Orientadores: Lea Rodrigues Simioni, Maria Alice Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-22T09:08:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zamuner_StellaRegina_M.pdf: 4585030 bytes, checksum: 636e8bb5cd4befaa834535cbf6468b34 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar as diferenças interespecíficas sobre as atividades neurotóxica (toxicidade e estudo miográfico) e miotóxica (estudo morfológico e dosagem de CK) dos venenos de B. jararaca, B. jararacussu, B. erythramelas, B. moojeni e B. neuwiedi assim como sua neutralização, tendo o veneno de C. d. terrificus como controle positivo. Para isso foi utilizada a preparação biventer cervicis de pintainho. Nossos dados mostraram que há grande diferença quanto à toxicidade dos venenos estudados, não havendo uma relação direta entre a atividade bloqueadora neuromuscular, in vitra, e os valores da 'DL IND. 50'. O veneno de B. neuwiedi foi o único que apresentou atividade neurotóxica pré-sináptica, apesar disto acontecer somente em baixas doses (5, 10 e 20 'mu'g/ml), pois quando a dose era de 200 'mu'g/ml, seu perfil igualou-se ao dos outros venenos botrópicos estudados. A temperatura de incubação foi um importante fator para o efeito bloqueador e miotóxico deste veneno, sugerindo que uma fosfolipase 'A IND. 2' ('PLA IND. 2') estaria envolvida neste processo. O antiveneno botrópico comercial neutralizou de maneira diferenciada os efeitos neuromusculares dos venenos botrópicos analisados, todavia foi incapaz de neutralizar os efeitos neuromusculares de B. neuwiedi, enquanto que o antiveneno crotálico mostrou alguma proteção sobre o mesmo efeito para a dose utilizada, sugerindo uma reatividade antigênica cruzada. Todos os venen,os estudados induziram liberação de CK significantemente diferente do controle. Os venenos de B. neuwiedi e B. jararacussu foram os que exibiram maior nível de liberação desta enzima. O antiveneno botrópico comercial foi eficiente em neutralizar a liberação de CK, induzida pelos venenos estudados, exceto para o veneno de B. jararacussu. Todos os venenos examinados produziram alterações mionecróticas caracterizadas por: fibras musculares fragmentadas, presença de 'lesões delta', desarranjo e hipercontração das miofibrilas, fibras edematosas e (ou) hialinas e grande espaço entre as fibras, sendo que os venenos de B. jararacussu e B. neuwiedi foram os que apresentaram maior grau de destruição da fibra muscular. O antiveneno botrópico comercial foi eficiente em proteger contra a atividade miotóxica, exceto para o veneno de B. jararacussu. A utilização do antiveneno foi um importante instrumento, observarmos as diferenças interespecíficas dos venenos botrópicos / Abstract: The aim of this study was to evaluate the interspecific differences in the neurotoxic and myotoxic activities of Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, Bothrops moojení, Bothrops erythromelas and Bothrops neuwíedí venoms as well as their neutralization by anti-bothropic antivenom for both activities. Crotalus duríssus terríficus venom was used as a positive control. The chick bíventer cervícís preparation was used throughout this study. There was no direct relationship between the ín vítro neurotoxicity and the 'LD IND. 50' of the venoms. The venom of B. neuwiedi was the only bothropic venom that showed neurotoxic activity, although this effect was seen on/y at low doses (5, 10 and 20 'mu'g/ml); when a dose of 200 'mu'g/ml was used this venom behaved like the other bothropic venoms. The neuromuscular blocking and myotoxic actions of this venom may involve a neurotoxic 'PLA IND. 2'since the temperature at which the experiment was performed influenced the neurotoxic effect observed. Commercial anti-bothropic antivenom neutralized the Bothrops venoms to different degrees, and was unable to neutralize the neuromuscular effects of B. neuwíedí venom. In contrast, anti crota/ic antivenom showed some degree of protection against the acting to this venom. All of the venoms stimulated the release of CK, with those of B. jararacussu and B. neuwiedí being the most potent. Commercial anti-bothropic antivenom prevented the release of CK by the venoms, although its efficacy against B. jararacussu venom was low. All of the venoms produced myonecrosis, including fragmentation of the fibers, delta lesions, hypercontraction of the myofibrils and edema. The venoms of B. jararacussu and B. neuwiedi were the most potent in destroying fibers. Commercial anti-bothropic antivenom was efficient in neutralizing this activity, except in the case of B. jararacussu venom / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador : Osvaldo Augusto Sant'Anna / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T08:39:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stephano_MarcoAntonio_M.pdf: 5348385 bytes, checksum: cc9b6a49e17db4782e79d2f71f8449d4 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Este trabalho objetivou identificar e demonstrar a razão dos baixos títulos neutralizantes da atividade letal, do soro antiveneno de Lachesis muta, produzido pelo Instituto Butantan. O veneno de Lachesis muta é responsável por 400 acidentes anuais no Brasil e o único tratamento, comprovadamente eficaz, é a soroterapia com antiveneno específico. Os baixos títulos de anticorpos encontrados nos plasmas de equídeos levam a uma descontinuidade de produção ou a um produto com alta concentração de proteína. Estudaram-se também as possibilidades dos venenos de Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus possuírem o mesmo efeito supressor. Na tentativa de elucidar a possível atividade imunossupressora do veneno de Lachesis muta, foram utilizados como modelo experimental, camundongos selecionados para boa resposta imune humoral (linhagens HQP) e um antígeno não relacionado, no caso o erítrócito de carneiro (EC). O teste de hemoaglutinação foi escolhido para se comparar o efeito do veneno de Lachesis muta na resposta imune a antígenos não relacionados. Grupos de animais receberam veneno de Lachesis muta 24h e 72h antes e concomitante ao EC. Após os primeiros ensaios, em que se verificou a presença de um fator que inibia a produção de anticorpos a um antígeno não relacionado e que este era dose-dependente, o veneno de Lachesis muta foi fracionado por cromatografia de gel filtração em Superdex® 75. Seis frações foram obtidas, porém as frações 4 e 5 apresentaram atividade imunossupressiva. Os venenos obtidos sem as frações 4 e 5 foram utilizados na imunização de equídeos e o título destes animais foi pelo menos, cinco vezes superior ao título obtido por animais imunizados com veneno total. Os resultados obtidos levam-nos às seguintes conclusões: o veneno de Lachesis muta muta apresenta um efeito imunossupressor parcial; pelo menos duas frações distintas apresentam esta atividade; a atividade imunossupressora é dose-dependente; as frações imunossupressoras quando removidas do veneno, faz com que este aumente em cinco vezes os títulos neutralizantes da atividade letal no plasma eqüino / Abstract: In order to study the effect of Lachesis muta venom on the antibody response to unrelated antigens we first made an experimental analysis on mice genetically selected for high antibodies" production (HGP lines), to determine the effect of Lachesis muta venom on the anti-sheep erythrocytes (SE) response. Groups of mice received lOOug of venom in 0,5ml by intraperitoneal (ip) route 72, 24 hs before or simultaneously with 5 X 108 SE/0,5ml ip. In a second test, we repeated the same experiment as described above with B. jararaca and C. d. terrificus venoms using 18ug/0,5ml and 0,6ug/0,5ml respectively, in order to observe wether the inhibitory effect was present in venoms of other species. To elucidate if the depletory effect was present only in a particular venom fraction, around 120mg of Lachesis muta muta venom was applied to a Superdex® 75 column. Six fractions were studied for their biological activity and biochemical aspects (polyacrilamide gel electrophoresis). The results showed that in relation to the control groups (SE only) the total Lachesis muta venom promoted a clear, significant (P < 0.001) and persistent decrease in the anti-SE antibody response, mainly in the group that received venom 72hs before. The venoms of B. jararaca and C. d. terrificus did not show any inhibitory effect. After the chromatographic separation fraction 4 (molecular mass between 24 and 30 kDa) and 5 (molecular mass between 10 and 14 kDa) showed a significant supressive effect (P < 0.001 and P < 0.01 respectively). These data showed an inhibitory effect of Lachesis muta venom on an unrelated antigen. The activity is dose dependent and is present only in this species of Crotalidae family. The experiment with select mice has got subject to be applied in antivenom production. When horses were immunized with Lachesis muta venom without supressive frations, the sera were three times more effetive than the same sera from the horses which received total Lachesis muta venom / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 carolina_nicolau_ioc_dout_2016.pdf: 5977694 bytes, checksum: af8dc8894964ad483ed199c8a766fe4e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Além de potencialmente letais, envenenamentos ofídicos frequentemente acarretam elevados índices de morbidade e são reconhecidos pela Organização Mundial da Saúde como uma condição negligenciada de saúde pública. Atualmente, um dos maiores problemas associados ao envenenamento por serpentes é a baixa eficácia dos soros antiofídicos em neutralizar os efeitos tóxicos locais (ex.: hemorragia e necrose). A seleção dos venenos que compõem o pool de imunização dos cavalos é uma etapa crucial na produção do soro antiofídico e um dos critérios utilizados é a classificação filogenética das serpentes. Neste contexto, com vistas à possível otimização do soro antiofídico produzido no Brasil, utilizamos a abordagem proteômica shotgun para caracterizar os venenos utilizados como antígenos na produção do soro antibotrópico produzido pelo Instituto Butantan. Outros dois venenos que não fazem parte do pool também foram analisados. Os resultados proteômicos deste trabalho indicaram que a classificação filogenética (baseada fundamentalmente em características morfológicas das serpentes e análises de DNA mitocondrial) não mostra boa correlação com a composição proteica dos venenos. Como os efeitos do envenenamento estão diretamente relacionados com os componentes proteicos, análises venômicas podem auxiliar na escolha do pool de imunização, aprimorando a eficácia do soro antiofídico. O emprego de inibidores toxinoespecíficos para administração local é uma possível alternativa na busca de terapias antiofídicas mais efetivas. Metalopeptidases (SVMP) são as principais responsáveis pela hemorragia local, sendo sintetizadas na forma de pró-enzimas. Acredita-se que o pró-domínio destas toxinas seja responsável pela modulação de sua atividade catalítica, através de um mecanismo conhecido por cysteine-switch Utilizamos as abordagens de avaliação de formação de complexo em condições nativas e cross-linking aliado à espectrometria de massas de alta resolução, para mapearmos a região de interação entre o pró-dominio recombinante (PD-Jar) de jararagina (principal metalopeptidase do veneno de Bothrops jararaca) e diferentes metalopeptidases isoladas de venenos botrópicos. Os resultados mostraram que, em concentrações equimolares, PD-Jar foi capaz de interagir com as SVMP da classe PI (BaP1, atroxlisina-I e leucurolisina-a), porém, foi degradado por todas as SVMP estudadas. Desta forma, o uso de PD-Jar na terapia antiveneno pode não ser efetivo; entretanto, pode auxiliar na elucidação do mecanismo de ativação das SVMP. Por outro lado, ainda que os componentes dos venenos possam causar efeitos deletérios significativos, eles também podem apresentar valor terapêutico. Recentemente, observamos que o peptidoma do veneno de B. jararaca é significativamente mais complexo do que previamente descrito na literatura. Desta forma, utilizando genômica funcional aliada à abordagem connectivity map, triamos o peptidoma por possíveis novas atividades biológicas relevantes. Diversas atividades potenciais, tais como antimalárica, anti-inflamatória e imunossupressora foram detectadas e serão submetidas à etapa de validação complementar. Em resumo, o presente trabalho mostrou a necessidade de estudos venômicos apara aperfeiçoar a escolha do pool de imunização para a produção do soro antibotrópico, confirmou a interação entre PD-Jar e algumas SVMP-PI e foi mostrado, pela primeira vez, um peptidoma de serpentes significativamente diverso com potencial terapêutico. Esses resultados poderão contribuir para o aprimoramento da terapia antiofídica atual e para a prospecção por novos fármacos para o tratamento de diferentes patologias / Snakebite envenoming induces high levels of morbidity, besides its lethality potential and have been classified as a neglected health condition by the World Health Organization. Currently, the major issue associated to snakebite envenoming is the low efficacy of the antiophidic serum to neutralize the toxic local effects such as hemorrhage and necrosis. One of the most essential steps in antivenom production is the appropriate choice of venoms to compose the horses\2019 immunization pool, which takes into account the phylogenetic classification of snakes. Thus, aiming at improvements in the efficacy of antibothropic sera produced in Brazil, we used shotgun proteomics to characterize the venoms used as antigens for the antibothropic serum production by the Butantan Institute. We also analyzed two other venoms not used in the immunization pool. The proteomic results indicated that phylogenetic classification (based on morphological features and mitochondrial DNA analysis) does not display good correlation to snake venom composition. Considering that the envenoming effects are directly related to venom proteins, venomic analysis may contribute for a more rational design for immunization pool, improving the efficacy of the antiophidic serum. The local administration of toxin-specific inhibitors may represent a good alternative for development of more effective antiophidic therapies. Metallopeptidases (SVMPs), mainly responsible for the local hemorrhage, are synthesized as a pro-enzyme. It is believed that the prodomain of SVMPs is responsible for the modulation of their catalytic activity, through a mechanism known as cysteine-switch Thus, we used complex formation assays in native conditions and with cross-linking allied to high resolution mass spectrometry, to map the interaction region between a recombinant prodomain (PD-Jar) from jararhagin (major class PIII SVMP from Bothrops jararaca venom), and different SVMPs isolated from bothropic venoms. The results indicated that PD-Jar is able to interact, in equimolar concentrations, with class P-I SVMPs (BaP1, atroxlysin-I and leucurolysin-a) but it was degraded by all SVMPs studied. Thus, PD-Jar may not be effective in antivenom therapy; however, it may contribute for the elucidation of the mechanism of activation of SVMPs. On the other hand, besides the dreadful effects of snake venom components, they display a therapeutic potential. Recently, we observed that the B. jararaca venom peptidome is far more complex than previously reported in the literature. Thus, using functional genomics associated to connectivity map approach, we screened for novel relevant activities in this peptidome. We identified different potential activities such as antimalarial, anti-inflammatory and immunosuppressive, which will be further validated through biological assays. In summary, in the present work we showed the importance to use venomic studies to improve the rational design for immunization pool for antibothropic serum production, we confirmed the interaction between PD-Jar and some SVMP-PI and we showed, for the first time, a significant diverse snake venom peptidome with therapeutic potential. Thus, these results may further contribute for improvements in the antiophidic therapy and for prospecting novel drugs to be applied to the treatment of different pathologies

Orientador: Julia Prado Franceschi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T10:30:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_RejaneMariaLirada_D.pdf: 35252135 bytes, checksum: d8fa4a7fb76a10643309ff440ecc76fc (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Este trabalho trata do estudo farmacológico do veneno de Bothrops leucurus, conhecida como jararaca-do-rabo-branco. Objetivou-se caracterizar suas atividades bioquúnicas e imunobiológicas, como forma de avaliar o grau de soroproteção conferido pelos anti-venenos produzidos no Brasil e anti-B. leucurus, produzido na Argentina. Utilizou-se venenos de duas regiões geográficas da Bahia (Região Metropolitana do Salvador - RMS e Sul/Sudeste baiano - SB) e de machos e remeas, a fim de se estabelecer possíveis variações geográficas e sexuais. Procedeu-se a determinação da dosagem protéica, perfil cromatográfico e eletroforético, das atividades tóxica, proteolítica, edemaciante, hemorrágica, necrosante, defibrinante, pró-coagulante, miotóxica e sobre a junção neuromuscular, caracterização imunoquúnica e neutralização das atividades biológicas da peçonha, frente aos soros antibotrópico-crotálico (SABC) do Instituto Butantan (IB), Instituto Vital Brazil (IVB), Fundação Ezequiel Dias (FUNED) e Soro anti- B. leucurus do Instituto Carlos Malbrán. O perfil eletroforético do veneno caracterizou-se pela presença de 4 bandas e o perfil cromatográfico por 7 picos, sendo semelhantes nos diferentes pools. Houve variação regional e sexual, nas atividades biológicas, já que o veneno das serpentes do SB apresentou atividades tóxica, hemorrágica, necrosante e miotóxica maior que da RMS, no entanto, a atividade coagulante desta última foi maior que o da primeira. O veneno das remeas foi mais coagulante que o dos machos. Todas as amostras induziram mionecrose, caracterizada por "balonização", vacuolização, lesões "delta", hipercontração, condensação das miofibrilas e áreas de degeneração muscular. As amostras, em concentrações a partir de 50 J.!glrnl,inibirama transmissão neuromuscular, de maneira dose-dependente e irreversível(com exceção do veneno dos machos), devido às suas ações pós-juncionais. Na dose de 10 µg/ml,veneno de machos e remeas induziu aumento na amplitude das respostas musculares, demonstrando ação pré-sináptica. A peçonha de espécimens da RMS foi mais potente em provocar 50% do bloqueio da resposta contrátil que os da SB, assim como o veneno das remeas foi mais potente que dos machos. Observou-se inibição da resposta acetilcolínica nas preparações tratadas com 50 e 100 µg/mldas diferentes amostras e da amplitude da resposta muscular, de maneira dose-dependente e irreversível, com variação geográfica e sexual. O ELISA demonstrou que todos os pools apresentaram títulos de anticorpos frente a todos os anti-soros testados, sendo maiores frente ao soro específico, com exceção do pool da RMS, cuja titulação do soro específico foi equivalente a do SABC do IB. Dentre os soros inespecíficos,o do IB foi o que apresentou maior titulação, seguido do SABC da FUNED e do IVB. Houve variação na capacidade neutralizante dos soros frente às amostras, e o SABC/IB apresentou maior reatividade cruzada frente ao veneno de machos e da RMS. Os SABCIFUNED e IVB foram melhor reconhecidos pelo veneno de machos, da RMS e SB. O Westemblot demonstrou que o veneno desta espécie apresentou reação cruzada tanto frente ao soro anti-B. leucurus quanto ao SABC do IB e que a reação foi mais intensa quando utilizou-se o soro específico. Todos os anti-venenos foram capazes de neutralizar as atividades hemorrágica, necrosante e hemolítica das duas amostras de veneno, apesar da variação regional observada nesta soroneutralização / Abstract: The present work was a phannacological study of the action Bothrops leucurus venoro, popular known as "white-tailed lancehead". Venom effects (males and females from 1v1RSand South/Southeast region - SSR, Bahia, Brazil) were examined to establish geographical and sexual variability. The venom was characterized based on biochemical (total protein content, chromatographic and electrophoretic pattern), biological (lethal - LDso, proteolytic, venom-induced oedema - ED3o, haemorrhagic - MHD, necrotizing - MND, procoagulant - MCD, defibrinogenating- MDD, myotoxic and neurotoxic activities), imunochemical (ELISA, Westemblot) properties and neutralization of the toxic activities (haemorrhage, necrosis and coagulation). The antibothropic antivenom was provided Instituto Butantan, Instituto Vital Brazil and Fundação Ezequiel Dias (Brazil) and anti-Bothrops leucurus antivenom provided Instituto Malbrán (Argentina). The electrophoretic pattem showed 4 bands and chromatographic pattem 7 peaks without sexual and geographical variability. Lethal, haemorrhagic, necrotizing and myotoxic activities are more intense in snakes proceeding of the SSR than MRS. The coagulant activity of the female's venom is more coagulant than male. All samples induced myonecrosis characterized by swollen, vacuolization, "delta" lesions, myofilament hypercontraction and areas of the muscular damage. Results indicated that by indirect stimulation, B. leucurus venom induced neuromuscular blockade dose-dependent and is irreversible under concentration upper of 50 µg/ml, with exception of the male's venom (upper 100 µg/ml). This occurred probably due to postsynaptic action (depolarizing the cellular membrane, characterized for the severe contracture in 100 µg/ml e 200µg/ml concentrations) of the venom proceeding of the 1v1RSand SSR regions and moderated contracture in 200 µg/ml concentration of the males and females venoro. A males and females venom-induced effect on presynaptic activity was suggested by the marked increase in the twitch tension in 10 µg/ml concentration. The female's B. leucurus venom and proceeding of the 1v1RS region were more potent than male's venom of the SSR region in provocked 50% of the neuromuscular blockade (P<0.05) / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2012-05-07T15:02:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000008.pdf: 645663 bytes, checksum: 1fdb98e2621023f13d0c6a16004b1cbd (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A segurança e a eficácia da imunoterapia antienvenenamento ofídico estão intimamente relacionadas à pureza e a uma cuidadosa determinação da potência do soro (atividade biológica). A metodologia atualmente utilizada apresenta importantes limitações, as quais este trabalho objetiva contribuir. A mesma é adotada como oficial pela Farmacopéia Brasileira, tendo sido preconizada em 1996 pela Portaria nº 174/MS. Observações preliminares deste estudo identificaram, principalmente, um alto índice de invalidação de ensaios e uma baixa repetibilidade e reprodutibilidade, representado por diferenças significativas no ensaio de potência nos resultados obtidos pelo INCQS e pelos laboratórios produtores, enfatizando a necessidade de aperfeiçoar a metodologia analítica para a determinação da potência do soro antibotrópico. De acordo com as recomendações do “Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms”, coordenado pela “Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit” da OMS em 2001, o estabelecimento de venenos e antivenenos de referência é essencial para a padronização destes ensaios e para permitir a comparação lote a lote, assim como a comparação entre laboratórios. Neste trabalho, apresentamos os resultados de um estudo interlaboratorial para o estabelecimento de veneno e antiveneno botrópico de referência, visando o aperfeiçoamento do controle da qualidade dos soros antibotrópicos, com ênfase na metodologia analítica para a determinação da potência, com a participação de todos os laboratórios brasileiros produtores de soro antibotrópico. Este estudo foi realizado em duas etapas. A primeira compreendeu a reavaliação da potência do lote nº 05 do Veneno Botrópico de Referência BRA/BOT/05, a avaliação da potência do candidato a Soro Antibotrópico de Referência Nacional BRA/ANTIBOT/01, e a avaliação da aplicabilidade de um controle da dose desafio de veneno referente a cinco vezes o valor de dose letal média (5 DL50). A segunda etapa compreenderá a comparação da metodologia de determinação da potência do Soro Antibotrópico pela determinação da Dose Efetiva Média – DE50 (Potência Absoluta) com a metodologia da Potência Relativa frente ao Soro Antibotrópico de Referência, através da determinação da potência de amostras codificadas. Esta monografia, entretanto irá tratar apenas do estabelecimento do veneno e antiveneno de referência. Os resultados obtidos permitiram a avaliação das precisões intraensaios, interensaios e interlaboratorial, a freqüência de ensaios inválidos assim como as diferentes interpretações dos laboratórios, INCQS e produtores nacionais à monografia do Soro Antibotrópico da Farmacopéia Brasileira. / Safety and efficacy of antivenom immunotherapy are closely related with purity and an accurate potency determination (biological activity) of the antivenom. The murine lethality assay, still in use, present several limitations and is not a fully validated methodology. Preliminary data shows a high incidence of invalid assays and a low repeatability and reproducibility of potency assays, evidenced by significant differences between INCQS and manufacturers, indicating the need for improvement of the analytical methodology. According to the recommendations of the “Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms”, sponsored by the Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit of WHO at 2001, the establishment of local venom reference preparations and standard antivenom preparations are essential to standardize these assays and to allow batch to batch comparisons as well as comparisons between different laboratories. In this work, we present the results of an interlaboratorial study - with the participation of all Brazilian manufacturers - for the establishment of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom and lot 01 of the Brazilian Reference Antivenom, looking forward the improvement of quality control of Bothrops antivenom. This study was done in two steps. The first one consisted in the potency evaluation of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom, the potency evaluation of the lot 01 of the Brazilian Bothropic Reference Antivenom and the evaluation of the use of a control of the challenge dose of five times the median lethal dose (5 LD50). The second step consisted on the comparison between the absolute and the relative (parallel line assay) potency evaluation of commercial Bothrops antivenom, using the Brazilian Bothropic Reference Antivenom, in a blind assay. This monograph will focus only in the establishment of Brazilian Reference Bothropic Venom and Antivenom. These results allowed us to evaluate the intra-assay; inter-assay and inter-laboratorial precision, the incidence of invalid assays, and showed that each laboratory interpret differently the Bothrops Antivenom monograph of Brazilian Pharmacopoeia.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monique_trugilho_ioc_dout_2009.pdf: 10986205 bytes, checksum: 7de098da6c6025322360c2bb8516382d (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A proteína antiofídica DM43 isolada do soro do gambá Didelphis aurita inibe o efeito hemorrágico e a atividade proteolítica de metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs). Ao se ligar às SVMPs, o homodímero de DM43 se dissocia e cada monômero se liga a uma molécula de metaloprotease. O monômero é composto de três domínios tipo-imunoglobulina, dois dos quais são glicosilados. Para investigar a relação estrutura-função de DM43, os genes codificantes para esta proteína e para seus domínios foram clonados nos vetores pET101D/TOPO ou pET102D/TOPO; neste último, a proteína recombinante foi expressa em fusão com a tiorredoxina. Expressamos as construções obtidas em bactérias competentes da linhagem BL21 Star (DE3) de E. coli, na forma de corpúsculos de inclusão. Após purificação e reenovelamento por diálise, os espectros de dicroísmo circular (CD) na região do ultravioleta distante indicaram uma mistura de \03B1-hélices e folhas \03B2 pregueadas para os domínios recombinantes expressos em fusão com a tiorredoxina. A identidade das proteínas recombinantes foi confirmada, tanto por immunoblotting com anticorpo policlonal contra DM43, quanto por espectrometria de massas (MS/MS). Entretanto, nenhum dos domínios recombinantes, isolados ou combinados, foi capaz de inibir a atividade proteolítica da jararagina, uma metaloprotease de Bothrops jararaca. Ao contrário, os domínios fusionados com a tiorredoxina foram degradados quando incubados com esta SVMP. Estes resultados podem indicar que a glicosilação é funcionalmente importante e/ou que a conformação nativa multidomínio é necessária para a atividade biológica deste inibidor. Para melhor entender seus requisitos estruturais, estudamos a DM43 nativa após degradação proteolítica. Sob condições nativas, a digestão limitada de DM43 com tripsina ou quimotripsina gerou vários fragmentos, mas nenhum peptídeo ativo contra a SVMP foi obtido. Sob condições desnaturantes, a digestão extensiva de DM43 pela endoproteinase Lys-C produziu peptídeos menores. Mesmo sem atividade biológica contra a jararagina, três destes peptídeos foram capazes de interagir com esta SVMP. Após sequenciamento por MS/MS, cada peptídeo foi localizado em um domínio diferente de DM43. Estes resultados parecem sugerir a participação conjunta dos três domínios na interação com as SVMPs / The antiophidic protein DM43 isolated from Didelphis aurita serum inhibits the hemorrhagic effect and the proteolytic activity of snake venom metalloproteinases (SVMPs). Upon SVMP addition, DM43 homodimer dissociates and one subunit binds to one SVMP. The 43 kDa monomer is composed of three immunoglobulin-like domains, two of which are glycosylated. To investigate the structure-function relationship in this protein, the genes encoding DM43 and its domains were separately cloned into pET101D/TOPO or pET102D/TOPO vector, this last with the fusion partner thioredoxin. The obtained constructions were expressed in BL21 Star (DE3) competent E. coli cells as inclusion bodies. After purification and dialysis refolding, circular dichroism (CD) spectra in the far UV region of the recombinants domains with fusion partner indicated the presence of folded proteins with both alpha-helix and beta-sheet. The identities of the recombinant proteins were confirmed by immunoblotting with polyclonal antibodies against serum DM43 and by mass spectrometry (MS/MS). However, none of the domains either isolated or in combination, were able to inhibit the proteolytic activity of jararhagin. In contrast, thioredoxin-fused domains were readily digested by this SVMP. These results may indicate that glycosylation is functionally important for DM43 and/or that a multidomain native conformation is necessary for the biological activity of the inhibitor. To better understand its structural requirements, serum DM43 was studied after proteolytic degradation. Under native conditions, limited digestion of DM43 by trypsin or chymotrypsin generated various fragments, but no active peptide against SVMP was obtained. Extensive digestion of denatured DM43 by Lys-C endopeptidase produced smaller peptides. Even though not able to neutralize the proteolytic activity of jararhagin, three DM43 Lys-C peptides were able to bind to SVMP. After sequencing by MS/MS, each peptide was localized to one DM43 domain. Taken together, these results seem to reinforce the participation of all three domains of DM43 in the interaction with SVMPs

Orientador: Heleno Rodrigues Correa Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T01:56:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fan_HuiWen_D.pdf: 34839721 bytes, checksum: 72795a1b109f24e939164950718cb192 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A ocorrência de sangramento sistêmico após o contato com lagartas foi descrita pela primeira vez no Brasil em 1912. Na Venezuela, uma síndrome hemorrágica causada por lagartas de mariposa da família Saturniidae, denominada Lonomia achelous, vem sendo relatada desde a década de 1960, com casos semelhantes na Região Amazônica. No final dos anos 1980, uma alta incidência da síndrome hemorrágica passou a ser descrita em áreas rurais do sul do Brasil e as lagartas foram identificadas como Lonomia obliqua. Pacientes apresentavam dor em queimação no local do contato, seguida de mal estar geral, cefaléia e náuseas e, após algumas horas, manifestações hemorrágicas: sangramentos de pele e mucosas, epistaxe, hematúria, hematêmese, sangramento pulmonar. Insuficiência renal aguda e hemorragia intracraniana estiveram associadas a casos fatais. Em pouco tempo, devido à gravidade e à progressão dos casos, o acidente por Lonomia passou a ser considerado um novo problema de saúde pública. Uma vez que os antivenenos constituem terapêutica efetiva no tratamento dos acidentes ofidicos, um processo para a produção de um soro antilonômico específico (SALon) foi desenvolvido, por meio da imunização de cavalos com extratos de cerdas de Lonomia. A segurança e a eficácia deste novo antiveneno foi testada em um ensaio clínico aleatorizado e aberto, realizado em três fases, no Hospital São Vicente de Paulo, Passo Fundo, RS. Na fase I, 15 pacientes receberam diferentes quantidades de SALon e três apresentaram reações anafiláticas/anafilactóides (urticária em dois e broncoespasmo em um). A freqüência e gravidade das reações precoces não foram excepcionalmente diferentes nas fases seguintes, comprovando assim a segurança no seu uso. Os pacientes na fase II, classificados de acordo com a gravidade, foram distribuídos em dois grupos: SALon ou ácido-epsilon-aminocapróico (EACA), um antifibrinolítico bastante utilizado nos envenenamentos por Lonomia na Venezuela. O estudo foi interrompido quando um paciente do grupo EACA veio a óbito 64 dias após a internação, por insuficiência renal aguda e complicações infecciosas. Até aquele momento, 9 pacientes haviam recebido SALon e 8 EACA. A comparação entre os grupos mostrou uma evidente superioridade do SALon na reversão da coagulopatia de consumo, medida pelo Tempo de Coagulação, Tempo de Protrombina e dosagem de fibrinogênio plasmático. Decidiu-se então por não mais privar os pacientes da soroterapia e, na fase III, a eficácia da associação SALon com EACA foi avaliada. Pacientes que receberam SALon (n = 58) ou SALon + EACA (n = 56) mostraram-se semelhantes em termos do tempo necessário para normalização dos parâmetros de coagulação que ocorreu nas primeiras 24 horas após a soroterapia na maioria dos casos. A reanálise seqüencial dos dados, aplicando-se o teste triangular, indicou uma redução substancial no número de pacientes, com as mesmas conclusões do estudo completo. O ensaio clínico foi finalizado concluindo-se que o antiveneno é eficaz no tratamento dos envenenamentos por Lonomia, não havendo nenhuma vantagem em se utilizar a associação com o EACA / Abstract: A clinical trial to evaluate the efficacy and safety of a specific antivenom against the hemorrhagic syndrome caused by Lonomia caterpillars. Disseminated bleeding after the contact with caterpillars was first described in Brazil in 1912. In Venezuela, a hemorrhagic syndrome caused by larvae ofa moth ofthe Satuniidae family, namely, Lonomia achelous, has been reported since the 1960's, and similar cases were also reported in Amazon region. At the end of the eighties, a very high incidence of the bleeding syndrome has been described in the rural areas in the south of Brazil and the caterpillars were identified as Lonomia oblíqua. Patients experienced burning pain at the site of contact, followed by general discornfort, headache and nausea, and in some hours afier contact, hemorrhagic manifestations: bleeding from skin and mucous membranes, epistaxis, hematuria, hematemesis, pulmonary bleeding. Acute renal failure and intracerebral bleeding were associated with fatal outcomes. In a short time, due to severity and progression of cases, Lonomia caterpillar envenoming was therefore considered a new public health problem. As antivenoms are effective therapy for treatment of snake bites, a process of manufacturing a specific Lonomia antivenom (SALon) was developed by immunizing horses with Lonomia caterpillar bristle extracts. The safety and efficacy of this new antivenom has been tested in a three phase randomized open c1inicaltrial at the Hospital São Vicente de Paulo, Passo Fundo, RS. In phase I, 15 patients received different amounts of SALon and three presented anaphylactic/anaphylactoid reactions (urticaria in two and brochospasm in one). Frequency and severity of early reactions were not exceptionally different in either ofthe next phases, confirming its safety. Patients in phase II, graded according to severity of envenoming, were allocated in two groups: SALon or epsilon-amino-caproic acid (EACA), an antillbrinolytic drug extensively used in Lonomia cases in Venezuela. The study was interrupted when a patient in group EACA died 64 days afier hospitalization in consequence of acute renal failure and infectious complications. At that time, 9 patients had received SALon and 8 EACA. The comparison showed an evident superiority of SALon in reversing the consumptive coagulopathy, measured by Coagulation Test, Prothrombin Time and dosage of plasma fibrinogen. The decision was not to deprive any patient of antivenom therapy and, in phase III, the efficacy of the association between SALon with EACA was assayed. Patients receiving SALon (n = 58) or SALon + EACA (n = 56) showed to be similar in terms the time needed to normalize coagulation parameters, which occurred within 24 hours afier antivenom therapy in most of patients. The sequential reanalysis of data, applying the triangular test, gave a substantial reduction in the number of patients required, for the same conclusions reached with the completed study. The trial was fmished concluding that antivenom is efficacy in the treatment of Lonomia caterpillar envenoming and there is no advantage to be used in association with EACA / Doutorado / Saude Coletiva / Doutor em Saude Coletiva

Orientador : Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T20:39:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farah_MariadeFatimaLovo_D.pdf: 2972585 bytes, checksum: 752746d577147ee644f3c83b54b2ca26 (MD5) Previous issue date: 1993 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

El ofidismo como problemática de salud en el Perú, requiere ser atendido con estudios dirigidos a optimizar la acción de los antivenenos producidos comercialmente y además, desarrollar nuevas tecnologías destinadas a este propósito. En este aspecto, la producción de inmunoglobulina Y específica (IgY) de origen aviar es una alternativa frente a los antivenenos equinos, y es el tema en la presente investigación. Se inmunizaron gallinas ponedoras de la raza Light Brown Leghorn con 500 µg del veneno de Bothrops atrox, emulsificado con adyuvante de Freund, siguiendo la aparición de anticuerpos en suero con la técnica de inmuno difusión doble. Los anticuerpos aviares fueron aislados de la yema de huevos que contenían los niveles más altos de IgY específica, determinados previamente por la técnica de ELISA, utilizando precipitación negativa con ácido caprílico y un paso adicional de precipitación positiva con sulfato de amonio. La masa de anticuerpos recuperados fue de 8,5 ± 1,35 mg/mL de yema habiéndose determinado en 8,3% la cantidad de IgY específica mediante cromatografía de afinidad en una columna de Sepharosa 4B-veneno. El antiveneno aviar tuvo una DE50 de 575 µL de antiveneno/mg de veneno y una potencia de 1,74 mg de veneno/mL de antiveneno aviar. Asimismo, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de Bothrops brazili comparte más epítopes comunes con el veneno de Bothrops atrox ya que se obtuvo un valor de 46% de reactividad cruzada en tanto que los venenos de Bothrops pictus y Bothrops barnetti tuvieron valores de 41% y 37% respectivamente; se encontró además que los venenos de Crotalus durissus (12%) y Lachesis muta (19%) tuvieron una baja reactividad cruzada con el veneno en estudio. / Ofidism as a health problem in Perú requires to be attended either optimizing commercial antivenom potency and developing news technologist on this. Production of specific avian immunoglobulin Y is an alternative in relationship IgG horse antibodies, which is the main point of this research. Laying Light Brow Leghorn chickens were immunizated with 500 µg of Bothrops atrox snake venom emulsificated with Complete Freund’s adjuvant, and the IgY antibodies production was evaluated with the double immunodiffusion method. The avian antibodies were isolated from egg yolk which contained high level of specific IgY, calculated by ELISA method. Using caprylic acid negative precipitation and ammonium sulfate positive precipitation, mass antibodies recovery was 8,5 ± 1,35 mg/ml of yolk and after step on sepharosa 4B-venom affinity chromatographic, specific IgY recovery was 8,3% . The avian antivenom had a ED50: 575 µL antivenom/mg of venom and potency was 1,74 mg of venom/ml of avian antivenom. In addition, the crossing reactivity assays showed that Bothrops brazili venom share more common epitope with Bothrops atrox venom with a value of 46% of crossing reactivity whilest the Bothrops pictus and Bothrops barnetti venoms had values of 41% and 37% respectly; in contrast the venoms of Crotalus durissus (12%) and Lachesis muta (19%) had low crossing reactivity with Bothrops atrox venom.

Orientador: Márcia Gallacci / Banca: Selma Maria Michelin Matheus / Banca: Yoko Yoshima-Franco / Resumo: Os acidentes botrópicos representam cerca de 87% dos envenenamentos ofídicos registrados no Brasil e se destacam pelas graves seqüelas que limitam a vida do acidentado. O principal efeito tóxico local destes é a mionecrose, que pode levar à perda tecidual permanente e à amputação. A mionecrose pode ser decorrente da isquemia do tecido muscular, causada por fatores hemorrágicos presentes nestes venenos (metaloproteases), ou da presença de miotoxinas (PLA2s) que afetam diretamente o tecido muscular. O método mais eficaz para o tratamento dos envenenamentos ofídicos é a soroterapia passiva. No entanto, esta é limitada devido à relativa ineficácia do soro em neutralizar a mionecrose dos venenos botrópicos, além de muitas comunidades não terem acesso à soroterapia. Estes fatores conduzem a busca de métodos alternativos, como o uso de extratos vegetais. Evidências mostram que o extrato aquoso da Casearia sylvestris, conhecida popularmente como "guaçatonga, é capaz de neutralizar efeitos tóxicos de venenos brutos e de suas miotoxinas isoladas. A Casearia sylvestris apresenta diversos outros efeitos terapêuticos como: anti-séptico, antiinflamatório, anestésico local, anti-tumoral, anti-úlcera e cicatrizante. Devido à escassez de estudos experimentais para avaliar a eficácia de extratos vegetais na redução dos danos locais ocasionados pelo envenenamento botrópico, torna-se importante avaliar a potencial atividade antiofídica da Casearia sylvestris. O presente estudo teve por objetivo investigar o uso do extrato aquoso da Casearia sylvestris, como terapêutica tópica dos efeitos locais do envenenamento botrópico experimental em camundongos. Foi avaliada a capacidade do extrato bruto da planta em neutralizar a mionecrose induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu e/ou acelerar o processo de regeneração... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops accidents represent about 87% of snakebites recorded in Brazil and account for serious the consequences that affect the life of the victim with social and economic repercussions. Its main toxic effect is myonecrosis, which can lead to permanent tissue loss and amputation. Myonecrosis may result from muscle tissue ischemia, hemorrhage caused by factors present in these venoms (metalloproteases), or the presence of myotoxins (PLA2s) that directly affect muscle tissue. The most effective treatment is passive serotherapy. However, this is limited due the relative ineffectiveness of the serum to neutralize the myonecrosis of Bothrops venoms and the lack of access to serotherapy by many communities. These factors lead to alternative methods such as the use of plant extracts. Evidence shows that the aqueous extract of Casearia sylvestris, known popularly as "guaçatonga", is able to neutralize the toxic effects of venom and their crude myotoxins isolated. Casearia sylvestris presents several other therapeutic effects such as, antiseptic, antiinflammatory, local anesthetic, anti-tumor, anti-ulcer and wound healing. Due to the scarcity of experimental studies to evaluate the efficacy of plant extracts in reducing the harm caused by Bothrops envenomation, it is important to evaluate the potential activity of antiophidic Casearia sylvestris as a complement to conventional serum therapy. The present study aimed to investigate the use of aqueous extract of Casearia sylvestris, topical therapy as complementary to local effects of Bothrops envenomation in experimental mice. We evaluated the ability of the crude extract of the plant to neutralize myonecrosis induced by the venom of Bothrops jararacussu and / or accelerate the process of muscle regeneration. The onset of myonecrosis and the regenerative process... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre