La compréhension récente des mécanismes impliqués dans l’échappement tumoral au système immunitaire est fondamentale. En effet, cela a permis le développement de nouvelles immunothérapies à l’origine de réponses prolongées chez les patients atteints par plusieurs types de cancers. Cependant, une majorité de patients répondent insuffisamment ou rechutent. Il est donc indispensable d’identifier les mécanismes de résistances aux immunothérapies, et de nouvelles cibles permettant d’augmenter l’activité de ces thérapeutiques.La Neuropiline-1 (Nrp1) est une glycoprotéine transmembranaire indispensable à de nombreux processus physiologiques tels que l’angiogénèse et la guidance axonale. Nous avons montré dans le laboratoire qu’elle était exprimée dans le système immunitaire, lors de la synapse immunologique puis sur les cellules T conventionnelles activées.L’objectif de ce travail était d’étudier le rôle de la Nrp1 dans la réponse anti tumorale des lymphocytes T CD8+ chez la souris et chez l’homme.Nous avons montré que la délétion de Nrp1 sur les cellules T CD8+ murines augmente la réponse anti tumorale et diminue la croissance tumorale. Les cellules T CD8+ murines délétées pour la Nrp1 ont des capacités effectrices augmentées. La Nrp1 ne pouvant pas signaliser de manière autonome, nous avons montré qu’elle forme un complexe avec PD-1 chez la souris et chez l’homme et qu’elle en module son activité. Enfin, nous avons observé un effet synergique entre l’inhibition de Nrp1 et de PD1 chez la souris, ouvrant la possibilité d’une efficacité clinique chez les patients. / T follicular helper (Tfh) cells play an essential role in the development of antigen-specific B cell immunity. Tfh cells regulate the differentiation and survival of activated B cells outside and inside germinal centers (GC) of secondary lymphoid organs. They act through cognate contacts with antigen-presenting B cells, but there is no current marker to specifically identify those Tfh cells which productively interact with B cells. Here we show that neuropilin 1 (Nrp1), a cell surface receptor, is selectively expressed by a subset of Tfh cells in human secondary lymphoid organs. Nrp1 expression on Tfh cells correlates with B cell differentiation in vivo and in vitro, is transient, and can be induced upon co-culture with autologous memory B cells in a cell contact-dependent manner. Comparative analysis of ex vivo Nrp1+ and Nrp1- Tfh cells reveals gene expression modulation during activation. Finally, Nrp1 is expressed by malignant Tfh-like cells in a severe case of angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) associated with elevated terminal B cell differentiation. Thus, Nrp1 is a specific marker of Tfh cells cognate activation in humans, which may prove useful as a prognostic factor and a therapeutic target in neoplastic diseases associated with Tfh cells activity.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Epidemiological studies have suggested that intake of fruits and vegetables act in the prevention of several diseases such as cancer and cardiovascular diseases. This can be explained by these bioactive compounds are present in their food nutritional matrix that may have different biological activities, including antioxidant, antitumor, genoprotective and in preventing the oxidation of LDL. However, much of the fruit remains to be studied. This is the case of Solanum sessiliflorum popularly known as mana-cubiu or cubíu fruit coming from the Amazon region of Brazil, considered the "Amazonian apple". This fruit is popularly used as a medicine to control the itching of the skin and reducing cholesterol levels, glucose and uric acid in the blood. Once S. sessiliflorum studies are still incomplete, the aim of this study was to chemically characterize the extract and perform tests to determine their prospecting potential antioxidant, antitumoral and effect in vitro on preventing the oxidation of LDL. For this, the study was conducted in two stages, the first stage was prepared hydroalcoholic extract of the peel and seed and pulp. After preparation of the extract, the chemical characterization was conducted by the same determination of total bioactive compounds (flavonoids, tannins and polyphenols), then the extract was chemically characterized by high performance liquid chromatography (HPLC). In the second step, we evaluated the antioxidant potential and in citoprotetor in and in PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) and human plasma exposed to hydrogen peroxide (H2O2). We also evaluated the antitumor activity in lines of breast (MCF7) and colorectal (HT29) cancer cell cancer, assessing cell proliferation and viability. After this, the effect has been evalueted on the oxidation of LDL (isolated from healthy individuals). The results obtained indicate that the extract of Solanum sessiliflorum presents in its composition total bioactive compounds such as flavonoids, tannins and polyphenols. These results corroborate the analysis performed by HPLC which indicated that the extracts present in its composition gallic acid, caffeic acid, quercetin, rutin, β carotene and catechin (the latter except in the pulp and seed extract). When examined the in vitro antioxidant effect was observed that extracts at different concentrations did not show any pro-oxidant potential. However extract the pulp and the seeds had antioxidant and cytoprotective activity. It was also observed that the extract of the pulp and the seeds had antigenotoxic and specific antitumor activity for colorectal cancer cells (in vitro tests performed with strain HT29 cells), and no antitumor activity was observed for breast cancer cells (MCF7), instead of the expected high concentrations in the extract increased the viability and proliferation. Another important finding was that both extracts, seeds and pulp and peel showed potential for inhibiting oxidation of LDL. In synthesis, the in vitro results obtained data indicate that S. sessiliflorum has antioxidant, antitumor and citoprotetor activity and present potential to inhibit the oxidation of LDL. These results should be proof of the presence of bioactive compounds in its composition as flavonoids, polyphenols and catechins. In literature there are several studies that report that eating foods rich in these types of compounds are related to the prevention of several chronic diseases, such as cancer and cardiovascular diseases. / Estudos epidemiológicos têm sugerido que a ingestão de frutas e verduras atuam na prevenção de diversas patologias, tais como o câncer e doenças cardiovasculares. Isto pode ser explicado por estes alimentos apresentarem compostos bioativos na sua matriz nutricional que podem ter diversas atividades biológicas, incluindo atividade antioxidante, antitumoral, genoprotetor e na prevenção da oxidação do LDL. Entretanto, uma grande parte dos frutos ainda precisa ser estudada. Este é o caso do Solanum sessiliflorum popularmente conhecido como mana-cubiu ou cubíu fruto oriundo da região amazônica do Brasil, considerado a maçã amazônica que é popularmente utilizado como medicamento no controle do prurido da pele e na redução dos níveis de colesterol, glicose e ácido úrico no sangue. Uma vez que estudos sobre o S. sessiliflorum são ainda incipientes, o objetivo deste estudo foi caracterizar quimicamente o extrato de S. sessiliflorum e realizar ensaios de prospecção para determinar seu potencial efeito antioxidante, antitumoral e na prevenção da oxidação do colesterol LDL através de ensaios in vitro. Para isto, o estudo foi conduzido em duas etapas, na primeira etapa foram preparados dois extratos hidroalcóolicos 1) da casca e 2) da semente e polpa do S. sessiliflorum. Após preparo do extrato, foi conduzida a caracterização química do mesmo através da determinação de compostos bioativos totais (flavonoides, taninos e polifenóis), em seguida, o extrato foi caracterizado quimicamente por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Na segunda etapa, foi avaliado o potencial antioxidante e citoprotetor em plasma humano exposto ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e também em PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells). Também foi verificada a atividade antitumoral em linhagens de célula de câncer de mama (MCF7) e de câncer de colorretal (HT29), avaliando a proliferação e a viabilidade celular. Após, foi avaliado o efeito na oxidação do LDL (isolado de indivíduos saudáveis). Os resultados obtidos indicam que o extrato de Solanum sessiliflorum apresenta em sua composição compostos bioativos totais como os flavonóides, taninos e polifenóis. Estes resultados corroboram com as análises realizadas por CLAE que indicaram que os extratos apresentam em sua composição ácido gálico, ácido caféico, quercetina, rutina, β-caroteno e catequina (este último exceto no extrato de polpa e semente). Quando analisado o efeito antioxidante in vitro foi observado que os extratos nas concentrações testadas não apresentaram potencial pró-oxidante. No entanto o extrato da polpa e da semente apresentou atividade antioxidante e citoprotetora. Também foi observado que o extrato da polpa e da semente apresentou atividade antigenotóxica e antitumoral específica para células de câncer de colorretal (teste in vitro realizado com linhagem de células HT29), e não foi observado atividade antitumoral em relação à linhagem de células de câncer de mama (MCF7), pelo contrário do esperado, em altas concentrações o extrato aumentou a viabilidade e a proliferação celular. Outro importante achado foi que ambos os extratos, semente e polpa e casca apresentaram potencial de inibição da oxidação do LDL. Em síntese, os dados obtidos nos experimentos in vitro indicam que o S. sessiliflorum apresenta atividade antioxidante, antitumoral, antigenotóxica e potencial de inibir a oxidação do LDL. Estes resultados devem-se a presença de compostos bioativos em sua composição como flavonóides, polifenóis e catequina. Na literatura há diversos estudos que relatam que a ingestão de alimentos ricos nestes tipos de compostos está relacionada à prevenção de diversas doenças crônicas, como o câncer e doenças cardiovasculares.

El cisplatí, PtCl2(NH3)2, ha estat una de les drogues més utilitzades en la quimioteràpia del càncer des del descobriment de la seva activitat. Però degut a la seva alta toxicitat i greus efectes secundaris, s'han sintetitzat nous compostos amb la finalitat de reduir aquests inconvenients.En aquest sentit, el treball desenvolupat en aquesta tesi doctoral ha estat la síntesi i caracterització de tretze complexos de Pt(II) amb la finalitat d'estudiar llur activitat antitumoral. Aquests complexos presenten unes característiques estructurals comunes: geometria cis, dos lligands làbils de tipus clorur i un lligand diaminoquelatant derivat dels àcids d,l-2,3-diaminopropiònic (Hdap) i d,l-2,4-diaminobutíric (Hdab). S'han dissenyat unes estratègies sintètiques a partir de les quals els lligands han estat funcionalitzats amb diferents grups de tipus éster, aminoàcid i peptídic: Etdap·2HCl, Etdab·2HCl, [(dap-Metala)·2CF3COOH], [(dab-Metala)·2CF3COOH], [(dap-phe)·2CF3COOH], [(dab-phe)·2CF3COOH], [(dap-Mettrp)·2CF3COOH], [(dab-Mettrp)·2CF3COOH], [(dap-ASTTTNYT-NH2)·2CF3COOH], essent Metala= éster metílic de L-alanina, phe= L-fenilalanina, Mettrp= éster metílic del L-triptofà. Aquests lligands diaminoquelatants s'han utilitzat per sintetitzar els corresponents complexos de Pt(II): PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dab-phe), PtCl2(dap-Mettrp), PtCl2(dab-Mettrp), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2).A través de diferents tècniques i assaigs biològics (dicroisme circular, electroforesi en gel d'agarosa, microscopia de forces atòmiques, citometria de flux, assaigs de proliferació cel·lular) s'ha pogut demostrar l'activitat antitumoral d'aquests compostos. A través de la tècnica de dicroisme circular (DC) s'ha pogut demostrar que els lligands lliures no interaccionen covalentment amb el DNA de Calf Thymus i no modifiquen l'estructura secundària de la doble hèlix. En canvi, els respectius complexos han demostrat tenir capacitat per interaccionar amb el DNA i modificar la seva estructura secundària. Els complexos PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab) i PtCl2(dab-phe) mostren un comportament similar al cisplatí, generant adductes cis-bifuncionals que distorcionen la doble hèlix de forma no desnaturalitzant amb obertura de la doble cadena. Els complexos PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) quan interaccionen amb el DNA generen un canvi en la conformació del DNA de la forma B a la forma C, produint-se un augment de la curvatura de l'hèlix per rotació de les bases nitrogenades. En aquests estudis s'ha comprovat que l'estructura del complex influeix en l'efecte generat sobre l'estructura secundària de l'àcid nucleic. En primer lloc, existeix una diferència en el comportament en funció del tamany del lligand diaminoquelatant, de manera que els complexos amb el lligand (dab) provoquen un efecte més remarcable. També s'observa aquest canvi de comportament al passar dels complexos que tenen el grup funcional esterificat als que el tenen protonat. D'aquesta manera, s'observa un major efecte sobre l'estructura secundària del DNA en aquells complexos que tenen el lligand diaminoquelatant de tres metilens (dab) i amb el grup carboxilat terminal protonat.Per tal de modelitzar la interacció d'aquests complexos amb el DNA, s'ha estudiat la interacció d'aquests compostos de Pt(II) amb 5'-GMP a través de RMN-1H, observant la variació dels senyals corresponents al H8 de 5'-GMP. Així s'ha pogut demostrar que aquests compostos interaccionen amb la 5'-GMP a través d'un enllaç covalent Pt-N7, de la mateixa manera a com interacciona el cisplatí.A través d'electroforesi en gel d'agarosa i microscopia de forces atòmiques (AFM) s'ha pogut determinar l'efecte que generen els lligands lliures i els respectius complexos de Pt(II) sobre l'estructura terciària del plasmidi pBR322. Els lligands provoquen un augment de l'agregació de les molècules de DNA i un lleuger augment de la compactació de l'estructura terciària. Aquests resultats s'atribueixen a la capacitat d'aquests compostos a interaccionar per pont d'hidrogen amb el DNA. Els corresponents complexos de Pt(II) provoquen un augment de l'agregació i una important compactació, degut per una banda a la capacitat de l'àtom de Pt a interaccionar covalentment amb el DNA, i per altra banda, a la capacitat del lligand a interaccionar per pont d'hidrogen amb l'àcid nucleic.Finalment s'ha estudiat l'activitat citotòxica d'aquests complexos de Pt(II) en diferents línies cel·lulars: A431 (línia de carcinoma epidermoide), HeLa (línia de carcinoma de coll d'úter) i HL-60 (línia promielocítica de leucèmia). Els complexos moderadament solubles en aigua, PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe) i PtCl2(dab-phe), han demostrat ser actius. L'activitat depèn de la concentració de complex, del temps d'incubació i de la línia cel·lular. Per temps d'incubació alts i concentracions de complex elevades s'observa la màxima activitat. Els complexos de l'alanina, PtCl2(dap-ala) i PtCl2(dab-ala), són els que mostren més activitat, mentre que els compostos de la fenilalanina són els menys actius, degut probablement a la voluminositat del lligand, la qual pot impedir o dificultar el transport del compost a través de la membrana cel·lular.L'activitat citotòxica dels complexos insolubles en aigua, PtCl2(Etdap) i PtCl2(Etdab), queda bloquejada per l'elevada concentració de DMSO (12%) necessària per solubilitzar els compostos. Aquests resultats permeten deduir que la presència d'un 12% de DMSO anul·la l'activitat d'aquests complexos, ja que el DMSO pot coordinar-se amb el Pt ocupant les posicions làbils del complex i evitant que es pugui coordinar amb el DNA.Els assaigs de proliferació cel·lular del complex PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) i del pèptid lliure ASTTTNYT-NH2 han demostrat que ambdós compostos són actius. Tot i això, l'activitat del complex és superior a la del pèptid lliure, ja que el Pt pot interaccionar covalentment amb el DNA i augmentar l'efecte citotòxic. Per tant, el complex presenta un lligand portador biològicament actiu que pot transportar el metall a través de la membrana cel·lular i facilitar així la seva interacció amb el DNA.A través de la tècnica de citometria de flux s'ha comprovat que en tots els casos la mort cel·lular produïda pels complexos ha estat per apoptosi.Per últim, s'ha sintetitzat i caracteritzat un complex trinuclear de Pt(II), {[Pt(Me2Bpy)2][PtCl2(Me2Bpy)]2}, essent Me2Bpy= 4,4'-dimetil-2,2'-dipiridil. La resolució de la seva estructura per difracció de Raig-X ha permès determinar l'existència d'una interacció intramolecular Pt-Pt de 3.474 Å. / Cisplatin, PtCl2(NH3)2, has been one of the most used drugs for the cancer chemotherapy. However, due to its high toxicity and important side effects, new complexes have been synthesized in order to reduce these disadvantages.In that way, the work presented in this thesis is the synthesis and characterization of 13 Pt(II) complexes in order to study their antitumor activity. These complexes present some common traits: cis geometry, two labile chloride ligands, and one diamine chelating ligand derived from d,l-2,3-diaminopropionic acid (Hdap) and d,l-2,4-diaminobutyric acid (Hdab). These ligands have been derived using new synthetic strategies with different functional groups as ester, aminoacid and peptide type: Etdap·2HCl, Etdab·2HCl, [(dap-Metala)·2CF3COOH], [(dab-Metala)·2CF3COOH], [(dap-phe)·2CF3COOH], [(dab-phe)·2CF3COOH], [(dap-Mettrp)·2CF3COOH], [(dab-Mettrp)·2CF3COOH], [(dap-ASTTTNYT-NH2)·2CF3COOH], being Metala= methyl ester of L-alanine, phe= L-phenylalanine and Mettrp= methyl ester of L-triptophan. These ligands have been used for preparing the following Pt(II) complexes: PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dab-phe), PtCl2(dap-Mettrp), PtCl2(dab-Mettrp), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2).Using different techniques and biologic assays (circular dichroism, agarose gel electrophoresis, atomic force microscopy, flow cytometry, cell proliferation assays) the antitumor activity of these complexes has been demonstrated.With circular dichroism it has been demonstrated that free ligands do not covalently bind Calf Thymus-DNA and do not modify its secondary structure. In constrast, the corresponding Pt(II) complexes are able to interact with DNA and modify its secondary structure. Complexes PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab) and PtCl2(dab-phe) behave in the same direction as cisplatin, forming cis-bifunctional intrastrand adducts that probably open the double helix. The other complexes, PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2), interact with DNA generating a BC transformation with increasing winding of the double helix by rotation of the bases. The influence of the complex structure in the effect on the secondary structure of DNA has been proved. Firstly, a difference in the behaviour exists depending on the ring size, so complexes with (dab) ligand cause bigger modifications. This kind of behaviour is also seen between complexes with ester groups at the C-terminus and complexes with carboxylic group. Thus, there is a greater effect in the secondary structure of the DNA in those complexes that have the (dab) ligand and a protonated carboxylate group.The interaction between the platinum complexes and 5'-GMP has been studied by 1H-NMR, following the variation of H8 signals from 5'-GMP. It has been demonstrated that all complexes covalently interact with 5'-GMP through the N7 of the base, as cisplatin do.The effect generated by free ligands and their Pt(II) complexes in the tertiary structure of pBR322 DNA has been determined by agarose gel electrophoresis and atomic force microscopy (AFM). Generally, the free ligands studied generate an increase of DNA aggregation and a slight coiling of the double helix, due to their possibility of forming hydrogen bonds with the DNA bases through different functional groups of their structure. The Pt(II) complexes generate an important coiling and aggregation of DNA, probably due to the covalent binding Pt-DNA and hydrogen bond interactions through their ligands.The cytotoxic activity of the Pt(II) complexes has been evaluated through cell proliferation assays in A431, HeLa and HL-60 cell lines using different incubation times (24h, 48h, 72h). The water-soluble complexes, PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe) i PtCl2(dab-phe), show antitumor activity in a dose- and time- dependent manner, gradually decreasing the cell survival percentage when the complex concentration increase, in the same direction as carboplatin. All these complexes present the highest activity at long incubation times and high complex concentration. The alanine complexes, PtCl2(dap-ala) and PtCl2(dab-ala) are the most active and those of phenylalanine are the less active, probably due to the ligand size, which can make its transport through cell membrane more difficult.The water-insoluble complexes, PtCl2(Etdap) and PtCl2(Etdab), apparently do not show antitumor activity due to the presence of 12% DMSO necessary por solving these complexes. In these conditions they do not cause a decrease in cell survival. The DMSO could interact with platinum, displacing the labile ligands of the complex and not allowing it to interact with DNA. Complex PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) is also insoluble in water, but can be dissolved in 2% DMSO solution. Cell proliferation assays show that the free peptide, ASTTTNYT-NH2, and the platinum complex are both active. The activity of the complex is higher than the free peptide, probably because platinum can covalently interact with DNA and increase the cytotoxic effect. This result suggest that the ligand can act as a carrier ligand and make the interaction metal-DNA be easier.Flow cytometry assays have demonstrated that cell death generated by the complexes synthesized is apoptosis. Agarose gel electrophoresis of extracted DNA show a classical 200-base pair integer oligonucleosome ladder.A new trinuclear Pt(II) complex, {[Pt(Me2Bpy)2][PtCl2(Me2Bpy)]2} being Me2Bpy= 4,4'-dimethyl-2,2'-dipyridyl, has been synthesized and characterized. The X-ray diffraction of its structure shows the existence of an intramolecular Pt-Pt interaction of 3.474 Å.

In this work we report that potato carboxypeptidase inhibitor suppresses the growth of several human and mouse pancreatic adenocarcinoma cell lines. The inhibitor also reduces the growth of solid tumors obtained by subcutaneous injection of human adenocarcinoma cell line in nude mice and the appearance of metastasis in mice injected intraesplenically with B16H10 melanoma cells. A transgenic line has been characterized, mice develop choroid plexus carcicomas and insulinomas. Lifespan of animals immunized with PCI I s significantly higher than control mice. To further characterize the effects of PCI on tumor cell growth, analyses of cell cycle phase distribution have been performed. A significant increase in the G0/G1 phase is also detected. This finding is correlated with an increase in the mRNA expression of p53. Moreover, we have demonstrated that PCI is easily internalized by the cells and the inhibitor remain altered after the internalization / En el presente trabajo se ha demostrado que el inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI) tiene un efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral tanto in vitro como in vivo, y se ha estudiado su mecanismo de acción, lo que ha llevado a descubrir que el PCI es un antagonista del EGF. Con dicho fin se han utilizado técnicas de cultivo celular en conjunción con técnicas bioquímicas, de biología molecular, de análisis computacional y ensayos con modelos animales / En el present treball s’ha demostrat que l’inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI) té un efecte inhibitori sobre el creixement tumoral tant in vitro com in vivo i s’ha estudiat el seu mecanisme d’acció, que ha permès descobrir que el PCI és un antagonista de l’EGF. Amb aquest fi s’han utilitzat tècniques de cultiu cel·lular amb tècniques bioquímiques, de biologia molecular, d’anàlisi computacional i assajos amb models animals

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No. of bitstreams: 1 Dissertação - Fabiano de Sousa Vargas.pdf: 3768449 bytes, checksum: fcc3a57e9e6cbb1e79933d1feba3250c (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Copaíba ( Copaifera L. ) is one of the best known and Amazonian plants used by traditional populations in natural medicine . The oleoresin of copaiba is a source of terpene compounds. The previous fractionation of terpene acids contained copaiba oil for the isolation of metabolites of interest is a useful method in dispatch processes phytochemicals later. The use of ion exchange chromatography is an alternative that minimizes the inconvenience of the formation of emulsions difficult separation. This paper proposes the use of methodology by ion exchange chromatography silica treated with aqueous KOH in order to re-isolate constituent terpenoids acids present in oleoresin gender Copaifera L quantity that allows making various biological assays. Aspects of the anti-inflammatory activity and antitumor activity via biological assays, enzymatic assays being developed tests (inhibition of tyrosinase and lipoxygenase) of cytokine and cytotoxicity in model cell culture in order to get a new bioactive compound that can be used in the preparation of a phytochemical or phyto, such as bleaching or skin protectors. Were obtained and identified by spectroscopic and spectrometric methods six (06) diterpene acids: copalic, 3-hydroxy-copalic, 3-acetoxy-copalic, hardwíckiico, colávico-15-methyl ester and kaurenoic. The acid 3-hydroxy-copalic was capable of inhibiting tyrosinase enzyme with IC50=255.53 ±18.59 μM . The colávico-15-methyl ester showed a higher capacity to inhibit lipoxygenase enzyme (IC50=157.82 ±17.69 μM ) . The cytotoxic activity of the substances was evaluated in healthy cells by strains of human lymphocytes , fibroblasts and 3T3L1 murine J774 macrophages , which poisonous substances only at concentrations above 250 μM . Was also made of the APPRAISAL hemolytic potential of the compounds , and found that none had significant hemolytic activity at concentrations up to 50 mM . For lines AGP - 1 ( gastric cancer ) , HCT -116 (colon cancer) , MCF - 7 ( breast cancer) , NIHOVCAR ( ovarian cancer ) , SKAMELL - 4 ( melanoma ) and SF -295 ( human glioblastoma ) , tested at a single concentration of 20 μM , showed no significant changes in cell viability . The antiinflammatory activity of the compounds was evaluated as inhibition of NO production in murine J774 macrophage lineage stimulated with LPS where the copalic acid ( 98.48 ± 1.30 % ) and hardwickiico acid ( 92.73 ± 4.97% ) had activity equivalent to that of standard indomethacin ( 96.58 ± 1.7 % ) at concentration of 100 μM . Was investigated first the effect of compounds isolated diterpene acids on the production of TNF - α , IL -6 and IL-10. The compounds did not inhibit the production of TNF - α . The acid 3-acetoxy-copalic, kaurenoic , colávico-15-methyl ester and copalic inhibited the production of IL -6 23.84 ± 8.17 %, 11.21 ± 5.74 %, 17.34 ± 4 18 ± 1.86 % and 4.19 %, respectively, at a single concentration of 50 μM . The kaurenoic acid , 3- acetoxy - copalic copalic and induced the production of IL-10 at concentrations of 12.5 μM and 25 μM , but there was a decrease in this induction when tested at a concentration of 50 μM . The kolávic-15-methyl ester and hardwickiic acid no changes of IL -10. Thus, these diterpenes may be considered components responsible for contributing to combat inflammation, however it is necessary to develop a pharmaceutical probably topical, to conduct clinical trials aimed to demonstrate its application in the treatment of injuries acute and chronic skin. / A copaíba (Copaifera L.) é uma das plantas amazônicas mais conhecidas e utilizadas por populações tradicionais como medicamento natural. O óleo-resina de copaíba é fonte de compostos terpênicos. O fracionamento prévio dos ácidos terpênicos contidos óleo de copaíba para o isolamento de metabólitos de interesse é um método útil na celeridade dos processos fitoquímicos posteriores. A utilização da cromatografia de troca iônica é uma alternativa que minimiza o inconveniente da formação de emulsões de difícil separação. O presente trabalho propõe o uso de metodologia de cromatografia por troca iônica por sílica tratada com solução aquosa de KOH com o objetivo de re-isolar constituintes ácidos terpenoides presentes em óleo-resinas do gênero Copaifera L em quantidade que permita a realização de diversos ensaios biológicos. Foram abordados aspectos da atividade anti-inflamatória e antitumoral, por meio de ensaios biológicos, sendo desenvolvidos ensaios enzimáticos (testes de inibição da tirosinase e lipoxigenase), de dosagem de citocinas e de modelo de citotoxicidade em cultura de células, a fim de obter-se um novo composto bioativo que poderá ser utilizado na elaboração de um fitofármaco ou fitocosmético, tais como clareadores ou protetores de pele. Foram obtidos e identificados por métodos de espectroscopia e espectrometria, seis (06) ácidos diterpênicos: os ácidos copálico, 3-hidróxi-copálico, 3-acetóxi-copálico, hardwíckiico, colávico-15-metil éster e o caurenóico. Apenas o ácido 3-OH-copálico apresentou capacidade de inibição da enzima tirosinase com CI50 de 255,53 ±18,59 μM. O colávico-15-metil éster apresentou maior capacidade de inibição da enzima lipoxigenase (CI50 = 157,82 ±17,69 μM). As atividades citotoxicas das substâncias foram avaliadas em células saudáveis por linhagens de linfócitos humanos, fibroblastos murinos 3T3L1 e macrófagos J774, sendo as substancias tóxicas apenas em concentrações acima de 250 μM. Foi feita também a avalição do potencial hemolítico dos compostos, sendo verificado que nenhum apresentou atividade hemolítica significativa em concentrações de até 50 mM. Para as linhagens AGP-1 (câncer gástrico), HCT-116 (cólon retal), MCF-7 (câncer de mama), NIHOVCAR (câncer de ovário), SKAMELL-4 (melanona) e SF-295 (glioblastoma humano), testadas em concentração única de 20 μM, não apresentaram alterações significativas da viabilidade celular. A atividade antiinflamatoria dos compostos foi avaliada quanto à inibição da produção de NO na linhagem de macrófagos murinos J774 estimulados com LPS, onde o ácido copálico (98,48±1,30%) e o ácido hardwickiico (92,73±4,97%) tiveram atividade equivalente ao do padrão indometacina (96,58±1,7%), todos na concentração de 100 μM. Foi investigada pela primeira vez a influência de compostos ácidos diterpênicos isolados sobre a produção de citocina TNF-α, IL-6 e IL-10. Os compostos não inibiram a produção de TNF-α. Os ácidos 3-acetóxi-copálico, caurenóico, colávico-15-metil éster e o copálico inibiram a produção de IL-6 em 23,84±8,17%; 11,21±5,74%; 17,34±4,18% e 4,19±1,86%, respectivamente, na concentração única de 50 μM. Os ácidos caurenóico, 3-acetóxi-copálico e copálico induziram a produção de IL-10 em concentrações entre 12,5 μM e 25 μM, porém houve uma diminuição nessa indução quando testados na concentração de 50 μM. Para os ácidos colávico-15-metil éster e o hardwickiico não houve alterações da produção de IL-10. Com isso, esses diterpenos podem ser considerados componentes responsáveis por contribuir no combate ao processo inflamatório, no entanto faz-se necessário o desenvolvimento de uma formulação farmacêutica, provavelmente de uso tópico, para realização de ensaios clínicos visando comprovar a sua aplicação no tratamento de lesões de pele agudas e crônicas.

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Estudos demostram efeitos benéficos do ácido ursólico (AU), incluindo sua capacidade imunomoduladora, anti-inflamatória, antitumoral e inibidor da metástase. Estudos sugerem que modificações estruturais do AU podem ampliar os efeitos biológicos benéficos deste composto. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro o efeito citotóxico e imunomodulador de derivados do ácido ursólico. Dezoito derivados semissintéticos foram preparados e cedidos para a verificação de atividades biológicas. Inicialmente, foram realizados testes em células de adenocarcinoma alveolar humano (A549), avaliando o efeito citotóxico e pró-apoptótico dos compostos. O efeito dos derivados do ácido ursólico foi também avaliado em macrófagos RAW264.7, analisando a viabilidade celular, a produção de óxido nítrico e a produção de fator de necrose tumoral. Em ambas as linhagens de células foi verificada a influências dos derivados na expressão do fator de transcrição NF-κB. As células A549 e RAW264.7 foram tratadas com os derivados nas concentrações de (7,5, 15, 30, 60 e 90µM), por 3, 24 e 48 horas. Os compostos AUD1, AUD5, AUD6, AUD8, AUD11, AUD12, AUD13 e AUD16 foram capazes de reduzir a viabilidade e a expressão de NF-κB nas células A549, em uma ou mais concentrações testadas. O composto AUD1 foi capaz de reduzir a viabilidade celular nas concentrações 30, 60 e 90μM, sendo significativamente mais eficaz que o AU nestas concentrações. Além disso, AUD1, AUD5, AUD6 e AUD8 induziram apoptose, sendo os derivados AUD1 e AUD8 significativamente mais eficaz que AU na indução da apoptose. Em relação aos macrófagos RAW264.7, somente os compostos AUD12, AUD13, AUD15 e AUD16 não promoveram redução da produção de NO. Todos os demais compostos reduziram a produção de NO em pelo menos uma das concentrações testadas, sem afetar a viabilidade celular. AUD2 promoveu a melhor produção de NO na menor concentração (7,5 μM) com IC50>90µM. Os compostos AUD1, AUD3, AUD4, AUD5, AUD6, AUD7, AUD8, AUD11, AUD12, AUD13, AUD14, AUD15 e AUD18 foram capazes de reduzir a expressão de NF-κB em todas as concentrações testadas. Em relação ao TNF, todos os compostos avaliados foram capazes de inibir a produção desta citocina pelas células RAW264.7 nas concentrações de 60 e 90μM. Ao realizar o estudo das modificação estruturais em relação as atividade biológicas é possível sugerir que a esterificação na posição C-28 ou ainda a manutenção do grupamento hidroxila no C-3 parecem importantes para o aumento da citotoxicidade dos compostos quando testadas em células A549. Além disso, quando avaliado o efeito imunomodulador na resposta inflamatória, a esterificação (C-3 e/ou C-28) potencializa a ação dos derivados do ácido ursólico em células RAW264.7. / The ursolic acid (3β-hydroxy-urs- 12-en- 28-oic acid) is a pentacyclic triterpene constituted by 30 carbon atoms that is usually obtained through the extraction and purification in different plants. The anti-inflammatory, anti-tumoral, immunomodulatory and anti-metastatic activity of ursolic acid (UA) has already been shown in different studies. Structural modifications in important portions of UA can amplify the beneficial biological effects of this compound. With this, it was synthesized 18 semisynthetic compound derivatives of ursolic acid (UAD1UAD18), which can be promising molecules to treat diseases that need new therapeutic options. The aim of this study was to evaluate in vitro the cytotoxic and immunomodulatory effects of these ursolic acid derivatives. To verify the biological activities was realized tests in the adenocarcinoma human alveolar basal epithelial cells (A549) evaluating the cytotoxic and the proapoptotic effects of these compounds. The murine macrophage cells (RAW264.7) were used to evaluate the effects of the UADs on cellular viability, nitric oxide production and tumoral necrosis factor production. In both cells was evaluated the expression of NF-κB. A549 and RAW264.7 were treated with UA or UADs in the concentrations of 7.5µM, 15µM, 30µM, 60µM and 90µM during 3, 24 or 48 hours. The compounds UAD1, UAD5, UAD6, UAD8, UAD11, UAD12, UAD13 and UAD16 were able to reduce the viability and the expression of NF-κB in A549 cells, in at least one of the concentrations. UAD1 was able to reduce the cellular viability in the concentrations of 30µM, 60µM and 90µM, being more effective than UA. Moreover, UAD1, UAD5, UAD6 and UAD8 induced the apoptosis of A549, being, UAD1 and UAD8, significantly more effective than UA. In RAW264.7, only the compounds AUD12, AUD13, AUD15 and AUD16 were not capable of promoting the reduction of NO production. The other compounds reduced the NO production in at least one of the concentrations, without cytotoxicity (IC50). AUD2 showed the better reduction of NO in the lower concentration, with IC50>90µM. The compounds UAD1, UAD3, UAD4, UAD5, UAD6, UAD7, UAD8, UAD11, UAD12, UAD13, UAD14, UAD15 and UAD18 were able to reduce the NF-κB expression in all tested concentrations, however, all the compounds reduced the production of TNF in the RAW264.7 cells in the concentrations of 60µM and 90µM. In conclusion, when was related the structure to the biological activity of the compounds, can be suggested that the esterification at C-28 or the conservation of the hydroxyl at C-3 seems to be important for the cytotoxicity of the compounds against A549 cells. Furthermore, when evaluated the immunomodulatory effect on the inflammatory response, the esterification (C-3 and/or C-28) enhances the action of the ursolic acid derivatives on RAW264.7 cells.

Dans la recherche de thérapie antitumorale de plus en plus innovante, nous avons évalué un traitement local basé sur l’utilisation de plasma froid. Le plasma froid (dans ce cas, <40°C) est un gaz ionisé par un apport d’énergie. Il contient des charges (électrons, ions), des radicaux libres et des molécules excitées. Il peut être généré à l’extrémité de cathéter permettant un traitement locorégional comme le traitement de dysplasie ou encore de tumeurs non résécables. Une activité antitumorale importante du plasma a été mise en évidence in vitro sur diverses lignées tumorales (colorectale, pulmonaire, pancréatique et cérébrale). Par ailleurs les cellules tumorales sont plus sensibles au plasma que les cellules normales. Les ROS générés sont à l’origine des principaux mécanismes d’action du plasma. Ils induisent de nombreux dommages à l’ADN, suivi d’un arrêt du cycle cellulaire conduisant à l’apoptose des cellules. Les études de tolérance ont mis en évidence l’innocuité de faibles doses de plasma sur le tissu traité permettant de définir les doses de plasmas utilisable dans le cadre de traitements antitumoraux. En utilisant des tumeurs xénogreffées en sous cutané et l’imagerie de bioluminescence, une activité antitumorale du plasma froid a été mise en évidence pour la première fois in vivo avec une augmentation de la survie des souris traitées d’environ 60%. Le traitement induit un arrêt de la prolifération tumoral avec une induction d’apoptose dans l’ensemble de la tumeur sans augmenter la surface de nécrose. L’effet antitumoral a également été démontré en utilisant le plasma gun sur un modèle de tumeurs colique et pancréatique en situation orthotopique chez la souris avec une augmentation de la survie (115%) accompagné d’une diminution de la métastasie. Ces résultats obtenues dans une démarche de recherche translationnelle montrent l’intérêt potentiel du plasma comme nouvel agent antitumoral. / In the context of new innovated antitumor treatment discovery, we evaluated the efficacy of a new local treatment based on non-thermal plasma (NTP). NTP is a cold (in this case, <40°C) ionized gas (a ir or noble gas) thanks to an electric discharge. It contains free charges (electrons, ions), free radicals and excited molecules. It can be generated at the end of a catheter allowing a local treatment that is compatible with usual endoscopes for dysplasia or non resecable tumors. We showed that NTP has a significant antitumor effect in vitro on various cell lines including colorectal, pancreatic, lung and brain tumor cells. The major action mechanisms of NTP was linked to a high rate generation of ROS in the vicinity of tumors cells and others plasma components have a minor implications. These ROS induce lethal DNA damages leading to a multiphase cell cycle arrest and finally to apoptosis. In vivo, a good tolerance of plasma treatment was highlighted and NTP treatment parameter was defined. Using subcutaneous xenografts and bioluminescence imaging, we showed a major antitumor effect of plasma in vivo with a 60% increase of mice life span. NTP treatments of tumor induce a tumor cell cycle arrest with a significant apoptosis induction in the whole tumor without increase of necrotic area. This in vivo antitumor effect was also observed with an in situ treatment using plasma gun of colorectal and pancreatic orthotopic tumor xenografts. A significant increase of mice lifespan (115%) was obtained together with a metastasis decrease. These results obtained in translational research showed the potential antitumor activity of NTP as a new type of treatment for cancer treatment.

Neste trabalho foram sintetizados complexos de cobre(II) com derivados imínicos da isatina, incluindo isatinas bromadas semelhantes a compostos encontrados em gastrópodes, a fim de compará-los com o composto já produzido e investigado [Cu(isaepy)], complexo de cobre(II) com base de Schiff feita a partir da isatina e 2-aminoetilpiridina. A isatina é um oxindol produzido em algumas plantas, também encontrado no tecido de mamíferos, com propriedades antitumorais naturais. Isatinas bromadas foram previamente constatadas como mais citotóxicas frente a células tumorais do que a isatina sem substituições. O objetivo principal foi verificar se a presença de bromo nos compostos análogos ao [Cu(isaepy)] levaria a um aumento da atividade antitumoral, assim como maior interação com DNA, alvo usual de metalofármacos. Depois de sintetizados, os compostos foram caracterizados por análise elementar (CHN), espectroscopia no infravermelho, espectroscopia UV/Vis e EPR. Foram feitos testes de citotoxicidade pelo método MTT com células de sarcoma uterino (MES-SA e MES-AS/Dx5, esta última resistente a doxorrubicina), adenocarcinoma cervical (HeLa) e células não cancerosas de fibroblasto humano P4. Adicionalmente, foram feitos testes de interação com DNA por UV/Vis e dicroísmo circular, além de testes de clivagem de DNA plasmidial. De modo geral, foi demonstrado que a simetria tetragonal em torno do cobre, determinada pelo EPR, é importante para a citotoxicidade dos complexos, que dessa forma podem se intercalar ao DNA e impedir sua replicação, por acabar distorcendo a hélice, e pela habilidade de realizarem clivagem oxidativa das fitas. [Cu(isaepy)] e seus análogos bromados demonstraram uma atividade citotóxica muito parecida, assim como grau de interação e clivagem com DNA. Conclui-se que, embora a presença de bromo nos análogos de [Cu(isaepy)] não levem a um aumento de atividade antitumoral, como observado em ligantes correlatos livres, nossos estudos apontam para diferentes fontes naturais (animal ou vegetal) para obtenção de precursores de novos compostos antitumorais. / In the present work, copper(II) complexes were synthesized with isatin derived imine ligands, including brominated oxindoles similar to compounds found in gastropods, in order to compare their reactivity with that of [Cu(isaepy)], a Schiff base-copper(II) complex already investigated, obtained with the precursors isatin and 2-aminoethylpyridine. Isatin is a natural oxindole extracted from plants, and also found in mammal tissue, with antitumor properties. Brominated isatins were previously described as much more cytotoxic, towards tumor cells, than unsubstituted isatin. The aim of this work was to verify if the presence of brome in analogue [Cu(isaepy)] compounds would increase their antitumor activity, along with higher DNA interaction, an usual target for metallodrugs. The copper(II) complexes were synthesized and then characterized through elemental analyses (CHN), infrared, UV/Vis and EPR spectroscopies. Cytotoxicity tests were carried out using MTT assay with cells lines MES-SA e MES-SA/Dx5 (uterine sarcome, sensitive and resistent to doxorubicin), HeLa (cervical adenocarcinoma) and non-tumor cells, human fibroblast P4. Additionally, DNA interaction experiments were carried out through UV/Vis spectroscopy and circular dichroism, and at last, DNA cleavage experiments with the studied complexes. In general, it was shown that a tetragonal symmetry around copper, shown by EPR, is very important to the complexes toxicity, since in that way they are able to intercalate DNA, and prevent its replication, as a consequence of double helix distortion, and eventual oxidative cleavage. [Cu(isaepy)] and its brominated analogues demonstrated a very similar cytotoxicity towards cancer cells, as well as quite same level of DNA interaction and cleavage. Although the presence of brome did not increase significantly their antitumor activity, as verified with the free isatin derivatives, our studies pointed to different natural sources to obtain precursors for such new antitumor compounds.

Apesar dos constantes avanços no tratamento de câncer, essa doença continua sendo umas das principais causas de mortalidade no mundo todo, portanto, é imperativo que novas modalidades de tratamento sejam desenvolvidas. Venenos de serpentes causam uma variedade de efeitos biológicos, pois constituem uma mistura complexa de substâncias como disintegrinas, proteases (serino e metalo), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases entre outras. No presente trabalho pesquisou-se em alguns venenos de serpentes frações com atividade antitumoral, pois há relatos de compostos ofídicos que apresentam esta atividade. Após fracionamento de venenos de serpentes das famílias Viperidae e Elapidae foram feitas incubações das frações obtidas com células normais de fibroblasto L929 e de melanoma B16-F10. Os resultados mostraram que as frações do veneno da serpente Notechis ater niger apresentaram a maior especificidade e potencial antitumoral em células de melanoma murino B16-F10 que os demais venenos utilizados. Este achado, aliado ao fato de ser um veneno pouco explorado foram determinantes para que este veneno fosse selecionado para dar continuidade aos estudos. As frações citotóxicas deste veneno foram submetidas a análises para identificar e caracterizar os componentes que apresentaram esta atividade atitumoral. Ensaios de western-blot e zimografia sugerem que estas proteínas não pertencem à classe das metalo e serinoproteinases. / Despite the constant advances in the treatment of cancer, this disease remains one of the main causes of mortality worldwide. So, the development of new treatment modalities is imperative. Snake venom causes a variety of biological effects because they constitute a complex mixture of substances as disintegrins, proteases (serine and metalo), phospholipases A2, L-amino acid oxidases and others. The goal of the present work is to evaluate a anti-tumor activity of some snake venoms fractions. There are several studies of components derived from snake venoms with this kind of activity. After fractionation of snake venoms of the families Viperidae and Elapidae, the fractions were assayed towards murine melanoma cell line B16-F10 and fibroblasts L929. The results showed that the fractions of venom of the snake Notechis ater niger had higher specificity and potential antitumor activity on B16-F10 cell line than the other studied venoms. Since the components of this venom are not explored yet coupled with the potential activity showed in this work, we decided to choose this venom to develop further studies. The cytotoxic fractions were evaluated to identify and characterize the components that showed antitumoral activity. Western blot assays and zymography suggests that these proteins do not belong to the class of metallo and serine proteinases.

Nos últimos anos as evidências de novos casos de câncer têm alarmado o mundo. O objetivo desse trabalho foi avaliar possíveis propriedades antineoplásicas atribuídas ao óleo de Copaifera reticulata Ducke pela etnofarmacologia. Ocorreu pela análise da citotoxicidade deste em cultivos de células normais e cancerosas de pulmão, murinas E10 e E9 e humanas das linhagens NCI-H460 e NCI-H2023. Os cultivos após serem incubados a 37&deg;C foram expostos a oito diferentes concentrações do óleo diluído em meio de cultivo permanecendo em estufa por 48 h na mesma temperatura. Decorrido esse tempo, adicionou-se o reagente MTT para leitura espectrofotométrica. Com a avaliação dos resultados dessa leitura, observou-se um grande potencial antitumoral do referido óleo, determinando-se sua IC50 para todas as células estudadas. Através da observação e captação de imagens microscópicas foi possível observar alterações morfológicas nas células nas diferentes concentrações do tratamento, havendo diferença entre a quantidade de células viáveis normais e neoplásicas. Concluiu-se que o óleo de Copaifera reticulata Ducke demonstrou efeito antineoplásico em duas linhagens de células neoplásicas do pulmão humano, bem como na linhagem murina E9, sendo que estudos efetuados para a caracterização de apoptose por fluorescência e alterações no ciclo celular nas células humanas reiteraram seu potencial como um agente contra o câncer. / In recent years evidences of new cancer cases in the world have been alarmed. The aim of this study was to evaluate the antineoplastic properties attributed to the Cofaífera retículata Ducke oil by ethnopharmacology. These analysis of cytotoxicity occurred through this normal murine cells E10 and lung cancer murine cells E9 and human lung cancer cell lines NCI-H460 and NCI-H2023. The cultures after being incubated at 37&deg;C were exposed with eight different oil concentrations diluted in warmed culture medium, remaining in incubator for 48 hours at the same temperature. After this time, added MTT reagent for spectrophotometric reading. With this reading analysis results it was observed a great potential antitumor of this oil determining their IC50 for ali cells studied. Through the microscopic images were possible to observe morphological changes in cells in different concentration of the oil exposure, differentiating normal cells from neoplastic cells. It was concluded that the Cofaífera retículata Ducke oil has the antineoplastic effect in two human lung cancer cell lines of as well as in murine cells E9, but the effect was not observed in E10 under the same conditions. Studies made in order to apoptosis characterization by fluorescence and cell cycle changes in human cells, confirming its potential as agent against cancer.