was obtained from fraction 11 and presented the best MIC in this study, 2.44 μg/mL for M. canis and 4.88 μg/mL, for T. rubrum. M. canis showed a change in the protein profile in SDS-PAGE after treatment with 4NC, with the appearance of bands of approximately 139 and 30 kD intracellular protein and 35 and 15 kDa in extracellular protein, each of those bands was analyzed through LC-MS/MS (MALDI-TOF/TOF). The ethanolic extract wasn‟t citotoxic until 500 μg/mL, while 4NC presented IC50 values of 18.3 and 31.5 μg/ml to Hep G2 and MRC-5 cell lines. / Mestre

Orientador: Ângela Regina Araújo / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Banca: Jacqueline Aparecida Takahashi / Resumo: Micro-organismos endofíticos habitam os espaços intra e intercelular de um hospedeiro, durante todo ou parte de seu ciclo de vida, sem causar danos aparentes. Esses micro- organismos são considerados uma fonte importante para a produção de metabólitos secundários com ação antimicrobiana, antitumoral, entre outras. Este trabalho descreve o estudo químico e biológico do fungo endofítico Phomopsis sp. associado à espécie vegetal do cerrado Senna spectabilis. Phomopsis sp. foi cultivado em diferentes meios de cultura para avaliar a variação metabólica em relação a composição dos nutrientes. Foram usados 5 meios líquidos comerciais (MBD, YM, Extrato de Malte, Nutrient e Czapek) e 2 meios sólidos (Milho e Arroz). Os extratos brutos Acetato e Acetonitrila obtidos foram avaliados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de arranjo de diodos e por Ressonância Magnética Nuclear de 1 H, e submetidos aos ensaios para a avaliação da potencialidade antifúngica, antioxidante e anticolinesterásica. Os resultados evidenciaram extratos com uma variação metabólica intensa e potencialmente bioativos. Destes, os meios MDB e Milho foram selecionados para obtenção dos extratos brutos em escala ampliada. O extrato bruto acetato obtido em MDB foi submetido a fracionamento cromatográfico e levou à identificação da uracila (1), ácido nitropropanóico (2), citocalasina H (3), tirosol (4), ciclo(L- Pro-L-Leu), (5), ciclo(L-Pro-L-Ile) (6), ciclo(L-Pro-L-Val) (7), ciclo(L-Pro-L-Tyr) (8) e ciclo(L-Pro-L-Phe) (9). Este é o primeiro relato de dicetopiperazinas obtidos de fungos do gênero Phomopsis. Esta classe de substâncias apresenta inúmeras bioatividades, principalmente antimicrobiana. O extrato bruto acetonitrila obtido de milho conduziu ao isolamento da citocalasina H (3), citocalasina J (10), alternariol monometil éter (11).... não descritos / Abstract: Endophytic microorganisms inhabit the intra and intercellular spaces of a host, during all or part of their life cycle, without causing any apparent damage. Microorganisms are regarded as an important source for the production of secondary metabolites with antimicrobial, antitumoral actions, among others. This work describes the chemical and biological study of endophytic fungus Phomopsis sp. associated with plant species of Cerrado Senna spectabilis. Phomopsis sp. was cultived in different culture media to assess the metabolic variation in relation to nutrient composition. Were used 5 commercial liquid media (PDB, YM, Malt extract, nutrient and Czapek) and 2 solid mediums (Corn and Rice). The acetate and acetonitrile crude extracts were evaluated by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector and 1 H Nuclear Magnetic Resonance and subjected to assays for the evaluation of potential antifungal, antioxidant and anticholinesterase. The results showed extracts with an intense metabolic variation and potentially bioactive. From these, the mediums PDB and Corn were selected to obtain the crude extracts on a large scale. The crude acetate extract obtained in PDB was submitted to chromatographic separation and led to the identification of uracil (1), 3-nitropropionic acid (2), cytochalasin H (3), tyrosol (4), cyclo (L- Pro-L-Leu) (5), cyclo (L-Pro-L-Ile) (6), cyclo (L-Pro-L-Val) (7), cyclo (L-Pro-L-Tyr) (8) and cyclo (L-Pro-L-Phe) (9). This is the first report of diketopiperazines obtained from fungi of the Phomopsis genus. This class of substances shows many bioactivities, especially antimicrobial. The crude acetonitrile extract obtained from Corn led to the isolation of cytochalasin H (3), cytochalasin J (10), alternariol monomethyl ether (11), alternariol (12) and 2-hydroxy-alternariol (13), being the last one reported for the first time as a natural product and with NMR data not reported / Mestre

Orientador: Angela Regina Araujo / Co-orientador: / Banca: Isabele Rodrigues Nascimento / Banca: Mônica Tallarico Pupo / Resumo: Os micro - organismos têm demonstrado serem valiosas fontes de princípios ativos de uso clínico, no qual a penicilina é o exemplo mais conhecido de metabólito secundário, de importância medicinal, produzido por fungos. A espécie vegetal Eugenia jambolana Lam ., popularmente conhecida como Jambolão, é utilizada na medicina popular brasileira, principalmente no tratamento de diabetes. O fungo Botryosphaeria parva, isolado das folhas da E. jambolana (L.) e codificado como Ej_F01, foi cultivado em escala ampliada em três meios de cultivo: Czapek ®, PDB e Milho. Após o período de fermentação do endófito no meio de milho, foi feita uma extração direta com MeOH, seguida de filtração e evaporação do solvente . O extrato obtido foi solubilizado em AcOEt e fez - se três part iç ões l í quido - líquido com H 2 O, após a evaporação do solvente orgânico, o extrato foi dissolvido em CH 3 CN e foi feita uma nova partição líquido - líquido com Hexano, após a evaporação da CH 3 CN, foi obtido o extrato de interesse . Após o período de fermentação do endófito nos meios líquidos (PDB e Czapek ® ), a suspensão micelar foi filtrada a pressão reduzida, separando os micélios dos meios fermentados . Em seguida, os filtrados aquosos foram submetidos a três partições líquido - líquido com AcOEt, e após a evapora ção do solvente orgânico, foram obtidos os extratos brutos de interesse . Todos os extratos for am fracionados utilizando técnicas cromatográficas, como Cromatografia em Coluna e/ou Cromatografia Líquida de Alta Eficiência preparativa. Após o fr acionamento d os extratos brutos, foi possível obter sete substâncias oriundas do extrato do m ilho, seis substâncias do extrato do Czape k ®, e uma do extrato de PDB, que foram submetidas a análises espectrométricas ( EM, RMN de 1 H, 13 C, 1D e 2D) para a determinação/identificação estrutural... / Abstract: M icroorganisms have proven to be valuable sources of active principles for clinical use, wherein the penicillin is the best known example of a secondary metabolite of medicinal importance, produced by fungi. The plant species Eugenia jambolana Lam., c ommonl y called Black Plum, is used in traditional Brazilian medicine, especially in the treatment of diabetes. The Botryosphaeria parva fungus, isolated from leaves of E. jambolana (L.) encoded as Ej_F01, was grown on an enlarged scale in three different culture media: Czapek ®, PDB and corn. After the fermentation period in the corn media, a direct extraction was done with MeOH followed by filtration and evaporation of the solvent. The extract was disolved in AcOEt and made three liquid - liquid partition with H 2 O, after evaporation of the organic solvent, the extract was dissolved in CH 3 CN and was made a new liquid - liquid partition with H exane, after evaporation of the CH 3 CN, it was obtained extract of interest. After the fermentation period in liquid media (PDB an d Czapek ® ), the micellar suspension was filtered under reduced pressure, separating the mycelium from the fermented broth . Then, the aqueous filtrates were subjected to three liquid - liquid partition with AcOEt, and after evaporation of the organic solvent, there were obtained the crude extracts of interest. All extracts were fractionated using chromatographic techniques su ch as column chromatography and /or preparative High Performance Liquid Chromatography efficiency. After the fractioning of crude extracts, it was possible to obtain seven substances derived from corn extract, six substances obtained from Czapek extract, and a substance obtained from the PDB extract, which were submitted to spectrometric analysis (MS - ESI, NMR 1 H, 13 C, 1D and 2D) for determin ing and structural identification. The substances 05, 08, 09 and 11 were identified as 5 - h... / Mestre

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3314099 bytes, checksum: 6718a7629561d518b36935f1ca31ec59 (MD5) Previous issue date: 2013-10-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The fungi have become, over the last two decades, a major cause of illness in humans. Fungi of the genus Penicillium can be found in various substrates and affect immunocompromised people, hospitalized patients, many animals and plants, as well as compromise the quality of air indoors. The indiscriminate use of antibiotics and the resulting framework of resistance of microorganisms to conventional antimicrobial therapy has been stimulating researchers to seek alternative sources of these compounds, among them products derived by medicinal plants. Tendency to get phytochemicals from extracts, fractions, fixed or essential oils obtained from plant species is currently observed. In this context, the present study evaluated the in vitro antifungal activity of seven phytochemicals: carvacrol, citral, geraniol, linalool, pcymene, terpinolene and thymol, against twelve strains of Penicillium. Firstly, screening was carried out to find the phytochemical with the best activity by determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by the broth microdilution technique. Following, the tests were proceeded with thymol, which were: determination of Minimum Fungicidal Concentration (MFC), effect of the phytochemical on mycelial growth kinetics, interference of thymol on germination of conidia and evaluation of the influence of thymol on the fungal morphology. To this end, we selected two strains, one that was more resistant and another with a more sensitive profile. The value of thymol MIC50 and MIC90 was 128μg/ml, while the CFM value ranged from 128μg/ml to 1024μg/ml. It was observed total radial mycelial growth inhibition at the three thymol concentrations used (128μg/ml, 256μg/ml and 512μg/ml) over 14 days of exposure. In the study of the interference of thymol on the conidia germination was observed inhibitory effect. At the concentration of 512μg/mL was found greater than 80% inhibition, at 256 μg/mL inhibition was higher than 75%, while in 128μg/mL inhibition was higher than 60%, all this for both strains tested, revealing concentration-dependent inhibitory effect. In the presence of thymol, morphological changes were observed in mycelial structure, such as decrease in the amount of conidia, reduction in the formation of reproductive structures with the appearance of rudimentary reproductive structures, besides the abnormal development of hyphae. Given the above, it is concluded that thymol has antifungal activity against strains of Penicillium and therefore represents a new possibility in the arsenal of products for the treatment of infections caused by this fungus. / Os fungos tornaram-se, ao longo das últimas duas décadas, uma das principais causas de doença em humanos. Fungos do gênero Penicillium podem ser encontrados nos mais variados substratos e afetam indivíduos imunocomprometidos, pacientes hospitalizados, animais e plantas diversas, além de comprometerem a qualidade do ar de ambientes internos. O uso indiscriminado de antibióticos e o decorrente quadro de resistência dos microrganismos à terapêutica antimicrobiana convencional vem impulsionando os pesquisadores a buscarem fontes alternativas desses fármacos, dentre elas, produtos de plantas medicinais. Observa-se, atualmente, uma tendência à obtenção de fitoconstituintes a partir de extratos, frações, óleos fixos ou essenciais, obtidos de espécies vegetais. Nesse contexto, o presente estudo avaliou a atividade antifúngica in vitro de sete fitoconstituintes: carvacrol, citral, geraniol, linalol, pcimeno, terpinoleno e timol, sobre doze cepas de Penicillium. Primeiramente, realizou-se uma triagem para encontrar o fitoconstituinte com melhor atividade, através da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), pela técnica de microdiluição. A seguir, prosseguiram-se os testes com o timol, quais foram: determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM), efeito do fitoconstituinte sobre a cinética de crescimento micelial do fungo, interferência do timol sobre a germinação dos conídios e avaliação da influência do timol sobre a micromorfologia fúngica. Para tanto, foram selecionadas duas cepas, uma que se mostrou mais resistente e outra com perfil mais sensível. O valor da CIM50 do timol, bem como da CIM90, foi 128μg/ml, já o valor da CFM variou de 128μg/ml a 1024μg/ml. Observou-se total inibição do crescimento micelial radial, nas três concentrações de timol utilizadas (128μg/ml, 256μg/ml e 512μg/ml), ao longo de 14 dias de exposição. No estudo da interferência do timol sobre a germinação dos conídios, observou-se efeito inibitório. Na concentração de 512μg/mL foi encontrada uma inibição superior a 80%, em 256 μg/mL a inibição foi superior a 75%, enquanto que em 128μg/mL a inibição foi superior a 60%, para as duas cepas testadas, revelando um efeito inibitório dependente da concentração. Na presença do timol, foram observadas alterações morfológicas na estrutura micelial, tais como diminuição do número de conídios, redução da formação de estruturas de reprodução com surgimento de estruturas reprodutivas rudimentares, além de desenvolvimento anormal das hifas. Diante do exposto, conclui-se que o timol apresenta atividade antifúngica contra cepas de Penicillium e, conseqüentemente, representa uma nova possibilidade no arsenal de produtos para o tratamento de infecções por este fungo.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2935405 bytes, checksum: a27c6a172bf89039f257e78b64b11891 (MD5) Previous issue date: 2010-06-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A microbiological screening tested ten essential oils and three phytochemicals in solid discs with a sterile medium to evaluate the susceptibility of diferent fungal strains. Oils from C. zeylanicum, O. majorana, O. vulgare were chosen due to their efficient antifungical activity against twenty-one strains analyzed. The tests that determine CIM and CFM have proven through essential oils from C. zeylanicum and O. vulgare were able of causing death on yeast and filamentous strains. The analyze about of the inhibition mycelial growth potential by kinetics of microbial death indicates which essential oils from cinnamon and oregano obtained a important antifungal activity compared with essential oil of marjoram. The oils were able to interfere accentually in the logarithmic phase of yeast during twenty-four hours exposure. This antifungal activity was compared with fungistatic and fungicidal effect of ketoconazole. In regard to count of yeasts, there was not a significant difference (p> 0.05) between to essential oils and the standard antifungal, ketoconazol. The fumigant effect of the essential oils examined in an optical microscope indicates that the possible mechanism of action is an interference with cell wall formation. In agreement with what research suggests, this study tested the effect of sorbitol, an osmotic protector which is a complement, this way, microscopic changes, such as: decreased percentage of cytoplasm, loss of pigmentation, deficient development of hyphae and empty hyphae were observed. This present study also analyzed the essential oils tested against resistant strains caused in part by the presence of efflux proteins on the membrane of some them. / Após triagem microbiológica por meio de difusão, avaliou-se a susceptibilidade fúngica de dez óleos essenciais e três fitoconstituintes. Os óleos de C. zeylanicum, O. majorana, O. vulgare foram escolhidos por apresentarem elevada atividade antifúngica sobre vinte e uma cepas testadas. Os ensaios para determinação da CIM e a CFM mostraram que os óleos essenciais de canela e orégano foram letais sobre as cepas leveduriformes e filamentosas, o que confirmou a boa atividade antifúngica destes óleos. A avaliação do potencial de inibição do crescimento micelial, pela cinética de morte microbiana, mostra que os óleos essenciais de canela e orégano, exibiram atividade antifúngica relevante em relação ao óleo essencial de manjerona. Os óleos foram capazes de interferir acentuadamente na fase logarítmica da levedura, num período de 24 horas, com pronunciado efeito fungicida e fungistático, após 4 horas de exposição. Esta atividade antifúngica foi comparada ao efeito fungistático e fungicida do cetoconazol. Não houve diferença significativa (p> 0,05), encontrada entre as contagens das leveduras frente aos óleos essenciais e o antifúngico padrão, cetoconazol. O efeito fumigante, dos óleos essenciais, quando analisado sob a luz da microscopia óptica, mostra que o possível mecanismo de ação destes óleos essenciais acontece por interferir na formação da parede celular. Para confirmar o modo de ação sugerido, o presente trabalho testou o efeito do sorbitol, protetor osmótico, adicionado ao meio. Observaram-se modificações microscópicas, como: diminuição do teor de citoplasma, perda de pigmentação, desenvolvimento distorcido de hifas e hifas vazias. Também, verificou-se grande resistência dos fungos, causadas em parte, pela presença de proteínas de efluxo na membrana de algumas cepas.

A própolis é um material resinoso coletado pelas abelhas de diversas partes das plantas como brotos, folhas jovens e exsudatos. É utilizado para embalsamar animais que tenham morrido dentro da colmeia, vedar as paredes e conferir proteção frente a doenças. O emprego desse produto natural com finalidade medicinal remonta a antiguidade, tendo iniciado junto com antigas civilizações como a Egípcia, Grega e Romana e perduram até os dias atuais com ampla utilização em múltiplas finalidades terapêuticas médicas e veterinárias. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial antifúngico, a capacidade de remover e inibir biofilmes de espécies de Candida não-albicans de diferentes tipos de própolis e analisar a composição química da própolis obtida do Rio Grande do Sul (RS). Foram realizadas macerações e extrações sequenciais com solventes em ordem crescente de polaridade a fim de purificar os extratos. Em seguida foi feita a determinação da atividade antifúngica pelo método da microdiluição em caldo e o ensaio de remoção e inibição de biofilmes através de teste em corpo de prova (utilizando cateter como material teste). Após, foi realizada a análise química da fração diclorometano de própolis obtida do RS. De modo geral, os extratos e frações de própolis vermelha e própolis nativa do RS demonstraram forte atividade anti-Candida frente às leveduras testadas e significativa capacidade de remoção de seu biofilme aderido em cateteres, como corpo de prova. A própolis verde apresentou baixo espectro de ação antifúngica. A análise química da fração diclorometano de própolis obtida do RS levou ao isolamento dos flavonoides pinocembrina, pinostrobina e pinostrobina chalcona. Os resultados evidenciam o potencial da própolis nativa do RS e da própolis vermelha para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos e desinfetantes contra Candida não-albicans. / Propolis is a resinous material collected by bees from various plant parts such as buds, young leaves and exudates. It is used to embalm animals that have died inside the hive, seal the walls and confer protection against the disease. The use of this natural product with medicinal purposes dates back to antiquity, having started with ancient civilizations as the Egyptian, Greek and Roman, and lasted to the present day with extensive use in multiple medical and veterinary therapeutic purposes. The aim of this study was to evaluate the antifungal potential, the ability to remove and inhibit biofilms of Candida non-albicans of different types of propolis and analyze the chemical composition of propolis obtained from Rio Grande do Sul (RS). Maceration and sequential extractions with solvents in order of increasing polarity were performed to purify the extracts. Then the antifungal activity was determined by the method of broth microdilution testing and removal and inhibition of biofilms through test of body of proof (catheter using as test material). After, the chemical analysis of the dichloromethane fraction of propolis obtained in RS was performed. In general, the extracts and fractions of propolis of RS demonstrated strong anti-Candida activity across the tested yeasts and significant capacity removal of biofilm attached in catheter, as test body. The green propolis had low action spectrum antifungal. Chemical analysis of the dichloromethane fraction of propolis native to RS led to the isolation of the flavonoids pinocembrin, chalcone pinostrobin and pinostrobin. The results show the potential of the RS native propolis and red propolis for the development of new antifungal agents and disinfectants against non-albicans Candida.

Este trabalho trata da purificação em escala preparativa por técnicas cromatográficas, determinação de seqüência primária parcial, caracterização espectroscópica por dicroísmo circular, fluorescência, infravermelho e investigação de atividades biológicas de duas lectinas ligantes de quitina dos extratos salinos de Artocarpus integrifolia, jaca, e Artocarpus incisa, fruta-pão. Nossos resultados revelaram que as lectinas quitina-ligantes das sementes de jaca e fruta-pão, jackina e frutackina respectivamente, são homólogas entre si, constituindo-se por monômeros de cerca de 14 kDa formados por três subunidades, unidas por pontes S-S. Elas possuem 62% de identidade entre si, são ricas em cisteínas, aminoácidos básicos e serinas e não possuem similares identificadas até o momento, podendo constituir um novo grupo de lectinas na superfamília de lectinas quitina-específicas. Os espectros de dicroísmo circular de jackina e frutackina são similares: ambas são proteínas de estrutura toda-beta, com máximo em torno de 230 nm e mínimo em torno de 214 nm, este último, bastante distorcido por estruturas desordenadas. Os espectros de fluorescência de jackina e frutackina apresentaram máximos de emissão acima de 340 nm, sugerindo que os N-terminais de duas das 3 cadeias de jackina e frutackina (onde os triptofanos estão localizados) estão expostos. Frente a condições extremas de pH e temperatura, monitoradas por CD e fluorescência, observou-se que a estrutura de jackina é vulnerável a pH ácido e termicamente estável. Quanto às atividades biológicas, jackina e frutackina mostraram atividade inibitória de crescimento para Saccharomyces cerevisiae; jackina também mostrou promoção de adesão da linhagem de células de eritroleucemia K562, atividade inibitória para Fusarium moniliforme na concentração de 2,25 mg/mL e atividade hemaglutinante frente a células sangüíneas humanas do sistema ABO e de coelhos, que não foi inibida nem por N-acetilglicosamina, indicando sua preferência por quitina ou seus fragmentos. / This work deals with the preparative-scale purification by chromatographic techniques, the partial primary sequence determination, the spectroscopic characterization by circular dichroism, fluorescence, FT-IR and the investigation of biological activities of two novel chitin-binding lectins from the saline extracts of the seeds of Artocarpus integrifolia, jackfruit, and Artocarpus incisa, breadfruit. Our results revealed that the chitin-binding lectins from jackfruit and breadfruit, jackin and frutackin respectively, are homologous to each other, consiting of monomers of 14 kDa, made up of 3 subunits, linked by S-S bridges. They have 62% of identity between each other; they are rich in cysteines, serines and basic amino acids and they are no homologous to any other known protein, probably constituting a new group of lectins in the chitin-binding lectin superfamily. The CD spectra of jackin and frutackin are similar: both present a beta profile spectra, presenting a maximum about 230 nm and a minimum around 214 nm, this later one, distorted by unordered structures. The fluorescence spectra of jackin and frutackin presented maxima above 340 nm, suggesting that the N-terminals of the 2 up 3 chains of jackin and frutackin (where the tryptophans are) are exposed. Regarding the pH and temperature exposure, monitored by CD and fluorescence, it was observed that the structure of jackin is vulnerable to acid pH and thermally stable. When considered the biological activities, jackin and frutackin presented growth inhibition activity towards Saccharomyces cerevisiae; jackin also promoted the adhesion of the erythroleukemic cell line K562, presented growth inhibition activity towards Fusarium moniliforme at 2,25mg/mL and hemaggluting activity towards rabbit and human red cells from the system ABO, that was not inhibited even by N-acetilglucosamine, suggesting itspreference by oligomers of N-acetilglicosamine or chitin.

A própolis é um material resinoso coletado pelas abelhas de diversas partes das plantas como brotos, folhas jovens e exsudatos. É utilizado para embalsamar animais que tenham morrido dentro da colmeia, vedar as paredes e conferir proteção frente a doenças. O emprego desse produto natural com finalidade medicinal remonta a antiguidade, tendo iniciado junto com antigas civilizações como a Egípcia, Grega e Romana e perduram até os dias atuais com ampla utilização em múltiplas finalidades terapêuticas médicas e veterinárias. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial antifúngico, a capacidade de remover e inibir biofilmes de espécies de Candida não-albicans de diferentes tipos de própolis e analisar a composição química da própolis obtida do Rio Grande do Sul (RS). Foram realizadas macerações e extrações sequenciais com solventes em ordem crescente de polaridade a fim de purificar os extratos. Em seguida foi feita a determinação da atividade antifúngica pelo método da microdiluição em caldo e o ensaio de remoção e inibição de biofilmes através de teste em corpo de prova (utilizando cateter como material teste). Após, foi realizada a análise química da fração diclorometano de própolis obtida do RS. De modo geral, os extratos e frações de própolis vermelha e própolis nativa do RS demonstraram forte atividade anti-Candida frente às leveduras testadas e significativa capacidade de remoção de seu biofilme aderido em cateteres, como corpo de prova. A própolis verde apresentou baixo espectro de ação antifúngica. A análise química da fração diclorometano de própolis obtida do RS levou ao isolamento dos flavonoides pinocembrina, pinostrobina e pinostrobina chalcona. Os resultados evidenciam o potencial da própolis nativa do RS e da própolis vermelha para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos e desinfetantes contra Candida não-albicans. / Propolis is a resinous material collected by bees from various plant parts such as buds, young leaves and exudates. It is used to embalm animals that have died inside the hive, seal the walls and confer protection against the disease. The use of this natural product with medicinal purposes dates back to antiquity, having started with ancient civilizations as the Egyptian, Greek and Roman, and lasted to the present day with extensive use in multiple medical and veterinary therapeutic purposes. The aim of this study was to evaluate the antifungal potential, the ability to remove and inhibit biofilms of Candida non-albicans of different types of propolis and analyze the chemical composition of propolis obtained from Rio Grande do Sul (RS). Maceration and sequential extractions with solvents in order of increasing polarity were performed to purify the extracts. Then the antifungal activity was determined by the method of broth microdilution testing and removal and inhibition of biofilms through test of body of proof (catheter using as test material). After, the chemical analysis of the dichloromethane fraction of propolis obtained in RS was performed. In general, the extracts and fractions of propolis of RS demonstrated strong anti-Candida activity across the tested yeasts and significant capacity removal of biofilm attached in catheter, as test body. The green propolis had low action spectrum antifungal. Chemical analysis of the dichloromethane fraction of propolis native to RS led to the isolation of the flavonoids pinocembrin, chalcone pinostrobin and pinostrobin. The results show the potential of the RS native propolis and red propolis for the development of new antifungal agents and disinfectants against non-albicans Candida.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos e glicoconjugados. Rizomas de Microgramma vaccinifolia têm ampla utilização na medicina popular no tratamento de hemoptises e hematúria. Os objetivos deste trabalho foram isolar, caracterizar, avaliar as atividades tóxica, antibacteriana e antifúngica da lectina de rizoma de M. vaccinifolia (MvRL) e identificar as raças 1, 2 e 3 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici por biologia molecular. As proteínas do extrato de rizoma (ER) foram fracionadas com sulfato de amônio fornecendo a fração 0-60% (F0-60%). Atividade hemaglutinante (AH) e concentração de proteína foram determinadas em ER e F0-60%. MvRL foi isolada por cromatografia da F0-60% em Sephadex G-25. A AH de MvRL foi avaliada em presença de carboidratos, glicoproteínas, preparações contendo carboidrato das raças 1, 2 e 3 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, em diferentes temperaturas, valores de pH e na presença de íons. Eletroforese em gel de poliacrilamida de MvRL foi realizada em condições nativas (PAGE) e desnaturadas (SDS-PAGE). O efeito de MvRL sobre Artemia salina, bactérias e fungos foi também avaliado. O DNA das raças 1, 2 e 3 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici foi isolado utilizando marcadores moleculares ISSR e RAPD. MvRL aglutinou eritrócitos humanos e sua AH foi inibida por manose, soro fetal bovino e preparações de F. oxysporum f.sp. lycopersici. A AH de MvRL foi termoestável, ativa em pH 5,0 e dependente de íons. PAGE revelou MvRL como uma proteína ácida e SDS-PAGE revelou banda polipeptídica glicosilada de massa molecular 17 kDa. Cromatografia de gel filtração definiu a massa molecular nativa de MvRL como 100 kDa indicando a lectina como um agregado molecular. MvRL foi tóxica sobre A. salina (CL50 de 154,16 μg/mL), não exibiu atividade antibacteriana e apresentou atividade antifúngica. MvRL foi mais ativa em inibir o crescimento da raça 3 de F. oxysporum f.sp. lycopersici. Os marcadores moleculares foram adequados para avaliar a variabilidade genética das raças. Em conclusão MvRL é uma lectina com atividade antifúngica e o efeito sobre F. oxysporum f.sp. lycopersici foi diferente para as três raças