Orientador : Christiane Pienna Soares / Banca: Raquel Alves dos Santos / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Banca: André Gonzaga dos Santos / Banca: Luis Octávio Regasini / Resumo: As atividades biológicas e farmacológicas dos biflavonoides são diversas incluindo suas propriedades imunossupressivas, anticancerígenas, antioxidantes, antiangiogênicas, antibacterianas, antivirais e antifúngicas. No presente estudo, avaliou-se a potencial capacidade do biflavonoide morelloflavona, isolada de Garcinia xanthochymus, em modular a expressão de HLA-G (Human Leukocyte Antigen- G), bem como seu potencial efeito quimiopreventivo. Inicialmente, foi avaliado o índice de morte celular causado pela morelloflavona por meio do ensaio de Anexina V - Iodeto de proídio em PBMC (Células mononucleares do sangue periférico), o qual apresentou índices de morte celular significantes. Através da citometria de fluxo observou-se um aumento da expressão de HLA-G vinculado à membrana celular em linhagens de melanoma (FON) (p < 0,001). Pôde-se observar a indução de HLA-G solúvel em linhagens de melanoma transfectada (M8-HLA-G1) (p < 0,001), sem alteração para os demais tipos celulares estudados, pelo ensaio imunoenzimático- ELISA. A expressão de RNAm de HLA-G também foi induzida pela morelloflavona, observada pela RT- PCR, em células de melanoma M8 que não expressam HLA-G constitutivamente. Ainda, foi avaliada a atividade quimiopreventiva da morelloflavona. Observou-se a duplicação da atividade da enzima quinona redutase na linhagem de hepatocarcinoma celular (Hepa1c1c7) por meio do ensaio quinona redutase. Pelo ensaio do cometa foi possível verificar a capacidade genotóxica e antigenotóxica. Em relação à antigenotoxicidade, a morelloflavona causou dano de DNA no pré-tratamento. No pós-tratamento foi observado que a morelloflavona pode ter a capacidade de reverter danos de DNA causados pelo peróxido de hidrogênio. Sendo assim, os dados demonstrados revelam que a morelloflavona induz a expressão de HLA-G e possui efeito quimiopreventivo. / Abstract: The biological and pharmacological activities of biflavonoids are diverse, including their immunosuppressive, anticancer, antioxidant, antiangiogenic, antibacterial, antiviral and antifungal properties. In the present study we assessed the potential ability of morelloflavone, a biflavonoid isolated from Garcinia xanthochymus in modulating the expression of HLA-G (Human Leukocyte Antigen-G), as well as their potential chemopreventive effect. First, we measured the rate of cell death by morelloflavone using Annexin V - Propidium iodide assay in PBMC (peripheral blood mononuclear cells), which showed significant levels of cell death. By flow cytometry was observed the increased expression of HLA-G membrane bound in melanoma cells line (FON) (p < 0.001). Also, was observed the induction of HLA-G soluble in transfected melanoma cells line (M8-HLA-G1) (p < 0.001), with no change to other cell types studied by Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA. The expression of HLA-G mRNA was also induced by morelloflavone, observed by RT-PCR, in melanoma cells (M8) that do not express HLA-G constitutively. Still, we evaluated the chemopreventive activity of morelloflavone. We observed a doubling of quinone reductase enzyme activity in hepatocellular carcinoma cells line (Hepa1c1c7) by quinone reductase assay. By comet assay we were able to verify the genotoxic and antigenotoxic capacity. Regarding antigenotoxicity, morelloflavone caused DNA damage pre treatment. In the posttreatment was observed that morelloflavone may be capable of reversing DNA damage caused by hydrogen peroxide. Thus, the data show that morelloflavone induces the expression of HLA-G and has chemopreventive effect. / Doutor

Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araújo / Resumo: O uso de vegetais, especialmente as frutas, no tratamento de doenças é uma tradição popular altamente difundida. Vários trabalhos reportaram as propriedades farmacológicas e terapêuticas do maracujá como: sua ação calmante; a presença de biomoléculas importantes em sua constituição; e, também, o potencial de redução de hiperlipidemias, usando a casca do maracujá-amarelo. A proposta deste trabalho foi verificar em polpas de maracujá comercial (MC), e seus híbridos, BRS Rubi do Cerrado (MRC) e BRS Sol do Cerrado (MSC), o seu potencial antioxidante e a sua implicação no nível de colesterol plasmático, bem como, avaliações das suas propriedades bioquímicas e físico-químicas. Os resultados mostraram valores próximos de pH (pH ≈ 3,0) e, também, de valores energéticos (173,29 a 177,78 kcal.100gpolpa-1), considerando proteínas e lipídeos, para os três tipos de maracujá estudados. O MC apresentou maiores valores de proteínas (1,8 g.100gpolpa-1) e de açúcares totais (3,97 g.100gpolpa-1). O MRC apresentou maiores valores de compostos fenólicos totais nos extratos aquosos e etanólicos (44,62 e 52,49 EAGmg.100gpolpa-1, respectivamente); de flavonoides totais no extrato etanólico (8,46 EQmg.100gpolpa-1); e de vitamina C (20,44 EAAmg.100gpolpa-1). Os dados das análises fisiológicas mostraram: i) redução de ingestão de ração em todos os grupos, exceto os que receberam ração normal, e a maior redução foi no grupo tratado com MSC; ii) aumento da massa corporal dos animais, independente dos tra... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of vegetables, especially fruits , in the treatment of diseases is a popular tradition. Several studies have reported the pharmacological and therapeutic properties of passion fruit as: its calming action; the presence of important biomolecules in their constitutio n ; also the potential for the reduction of hyperlipidemias using the fruit peel of the yellow p assion. The purpose of this stud y was to verify in pulp of the passion fruit commercial (MC) and its hybrids BRS Rub y of the Cer rado (MRC) and BRS Sun of the Cerrado (M SC) their antioxidant potential and their implication in the plasma cholesterol level , as well as evaluations of their biochemical and physical chemicals properties . The results showed near values of the pH ( pH ≈ 3.0 ) and also energy values (173.29 to 177.78 kcal.100g pulp - 1 ), considering proteins and lipids, for the three types of passion fruit studied. The MC showed higher values of proteins (1.8 g.100g p ulp - 1 ) and of total sugars (3.97 g.100g p u lp - 1 ). The MRC presente d higher values of total phenolic compounds in the aqueous and ethanolic extracts (44.62 and 52.49 EAG mg .100g pulp - 1 , respectively); of total flavonoids in the ethanolic extract (8.46 EAA mg .100g pulp - 1 ); and vitamin C (20.44 EAA mg .100g pu lp - 1 ). Data from the physiological analyzes showed: i) reduction of dietary intake in all groups, except those receiving normal ration, and the largest reduction was in the group treated with M SC ; ii) increase... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Tiago Santana Balbuena / Banca: José Roberto Aparecido dos Santos Pinto / Banca: Alessandro de Mello Varani / Resumo: As mudanças climáticas globais podem alterar significativamente o metabolismo das células vegetais. Um cenário com alta concentração de CO2 atmosférico pode ser benéfico para plantas do tipo C3 devido ao estímulo à fixação de carbono. No entanto, esse aumento esperado na taxa de assimilação de carbono também pode aumentar a atividade e a expressão das enzimas envolvidas na cadeia de transporte de elétrons, resultando em maior acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Nesse trabalho, foi estudada a resposta do sistema antioxidante em cloroplastos de Eucalyptus urophylla cultivados sob altas concentrações de CO2. As plantas de E. urophylla expostas a alta concentração de CO2 (980 ppm) mostraram um aumento no fechamento estomático e pequena, mas significativa, indução do estresse oxidativo em relação as plantas cultivadas em concentração atmosférica de CO2. Entretanto, essas respostas não foram observadas quando as plantas foram cultivadas em concentração de CO2 igual a 680 ppm, cujo tratamento induziu abertura estomática. Através de uma abordagem de proteômica de descoberta, foram identificadas e detectadas 19 proteoformas antioxidantes cloroplastidiais e 2 proteoformas diferencialmente reguladas. Dentre essas, destacam-se uma proteoforma de ascorbato peroxidase e uma de superóxido dismutase, as quais estão possivelmente envolvidas na neutralização de espécies reativas de oxigênio após cultivo em atmosfera enriquecida com CO2, e que podem ser utilizadas como marcadores bioquími... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Global climate change can significantly alter plant cell metabolism. A higher atmospheric CO2 scenario may be beneficial for C3 plants through the stimulation of carbon fixation. However, this predicted increase in the rate of carbon assimilation may also increase the activity and expression of enzymes involved in the electron transport chain, resulting in higher accumulation of reactive oxygen species. Here, we studied the responses of the chloroplast antioxidant system of Eucalyptus urophylla plants cultivated under high-CO2 conditions. E. urophylla plants exposed to a high concentration (980 ppm) of CO2 showed an increase in stomatal closure and a small, but significant, induction of oxidative stress in relation to plants grown at atmospheric CO2 concentration. However, these responses were not observed at a CO2 concentration equal to 680 ppm, which induced stomatal aperture. With the discovery proteomics approach used herein, we identified 19 chloroplast antioxidant proteoforms and pinpointed 2 differentially regulated antioxidants proteoforms. We highlight an isoform of ascorbate peroxidase and one of superoxide dismutase, which are possibly involved in the neutralization of reactive oxygen species upon cultivation in a high CO2 atmosphere and could be used as biochemical markers of abiotic stress or as targets in genetic engineering programs. / Mestre

Gliomas são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. Os nucleotídeos da adenina são moléculas sinalizadoras no meio extracelular, envolvidas em importantes condições fisiológicas e patológicas. O ATP, neurotransmissor excitatório, e a adenosina, neuromoduladora, entre outros efeitos, podem induzir proliferação celular em linhagens de gliomas. Os eventos induzidos pelos nucleotídeos extracelulares são controlados pela ação das E-NTPDases, que hidrolisam o ATP até adenosina extracelularmente. Recentes estudos epidemiológicos têm sugerido que os flavonóides derivados da dieta, em particular a quercetina, apresentam um papel benéfico em prevenir ou inibir a tumorigênese. Assim, primeiramente nós avaliamos o efeito antiproliferativo da quercetina em linhagem de glioma humano U138MG. O estudo demonstrou que este flavonóide induziu em cultura de gliomas: (1) diminuição da proliferação e da viabilidade celular; (2) morte celular via necrose e apoptose; (3) parada no ciclo celular na fase G2 e (4) diminuição do índice mitótico. Além disso, nós demonstramos que a quercetina, enquanto promoveu regressão tumoral, protegeu culturas organotípicas hipocampais do dano isquêmico. Em conjunto, esses dados sugerem que a quercetina exibe efeitos antiproliferativos direcionados para as células tumorais e reduzida citotoxicidade para células normais, características altamente desejáveis na quimioterapia. Dados do nosso laboratório demonstram que o metabolismo extracelular das purinas encontra-se alterado em linhagens de gliomas com relação a culturas de astrócitos, sugerindo que mudanças no sistema purinérgico podem ser uma característica dos gliomas que potencialmente podem contribuir para o seu fenótipo de malignidade. Assim, o passo seguinte desse trabalho foi investigar o perfil de secreção dos derivados da adenina, o metabolismo extracelular do AMP e a ação da quercetina sobre o sistema purinérgico. As culturas de glioma apresentaram secreção de ATP, o qual foi detectado em maiores níveis com relação as outras moléculas avaliadas, ADP, AMP, adenosina e inosina. O AMP extracelular foi eficientemente metabolizado pelos gliomas, demonstrando uma ecto-5’-NT/CD73 muito ativa. Adicionalmente, quercetina interagiu com o sistema purinérgico, inibindo não-competitivamente a atividade da ecto-5’-NT/CD73 e modulando negativamente a sua expressão. Nós sugerimos que a inibição da atividade da ecto-5’-NT/CD73 pode resultar em um decréscimo na disponibilidade de adenosina extracelular, uma promotora tumoral. Tal efeito pode estar correlacionado com a inibição da proliferação promovida pela quercetina nessa linhagem de glioma. Nossos dados sugerem que a quercetina pode ter uma função importante na inibição da proliferação dos gliomas, atuando em diferentes vias de sinalização, incluindo o sistema purinérgico. Assim, esse estudo abre novas perspectivas para as potenciais aplicações dos flavonóides na prevenção e tratamento de tumores cerebrais.

Os estrógenos exercem diversas ações não reprodutivas em vários órgãos, incluindo o cérebro. Tem sido demonstrado que a privação estrogênica está implicada na patogênese de algumas doenças neurodegenerativas e na isquemia cerebral. Relatos da literatura sugerem que as mulheres menopáusicas são mais suscetíveis a esses distúrbios e ao déficit cognitivo do que as mulheres jovens. Entretanto, devido aos possíveis efeitos colaterais da terapia de reposição hormonal, tais como o câncer de mama e o aumento do risco a acidentes cerebrovasculares, cresce o número de terapias alternativas para tratar os sintomas associados à menopausa. No presente trabalho, nós investigamos o efeito da ovariectomia sobre alterações bioquímicas (Na+,K+-ATPase, colinesterases, gangliosídios e alguns parâmetros de estresse oxidativo) e comportamentais em ratas adultas. Também determinamos a ação do tratamento com as vitaminas E e C e da dieta de soja rica em isoflavonas sobre as alterações provocadas pela ovariectomia nos parâmetros estudados. Nossos resultados mostraram que a ovariectomia aumentou, significativamente, as atividades da acetilcolinesterase, Na+,K+-ATPase e catalase, e não alterou o conteúdo e o perfil dos gangliosídios, em cérebro de ratas adultas. A atividade da butirilcolinesterase sérica foi inibida pela ovariectomia. O aumento da atividade da acetilcolinesterase poderia diminuir os níveis de acetilcolina, levando à redução da transmissão colinérgica. Acreditamos que o aumento da atividade da Na+,K+-ATPase poderia provocar uma hiperpolarização da membrana sináptica. O aumento da atividade da catalase seria uma conseqüência do estresse oxidativo induzido pela ovariectomia. Além disso, estudos comportamentais mostraram que a ovariectomia causou um déficit na memória espacial em ratas adultas. Posteriormente, avaliamos o efeito do tratamento com as vitaminas E e C e da dieta de soja rica em isoflavonas sobre os parâmetros alterados pela ovariectomia. O tratamento crônico com as vitaminas E e C reverteu a ação da ovariectomia sobre as atividades da Na+,K+-ATPase e da acetilcolinesterase e sobre o déficit de memória espacial. As isoflavonas da soja reverteram a ativação da atividade da acetilcolinesterase causada pela ovariectomia e não alteraram a atividade da Na+,K+-ATPase. Ambos os tratamentos utilizados não modificaram a atividade da butirilcolinesterase sérica. Além disso, suplementação com isoflavonas da soja, a longo (60 dias) e a médio (30 dias) prazo, protegeram contra o déficit de memória espacial causado pela ovariectomia. Considerando que a modulação do receptor AMPA tem sido descrita como uma etapa necessária para a ativação de cascatas celulares durante o aprendizado e a formação da memória, nós também investigamos o efeito da ovariectomia e da administração das vitaminas E e C sobre a fosforilação de diferentes subunidades do receptor AMPA e a possível modulação da via ERK1/2-CREB no hipocampo. Nossos resultados mostraram que a ovariectomia aumentou os níveis de pGLU 2/3 Ser 880/891 e que o tratamento com os antioxidantes reverteu esse efeito. Não observamos modificação nos níveis de outras subunidades fosforiladas do receptor AMPA, nem na via de sinalização ERK1/2 – CREB. Esses resultados em conjunto, vi mostram alguns efeitos da depleção hormonal ovariana sobre alguns parâmetros bioquímicos e comportamentais e colaboram para o entendimento dos sintomas e distúrbios neurológicos observados em algumas mulheres menopáusicas. Além disso, se confirmado em humanos, nossos dados relacionados a suplementação com as vitaminas E e C e as isoflavonas da soja podem ser uma estratégia para tratar alguns sintomas associados à menopausa. / Estrogen also exerts diverse non-reproductive actions on multiple organs, including the brain, and it has been shown that estrogenic deprivation is implicated in the pathogenesis of neurodegenerative conditions and cerebral ischemia. There is a large body of literature to suggest that postmenopausal women are more vulnerable than younger women to such diseases and to cognitive deficits. However, due to the possible side effects of hormonal replacement therapy, such as breast cancer and increased risk of brain damages, there is a growing demand for alternative treatments of pathological processes and symptoms associated with menopause. In the present work, we investigated the effect of ovariectomy on biochemical parameters (Na+,K+- ATPase, cholinesterases and gangliosides), as well as on some parameters of oxidative stress and on spatial memory tasks. We also determined the actions of vitamins E and C or soy isoflavones on parameters altered by ovariectomy. Our results showed that ovariectomy increased significantly the activities of acetylcholinesterase, Na+, K+-ATPase and catalase, and did not alter the gangliosides content and profile, in brain of female adult rats. The activity of butyrylcholinesterase was inhibited by ovariectomy in serum. This effect on acetylcholinesterase activity could decrease acetylcholine levels, leading to reduction of cholinergic neurotransmission. The activation of Na+,K+-ATPase activity could cause hyperpolarization of synaptic membrane. Increased catalase activity could be a consequence of oxidative stress induced by ovariectomy. Besides, the present study reported an impairment of spatial navigation caused by ovariectomy in adult rats. Afterwards, we decided to evaluate the influence of vitamins E and C and soy isoflavone diet on parameters altered by ovariectomy. The treatment with vitamins E and C reversed the ovariectomy action on Na+,K+- ATPase and acetylcholinesterase activities and on spatial memory. The supplementation with soy isoflavones reversed the activation of acetylcholinestersase caused by ovariectomy and did not alter the incresead in Na+,K+-ATPase activity. Both treatments used in this study were unable to alter the inhibition of butyrylcholinesterase caused by ovariectomy. Besides, soy isoflavones diet, in the long term (60 days) and in the short term (30 days), protected against memory spatial deficit caused by ovariectomy. Considering that AMPA receptor modulation has been described as a necessary step to activation of cellular cascades during learning and memory formation, we also decided to investigate the effect of ovariectomy and the administration of vitamins E and C on the phosphorilation of different AMPAr subunits and on the possible modulation of the ERK1/2 – CREB signaling pathway in the hippocampus. Our results show that ovariectomy significantly increases the phosphorilation of AMPAr subunit pGLU 2/3 Ser 880/891 and the treatment with vitamins E plus C reverts this activation. We did not find any modification in the levels of other phosphorilated subunits of AMPAr and no changes were found in the levels of pERK1/2 and pCREB between groups showing that ovariectomy and the treatment with these antioxidants were unable to alter the ERK1/2 – CREB signaling pathway in the hippocampus. Taken together, our results show the effects of hormonal depletion on some biochemical viii and behavioral parameters and contribute to understand the symptoms and neurological dysfunction found in some menopausal women. Assuming the possibility that these phenomena may occur in humans, these dada are very encouraging, since vitamins E plus C and soy isoflavones may constitute a good alternative to a novel therapeutic strategy to block injurious effects associated to menopause.

Várias ervas culinárias e especiarias têm sido relatadas como fonte de agentes neuroprotetores inovadores com base na inibição da acetilcolinesterase (AChE), atividades antioxidante e anti-inflamatória. Neste contexto, estudos recentes têm demonstrado as propriedades neuroprotetoras de espécies da família Lamiaceae. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação antioxidante e neuroprotetora de Ocimum americanum Linn. (Lamiaceae, "alfavaca", "manjericão"), uma espécie de manjericão que é comumente utilizada como condimento. Fatias hipocampais de ratos jovens e envelhecidos foram incubadas com diferentes concentrações do extrato etanólico de Ocimum americanum (EEOA) e submetidas à lesão induzida por peróxido de hidrogênio (H2O2); a atividade mitocondrial e a liberação de lactato de desidrogenase (LDH) foram avaliadas. O efeito do tratamento agudo com EEOA sobre a memória aversiva de curta duração e parâmetros bioquímicos em hipocampo de ratos jovens também foi estudado. Além disso, o efeito da suplementação crônica com EEOA em vários parâmetros bioquímicos em hipocampo de ratos jovens e envelhecidos foi avaliado. O H2O2 reduziu significativamente a atividade mitocondrial em fatias hipocampais de ratos jovens e envelhecidos, e o EEOA reverteu esta redução em fatias hipocampais de ratos jovens. Além disso, o H2O2 aumentou a liberação de LDH por fatias hipocampais de ratos jovens, porém o EEOA reduziu a liberação de LDH em fatias hipocampais de ambas as idades. O tratamento agudo com EEOA não alterou a memória aversiva de curta duração, bem como o conteúdo de radicais livres no hipocampo. A administração de dimetil sulfóxido (DMSO) aumentou a lipoperoxidação (LPO), enquanto que a administração aguda do EEOA (gavagem) reverteu o efeito do DMSO. Observou-se um aumento no conteúdo de radicais livres, mas não houve alterações na LPO no hipocampo de ratos envelhecidos. No entanto, a suplementação crônica com o EEOA diminuiu os níveis de radicais livres e a LPO em ratos envelhecidos. Além disso, a suplementação crônica com o EEOA reduziu o conteúdo de TNF-α no hipocampo de ratos jovens e envelhecidos e diminuiu os níveis de IL-1β em ratos jovens. O tratamento agudo com o EEOA e a suplementação crônica não alteraram a atividade da AChE no hipocampo. Nossos resultados sugerem que o EEOA contém compostos neuroprotetores. Podemos propor que as propriedades antioxidantes, bem como a modulação do processo de neuroinflamação, podem estar relacionadas com o efeito neuroprotetor. / Several culinary herbs and spices have been reported as source of innovative neuroprotective agents based on acetylcholinesterase (AChE) inhibition, antioxidant and anti-inflammatory activities. In this context, recent studies have shown the neuroprotective properties of species of the Lamiaceae family. The aim of this study was to evaluate the antioxidant and neuroprotective action of Ocimum americanum Linn. (Lamiaceae, “alfavaca”, “manjericão”), a basil species which is commonly used for seasoning. Hippocampal slices from young and aged rats were incubated with different concentrations of ethanol extract of Ocimum americanum (EEOA) and submitted to H2O2-induced injury; mitochondrial activity and lactate dehydrogenase (LDH) release were evaluated. The effect of acute treatment with EEOA on short-term aversive memory and biochemical parameters in hippocampus from young rats was also studied. In addition, the effect of chronic supplementation of EEOA on several biochemical parameters in hippocampus from young and aged rats was evaluated. The H2O2 significantly impaired mitochondrial activity in hippocampal slices from young and aged rats, and EEOA reversed this impaired in young rats. Besides, H2O2 enhanced LDH released by hippocampal slices in young rats; however the EEOA reduced the LDH released in both ages. The acute treatment with EEOA did not alter short-term aversive memory, as well as the content of free radicals in the hippocampus. The administration of the dimethyl sulfoxide (DMSO) increased the lipid peroxidation (LPO) whereas the acute administration of EEOA (gavage) reversed the DMSO effect. We observed an increased in free radicals content while there was no changes on LPO in hippocampus from aged rats. However, the chronic supplementation with EEOA decreased the free radical levels and LPO in aged rats. Moreover, EEOA chronic supplementation reduced TNF-α content in the hippocampus from young and aged rats and decreased IL-1β levels in young rats. The acute treatment with EEOA and the chronic supplementation did not alter AChE activity in hippocampus. Our findings suggest that the EEOA contains neuroprotective compounds. We can propose that the antioxidant properties, as well as the modulation on neuroinflammation process, can be related to neuroprotective effect.

O estresse oxidativo tem um papel importante no desenvolvimento de diferentes doenças inflamatórias agudas, mas intervenções que diminuem a geração ou os efeitos das espécies reativas de oxigênio têm papel controvérsio em modelos animais e humanos. Neste trabalho avaliamos os efeitos de uma combinação de antioxidantes (N-acetilcisteína e deferoxamina) em diferentes modelos animais de doenças inflamatórias agudas: sepse induzida por ligação cecal e perfuração (CLP), insuficiência hepática aguda e lesão pulmonar aguda. No modelo de CLP os ratos tratados com antioxidantes apresentaram uma significativa redução na atividade de mieloperoxidase (como marcador de infiltração neutrofílica) e uma menor quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico em diferentes órgãos envolvidos na resposta à sepse.A produção mitocondrial de superóxido foi significativamente diminuída pelo tratamento antixodante. Além disto o tratamento melhora o equilíbrio entre superóxido dismutase e catalase e melhora a sobrevida dos animais submetidos a CLP. No modelo de insuficiência hepática aguda o tratamento com antioxidantes significativamente diminui o dano oxidativo hepático e no sistema nervoso central, atenua marcadores de insuficiência hepática e melhora a sobrevida dos animais. No modelo de lesão pulmonar aguda o tratamento com N-acetilcisteína e deferoxamina diminui o conteúdo de proteínas do lavado bronco-alveolar, assim como o influxo de células inflamatórias, marcadores de dano oxidativo e citocinas inflamatórias.Em conclusão, nossos dados demonstram pela primeira vez que o tratamento com N-acetilcisteína e deferoxamina é superior ao uso isolado destes antioxidantes em diferentes modelos animais de doenças inflamatórias agudas. Este efeitos é parcialmentesecundário a uma diminuição do estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e resposta inflamatória no rato. / Oxidative stress plays an important role in the development of acute inflammatory diseases, but interventions that reduce the generation or the effects of reactive oxygen species exert controversial effects in animal models and in humans. Here we have evaluated the effects of a combination of antioxidants (N-acetylcysteine plus deferoxamine) in a murine model of polymicrobial sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), in a murine model of acute hepatic failure and in a murine model of acute lung injury. In the CLP model of sepsis rats treated with antioxidants had significantly lower myeloperoxidase activity (as an index of neutrophil infiltration) and thiobarbituric acid reactive species formation in several organs involved in septic response. Mitochondrial superoxide production was significantly reduced by antioxidant treatment. Furthermore, antioxidants significantly improved the balance between catalase and superoxide dismutase activities, and improved survival to 66%. In the acute hepatic failure model, N-acetylcysteine plus deferoxamine treatment significantly attenuated hepatic and central nervous system oxidative damage, attenuated markers of hepatic failure and improves survival to 80%. In the acute lung injury model, N-acetylcysteine plus deferoxamine decreased bronchoalveolar lavage fluid protein, inflammatory cells, oxidative damage variables, and proinflammatory cytokines. In conclusion, our data provide the first experimental demonstration that N-acetylcysteine plus deferoxamine is superior to each antioxidant used alone in different animal models of acute inflammatory diseases. This effect is partially secondary to a decrease in oxidative stress, mitochondrial dysfunction and inflammatory response in the rat.

O antioxidante resveratrol, uma fitoalexina encontrada, principalmente em uvas e também em quantidades significativas em vários tipos de vinho tinto, é um promissor produto natural, com atividades antitumoral, cardioprotetora e neuroprotetora. O objetivo do presente estudo foi investigar em células de glioma C6 o efeito do resveratrol sobre proliferação celular e alguns parâmetros específicos relacionados a astrócitos (captação de glutamato, glutamina sintetase e secreção de S100B), comumente associados com o papel protetor dessas células. Além disso, foi investigado o efeito genoprotetor do resveratrol em condições de estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio (H2O2) em células C6. A proliferação celular foi significativamente reduzida após tratamento com 100 e 250 μM de resveratrol. Uma rápida incubação com resveratrol (1 h) induziu um aumento linear na captação de glutamato e na atividade da glutamina sintetase. O dano ao DNA foi medido pelo ensaio Cometa. Para investigar os efeitos do resveratrol sobre o dano ao DNA induzido por H2O2 utilizou-se dois modelos de indução de estresse oxidativo. A mudança de parâmetros gliais pode contribuir para o papel protetor de astrócitos em condições de injúria cerebral, reforçando o uso deste composto no arsenal terapêutico contra doenças neurodegenerativas e desordens isquêmicas. Resveratrol também foi capaz de prevenir o dano oxidativo ao DNA celular, provavelmente, devido a suas propriedades antioxidantes, isto pode ser importante para proteger o DNA em doenças relacionadas com estresse oxidativo. / The antioxidant resveratrol, a phytoalexin found mainly in grapes and also substantial amounts in several types of red wine, is a promising natural product with anticancer, cardio-protective and neuroprotective activities. The objective of the present study was to investigate in C6 glioma cells, the effect of resveratrol on cell proliferation, cell death and some specific parameters of astrocyte activity (glutamate uptake, glutamine synthetase and secretion of S100B) commonly associated with the protective role of these cells. Furthermore, it was investigated the genoprotective effects of resveratrol under conditions of oxidative stress induced by hydrogen peroxide (H2O2) in C6 cells. Cell proliferation was significantly decreased following treatment with 100 and 250 μM resveratrol. Short-term (1 h) of resveratrol exposure induced a linear increase in glutamate uptake and in glutamine synthetase activity. DNA damage was assessed by the comet assay. For investigate the effects of resveratrol against oxidative stress induced by H2O2 on DNA damage, two models of oxidative stress induction were used. Changes in glial activities can contribute to the protective role of astrocytes in brain injury conditions, reinforcing the use of this compound in the therapeutic arsenal against neurodegenerative diseases and ischemic disorders. Resveratrol was able to prevent oxidative damage to cellular DNA, probably, due to its antioxidant properties, it may be important in diseases for protecting against DNA damage through oxidative stress.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:47:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213495.pdf: 1985309 bytes, checksum: 628d08b3cd5a9cb6428edba5865ae12a (MD5) / A medicina popular tem-se utilizado de plantas para o tratamento das mais diversas patologias, entretanto faz-se necessário estudos embasados cientificamente que corroborem com os relatos etnobotânicos e etnofarmacológicos. A fim de resgatar a cultura popular, bem como, valorizar a biodiversidade do bioma Mata Atlântica, especialmente a Reserva da Juréia/SP, objetivou-se neste trabalho submeter o extrato bruto e frações de Ouratea parviflora, Polymnia sonchifolia e Marlierea obscura (popularmente utilizadas como antiinflamatórias), a ensaios in vitro e in vivo para avaliação do potencial antioxidante e antiinflamatório. A avaliação in vitro do potencial antioxidante fez-se pelos métodos de captação do radical DPPH, O2·- e ·OH, além da lipoperoxidação. A avaliação in vivo do estresse oxidativo (fragmentação do DNA, lipoperoxidação de membranas e carbonilação de proteínas) e as defesas antioxidantes (concentração de GSH, atividade da CAT, GST) foi realizada em camundongos pré-tratados com OPEB, OP4 e posteriormente expostos ao CCl4. Para a avaliação da atividade antiinflamatória selecionou-se os extratos e frações que apresentaram melhor atividade antioxidante, sendo estes OPEB, OP4, PSEB e MO3. Para tanto, aplicou-se o ensaio do edema de pata induzido pela carragenina em camundongos. Os extratos e frações das referidas plantas apresentaram significativa atividade antioxidante in vitro, destacando-se a Ouratea parviflora (OPEB, OP4), pois foram capazes de causar o "scavenger" de radicais DPPH, O2·- e ·OH em concentrações por vezes menores ou similares à rutina, reconhecido agente antioxidante. O CCl4 causou estresse oxidativo e dano celular ao fígado dos camundongos, onde a rutina, OPEB e OP4 apresentaram importante atividade na proteção tecidual comprovada pelos ensaios FOX, dano ao DNA, oxidação proteica, redução da GSH e elevação da AST (exceto OPEB), elevação da CAT, GST e ALT. Embora nos tempos 60 e 120 minutos, tenha ocorrido uma tendência de inibição do edema pelo tratamento prévio com as plantas medicinais (300 mg/Kg) via oral, a análise estatística não revelou diferenças significativas entre os diferentes tratamentos. Apesar disso, o aparente efeito antiedematogênico exibido por OP4 e MO3 vem de encontro aos resultados obtidos nos ensaios referentes à atividade antioxidade, especialmente o ·OH, radical envolvido no processo inflamatório. Os dados obtidos permitem concluir que os produtos de Ouratea parviflora, particularmente OPEB e OP4, poderiam se constituir em protótipos para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para o tratamento patologias associadas a geração de EROs, uma vez que demonstraram importante potencial antioxidante in vitro e in vivo. A atividade antiinflamatória de Ouratea parviflora, Polymnia sonchifolia e Marlierea obscura não pode ser confirmada através do modelo experimental do edema de pata induzido pela carragenina.