Candida spp. is the most common etiologic agent of opportunistic fungal infections and Candida albicans species still remains the most frequently isolated species in candidiasis. However, the rate of Candida non-albicans isolates has increased in hospitals, where the use of azole antifungals for prophylaxis or therapy is frequent. The prolonged and indiscriminate use of antifungals has favored the development of resistant yeasts. In this context, other species have emerged as clinically important pathogens. Candida dubliniensis species is one that has become important because the easy way that acquires resistance to fluconazole, and may become a relatively more resistant pathogen and therefore more difficult to treat. This framework requires that measures of surveillance the susceptibility or investigations about the magnitude of the resistance are taken. This study aimed to evaluate and interpret the results of in vitro susceptibility of Candida dubliniensis sensitive and resistant to fluconazol and Candida albicans to echinocandins, voriconazole, itraconazole and posaconazole in the light of official documents and also by using proposed points of epidemiological cuts. Where evalued thre groups of isolates: a group of isolates of C. albicans against fluconazole sensitive (Group I), the other two isolates of C. dubliniensis, a compound of isolates sensitive to fluconazole (Group II) and other derived from the first fluconazole resistant (Group III). Groups I and II tests with fluconazole were shown to be susceptible to this antifungal and group III after exposure to increasing concentrations of fluconazole was classified as resistant based on document M27-S3 (2008) and in epidemiological cutoffs. The group I was considered 100% sensitive to antifungal agents based on documents M27-S4 (2012) and M27-S3 (2008). Group II was regarded as 100% sensitive to echinocandins, voriconazole, itraconazole, based on M27-S3 and 100% sensitive to posaconazole based on epidemiological cutoff. However, when interpreting the epidemiological cutoffs MICs, was observed 9.09% for non-sensitive isolates to micafungin. Finally, the group III was 100% sensitive to echinocandins, voriconazole, 100% itraconazole resistant to based on the M27-S3. Based on the epidemiological cutoffs, 4.54% were resistant to anidulafungin, 31.8% resistant to micafungin, 22.7% resistant or susceptible to voriconazole and 100% posaconazole sensitive. Evaluation of antifungal susceptibility is a complex issue and, at the time re-definitions of MICs defining susceptibility or resistance are under intense review, note difficulties in the interpretation of such tests. / Candida spp. é o agente etiológico mais frequentemente causador de infecções fúngicas oportunistas e a espécie Candida albicans ainda permanece como a espécie mais frequentemente isolada nas candidíases. No entanto, a taxa de isolamentos de espécies de Candida não-albicans tem aumentado nas unidades hospitalares, onde o uso de antifúngicos azólicos de forma profilática ou terapêutica é frequente. O uso prolongado e indiscriminado dos antifúngicos tem favorecido o desenvolvimento de leveduras resistentes. Neste contexto, outras espécies emergiram como patógenos de importância clínica. Candida dubliniensis é uma das espécies que tornou-se relevante, por causa da facilidade com que adquire resistência ao fluconazol, podendo tornar-se um agente patogênico relativamente mais resistente e, consequentemente, mais difícil de tratar. Este quadro impõe que medidas de vigilância da suscetibilidade ou de investigações sobre a magnitude da resistência sejam tomadas. Este estudo objetivou avaliar e interpretar os resultados da suscetibilidade in vitro de Candida dubliniensis sensível e resistente ao fluconazol e Candida albicans às equinocandinas, voriconazol, itraconazol e posaconazol à luz dos documentos oficiais e também pelas propostas utilizando pontos de corte epidemiológicos. Foram avaliados três grupos de isolados: um grupo de isolados de C. albicans sensíveis ao fluconazol (Grupo I), os outros dois de isolados de C. dubliniensis, um composto por isolados sensíveis ao fluconazol (Grupo II) e outro derivado do primeiro resistente ao fluconazol (Grupo III). Os grupos I e II nos testes com o fluconazol foram evidenciados como sensíveis a este antifúngico e o grupo III após exposições a concentrações crescentes de fluconazol foi classificado como resistente, com base no documento M27-S3 (2008) e nos cutoffs epidemiológicos. O grupo I foi considerado 100% sensível aos antifúngicos com base nos documentos M27-S4 (2012) e M27-S3 (2008). O grupo II foi considerado 100% sensível às equinocandinas, voriconazol, itraconazol, com base no M27-S3 e 100% sensível ao posaconazol com base no cutoff epidemiológico. No entanto, ao interpretar as CIMs pelos cutoffs epidemiológicos, foi evidenciada 9,09% de isolados não sensíveis a micafungina. E, por fim, o grupo III que foi 100% sensível às equinocandinas, voriconazol, 100% resistente ao itraconazol com base no M27-S3. Com base nos cutoffs epidemiológicos, 4,54% foram considerados resistentes a anidulafungina, 31,8% resistente a micafungina, 22,7% resistente ou não sensíveis ao voriconazol e 100% sensível ao posaconazol. A avaliação da suscetibilidade aos antifúngicos é um tema complexo e, no momento em que redefinições das CIMs definidoras de sensibilidade ou resistência estão sofrendo intensas revisões, nota-se dificuldades nas interpretações de tais testes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pythiosis is a granulomatous disease of human and animals that occurs primarily in tropical and subtropical areas of the world. It is caused by an aquatic, fungus-like organism called Pythium insidiosum. The treatment for pythiosis is uncertain, with an unfavorable prognosis for human and animals. Therefore, new possibilities for treatments must be examined. We have evaluated the in vitro activities of terbinafine (0.25 to 32 mg/L) alone and in combination with caspofungin (0.5 to 128 mg/L), miconazole (0.25 to 32 mg/L), fluconazole(0.125 to 64 mg/L), ketoconazole (0.125 to 64 mg/L), amphotericin B (0.25 to 16 mg/L), fluvastatin (0.125 to 64 mg/L), rifampicin (0.25 to 64 mg/L), metronidazole (0.25 to 128 mg/L) and ibuprofen (8 to 2,048) against 17 clinical isolates of P. insidiosum. Antifungal activities were assayed by broth microdilution, based on protocol M38-A for filamentous fungi, adapted to P. insidiosum, as well as the checkerboard method. Synergisms were observed in combinations of terbinafine plus caspofungin (41.18%), fluconazole (41.18%), amphotericin B (41.18%), ketoconazole (29.41%) and miconazole (11.76%). The combinations of terbinafine plus rifampicin and terbinafine plus metronidazole were indifferent for 94.12% of strains. Terbinafine plus ibuprofen was indifferent for 82.35% of strains. Antagonisms were observed in combinations of terbinafine with fluvastatin (35.30%) or rifampicin (5.88%). The combinations of terbinafine plus caspofungin, terbinafine plus fluconazole and terbinafine plus amphotericin B may have significant therapeutic potential for treatment of pythiosis. / Pitiose é uma doença granulomatosa de humanos e animais que ocorre principamente em áreas tropicais e subtropicais de todo o mundo. Ela é causada por um microrganismo aquático semelhante aos fungos chamado Pythium insidiosum. O tratamento para pitiose é incerto, com um prognóstico desfavorável tanto para humanos como para os animais. Com isso, novas possibilidades para tratamentos devem ser examinados. Desta forma, avaliou-se a atividade in vitro da terbinafina (0,25 a 32 mg/L) sozinha e em combinação com caspofungina (0,5 a 128 mg/L), miconazol (0,25 a 32 mg/L), fluconazol (0,125 a 64 mg/L), cetoconazol (0,125 a 64 mg/L), anfotericina B (0,25 a 16 mg/L), fluvastatina (0,125 a 64 mg/L), rifampicina (0,25 a 64 mg/L), metronidazol (0,25 a 128 mg/L) e ibuprofeno (8 a 2.048) frente a 17 isolados clínicos de P. insidiosum. As atividades antifúngicas foram avaliadas por microdiluição em caldo, baseado no protocolo M38-A para fungos filamentosos, adaptado para P. insidiosum, e pela técnica de checkerboard. Sinergismos foram observados nas combinações de terbinafina mais caspofungina (41,18%), fluconazol (41,18%), anfotericina B (41,18%), cetoconazol (29,41%) e miconazol (11,76%). As combinações de terbinafina mais rifampicina e terbinafina mais metronidazol foram indiferentes para 94,12% das cepas. Terbinafina mais ibuprofeno foi indiferente para 82,35% dos isolados. Antagonismos foram observados nas combinações de terbinafina mais fluvastatina (35,30%) ou rifampicina (5,88%). As combinações de terbinafina mais caspofungina, terbinafina mais fluconazol e terbinafina mais anfotericina B podem ter significante potencial terapêutico para o tratamento da pitiose.

O estudo teve como objetivos avaliar a ação antifúngica in vitro e in vivo do óleo essencial do Origanum vulgare (orégano), determinar a composição química dos óleos estudados e verificar a toxicidade em ratos Wistar. Inicialmente, oito amostras de O. vulgare foram extraídas por hidrodestilação e os óleos essenciais analisados por cromatografia gasosa, sendo posteriormente testados in vitro para escolha do óleo para os ensaios in vivo. Os testes in vitro seguiram as normas estabelecidas pelo CLSI-M27-A2, sendo utilizados sete isolados de Sporothrix schenckii e 16 isolados de Candida spp. A toxicidade do O. vulgare foi avaliada em 30 ratos wistar, fêmeas, tratadas via oral e vaginal com óleo a 3%, por 30 dias, através de parâmetros clínicos, hematológicos e histopatológicos. Para o teste in vivo, foram utilizados 48 ratos wistar, machos, distribuídos em quatro grupos: T1:óleo (1,5%); T2:óleo (3%); T3:fluconazol (10mg/Kg/dia); T4:controle negativo (emulsão); os óleos foram emulsionados com 0,001% de Tween 80. Para a reprodução experimental da candidíase sistêmica foi utilizado isolado canino e o inóculo (106céls/mL deC. albicans) foi administrado pela veia lateral da cauda em todos os animais. Os fármacos e o diluente foram administrados diariamente por via oral, com auxílio de sonda oro-gástrica, durante 30 dias. Foi realizada avaliação clínica semanal e pesagem dos animais, e após a necropsia foi realizada análise macroscópica, pesagem dos órgãos e retroisolamento de C. albicans. O óleo essencial do O. vulgare utilizado nos testes in vitro apresentou como componentes majoritários o 4-terpineol, carvacrol, timol e α-terpineol. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) do O. vulgare para S. Schenckii foi de 0,25% (250μL/mL-1) para todos os isolados testados. Para Candida spp. os resultados foram expressos em CIM e CFM (Concentração Fungicida Mínima), obtendo-se CIM de 2,72μL mL-1 e CFM de 5μL mL-1 para C.albicans isolada de animais; CIM de 2,97μL mL-1 e CFM 3,54μL mL-1 para cepas padrões e CIM igual 2,10μL mL-1 e CFM igual 2,97μL -1mL para espécies não-albicans. A utilização do óleo essencial de O. vulgare a 3%, uma vez ao dia, 30 dias, por via oral e vaginal, não causou toxicidade nos ratos wistar. Na candidíase experimental sistêmica, os animais tratados com óleo a 3% e com fluconazol resultaram em menor freqüência de alterações clínicas. Não houve diferenças entre os grupos quanto a alterações macroscópicas nos órgãos, com exceção dos rins, onde o grupo T3 diferiu dos demais grupos (T1,T2,T4) sendo aquele com menor alterações. Quanto ao retroisolamento, foi obtido menor quantidade de Unidades Formadoras de Colônias no grupo T3 e maior no T4. Dessa forma é possível concluir que o óleo essencial do O. vulgare possui atividade in vitro frente ao S. schenckii e Candida spp. e que sua composição química interfere nos resultados. A utilização do óleo à 3%, via oral e vaginal por 30 dias não causou alterações toxicológicas relevantes em ratas Wistar. O uso do óleo a 3% demonstrou bons resultados no tratamento da candidíase experimental sistêmica, porém são necessários maiores estudos que possibilitem introduzir esta substância como opção terapêutica para candidíase. / The aims of this study were to evaluate the in vitro antifungal activity of the essential oil Origanum vulgare (oregano), to determine the chemical composition of the oils tested and to verify their toxicity to rats. Eight samples of Origanum were extracted by hydrodestilation, and the composition of the essential oils was determined by gaseous chromatography. In vitro antifungal sensitivity was performed with CLSI-M27-A2 protocol. Seven isolates of Sporothrix schenckii and 16 isolates of Candida species were tested. The animal model consisted of female wistar rats, which were treated orally and vaginally with 3% oil for 30 days. Animals were analyzed by clinical, hematological and hystopathologic parameters. For the in vivo test, 48 rats wistar were used, distributed in four groups: T1/n=12: oil 1,5%; T2/n=12:oil 3%; T3/n=12: Fluconazole 10mg/Kg; T4/n=12: Control (emulsion); the oils had been emulsified with 0,001% of Tween 80. The experimental disease was carried with one canine isolate, which was prepared with a suspension of C. albicans (106 céls/mL), and inoculated for the lateral vein of the tail. The drugs and diluent had been administered daily orally during 30 days. Weekly clinical evaluation and weighing of the animals were performed, and to at the end of experiment autopsies were done with macroscopic analysis, weighing of the tissues and retro isolation of C. albicans. The O. vulgare essential oil used in the tests in vitro showed 4-terpineol, carvacrol, timol and alfa-terpineol as majority component. The Minimum Inhibitory Concentration (CIM) of the O. vulgare for S. schenckii was 0,25% (250μL/mL), for all the isolates tested. For Candida spp. the results had been express in CIM and CFM (Concentration Fungicidal Minimum), showing CIM 2,72μL mL-1 and CFM 5μL mL-1 for C.albicans isolates from animals; CIM 2,97μL mL-1 and CFM 3,54μL mL-1 for standards strains and CIM 2,10 μL mL-1 and CFM 2,97μL -1mL for species non-albicans. The use of the 3% essential oil, daily for 30 days, orally and vaginally, did not cause toxicity in the rats. In systemic experimental candidiasis, animals treated with 3% oil and fluconazole showed lesser frequency of clinical alterations. Differences between the groups weren’t observed in the organs macroscopic alterations, with exception of the kidneys that presented more lesions in the group T3. The retro isolation was higher in the T4 group and in the group T3 was of minor. Thus, we conclude that the O. vulgare essential oil have activity in vitro against S. schenckii and Candida spp. and its chemical composition intervenes in the results. The use of the 3% oil for 30 days does not cause oral and vaginal significative alterations in wistar rats. The use of the 3% oil demonstrated good results in the treatment of systemic experimental candidiasis, however other studies are necessary to introduce this substance as a therapeutic option for candidiasis.

Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2016-03-15T13:04:05Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 38162809 bytes, checksum: 30693a1c23ea69db4e42ef93733e97d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-15T13:04:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 38162809 bytes, checksum: 30693a1c23ea69db4e42ef93733e97d4 (MD5) Previous issue date: 2015-02-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Candidiasis is an opportunistic infection caused by Candida yeasts. In Brazil, the species C. tropicalis is the second most commonly isolated after C. albicans. Conventional fungal infection treatments are unsatisfactory because of the appearance of resistance and security issues and toxicity of commercially available antifungal drugs. Therefore, it has become essential to develop new drugs and alternative therapies for the treatment of candidiasis. In this context, antifungal compounds of natural origin, such as terpenes, have received much attention in recente times to be promising therapeutic tool for treatment fungal infections. Thus, it was investigated the antifungal activity of citral and geraniol monoterpenes on strains of C. albicans and C. tropicalis. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Fungicidal Concentration (MFC) were determined by the broth microdilution techniques. Also, it was investigated a possible products action on fungal cell wall (0.8 M sorbitol assay), cell membranes (ergosterol complexation), the time-kill curve, (log CFU/mL) and biological activity on the yeast’s micromorphology. Among the monoterpenes, geraniol was the most potent, as showed the lowest MIC value (16 µg/mL). As for citral, the MIC and MFC was 64 µg/mL for 15 of the 16 tested strains. In accordance with the MIC results, two strains of C. albicans (ATCC 76485 and ML-70) and C. tropicalis (ATCC 13803 and ML-118) were selected for further testing. The result of the possible mechanism of action showed no involvement with cell wall (identical CIM medium with and without addition of sorbitol) or binding to ergosterol (identical CIM medium with and without addition of ergosterol). In the morphological interference assay, it was observed that both citral and geraniol inhibited pseudohyphae and chlamydoconidia formation. It was also found that the monoterpenes have concentration-dependent antifungal activity. It follows, therefore, the citral and geraniol monoterpenes showed potential antifungal activity in vitro against the tested strains, denoting are promising antifungal agents with potential applicability in the treatment of infections caused by Candida yeasts, such as those that occur in the hospital. The probable mechanism of action does not involve the cell wall or binding ergosterol. / A candidíase é uma infecção oportunista causada por leveduras do gênero Candida. No Brasil, a espécie Candida tropicalis é a segunda mais comumente isolada após Candida albicans. O tratamento convencional das infecções fúngicas não é satisfatório em virtude do surgimento de resistência e dos problemas relacionados à segurança e toxicidade dos fármacos antifúngicos comercialmente disponíveis. Assim sendo, torna-se imprescindível o desenvolvimento de novos medicamentos e terapias alternativas para o tratamento de candidíase. Neste contexto, compostos antifúngicos de origem natural, tais como os terpenos, têm recebido grande atenção nos últimos tempos por serem promissoras ferramentas terapêuticas no tratamento de infecções fúngicas. Por isso, investigou-se a atividade antifúngica dos monoterpenos citral e geraniol sobre cepas de C. albicans e C. tropicalis. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida Mínima (CFM) foram determinadas pela técnica de microdiluição em caldo. Também, foi investigada uma possível ação dos monoterpenos sobre a parede celular fúngica (ensaio com sorbitol 0,8 M), membrana celular (complexação com ergosterol), curva de morte microbiana e atividade biológica sobre a micromorfologia da levedura. Entre os monoterpenos, o geraniol foi o mais potente, pois apresentou menor valor de CIM (16 µg/mL). Já para o citral, a CIM e CFM foi de 64 µg/mL para 15 das 16 cepas testadas. De acordo com os resultados da CIM, duas cepas de C. albicans (ATCC 76485 e LM-70) e C. tropicalis (ATCC 13803 e LM-118) foram escolhidas para os outros testes. O resultado do possível mecanismo de ação, mostrou que não houve envolvimento com a parede celular (CIM idêntica no meio com e sem adição de sorbitol) ou ligação ao ergosterol (CIM idêntica no meio com e sem adição de ergosterol). No ensaio da interferência dos monoterpenos sobre a morfologia da levedura, observou-se que tanto o citral quanto o geraniol inibiram a formação de clamidoconídios e pseudo-hifas. Foi verificado também que os monoterpenos têm atividade antifúngica dependente da concentração. Conclui-se, assim, que os monoterpenos citral e geraniol apresentaram potencial atividade antifúngica in vitro contra as cepas testadas, denotando serem promissores agentes antifúngicos com potencial aplicabilidade no tratamento de infecções causadas por leveduras do gênero Candida, como aquelas que acontecem no ambiente hospitalar.

Submitted by Márcio Maia (marciokjmaia@gmail.com) on 2016-09-08T19:00:34Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1813229 bytes, checksum: 9baf431a2df59a0cbf6ce91d58a3ce3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T19:00:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1813229 bytes, checksum: 9baf431a2df59a0cbf6ce91d58a3ce3c (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / Dematiaceous, demaceous or dark fungi comprise a large, heterogeneous group of fungi that cause a variety of diseases, including feohifomycoses, cromoblastomycoses, mycetoma and allergies. Species of the genus Cladosporium are relevant in developing cromoblatomycoses, and stand out as plant contaminants. The toxicity of conventional antifungal and increased resistance to therapeutic regimens, driving the study of the antifungal activity of new alternatives, including natural sources. Given this context, the aim of this study was to evaluate the In vitro antifungal activity of seven essential oils (Laurus nobilis L., Mentha arvensis, Mentha X piperita L., Mentha spicata, Ocimum basilicum L., Cymbopogon nardus L. Rendle e Origanum vulgare) and the phytoconstituent citronellal on strains of dematiaceous fungi. In this study, the following methods were used: microbiological screening, determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (MFC), kinetics of microbial death, inhibition of conidial germination and evaluation of morphological changes. Among the essential oils tested, the C. nardus essential oil demonstrated potent antifungal activity, inhibiting the growth of 83,3% of strains used. The Cymbopogon Nardus L. Rendle (citronella grass) belongs to the family Poaceae, subfamily Panicoideae. The Cymbopogon genus consists of eighty-five species. C. nardus presents constitution of essential oil with two major compounds: the citronellal and geraniol. Citronellal is a monoterpene, predominantly formed by the secondary metabolism of plants. The essential oil of C. nardus had its MIC and MFC established at 64 mg / mL and the citronellal in 32 mg / mL. Both the essential oil of C. nardus as citronellal significantly inhibited the radial mycelial growth of the tested strains, the MIC concentrations, MICx2 and MICx4 after 12 days of exposure. In MIC50 concentrations (64 ug / ml- essential oil and 32μg / ml -citronellal) and MIC90 (128 ug / ml - 512μg essential oil and / ml - citronellal), were able to significantly inhibit the germination of fungal conidia from both strains tested. The determination of the effect of the essential oil of C. nardus and citronellal on the morphogenesis of C. carrionii strains showed that both were capable of inducing morphological changes, as development tortuous hyphae, fine and decreased conidiation in MIC concentrations, MICx2 and MICx4. Thus, it is concluded that the essential oil of C. nardus and its phytoconstituent citronellal showed pronounced antifungal activity against the strains of C. carrionii tested, what drives the study of its In vivo antifungal activity, as well as the search for pharmaceutical formulations to be used for the therapy of certain mycoses, especially those caused by dematiaceous fungi. / Fungos dematiáceos, demáceos ou escuros compõem um grupo grande e heterogêneo de fungos que causam uma variedade de doenças, incluindo feohifomicoses, cromoblastomicoses, micetomas e alergias. Espécies do gênero Cladosporium são relevantes no desenvolvimento de cromoblatomicoses, e se destacam como contaminantes de plantas. A toxicidade dos antifúngicos convencionais e o aumento da resistência aos esquemas terapêuticos utilizados impulsionam o estudo da atividade antifúngica de novas alternativas, incluindo as de fonte natural. Diante desse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antifúngica In vitro de sete óleos essenciais (Laurus nobilis L., Mentha arvensis, Mentha X piperita L., Mentha spicata, Ocimum basilicum L., Cymbopogon nardus L. Rendle e Origanum vulgare) e do fitoconstituinte citronelal sobre cepas de fungos dematiáceos. Neste estudo, os seguintes métodos foram utilizados: triagem microbiológica, determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM), cinética de morte microbiana, inibição da germinação de conídios e avaliação de alterações morfológicas. Dentre os óleos essenciais testados, o de C. nardus demonstrou uma potente atividade antifúngica, inibindo o crescimento de 83,3% das cepas de fungos demáceos utilizadas. O Cymbopogon nardus L. Rendle (capim-citronela) pertence à família Poaceae, subfamília Panicoideae. O gênero Cymbopogon é constituído de oitenta e cinco espécies. O C. nardus apresenta constituição do óleo essencial com dois compostos majoritários: o citronelal e o geraniol. Citronelal é um monoterpeno, predominantemente formado pelo metabolismo secundário de plantas. O óleo essencial de C. nardus teve sua CIM e CFM estabelecidas em 64 μg/ mL e o citronelal em 32 μg/ mL. Tanto o óleo essencial de C. nardus quanto o citronelal inibiram de forma significativa o crescimento micelial radial das cepas testadas, nas concentrações CIM, CIMx2 e CIMx4, após 12 dias de exposição. Nas concentrações CIM50 (64 μg/ mL- óleo essencial e 32μg/mL -citronelal) e CIM90 (128 μg/mL - óleo essencial e 512μg/mL - citronelal), foram capazes de inibir de forma significativa a germinação dos conídios fúngicos de ambas as cepas testadas. A determinação do efeito do óleo essencial de C. nardus e do citronelal sobre a morfogênese das cepas de C. carrionii demonstrou que ambos foram capazes de induzir alterações morfológicas, como desenvolvimento de hifas tortuosas, finas e diminuição da conidiação, nas concentrações CIM, CIMx2 e CIMx4. Dessa forma, conclui-se que o óleo essencial de C. nardus e o seu fitoconstituinte citronelal mostraram pronunciada atividade antifúngica sobre as cepas de C. carrionii testadas, o que impulsiona o estudo de suas atividades antifúngicas In vivo, bem como a busca por formulações farmacêuticas a serem utilizadas para a terapia de algumas micoses, especialmente aquelas causadas por fungos demáceos.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-11T13:49:03Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4539317 bytes, checksum: 8b0c70f7cf6924075fe039736b510527 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-11T13:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4539317 bytes, checksum: 8b0c70f7cf6924075fe039736b510527 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / Cryptococcosis is an infection caused by fungus of the genus Cryptococcus. This fungus is cosmopolitan and there are two main species, Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gatii. The infection manifests primarily non-lung tissue and central nervous system, being highly lethal when not treated properly. Individuals with HIV or the compromised immune system are more susceptible to the development of cryptococcosis. Therapeutic agents available for the treatment of cryptococcosis are limited and toxic, besides the high incidence of physical resistance to these agents. Therefore, a search for other therapeutic alternatives for the treatment of cryptococcosis is essential. In this scenario, natural products, such as essential oils and their phytochemicals, are very promising for the development of new antifungal drugs. The objective of this study was to evaluate the antifungal activity of O. vulgare L. (oregano) and its major phytochemical, carvacrol, on Cryptococcus neoformans strains. The composition of the essential oil was analyzed by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC-MS). Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (CFM) were determined by broth microdilution technique. The sensitivity profile of the strains was determined by disc diffusion method, as well as the study of association of the products with antifungals. The kinetics of microbial death were also evaluated. The results of CG-MS have indicated a higher concentration of carvacrol (67.97%), p-cymene (11.67%), γ-terpinene (7.92%), thymol (7.84%) and linalool 3.44%). The MIC50, as well as MIC90, of the essential oil were 64 μg/mL. Carvacrol presented MICs of 32 μg/mL and MICs of 64 μg/mL. The CFM50 and CFM90 from the essential oil were 64 μg/mL and 256 μg/mL respectively. Carvacrol has shown CFM50 equal to 32 μg/mL and CFM90 equal to 64 μg/mL. The strains profile has shown 100% of sensitivity to amphotericin B (100 μg), 30% sensitivity to fluconazole (25 μg) and any strain has shown sensitivity to 5-fluorocytosine (10 μg). The association of essential oil and carvacrol with amphotericin B and fluconazole has not shown synergism of action. The microbial death curve has shown that the products have concentration-dependent fungicidal effect. The results of the study demonstrate that the essential oil of oregano and carvacrol have an antifungal activity, showing them as promising agents to the development of drugs capable to treat cryptococcosis. / Criptococose é uma infecção causada por fungos do gênero Cryptococcus. Esse fungo é cosmopolita e tem duas espécies principais patogênicas ao homem: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gatii. A infecção se manifesta principalmente no tecido pulmonar e sistema nervoso central, sendo altamente letal quando não tratada adequadamente. Indivíduos portadores do HIV ou com sistema imunológico comprometido são os mais susceptíveis ao desenvolvimento da criptococose. Os agentes terapêuticos disponíveis atualmente para o tratamento da criptococose são limitados e possuem significativa toxicidade, além da alta incidência de resistência fúngica a esses agentes. Assim sendo, é imprescindível a busca por alternativas terapêuticas para o tratamento da criptococose. Nesse panorama, os produtos naturais, como óleos essenciais e seus fitoconstituintes, se mostram muito promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos antifúngicos. Diante disto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial de O. vulgare L. (orégano) e seu fitoconstituinte majoritário, o carvacrol, sobre cepas de Cryptococcus neoformans. A composição do óleo essencial foi analisada por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM). A Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) foram determinadas pela técnica de microdiluição em caldo. O perfil de sensibilidade das cepas frente a antifúngicos licenciados, foi determinado pelo método de disco-difusão, bem como o estudo de associação dos produtos com antifúngicos. A cinética de morte microbiana também foi avaliada. Os resultados da CG-MS indicaram a presença de cinco fitoconstituintes presentes em maior quantidade: carvacrol (67,97%), p-cimeno (11,67%), ý-terpineno (7,92%), timol (7,84%) e linalol (3,44%). A CIM50, assim como a CIM90, do óleo essencial foi de 64 μg/mL. Já o carvacrol apresentou CIM50 de 32 μg/mL e CIM90 de 64 μg/mL. A CFM50 e CFM90 do óleo essencial foram 64 μg/mL e 256 μg/mL respectivamente. O carvacrol teve CFM50 de 32 μg/mL e CFM90 de 64 μg/mL. O perfil de sensibilidade das cepas mostrou que 100% das cepas foram sensíveis a anfotericina B (100 μg), 30% foram sensíveis ao fluconazol (25 μg) e nenhuma cepa apresentou sensibilidade a 5-fluorocitosina (10 μg). A associação do óleo essencial e do carvacrol com anfotericina B e fluconazol não apresentou sinergismo de ação. A curva de morte microbiana demonstrou que os produtos apresentaram efeito fungicida dependente de concentração. Os resultados desse estudo demonstram que o óleo essencial de orégano e o carvacrol possuem atividade antifúngica, se mostrando como agentes promissores para o desenvolvimento de medicamentos para o tratamento da criptococose

Os compostos lipofílicos da própolis vermelha brasileira (PVB) têm recebido atenção especial devido a interessantes relatos referentes às suas atividades biológicas. Neste contexto, este estudo teve três etapas: a primeira objetivou investigar a atividade do extrato bruto etanólico da PVB e respectivas frações (obtidas com solventes de polaridade crescente, por meio de maceração em temperatura ambiente) contra cepas de Candida não-albicans (CNA) - C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis. A concentração inibidora mínima (CIM) foi determinada pelo método de microdiluição em caldo, com concentrações variando entre 1,9 a 500 μg/mL. Dentre as frações testadas, a fração hexânica (HEX) apresentou maior potencial antifúngico, alcançando valor de CIM de 1,95 μg/mL contra espécies de C. parapsilosis. Para cepas de C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis, os valores de CIM obtidos foram variáveis (1,95-250 μg/mL). Ensaio colorimétrico de MTT foi utilizado para confirmar o dano celular e os resultados variaram de 80,66 a 94,44%, com extensa morte celular causada pela HEX, incluindo efeitos contra cepas resistentes de CNA, principalmente C. glabrata e C. parapsilosis. Esta potencial capacidade antifúngica está relacionada com compostos lipofílicos, provavalmente benzofenonas polipreniladas (BPPs), anteriormente descritas para PVB. A segunda etapa teve como objetivo avaliar a composição química do extrato hexânico da PVB (HEXred) por CLUE-DAD-EM. A investigação química resultou, principalmente, na identificação de BPPs (oblongifolina A, gutiferona E e/ou xantochimol). Após, um método de CLAE-UV isocrático foi validado para a determinação do teor total de BPPs (a 260 nm) expresso como garcinol, um diasterorisômero da gutiferona E disponível comercialmente. O método mostrou ser específico, exato, preciso e linear (0,1 a 10 μg/mL) para a determinação de BPPS na HEXred e na nanoemulsão (NE) contendo HEXred, bem como em amostras de pele e mucosa suínas, após estudos de permeação/retenção. O efeito matriz foi determinado para todas as matrizes complexas, demonstrando baixo efeito durante a análise. A estabilidade do método foi verificada por meio da exposição da HEXred às condições de estresse ácida, alcalina, oxidativa e térmica. Não houve interferência dos produtos de degradação durante a análise, indicando que o método analítico/bioanalítico proposto provou ser simples e confiável para a determinação de BPPs na presença de diferentes matrizes. Como terceiro passo nós buscamos otimizar a incorporação de BPPs em NE destinada ao tratamento de infecções fúngicas mucocutâneas. A otimização da NE foi realizada por meio de experimento de Box-Behnken, que permitiu avaliar simultaneamente a influência das concentrações do fosfolipídeo da lecitina de gema de ovo, do lípido catiónico DOTAP e das BPPs nas propriedades físico-químicas da NE, bem como na eficiência de associação (EA) das BPPs. Utilizando o software Mini-Tab®, a formulação ótima foi selecionada com base no menor tamanho de gotícula e maiores potencial zeta e eficiência de associação, exibindo um tamanho médio de 140,56 ± 5,22 nm, potencial zeta de + 60,72 ± 3,07 e 99,55 ± 1,09% de EA. Células de difusão do tipo Franz foram usadas para avaliar a distribuição das BPPs através da pele e mucosa suínas, sendo encontradas BPPs nas camadas de ambos os tecidos (principalmente na derme). Uma maior quantidade de BPPs (até 3 vezes) foi detectada na pele e mucosa lesadas o que demonstra o efeito da integridade do tecido na distribuição das BPPs, como sugerido por imagens de microscopia confocal de fluorescência. As BPPs foram detectadas no fluido receptor apenas quando a mucosa esofágica foi lesada. A atividade antifúngica das formulações foi investigada contra espécies de CNA - C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis. Os valores de CIM variaram de 0,654 a 2,617 μg/mL, com dano celular superior a 78% como verificado por ensaio de MTT. Tais resultados sugerem que a NE otimizada possui potencial promissor para ser utilizada topicamente para o tratamento de infecções fúngicas mucocutâneas causadas por espécies de CNA. / Lipophilic compounds of Brazilian red propolis (BRP) have received increasing attention due to some interesting findings regarding their biological activities. This study had three steps: first we aimed to investigate the activity of BRP crude ethanolic extract and their fractions (obtained with increasing polarity solvents, through maceration at room temperature) against non-albicans Candida (NAC) strains. Minimal inhibitory concentration (MIC) was determined by the broth microdilution method, with concentrations ranging from 1.9 to 500 μg/mL. Among the tested fractions, n-hexane fraction (HEX) showed higher antifungal potential, achieving MIC values of 1.95 μg/mL against C. parapsilosis strains. On C. glabrata, C. krusei and C. tropicalis strains, variable MIC values were obtained (1.95 to 250 μg/mL). MTT colorimetric assay was employed to confirm the cell damage and the results ranged from 80.66 to 94.44%, with extensive cell death caused by HEX, including the effects against NAC resistant strains, mainly C. glabrata and C. parapsilosis. This potential antifungal capacity showed by HEX is related to the lipophilic compounds, probably polyprenylated benzophenones (PPBs), previous described for BRP. In the second step we aimed to evaluate the chemical composition of BRP n-hexane extract (HEXred) by UPLC-PDA-MS. Chemical investigation mainly resulted in the identification of PPBs in this extract, named oblongifolin A, guttiferone E, and/or xanthochymol. After that, an isocratic HPLC-UV method was validated for the determination of total content of PPBs (at 260 nm) expressed as garcinol, a commercially available guttiferone E diastereoisomer. The method showed to be specific, precise, accurate, and linear (0.1 to 10 μg/mL) for the determination of PPBs in HEXred, BRP-loaded nanoemulsions (NE), as well as, in porcine skin and mucosa samples after permeation/retention studies. The matrix effect was determined for all complex matrices, demonstrating low effect during the analysis. The stability-indicating method was verified by submitting HEXred to acidic, alkaline, oxidative, and thermal stress conditions. No interference of degradation products was detected during analysis, indicating that the proposed analytical/bioanalytical method proved to be simple and reliable for the determination of PPBs in the presence of different matrices. As third step we aimed to optimize the incorporation of PPBs into NE intended for the treatment of mucocutaneous fungal infections. The optimization of NE was performed by means of a Box-Behnken Design, which allowed evaluating simultaneously the influence of the phospholipid egg-lecithin, the cationic lipid DOTAP and PPBs concentrations on the physicochemical properties of NE, as well as on the association efficiency (AE) of PPBs. By using the Mini Tab® software, the optimal formulation was selected based on the smallest droplet size and highest zeta potential and AE, exhibited a mean average size of 140.56±5.22 nm, zeta potential of +60.72±3.07 and AE of 99.55±1.09%. Franz-type diffusion cells were used to evaluate PPBs distribution through porcine skin and mucosa being PPBs found in both mucosa and skin layers (mainly in the dermis). A higher amount of PPBs (up to 3-fold) was detected in impaired skin and mucosa demonstrating the effect of the integrity of the tissue on PPBs distribution, as suggested by confocal fluorescence microscopy images. PPBs were detected in the receptor fluid only when esophageal mucosa was impaired. The antifungal activity of the formulations was investigated against NAC species – C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis and C. parapsilosis. MIC values varied from 0.654 to 2.617 μg/mL, with cell damage higher than 78 % as verified by MTT assay. Such results suggest that the optimized NE have promising potential to be used topically for the treatment of mucocutaneous fungal infections caused by NAC strains.

Cumarinas são estruturas promissoras e diversas atividades biológicas têm sido atribuídas a esses metabólitos secundários vegetais. Estudos sugerem que o mecanismo antifúngico desses compostos esteja correlacionado com a atividade antioxidante. A reação da tirosinase, que produz radicais livres, está envolvida no processo de melanização do fungo Sporothrix schenckii, o causador de micose subcutânea de maior incidência no sul do Brasil. A inibição dessa enzima foi recentemente reportada para extrato de Pterocaulon (Asteraceae), planta rica em cumarinas e usada na medicina tradicional do Brasil para tratamento tópico de micoses e na medicina popular da Argentina como anticâncer. O objetivo desse trabalho foi investigar in vitro a atividade antifúngica, correlacionando-a com atividade antioxidante, de extratos de espécies de Pterocaulon e de 6,7-metilenodioxicumarinas isoladas e também de 4-metilcumarinas obtidas por síntese, bem como a investigação da atividade citotóxica de algumas destas moléculas. As 6,7-metilenodioxicumarinas foram isoladas de P. balansae e P. lorentzii, enquanto que as 4-metilcumarinas foram sintetizadas via Pechmann por micro-ondas. A atividade antifúngica contra Sporotrix schenckii foi realizada conforme manual do Clinical and Laboratory Standards Institute. O estudo das propriedades eletroquímicas foi obtido por voltametria cíclica e a capacidade antioxidante pelo método espectofotométrico DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) e pelo método fluorimétrico ACAP contra radicais peroxil. A análise dessa atividade mostrou que os extratos metanólicos de espécies de Pterocaulon (P. polystachyum, P. balansae, P. lorentzii, P. lanatum e P. cordobense) foram ativos frente às cepas do fungo S. schenckii, sendo o extrato de P. polystachyum o mais ativo, apresentando Concentração Inibitória Mínima (CIM) compreendida entre 156 e 312 μg/mL. O fracionamento dos extratos lipofílicos de P. balansae e P. lorentzii levou ao isolamento de três metilenodioxicumarinas. Dados cristalográficos da 5-metóxi-6,7-metilenodioxicumarina, inéditos, foram depositados no Cambridge Crystallographic Data Centre 779123. As cumarinas sintéticas foram obtidas em rendimentos satisfatórios (98-30%) e em reduzido tempo de reação (5-20 min). O screening destas cumarinas frente às cepas do fungo S. schenckii revelou que 5-carboxi-6,7-diidroxi-4-metilcumarina, com CIM de 66 μM e Concentração Fungicida Mínima de 246 μM, foi o composto mais ativo. Essa cumarina apresentou sinergismo com a Anfotericina B, sendo sua CIM reduzida para 15 μM. A atividade antifúngica desses compostos pode estar correlacionada com a atividade antioxidante. O composto 5-carboxi-6,7-diidroxi-4-metilcumarina foi o mais ativo mostrando elevada capacidade antioxidante frente aos radicais DPPH com valores de IC50 de 17,49 μM e elevada atividade frente ao radical peroxil. Além disso, apresentou um potencial de oxidação de 0,4 V sugerindo atividade antioxidante. Baseado nos ensaios antioxidante e antifúngico foi possível observar que a presença de grupamentos hidroxilas no C-7 e C-8 do anel cumarínico, assim como a adição de grupamento polar no C-5 favoreceu ambas as atividades antifúngica e antioxidante. Na segunda etapa desse trabalho foi avaliada a citotoxicidade das cumarinas isoladas e algumas cumarinas simples, disponíveis comercialmente, pelo método Metil Tiazol Tetrazólio (MTT) usando linhagens de glioma humano (U138-MG) e de ratos (C6). Foi observado que as 6,7-metilenodioxicumarinas causaram uma significativa redução na viabilidade celular, sugerindo uma influência positiva do grupamento metilenodioxi sobre essa atividade. O composto 5-metóxi-6,7-metilenodioxicumarina foi o mais promissor (IC50= 34,6 μM e IC50= 31,6 μM para C6 e U-138 MG, respectivamente). Como desfecho desse trabalho, pode-se concluir que as cumarinas apresentaram uma atividade inibitória frente ao crescimento celular de linhagens de glioma e um efeito fungicida sobre S. schenckii, resultados estes que corroboram com o uso popular dessas plantas. / Coumarins are promising structures and diverse biological activities have been attributed to these secondary plant metabolites. Studies suggest that the mechanism of antifungal compounds is correlated with antioxidant activity. The reaction of tyrosinase, which produces free radicals, is involved in the process of melanization of the fungus Sporothrix schenckii, the agent of subcutaneous mycosis with the highest incidence in southern Brazil. The inhibition of this enzyme has recently been reported to extract Pterocaulon (Asteraceae) This plant is rich in coumarins and used in traditional medicine in Brazil for topical treatment of fungal infections and in folk medicine of Argentina as anticancer. The aim of this study was to investigate the in vitro antifungal activity and correlation with its antioxidant properties and cytotoxic activities of extracts of some species of Pterocaulon, as well as the isolated coumarins, and 4-methylcoumarin analogs obtained by synthesis. The 6.7-methylenedioxycoumarins were isolated from P. balansae and P. lorentzii, while the 4-methylcoumarins were synthesized via Pechmann reaction using microwave. The antifungal activity against Sporothrix schenckii was performed as indicated in the Manual of Clinical and Laboratory Standards Institute. A study of the electrochemical properties of coumarins was performed by cyclic voltammetry, by the method of 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) and against peroxyl radicals (ACAP) by fluorometric method. The analysis showed that the antifungal activity of the methanol extracts of Pterocaulon species (P. polystachyum, P. balansae, P. lorentzii, P. lanatum and P. cordobense) were active against the strains of the fungus S. schenckii, being the extract of P. polystachyum the most active, presenting Minimum Inhibitory Concentration (MIC) compressed between 156 and 312 μg/mL. The fractionation of lipophilic extracts of P. balansae and P. lorentzii led to the isolation of three methylenedioxycoumarins. The crystallographic data of 5-methoxy-6,7-methylenedioxycoumarin were deposited at the Cambridge Crystallographic Data Center 779123. The synthetic coumarins were obtained in satisfactory yields (98-30%) and reduced reaction time (5-20 min). The screening of these coumarins against strains of the fungus S. schenckii revealed that the 5-carboxy-6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin was the most active compound, presenting MIC of 66 μM and Minimum Fungicidal Concentration of 246 μM. This coumarin showed synergism with Amphotericin B, and its MIC was reduced to 15 μM. The antifungal activity of phenolic compounds could be related to its antioxidant activities. The compound 5-carboxy-6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin was again the most active with IC50 value of 17.49 μM, showing the highest capacity to deplete the radicals DPPH and ACAP, moreover present a oxidation potential of 0.4 V suggesting antioxidant activity. Based on the antioxidant and antifungal tests it was observed that the presence of hydroxyl groups at C-7 and C-8 of the coumarin ring and the addition of polar grouping at C-5 favored both antifungal and antioxidant activities.In the second part of this work, it was evaluated the cytotoxicity of the Pterocaulon compounds and some commercially available coumarins, with simple structure. The cytotoxic potential was determined by Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) test using strains of human glioma (U138-MG) and rat (C6). It was observed that the 6,7-methylenedioxycoumarins caused a significant reduction in cell viability, suggesting a positive influence of the methylenedioxy group in this activity. The compound 5-methoxy-6,7-methylenedioxycoumarin was the most promising (IC50 = 34.6 μM and IC50 = 31.6 μM for C6 and U-138 MG, respectively). In conclusion, this work it was demonstrated that some coumarins showed an inhibitory activity against the growth of glioma cell lines and a fungicidal effect on the S. schenckii. These results corroborate the popular use of these plants.

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To screen and identify the most promising strains, 18 filamentous fungi were selected and aliquots of a spore suspension were transferred to 250 ml Erlenmeyers containing 100 ml of a liquid culture medium (20 g of glucose, 0.5 g of yeast extract, 0.5 g of soy peptone, 0.5 g of NaCl, 0.5 g of K2 HPO4). The microorganisms were incubated at 200 rpm and 28 °C for 65 hours. After growth, 25 mg of morin were solubilized in ethanol and added to each Erlenmeyer. After 96 hours of incubation, extraction and subsequent purification were performed on a silica-filled chromatographic column and preparative chromatography. The obtained derivative was characterized by Nuclear Magnetic Resonance of Hydrogen and Carbon (NMR1H13C) and Mass Spectrometry (MS). In addition, antioxidant, antifungal and cytotoxicity activities were evaluated. The results showed that ten strains were able to catalyze the biosynthesis of up to four morin derivatives. Beauveria bassiana ATCC 7159 was selected to conduct the reaction staggering, where it was possible to obtain three ineded derivatives of the starting compound, leading to the isolation and purification of a methylglycosylated major product, termed morin 4’-O-β-D-(4’’-O-methyl) glucopyranoside. The results obtained through the evaluation of antioxidant and antifungal activities showed a good performance of the evaluated compounds. In addition, the obtained compost showed a low red blood cell cytotoxicity (0.6-1.2%). In silico studies have evaluated potential biological activities for morin and its derivatives. The derivative obtained by biosynthesis catalysed by B. bassiana ATCC 7159 is unprecedented and has good antioxidant, antifungal and low cytotoxicity profiles in red blood cells. / A biossíntese de compostos catalisada por micro-organismos é uma estratégia inovadora na funcionalização de produtos naturais e sintéticos. Esta estratégia é apresentada como uma ferramenta promissora e grande aliada da química verde na produção de novos compostos bioativos. A morina é um flavonóide que possui reconhecidas atividades antioxidante e antifúngica. Assim, o objetivo deste estudo é a produção de derivados da morina através de biossíntese, e a avaliação de suas atividades antioxidante, antifúngica e citotóxica em hemácias. Para realizar a triagem e a identificação da cepa mais promissora, 18 fungos filamentosos foram empregados; alíquotas de uma suspensão de esporos foram transferidas para Erlenmeyers de 250 mL contendo 100 mL de diferentes meios de cultura líquido (Glicose, PDSM e Czapek). Os micro-organismos foram incubados a 200 rpm e 28 °C durante 65 horas. Após o crescimento, 25 mg/mL de morina foram solubilizados em etanol e adicionados a cada Erlenmeyer. Ao final do período de 96 horas de incubação foi realizada a extração e posterior purificação em coluna cromatográfica preenchida com silica e cromatografia preparativa. Os produtos foram monitorados por Espectrometria de Massas (EM) e o produto majoritário obtido foi caracterizado por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono (RMN1H13C) e Espectrometria de Massas (EM). Além disso, a atividade antioxidante, antifúngica e a citotoxicidade em hemácias da morina e do produto majoritário obtido foram avaliadas. Os resultados mostraram que dez cepas foram capazes de catalisar a biossíntese de até três derivados da morina. A Beauveria bassiana ATCC 7159 foi selecionada para conduzir o escalonamento da reação em biorreator de tanque agitado, uma vez que essa cepa foi capaz de biocatalizar o maior número de derivados. Foi possível a obtenção de três derivados inéditos do composto de partida, conduzindo ao isolamento e purificação de um produto majoritário metilglicosilado, denominado morina 4’-O-β-D-(4’’-O-metil) glucopiranosídeo. A atividade antioxidante avaliada por voltametria cíclica de pulso diferencial apresentou 5 picos de oxidação para o derivado metilglicosilado e 2 picos de oxidação para a morina. Na avaliação da atividade antifúngica, o derivado obtido, quando comparado com a morina, apresentou menor concentração inibitória minima para cepa L18 de Cryptococcus sp. Além disso, o composto obtido apresentou uma baixa citotoxicidade em hemácias (0.6-1.2%). Estudos in silico avaliaram as potenciais atividades biológicas para a morina e seus derivados. O derivado obtido através de biossíntese catalisada por B. bassiana ATCC 7159 é inédito e possui bons perfis antioxidante, antifúngico e baixa citotoxicidade em hemácias.

Cumarinas são estruturas promissoras e diversas atividades biológicas têm sido atribuídas a esses metabólitos secundários vegetais. Estudos sugerem que o mecanismo antifúngico desses compostos esteja correlacionado com a atividade antioxidante. A reação da tirosinase, que produz radicais livres, está envolvida no processo de melanização do fungo Sporothrix schenckii, o causador de micose subcutânea de maior incidência no sul do Brasil. A inibição dessa enzima foi recentemente reportada para extrato de Pterocaulon (Asteraceae), planta rica em cumarinas e usada na medicina tradicional do Brasil para tratamento tópico de micoses e na medicina popular da Argentina como anticâncer. O objetivo desse trabalho foi investigar in vitro a atividade antifúngica, correlacionando-a com atividade antioxidante, de extratos de espécies de Pterocaulon e de 6,7-metilenodioxicumarinas isoladas e também de 4-metilcumarinas obtidas por síntese, bem como a investigação da atividade citotóxica de algumas destas moléculas. As 6,7-metilenodioxicumarinas foram isoladas de P. balansae e P. lorentzii, enquanto que as 4-metilcumarinas foram sintetizadas via Pechmann por micro-ondas. A atividade antifúngica contra Sporotrix schenckii foi realizada conforme manual do Clinical and Laboratory Standards Institute. O estudo das propriedades eletroquímicas foi obtido por voltametria cíclica e a capacidade antioxidante pelo método espectofotométrico DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) e pelo método fluorimétrico ACAP contra radicais peroxil. A análise dessa atividade mostrou que os extratos metanólicos de espécies de Pterocaulon (P. polystachyum, P. balansae, P. lorentzii, P. lanatum e P. cordobense) foram ativos frente às cepas do fungo S. schenckii, sendo o extrato de P. polystachyum o mais ativo, apresentando Concentração Inibitória Mínima (CIM) compreendida entre 156 e 312 μg/mL. O fracionamento dos extratos lipofílicos de P. balansae e P. lorentzii levou ao isolamento de três metilenodioxicumarinas. Dados cristalográficos da 5-metóxi-6,7-metilenodioxicumarina, inéditos, foram depositados no Cambridge Crystallographic Data Centre 779123. As cumarinas sintéticas foram obtidas em rendimentos satisfatórios (98-30%) e em reduzido tempo de reação (5-20 min). O screening destas cumarinas frente às cepas do fungo S. schenckii revelou que 5-carboxi-6,7-diidroxi-4-metilcumarina, com CIM de 66 μM e Concentração Fungicida Mínima de 246 μM, foi o composto mais ativo. Essa cumarina apresentou sinergismo com a Anfotericina B, sendo sua CIM reduzida para 15 μM. A atividade antifúngica desses compostos pode estar correlacionada com a atividade antioxidante. O composto 5-carboxi-6,7-diidroxi-4-metilcumarina foi o mais ativo mostrando elevada capacidade antioxidante frente aos radicais DPPH com valores de IC50 de 17,49 μM e elevada atividade frente ao radical peroxil. Além disso, apresentou um potencial de oxidação de 0,4 V sugerindo atividade antioxidante. Baseado nos ensaios antioxidante e antifúngico foi possível observar que a presença de grupamentos hidroxilas no C-7 e C-8 do anel cumarínico, assim como a adição de grupamento polar no C-5 favoreceu ambas as atividades antifúngica e antioxidante. Na segunda etapa desse trabalho foi avaliada a citotoxicidade das cumarinas isoladas e algumas cumarinas simples, disponíveis comercialmente, pelo método Metil Tiazol Tetrazólio (MTT) usando linhagens de glioma humano (U138-MG) e de ratos (C6). Foi observado que as 6,7-metilenodioxicumarinas causaram uma significativa redução na viabilidade celular, sugerindo uma influência positiva do grupamento metilenodioxi sobre essa atividade. O composto 5-metóxi-6,7-metilenodioxicumarina foi o mais promissor (IC50= 34,6 μM e IC50= 31,6 μM para C6 e U-138 MG, respectivamente). Como desfecho desse trabalho, pode-se concluir que as cumarinas apresentaram uma atividade inibitória frente ao crescimento celular de linhagens de glioma e um efeito fungicida sobre S. schenckii, resultados estes que corroboram com o uso popular dessas plantas. / Coumarins are promising structures and diverse biological activities have been attributed to these secondary plant metabolites. Studies suggest that the mechanism of antifungal compounds is correlated with antioxidant activity. The reaction of tyrosinase, which produces free radicals, is involved in the process of melanization of the fungus Sporothrix schenckii, the agent of subcutaneous mycosis with the highest incidence in southern Brazil. The inhibition of this enzyme has recently been reported to extract Pterocaulon (Asteraceae) This plant is rich in coumarins and used in traditional medicine in Brazil for topical treatment of fungal infections and in folk medicine of Argentina as anticancer. The aim of this study was to investigate the in vitro antifungal activity and correlation with its antioxidant properties and cytotoxic activities of extracts of some species of Pterocaulon, as well as the isolated coumarins, and 4-methylcoumarin analogs obtained by synthesis. The 6.7-methylenedioxycoumarins were isolated from P. balansae and P. lorentzii, while the 4-methylcoumarins were synthesized via Pechmann reaction using microwave. The antifungal activity against Sporothrix schenckii was performed as indicated in the Manual of Clinical and Laboratory Standards Institute. A study of the electrochemical properties of coumarins was performed by cyclic voltammetry, by the method of 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) and against peroxyl radicals (ACAP) by fluorometric method. The analysis showed that the antifungal activity of the methanol extracts of Pterocaulon species (P. polystachyum, P. balansae, P. lorentzii, P. lanatum and P. cordobense) were active against the strains of the fungus S. schenckii, being the extract of P. polystachyum the most active, presenting Minimum Inhibitory Concentration (MIC) compressed between 156 and 312 μg/mL. The fractionation of lipophilic extracts of P. balansae and P. lorentzii led to the isolation of three methylenedioxycoumarins. The crystallographic data of 5-methoxy-6,7-methylenedioxycoumarin were deposited at the Cambridge Crystallographic Data Center 779123. The synthetic coumarins were obtained in satisfactory yields (98-30%) and reduced reaction time (5-20 min). The screening of these coumarins against strains of the fungus S. schenckii revealed that the 5-carboxy-6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin was the most active compound, presenting MIC of 66 μM and Minimum Fungicidal Concentration of 246 μM. This coumarin showed synergism with Amphotericin B, and its MIC was reduced to 15 μM. The antifungal activity of phenolic compounds could be related to its antioxidant activities. The compound 5-carboxy-6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin was again the most active with IC50 value of 17.49 μM, showing the highest capacity to deplete the radicals DPPH and ACAP, moreover present a oxidation potential of 0.4 V suggesting antioxidant activity. Based on the antioxidant and antifungal tests it was observed that the presence of hydroxyl groups at C-7 and C-8 of the coumarin ring and the addition of polar grouping at C-5 favored both antifungal and antioxidant activities.In the second part of this work, it was evaluated the cytotoxicity of the Pterocaulon compounds and some commercially available coumarins, with simple structure. The cytotoxic potential was determined by Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) test using strains of human glioma (U138-MG) and rat (C6). It was observed that the 6,7-methylenedioxycoumarins caused a significant reduction in cell viability, suggesting a positive influence of the methylenedioxy group in this activity. The compound 5-methoxy-6,7-methylenedioxycoumarin was the most promising (IC50 = 34.6 μM and IC50 = 31.6 μM for C6 and U-138 MG, respectively). In conclusion, this work it was demonstrated that some coumarins showed an inhibitory activity against the growth of glioma cell lines and a fungicidal effect on the S. schenckii. These results corroborate the popular use of these plants.