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Nuclear Factor Kappa B Pathway and human cancer therapeuticsGuo, Xiaoxia January 2009 (has links)
Cancer is one of the major causes of morbidity in the world. Although the overall survival of cancer has been significantly improved by chemotherapy in the last three decades, the success of cancer chemotherapy is still severely limited by the lack of selectivity of anti-cancer drugs to malignant cells leading to dose-limiting toxicity and the resistance of cancer cells to the conventional anti-cancer drugs. Gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT) was designed to direct the anti-cancer drugs to specifically target the cancer cells by using cancer specific promoter to drive the expression of enzyme which can convert prodrug into anti-cancer drug specifically in cancer cells. However, this strategy is hindered by the lack of strong cancer specific promoters to specifically express drug-converting enzymes in cancer cells. In consequence, there is not enough anti-cancer drug activated inside the cancer cells. The first part of this study was to employ NF-κB binding sites as a novel enhancer system to improve the promoter activity of carcinoembryonic antigen (CEA) and human telomerase reverse transcriptase (hTERT) for GDEPT. In this system, the basal CEA promoter sequences were placed downstream of the 4 or 8 NF-κB DNA binding sites linked in tandem (κB4 or κB8). The system was designed to serve two particular purposes: to exploit the high levels of intratumoural NF-kB expression and keep the relative tumour specificity of the CEA and hTERT promoters. The results demonstrated that κB enhancer systems increased the transcriptional activity of CEA and hTERT promoter without compromising its cancer specificity. The fidelity of the κB4-CEA enhancer-promoter system was therefore improved by the increased transcriptional contrast between the cancer and normal cells. Moreover, in comparison with CEA promoter alone, κB-CEA enhancer-promoter system expressed human thymidine phosphorylase (TP) protein at significantly higher levels which were comparable to those expressed by CMV promoter. The κBCEA- TP system transfected cells demonstrated significantly higher sensitivity to 5'-Deoxy-5-Fluorouridine (5'-DFUR), a prodrug of 5-fluorouracil (5-FU). The second part of this study was involved in using NF-κB inhibitor as a chemosensitizer to sentizise the anti-cancer drug-induced chemoresistance cells to anti-cancer drugs. The results derived from this study manifested that the anti-alcoholism drug, Disulfiram (DS), and anti-inflammatory drug, triptolide (PG490), markedly enhanced the cytotoxicity of several conventional anti-cancer drugs in colon, lung and breast cancer cell lines. PG490 induced caspase-dependent cell death accompanied by a significant decrease in Bcl-2 levels. PG490 induced the expression of p53 and down-regulated p21 expression. This study indicated that some clinically used non-cancerchemotherapeutic drugs may be developed as chemosensitizers for cancer chemotherapy
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Expression diagnostisch verwendbarer Antigene zum Nachweis West-Nil-Virus-spezifischer AntikörperDelker, Anna Maria 26 March 2014 (has links) (PDF)
Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate.
Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich.
Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.
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Charakterisierung rekombinanter immunreaktiver Antigene der Krätzmilbe Sarcoptes scabieiKuhn, Carola 23 May 2005 (has links)
Die parasitische Milbe Sarcoptes scabiei, die im Stratum corneum ihres Wirtes lebt, ist weit verbreitet. Eine zuverlässige Diagnose mittels herkömmlicher Techniken ist unzulänglich. Serologische Tests unter Verwendung von Gesamtantigen sind aufwändig und teuer in der Herstellung, und Kreuzreaktionen mit freilebenden Milben können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit wurde eine cDNA-Bank aller Entwicklungsstadien von S. scabiei var. suis erstellt. Unter Verwendung eines humanen Skabies-positiven Sammelserums wurden 61 rekombinante immunreaktive Klone von S. scabiei isoliert, und das Protein von sieben dieser Klone als Diagnostikkandidaten wurde aufgereinigt. Die identifizierten Sequenzen zeichnen sich z. T. durch das Vorhandensein repetitiver Bereiche aus. Die rekombinanten Proteine wurden im ELISA unter Verwendung von Human- und Schweineseren auf ihre Sensitivität geprüft. Die Antigene zeigten signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen mit den humanen Positiv- bzw. Negativseren, während dies bezüglich der Reaktion mit den porzinen Seren, nur für vier der Antigene der Fall war. Unspezifische Reaktionen mit E. coli-Protein sowie GST bei einem als Fusionsprotein exprimierten Antigen erwiesen sich als störend. 42.6% der isolierten Klone enthalten eine repetitive zentrale Region, deren offener Leserahmen hauptsächlich für die Aminosäuren Glutamat und Lysin kodiert. Obwohl sie große Homologien aufweisen, unterscheiden sich die Transkripte sowohl im zentralen Bereich als auch am 3´-Ende voneinander. Mittels der Southern Blot-Analyse konnte in Sarcoptes nur eine Genkopie detektiert werden, während dieses Gen in Dermatophagoides-Milben nicht nachgewiesen werden konnte. Auf Grund der Spezifität des Antigens für die parasitischen Milben könnte dieses Antigen für die Serodiagnostik besonders geeignet sein. Anhand von immunhistochemischen Untersuchungen wurden entsprechende Proteine in einer Organstruktur, bei der es sich vermutlich um die Hoden der Milben handelt, detektiert. In dieser Arbeit wurden rekombinante Antigene für die Serodiagnostik der Sarcoptes-Infektion bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass das Expressionssystem E. coli als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von Sarcoptes-Infektionen möglicherweise ungeeignet ist. / The parasitic mite Sarcoptes scabiei, which lives in the Stratum corneum of the host, is prevalent worldwide. Reliable diagnosis using conventional methods is unsatisfying. Serological tests using the total antigen are labour intensive and expensive to produce, and moreover there exist unspecific crossreactions against house dust mites, which lead to false positive results. We expect an improvement of serological diagnosis using specific recombinant antigens of the Sarcoptes-mites. In this work, we constructed a cDNA-library of all stages from S. scabiei var. suis. Using scabies-positive pooled human sera, we isolated 61 recombinant immunoreactive clones and purified the protein of seven clones as potential candidates for diagnosis. The identified sequences are partially characterized by the presence of repetitive domains. The recombinant proteins were tested for their sensitivity in the ELISA, using positive and negative human- and porcine sera. There exist significant differences between the reactions of the positive and negative sera for all the seven antigens using human sera. In contrast, with the porcine sera, significant difference could be detected only in four antigens. Reactions against of E. coli-protein and the GST in the fusionprotein caused problems of unspecific background. 42.6% of the isolated clones contain a repetitive central region, and the ORF mainly encodes the aminoacids glutamate and lysine. Altough there exist high homologies, the sequences of the transcripts differ in the central region and at the 3´-end. By southern blot analysis we could show one copy of the gene, while it was not detected in the genome of the free-living Dermatophagoides-mites. As for the specificity for the parasitic mites, the antigens might be good candidates for immunodiagnosis. In immunohistochemical studies the proteins were detected in a paired structure in the posterior part of the mites opisthosoma, which might be the testis. In this study, recombinant antigens of S. scabiei were produced and tested for the use in immunodiagnosis. It was shown, that the E. coli-expression system might be unsuitable for the production of recombinant antigens for their use in immunodiagnosis of Sarcoptes-infections.
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Epidemiologische Untersuchungen zur Toxoplasmose und Identifizierung immunogener parasitärer Antigene / Epidemiological analysis of toxoplasmosis and identification of immunogenic parasitic antigensHotop, Andrea 07 July 2011 (has links)
Die Toxoplasmose ist eine Infektionskrankheit, die durch den Parasiten Toxoplasma gondii verursacht wird. Während eine Infektion bei den meisten immunkompetenten Menschen asymptomatisch abläuft, kann bei einer Primärinfektion in der Schwangerschaft der Parasit auf den Föten übergehen und zu einem Abort oder zu schweren Erkrankungen dessen führen.Eine pränatale Therapie soll eine Übertragung verhindern oder klinische Auswirkungen beim Kind mindern. Um die Effektivität der in Deutschland durchgeführten Therapie beurteilen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine retrospektive Untersuchung von 685 schwangeren Frauen durchgeführt, deren serologische Befunde auf eine Primärinfektion hindeuteten. In Folge dieser Studie konnte gezeigt werden, dass eine innerhalb von vier Wochen nach Infektion eingeleitete antiparasitäre Therapie das Risiko für die Ausprägung von klinisch-manifesten Erkrankungen des Kindes mindert.Um valide epidemiologische Untersuchungen durchführen zu können ist eine zuverlässige Diagnostik unabdingbar. Hierfür ist von Bedeutung, dass T. gondii ein intrazellulärer Parasit ist, welcher in drei verschiedenen Stadien vorkommt: als Oozysten, Tachy- und Bradyzoiten. Bei einer akuten Infektion sind vorwiegend sich schnell vermehrende Tachyzoiten vorhanden, während bei einer chronischen Infektion Bradyzoiten-enthaltene Zysten dominieren. Es wird davon ausgegangen, dass jedes Parasitenstadium spezifische Antigene exprimiert.Im Zuge dieser Arbeit sollten daher diagnostische Marker identifiziert werden, die eine Differenzierung zwischen einer akuten und einer chronischen Infektion erlauben. Über 2D-Gelelektrophoresen und Massenspektrometrie konnten dabei u. a. die Proteine GRA1, GRA7, ROP9, MIC5 und SUB1 als Marker für eine akute Infektion ermittelt werden. Diese, sowie sieben weitere Proteine, wurden rekombinant in E. coli hergestellt und in einem Lineblot-Verfahren an Humanseren auf ihre diagnostischen Eigenschaften untersucht.Durch den Nachweis spezifischer IgG-Antikörper gegen rGRA1, rGRA2 und rGRA6 konnte eine Toxoplasma-Infektion in bis zu 100 % erkannt werden. Eine Diskriminierung des Infektionsstadiums war allerdings nicht möglich. Eine akute Infektion ließ sich jedoch durch den Nachweis von rSUB1- und rGRA6-spezifischen IgG- und IgA Antikörper mit einer Wahrscheinlichkeit von bis zu 92 % von einer chronischen Infektion unterscheiden.Des Weiteren wurden mit Hilfe des Lineblot-Verfahrens untersucht, ob die rekombinanten Antigene auch Potenzial hatten eine der häufigsten klinisch-manifesten Erkrankungen - die okuläre Toxoplasmose (Retinochorioiditis) - zu identifizieren. Dabei konnten durch den Nachweis GRA2-spezifischer IgA- und BAG1-spezifischer IgG-Antikörper signifikante Unterschiede bei Patienten mit einer Retinochorioiditis im Vergleich zu T. gondii infizierten Patienten ohne okuläre Läsionen festgestellt werden.Um festzustellen, ob der Lineblot-Assay unter der Verwendung rekombinanter Antigene auch in der Veterinärmedizin eingesetzt werden kann, wurden Verlaufseren von Hühnern, Puten und Schweinen untersucht, die experimentell mit Oozysten oder Tachyzoiten infiziert worden waren. Dabei zeigten die Tiere, in Abhängigkeit von dem getesteten Antigen, eine teilweise Infektionsdosis- und Infektionsart-abhängige Antikörper-Kinetik.In der Zusammenschau können die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zur Verbesserung der Diagnostik und Therapie der Toxoplasmose insbesondere in der Schwangerschaft beitragen.
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Expression diagnostisch verwendbarer Antigene zum Nachweis West-Nil-Virus-spezifischer Antikörper: Expression diagnostisch verwendbarer Antigene zum NachweisWest-Nil-Virus-spezifischer AntikörperDelker, Anna Maria 12 March 2014 (has links)
Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate.
Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich.
Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.:Inhaltsverzeichnis
Bibliografische Darstellung V
Abkürzungsverzeichnis VI
Abbildungsverzeichnis IX
Tabellenverzeichnis X
Formelverzeichnis XII
1 Einleitung 1
1.1 West-Nil-Virus: Relevanz und epidemiologische Aspekte 1
1.2 Virale Struktur und Replikation 3
1.3 West-Nil-Virus-Erkrankung: Prädiktion, Pathogenese und Krankheitsbild 7
1.4 Diagnostik von West-Nil-Virus-Infektionen 9
1.5 Zielstellung 12
2 Materialien 13
2.1 Versuchstiere, Bakterien-, Hefe- und Virusstämme 13
2.2 Vektoren und Oligonukleotide 13
2.3 Reagenzsysteme, Standards und Enzyme 15
2.4 Antikörper 16
2.5 Feinchemikalien und Reagenzien 16
2.6 Puffer und Lösungen 19
2.7 Nährmedien 20
2.8 Verbrauchsmaterialien und Technische Ausstattung 21
3 Methoden 25
3.1 Molekularbiologische Methoden 25
3.1.1 Reverse Transkription 25
3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 25
3.1.3 DNA-Sequenzierung 28
3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese 28
3.1.5 DNA-Reinigung 29
3.1.6 Bestimmung der DNA-Konzentration 29
3.1.7 Restriktionsverdau 29
3.1.8 Ligation 30
3.2 Arbeiten mit E. coli 31
3.2.1 Kultivierung und Lagerung 31
3.2.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 31
3.2.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E. coli-Zellen 31
3.2.4 Plasmidpräparation aus E. coli 31
3.2.5 Expression rekombinanter Proteine in E. coli 32
3.3 Arbeiten mit P. pastoris 32
3.3.1 Kultivierung und Lagerung 32
3.3.2 Herstellung kompetenter P. pastoris-Zellen 32
3.3.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente P. pastoris-Zellen 33
3.3.4 Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris 33
3.4 Biochemische Methoden 34
3.4.1 Proteinextraktion aus Bakterienzellen 34
3.4.2 Proteinextraktion aus Hefezellen 35
3.4.3 Proteinfällung mittels Trichloressigsäure (TCA) 35
3.4.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 35
3.4.5 Silberfärbung 37
3.4.6 Western Blot 37
3.4.7 Reinigung der rekombinanten Polypeptide aus Proteingemischen 38
3.4.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 40
3.4.9 Spaltung von MBP-Fusionsproteinen 40
3.4.10 Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) 41
3.4.11 Immunisierung der Balb/c-Mäuse 42
3.4.12 Indirekter ELISA 43
3.4.13 Bestimmung des murinen Antikörpertiters 44
3.4.14 Nachweis humaner Antikörper im Testserum 45
4 Ergebnisse 46
4.1 Definition der ausgewählten Strukturproteinsequenzen 46
4.2 Expression der rekombinanten Polypeptide prM, Cnat und Cme in P. pastoris 47
4.2.1 Klonierung der Expressionsplasmide 47
4.2.2 Transformation von Pichia pastoris 49
4.2.3 Expression der Zielpeptide in P. pastoris 51
4.3 Expression von Cnat und Cme in E. coli 56
4.3.1 Klonierung der Expressionsplasmide 56
4.3.2 Transformation von E. coli 58
4.3.3 Expression der WNV-Sequenzen Cnat und Cme als Fusionsproteine 59
4.3.4 Spaltung der Fusionsproteine mittels Faktor Xa 62
4.3.5 Isolierung der Zielpeptide Cnat und Cme 63
4.4 Untersuchung der Immunogenität der rekombinanten WNV-Polypeptide 66
4.4.1 Immunisierung von Versuchstieren mit rekombinanten WNV-Polypeptiden 66
4.4.2 Analyse der murinen Seren mittels ELISA 66
4.4.3 Erweiterte Analyse des rekombinanten prM-Polypeptids mit Humanseren 67
4.4.4 Erweiterte Analyse der murinen prM-Seren im IFT 69
4.5 Prüfung der rekombinanten Peptidantigene auf ihre Verwendbarkeit in einem WNV-spezifischen Testsystem 69
4.5.1 Untersuchung der humanen Seren S2-S42 mittels ELISA 69
4.5.2 Einsatz von Cnat und MBP-Cme als Antigene zur Untersuchung der humanen Seren S2-S42 im ELISA 70
5 Diskussion 72
5.1 Expression von prM, Cnat und Cme in P. pastoris 73
5.2 Expression von Cnat und Cme in E. coli 77
5.3 Analyse der Immunogenität von prM, Cnat und MBP-Cme 79
5.4 Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA für die Detektion WNV-spezifischer Antikörper in humanen Serumproben 84
6 Zusammenfassung 90
7 Literaturverzeichnis 94
8 Anhang 104
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XIV
Danksagung XV
Lebenslauf XVI
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THE DISCOVERY AND CHARACTERIZATION OF NOVEL POTENT 5-SUBSTITUTED 3, 3’, 4’, 7-TETRAMETHOXYFLAVONOID DNA TRIPLEX SPECIFIC BINDING LIGANDSRangel, Vanessa Marie 01 January 2023 (has links)
Chemotherapy works by killing fast dividing cells. Unfortunately, these drugs are not specific to cancer tissue and can damage normal cells. Chemotherapy is like taking poison and hoping it kills the cancer cells before it kills you. As an alternative, many researchers have investigated the use of antigene therapy to selectively target cancer causing genes to avoid off target effects. Although promising, the theory is limited by the stability of the triplex structure. Here, we report the discovery of potent triplex binding ligands derived from the natural product quercetin. Chemical derivatives of 5-substituted 3, 3’, 4’, 7-tetramethoxyquercetin derivatives were characterized using several biophysical methods: thermal denaturation monitored by UV, circular dichroism, viscometry, differential scanning calorimetry, and isothermal titration calorimetry. The data revealed that these derivatives specifically stabilize triplex DNA and do not influence the stability of duplex DNA, triple RNA, or duplex RNA. Structurally, the amino containing side chains at the 5-position and the linker length are critical for the observed binding affinity and specificity. Two derivatives, 5 and 7, are comparable (if not better) to the triplex groove binder Neomycin. Our data confirm the binding mode as enthalpically driven intercalation. Piperidine or pyrrolidine 5-substituted 3, 3’, 4’, 7-tetramethoxyquercetin derivatives with a three-carbon linker are the lead compounds for development as a potential antigene enhancer.
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The changes in antigenic components of Vibrio cholerae strains isolated in Vietnam / Sự biến đổi thành phần kháng nguyên của các chủng Vibrio cholerae phân lập ở Việt NamHa, Thi Quyen, Dinh, Duy Khang 08 December 2015 (has links) (PDF)
Whole cells of Vibrio cholerare serotype Inaba and serotype Ogawa (strains I389 and O395) were injected into rabbits to obtain antiserum. The antiserums were used for immune reaction with antigenic components of 25 strains of V.cholerae isolated from five provinces of Vietnam and the two standard strains I389 and O395 by Western-blot technique. Analysis of immune hybrid results showed that there were 11 antigenic components with molecular weights approximately 79kDa, 62kDa, 52kDa, 45kDa, 42kDa, 38kDa, 35kDa, 31kDa, 26kDa, 23kDa and 20kDa. In which the antigens of 45kDa, 42kDa, 31kDa and 20kDa were similar to OmpT, OmpS, Omp-31kDa and TcpA that have been considered as vaccine-candidate antigens. Among 25 V.cholerae strains, there were 6 antigenic components in common including 79kDa, 62kDa, 45kDa, 35kDa, 31kDa and 20kDa. 23/25 strains contained 42kDa antigen; 5/25 strains contained 38kDa and 23kDa antigens; 11/25 had 26kDa antigen. In addition, 7/25 strains contained antigens identical to V.cholerae I389 serotype Inaba; 6/25 strains contained antigens of I389 and O395; 12/25 strains had changes of antigenic components. These changes were actually the lack of antigens, not appearing new antigens. These results are considered as basis for researches about immune response and prevention of cholera disease. / Toàn bộ tế bào của các chủng Vibrio cholerare typ huyết thanh Inaba và typ huyết thanh Ogawa (chủng I389 và O395) được sử dụng để gây miễn dịch trên thỏ để thu kháng huyết thanh. Các kháng huyết thanh được dùng để thực hiện phản ứng miễn dịch với các thành phần kháng nguyên của 25 chủng V.cholerae phân lập từ 5 tỉnh thành của Việt Nam và hai chủng chuẩn I389 và O395 bằng kỹ thuật Western-blot. Phân tích kết quả lai miễn dịch cho thấy, có tổng số 11 thành phần kháng nguyên có kích thước khoảng 79kDa, 62kDa, 52kDa, 45kDa, 42kDa, 38kDa, 35kDa, 31kDa, 26kDa, 23kDa và 20kDa. Các kháng nguyên này chủ yếu là các protein màng ngoài (Omp) và kháng nguyên lông (TcpA). Trong đó các kháng nguyên 45kDa, 42kDa, 31kDa và 20kDa trùng với các kháng nguyên OmpS, OmpT, Omp-31kDa và TcpA được xem là những kháng nguyên dự tuyển vacxin tả. Có 6 kháng nguyên chung giữa 25 chủng với kích thước 79kDa, 62kDa, 45kDa, 35kDa, 31kDa và 20kDa. 7/25 chủng có các kháng nguyên giống với kháng nguyên của chủng V. cholerae I389 typ huyết thanh Inaba; 6/25 chủng có các kháng nguyên giống với kháng nguyên của cả hai chủng V.cholerae I389 và O395; 12/25 chủng có sự biến đổi thành phần kháng nguyên. Tuy nhiên, sự biến đổi này thực chất là sự thiếu hụt chứ không phải là sự xuất hiện các thành phần kháng nguyên mới. Các kết quả nghiên cứu này có thể được xem là nền tảng ban đầu cho các nghiên cứu về miễn dịch và dự phòng bệnh tả.
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Die proteasomale HomöostaseHeink, Sylvia 03 August 2005 (has links)
Das Proteasom spielt eine zentrale Rolle beim Proteinabbau und der Antigen-Generierung für die adaptive Immunantwort. Vertebraten exprimieren zwei Typen des proteolytischen 20S-Kernkomplexes: das konstitutive c20S (mit den aktiven Untereinheiten beta 1, 2, 5) und das Immunoproteasom i20S (mit den Immunountereinheiten LMP2, MECL-1, LMP7). Die i20S-Expression wird durch Interferon_gamma (IFNg) induziert, was die Antigen-Präsentation auf MHC Klasse I und die Immunantwort gegen infizierte bzw. maligne entartete Zellen durch cytotoxische T-Zellen steigert. Proteasomen werden über komplexe, bisher unvollständig verstandene Biogenese-Prozesse formiert. Die initialen Schritte der humanen 20S-Formation wurden in dieser Arbeit untersucht und eine Methode zur Isolation früher Assemblierungsintermediate (EPIs) etabliert. Die 20S-Biogenese bedarf der Assistenz von Hilfsfaktoren wie dem Proteasom-Maturierungsprotein POMP. Diese Komponente von Precursorkomplexen stellt das erste Substrat gereifter c20S dar. In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass POMP ebenfalls die i20S-Formation vermittelt und sich die Biogenese von c20S und i20S hinsichtlich der Maturierungskinetik unterscheidet. POMP wird durch IFNg induziert und interagiert mit der Immunountereinheit LMP7. Dieses molekulare Zusammenspiel bewirkt eine schnellere Maturierung von i20S- im Vergleich zu c20S- Precursorkomplexen, wodurch POMP einem schnelleren Abbau unterliegt. Die forcierte i20S-Biogenese ist eine intrinsische Eigenschaft und unabhängig von weiteren, IFNg-induzierten Faktoren. Nur die LMP7_E2-Variante vermittelt die schnelle Degradation von POMP, während das nicht funktionelle LMP7_E1 mit einer anderen Prosequenz nicht in i20S-Vorläufer inkorporiert wird. Somit führt die alleinige LMP7_E1-Expression in IFNg-stimulierten Carcinom-Zellen zu einer i20S-Defizienz, was eine mögliche Immunevasions-Strategie darstellt. Weiterhin besitzen beide 20S-Typen unterschiedliche Halbwertszeiten: i20S sind, unabhängig von weiteren IFNg-induzierten Proteinen, signifikant instabiler als c20S. Somit werden i20S sowohl schneller formiert als auch zügiger wieder abgebaut als c20S, womit sie typische Eigenschaften cytokin-regulierter Proteine aufweisen. Die i20S-Formation ist also eine transiente Antwort und stellt ein effizientes Instrument zur schnellen Reaktion auf immunologische Herausforderungen wie z.B. eine Infektion dar. Nach einer wirksamen Immunantwort erlaubt die geringere i20S-Stabilität eine schnelle Rückkehr zur standardmäßigen c20S-Expression. / The proteasome plays a crucial role in protein degradation and antigen generation for the adaptive immune response. Vertebrates express two types of the proteolytic 20S core complex: the constitutive proteasome c20S (with the active subunits beta 1, 2 and 5) and the immunoproteasome i20S (with the immunosubunits LMP2, MECL-1 and LMP7). Interferon_gamma (IFNg) induces the i20S expression, that supports a more efficient MHC class I antigen presentation and an effective immune response against infected or malignant cells by cytotoxic T-cells. Proteasomes are formed by a complex and not well understood biogenesis program. The initial steps in the human 20S formation have been analyzed in this thesis and a method for the isolation of ´early proteasome assembly intermediates´ (EPIs) has been established. The 20S biogenesis requires the assistance of accessory factors like the proteasome maturation protein POMP. This component of precursor complexes becomes the first substrate of the matured c20S. The described experiments demonstrate for the first time that POMP mediates the i20S formation and that biogenesis of c20S and i20S differ in their maturation kinetics. POMP is induced by IFNg and interacts with the immunosubunit LMP7. This molecular interplay provokes a faster maturation of i20S compared to c20S precursor complexes, whereby POMP becomes subject to a faster degradation. The accelerated i20S biogenesis is an intrinsic characteristic and independent of additional IFNg-induced factors. Exclusively the LMP7_E2 variant causes the rapid degradation of POMP, whereas the non-functional LMP7_E1 bearing another prosequence is not incorporated into i20S precursor complexes. Thus, LMP7_E1 expression in IFNg-stimulated carcinoma cells leads to a i20S deficiency pointing out a possible immune evasion strategy. In addition, both 20S types display different half-life values: i20S are, independent of other IFNg-induced proteins, significantly less stable than c20S. Thus, i20S are not only faster assembled, but also more quickly decomposed compared to c20S, showing typical attributes of proteins regulated by cytokines. Consequently, i20S formation is a transient response and represents an efficient instrument for a rapid adjustment to varying immunological challenges like an infection. Once the immune response has been effective, the lower stability of i20S permits an expeditious return to the standard c20S expression.
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The changes in antigenic components of Vibrio cholerae strains isolated in Vietnam: Research articleHa, Thi Quyen, Dinh, Duy Khang 08 December 2015 (has links)
Whole cells of Vibrio cholerare serotype Inaba and serotype Ogawa (strains I389 and O395) were injected into rabbits to obtain antiserum. The antiserums were used for immune reaction with antigenic components of 25 strains of V.cholerae isolated from five provinces of Vietnam and the two standard strains I389 and O395 by Western-blot technique. Analysis of immune hybrid results showed that there were 11 antigenic components with molecular weights approximately 79kDa, 62kDa, 52kDa, 45kDa, 42kDa, 38kDa, 35kDa, 31kDa, 26kDa, 23kDa and 20kDa. In which the antigens of 45kDa, 42kDa, 31kDa and 20kDa were similar to OmpT, OmpS, Omp-31kDa and TcpA that have been considered as vaccine-candidate antigens. Among 25 V.cholerae strains, there were 6 antigenic components in common including 79kDa, 62kDa, 45kDa, 35kDa, 31kDa and 20kDa. 23/25 strains contained 42kDa antigen; 5/25 strains contained 38kDa and 23kDa antigens; 11/25 had 26kDa antigen. In addition, 7/25 strains contained antigens identical to V.cholerae I389 serotype Inaba; 6/25 strains contained antigens of I389 and O395; 12/25 strains had changes of antigenic components. These changes were actually the lack of antigens, not appearing new antigens. These results are considered as basis for researches about immune response and prevention of cholera disease. / Toàn bộ tế bào của các chủng Vibrio cholerare typ huyết thanh Inaba và typ huyết thanh Ogawa (chủng I389 và O395) được sử dụng để gây miễn dịch trên thỏ để thu kháng huyết thanh. Các kháng huyết thanh được dùng để thực hiện phản ứng miễn dịch với các thành phần kháng nguyên của 25 chủng V.cholerae phân lập từ 5 tỉnh thành của Việt Nam và hai chủng chuẩn I389 và O395 bằng kỹ thuật Western-blot. Phân tích kết quả lai miễn dịch cho thấy, có tổng số 11 thành phần kháng nguyên có kích thước khoảng 79kDa, 62kDa, 52kDa, 45kDa, 42kDa, 38kDa, 35kDa, 31kDa, 26kDa, 23kDa và 20kDa. Các kháng nguyên này chủ yếu là các protein màng ngoài (Omp) và kháng nguyên lông (TcpA). Trong đó các kháng nguyên 45kDa, 42kDa, 31kDa và 20kDa trùng với các kháng nguyên OmpS, OmpT, Omp-31kDa và TcpA được xem là những kháng nguyên dự tuyển vacxin tả. Có 6 kháng nguyên chung giữa 25 chủng với kích thước 79kDa, 62kDa, 45kDa, 35kDa, 31kDa và 20kDa. 7/25 chủng có các kháng nguyên giống với kháng nguyên của chủng V. cholerae I389 typ huyết thanh Inaba; 6/25 chủng có các kháng nguyên giống với kháng nguyên của cả hai chủng V.cholerae I389 và O395; 12/25 chủng có sự biến đổi thành phần kháng nguyên. Tuy nhiên, sự biến đổi này thực chất là sự thiếu hụt chứ không phải là sự xuất hiện các thành phần kháng nguyên mới. Các kết quả nghiên cứu này có thể được xem là nền tảng ban đầu cho các nghiên cứu về miễn dịch và dự phòng bệnh tả.
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Site-specific functionalization of antigen binding proteins for cellular delivery, imaging and target modulationSchumacher, Dominik 09 November 2017 (has links)
Antikörper und Antigen-bindende Proteine, die an Fluorophore, Tracer und Wirkstoffe konjugiert sind, sind einzigartige Moleküle, welche die Entwicklung wertvoller diagnostischer und therapeutischer Werkzeuge ermöglichen. Allerdings ist der Konjugationsschritt sehr anspruchsvoll und trotz intensiver Forschung noch immer ein bedeutender Engpass. Zusätzlich sind Antigen-bindende Proteine oftmals nicht dazu in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen und im Zellinneren nicht funktionsfähig. Daher ist ihre Verwendung auf extrazelluläre Targets beschränkt, was eine bedeutende Anzahl wichtiger Antigene vernachlässigt. Beide Limitierungen bilden Kernaspekte dieser Arbeit. Mit Tub-tag labeling wurde ein neuartiges und vielseitiges Verfahren für die ortsspezifische Funktionalisierung von Biomolekülen und Antigen-bindenden Proteinen entwickelt, und so die Palette der Proteinfunktionalisierungen bedeutend erweitert. Tub-tag wurde erfolgreich für die ortsspezifische Funktionalisierung verschiedener Proteine und Antigen-bindender Nanobodies angewendet, die für konfokale Mikroskopie, Proteinanreicherung und hochauflösende Mikroskopie eingesetzt wurden. In einem weiteren Projekt wurden zellpermeable Antigen-bindende Nanobodies hergestellt und somit das schon lange Zeit bestehende Ziel, intrazelluläre Targets durch in vitro funktionalisierte Antigen-bindende Proteine zu visualisieren und manipulieren, erreicht. Hierzu wurden zwei verschiedene Nanobodies an ihrem C-Terminus cyclischen zellpenetrierenden Peptiden unter Verwendung von Expressed Protein Ligation funktionalisiert. Diese Peptide ermöglichten die Endozytose-unabhängige Aufnahme der Nanobodies mit sofortiger Bioverfügbarkeit. Mit Tub-tag labeling und der Synthese von zellpermeablen Nanobodies konnten wichtige Bottlenecks im Bereich der Proteinfunktionalisierung und Antikörperforschung adressiert werden und neue Tools für die biochemische und zellbiologische Forschung entwickelt werden. / Antibodies and antigen binding proteins conjugated to fluorophores, tracers and drugs are powerful molecules that enabled the development of valuable diagnostic and therapeutic tools. However, the conjugation itself is highly challenging and despite intense research efforts remains a severe bottleneck. In addition to that, antibodies and antigen binding proteins are often not functional within cellular environments and unable to penetrate the cellular membrane. Therefore, their use is limited to extracellular targets leaving out a vast number of important antigens. Both limitations are core aspects of the presented thesis. With Tub-tag labeling, a novel and versatile method for the site-specific functionalization of biomolecules and antigen binding proteins was developed expanding the toolbox of protein functionalization. The method is based on the microtubule enzyme tubulin tyrosine ligase. Tub-tag labeling was successfully applied for the site-specific functionalization of different proteins including antigen binding nanobodies which enabled confocal microscopy, protein enrichment and super-resolution microscopy. In addition to that, cell permeable antigen binding nanobodies have been generated constituting a long thought goal of tracking and manipulating intracellular targets by in vitro functionalized antigen binding proteins. To achieve this goal, two different nanobodies were functionalized at their C-terminus with linear and cyclic cell-penetrating peptides using expressed protein ligation. These peptides triggered the endocytosis independent uptake of the nanobodies with immediate bioavailability. Taken together, Tub-tag labeling and the generation of cell-permeable antigen binding nanobodies strongly add to the functionalization of antibodies and their use in biochemistry, cell biology and beyond.
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