Quelque soit le type de dégénérescences rétiniennes, les cellules photoréceptrices à l'origine de la genèse du signal lumineux, meurent par un mécanisme commun : l'apoptose. Au laboratoire, nous avons mis en évidence que l'inhibition de la caspase-3, une caspase effectrice de l'apoptose, permet de réduire l'apoptose des cellules photoréceptrices (Perche et al. 2007). Dans la continuité de ces résultats, le but de nos travaux de thèse est d'identifier les molécules impliquées en amont de la caspase-3. Pour mener à bien notre projet, nous avons utilisées un modèle expérimentale de dégénérescence rétinienne induite par une exposition à la lumière (modèle de photodégénérescence rétinienne). Les atteintes rétiniennes sont quantifiées par : l'électrorétinographie in-vivo permettant d'évaluer la fonction rétinienne, l'histologie pour l'analyse morphométrique de la rétine aux quelles sont associés des dosages enzymatiques. Ainsi, nous avons montré que l'injection d'un inhibiteur de la caspase-12 à 0,4 ou à 0,8 mM, de la caspase-9 à 0,2 ou à 0,4 mM, ou de la caspase-8 à 0,2 mM, injecté dans le vitré n'a aucun effet toxique sur la rétine et n'a aucun effet protecteur contre l'apoptose des cellules photoréceptrices induites par la lumière. Ces résultats suggèrent que les caspases-8, 9 et 12 ne sont pas impliquées dans l'activation de la caspase-3 et donc dans l'initiation de l'apoptose des photorécepteurs induite par la lumière. Toutefois, après injection dans le vitré, les inhibiteurs inhibent leur cible respective uniquement transitoirement. Par conséquent, pour pouvoir conclure sur le rôle de ces caspases dans le processus dégénératif, il faudrait pouvoir inhiber les caspases de façon plus persistante. Il serait donc intéressant de reproduire des expérimentations similaires en augmentant la concentration de l'inhibiteur injecté ou en réduisant le délai entre l'injection de l'inhibiteur et l'induction du stress. De plus, la caspase-3 peut être activée indépendamment des caspases initiatrices, comme par exemple : les céramides, les cathepsines et les calpaïnes. / No abstract available

Notre laboratoire a caractérisé TP53INP1 comme un gène clé de réponse au stress cellulaire. Cible de p53, TP53INP1 est ubiquitairement exprimé et fortement induit lors de différents stress in vivo et in vitro. Sa surexpression ectopique induit un arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire. Nous avons montré que l’expression de TP53INP1 est perdue dans plusieurs cancers chez l’homme et que sa réexpression dans les cellules cancéreuses inhibe la croissance tumorale. De plus, les souris TP53INP1-déficientes sont très susceptibles au développement de tumeurs induites et présentent un stress oxydatif permanent caractérisé par une augmentation du taux de ROS. L’ensemble de ces résultats indique que TP53INP1 possède une fonction suppressive de tumeur probablement en lien avec son implication dans la régulation du statut redox cellulaire. Le but de mon travail de thèse est de décrypter cette fonction an niveau cellulaire et moléculaire en exploitant le modèle des souris déficientes. Mes travaux montrent que l’absence de TP53INP1 affecte tous les processus biologiques dérégulés lors de la tumorigenèse. En effet, la perte de TP53INP1 se caractérise par une augmentation de la prolifération cellulaire, de la migration cellulaire, de l’angiogenèse et de l’instabilité génétique. De façon paradoxale, les cellules déficientes pour TP53INP1 présentent une sensibilité accrue à l’apoptose induite par un stress indépendant ou non de p53. Cette sensibilité se base probablement sur un fort défaut de l’autophagie dans ces cellules. Nous observons également une diminution du taux des petites molécules antioxydantes liée au stress oxydatif constitutif observé dans ces souris. Les défauts observés en absence de TP53INP1 sont corrigés par un traitement avec un antioxydant, le N-Acetylcystéine, ce qui démontre le lien entre le rôle suppresseur de tumeur de TP53INP1 et son implication dans le contrôle du stress oxydatif. Ce travail a permis de mieux comprendre le rôle antioxydant TP53INP1 en lien avec sa fonction de suppresseur de tumeur. / Our laboratory has characterized TP53INP1 as a key gene in cell stress response. Target of p53, TP53INP1 is ubiquitously expressed and strongly induced during various stress-inducing treatments in vivo and in vitro. Its ectopic overexpression induces cell cycle arrest and cell death. We have shown that the expression of TP53INP1 is lost in many human cancers and that its re-expression in cancer cells inhibits tumor growth. In addition, TP53INP1-deficient mice are highly susceptible to induced tumors and show a permanent oxidative stress characterized by increased ROS levels. Taken together, these results indicate that TP53INP1 has a tumor suppressor function likely related to its involvement in the regulation of cellular redox status. The purpose of my PhD is to decipher the cellular and molecular function of TP53INP1 by exploiting the model of deficient mice. My work shows that the absence of TP53INP1 affects all biological processes deregulated in tumorigenesis. Indeed, the loss of TP53INP1 is characterized by an increase in cell proliferation, cell migration, angiogenesis and genetic instability. Paradoxically, TP53INP1-deficient cells have increased susceptibility to stress-induced apoptosis, independently or not of p53. This sensitivity is probably based on a strong impairment of autophagy in these cells. We also observed a decrease in the rate of small antioxidant molecules related to constitutive oxidative stress in these mice. The defects observed in the absence of TP53INP1 are corrected by treatment with an antioxidant, N-acetylcysteine, demonstrating the link between the role of TP53INP1 in tumor suppression and its involvement in redox control. This work has led to a better understanding of the antioxidant role of TP53INP1 linked to its function as a tumor suppressor.

ABSTRACT Aims/hypothesis: Obesity is associated with a dysregulation of beta-cell and adipocyte function. The molecular interactions between adipose tissue and beta-cells are not yet fully elucidated. We investigated, whether or not the adipocytokine nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt), which has been associated with obesity and type 2 diabetes mellitus (T2DM) directly influences beta-cell survival and function. Methods: The effect of Nampt on viability of INS-1E cells was assessed by WST-1 assay. Apoptosis was measured by Annexin V/PI and TUNEL assay. Activation of apoptosis signaling pathways was evaluated. Adenylate kinase release was determined to assess cytotoxicity. Chronic and acute effects of the adipocytokine Nampt and its enzymatic product nicotinamide mononucleotide (NMN) on insulin secretion were assessed by glucose stimulated insulin secretion in human islets. Results: While stimulation of beta-cells with the cytokines IL-1β, TNFα and IFN-γ or palmitate significantly decreased viability, Nampt showed no direct effect on viability in INS-1E cells or in human islets, neither alone nor in the presence of pro-diabetic conditions (elevated glucose concentrations and palmitate or cytokines). At chronic conditions over 3 days of culture, Nampt and its product NMN had no effects on insulin secretion. In contrast, both Nampt and NMN potentiated glucose stimulated insulin secretion acutely during 1h incubation of human islets. Conclusion/interpretation: Nampt did influence neither beta-cell viability nor apoptosis but acutely potentiated glucose stimulated insulin secretion.

Les homologues Bcl-2 constituent une famille de protéines structurellement apparentées qui jouent un rôle central dans la régulation de l'apoptose. Les mécanismes de régulation de l'apoptose entérocytaire sont peu connus. Afin de mieux comprendre cette régulation, le but de ce travail était d'analyser l'établissement des mécanismes de contrôles de l'apoptose entérocytaire au cours du développement de l'intestin humain. Pour ce faire nous avons étudié l'expression épithéliale des homologues Bcl-2 proapototiques (Bax, Bak et Bad) et anti-apoptotiques (Bcl-2, Mcl-1 et BCI-X L ), ainsi que la molécule associée anti-apoptotique Bag-1, le long de l'axe cryptevillosité et pour les différents segments (jéjunum, iléon et côlon) de spécimens foetaux humains âgés de 9 à 20 semaines de gestation. Dans un premier temps, afin d'analyser l'expression épithéliale des homologues Bcl-2 le long de l'axe crypte-villosité, nous avons effectué des immunofluorescences indirectes en utilisant des anticorps spécifiques pour les homologues étudiés. Dans un deuxième temps, afin d'analyser l'expression épithéliale des homologues Bcl-2, nous avons effectué des Western blots."--Résumé abrégé par UMI.

Les pro-protéines convertases (PCs), nommées PC1/3, PC2, furine, PACE4, PC5/6, PC4 et PC7, sont impliquées dans l'activation de précurseurs protéiques de par le clivage endoprotéolytique qu'elles effectuent en C-terminal des paires de résidus basiques Lys/Arg-Arg. Ces protéases à sérine occupent des fonctions dans l'initiation et le maintient [i.e. maintien] du phénotype néoplasique puisqu'elles activent, entre autres, des protéines reliées à la prolifération, l'adhésion et l'invasion cellulaire cancéreuse. Étant donné le caractère unique et redondant dans la fonctionnalité des PCs, il est important de distinguer les rôles spécifiques tenus par chacune. Ainsi, l'implication de PACE4 dans la progression cancéreuse est de plus en plus investiguée. L'inhibiteur peptidique spécifique envers PACE4, LLLLRVKR (Multi-Leu ou ML), offre la possibilité d'étudier les impacts d'une inhibition de PACE4 sur les traits distinctifs d'une lignée cancéreuse. Pour introduire ces travaux, il a été prouvé que la lignée cancéreuse humaine de la prostate DU145 surexprimait uniquement PACE4. Nous démontrons par essais MTT que le ML réduit de 50% la prolifération de ce modèle. Suite à l'optimisation de la pénétration et de la stabilité du peptide, l'inhibition de la prolifération obtenue fut quasi complète. Des travaux ont aussi été réalisés afin de mieux comprendre ces effets. La formation de colonies, la viabilité cellulaire, le cycle de division et l'expression de diverses protéines furent étudiées. Enfin, la progression des tumeurs DU145 fut abolie par des traitements intra tumoraux avec le ML. Le ML est donc un inhibiteur de PACE4 qui bloque la progression tumorale, ce qui lui confère une application thérapeutique potentielle.

Le remodelage osseux est un phénomène finement régulé selon la balance de formation et de résorption osseuse. La régulation de la résorption osseuse se fait principalement par l'apoptose des ostéoclastes. Nous avons démontré auparavant que plusieurs facteurs comme TRAIL, FASL et TGF-[bêta]1 induisent l'apoptose des ostéoclastes humains. Par contre, nous ne connaissons pas l'effet de l'OPG sur l'apoptose ostéoclastique en plus de ne pas connaître les mécanismes impliqués dans la mort cellulaire induite par le TGF-[bêta]1 chez les ostéoclastes. Afin de vérifier ces effets, nous avons utilisé une culture primaire d'ostéoclastes humains produite à partir de monocytes de sang de cordon ombilical. Ces ostéoclastes sont différenciés à l'aide du M-CSF et du RANKL. L'OPG est un membre de la famille des récepteurs du TNF. L'OPG est un récepteur soluble pour RANKL et pour TRAIL. Nous avons démontré que l'OPG permettait de diminuer l'apoptose des ostéoclastes cultivés dans un milieu sans M-CSF et sans RANKL. Cette baisse surprenante de la mort a été expliquée par une augmentation d'expression de TRAIL par les ostéoclastes lorsque ceux-ci sont cultivés en absence de ses facteurs de survie (M-CSF et RANKL). L'OPG agit sur l'apoptose en séquestrant le TRAIL produit par les ostéclastes [ostéoclastes] empêchant ainsi l'induction de l'apoptose par le TRAIL des ostéoclastes environnants. Ceci en fait un mécanisme de régulation autocrine de la survie des ostéoclastes lors du remodelage osseux. De plus, nous avons aussi démontré un mécanisme expliquant l'apoptose des ostéoclastes par le TGF-[bêta]1. Nous avons premièrement démontré la présence des récepteurs de type I et II à la surface des ostéoclastes proposant une action directe du TGF-[béta]1. Par la suite, nous avons démontré que le TGF[bêta]1 induisait une activation de la caspase 9 objectivant ainsi une apoptose par la voie mitochondriale. Cette activation de l'apoptose par la voie intrinsèque serait le résultat de l'activation de la voie de p38 des MAPK et de la voie des Smad suivie par une augmentation de l'expression des homologues de Bcl-2 pro-apoptotiques Box et Bim. En sachant que le TGF-[béta]1 peut être libéré et activé de la matrice osseuse lors de la résorption, l'induction de l'apoptose des ostéoclastes par ce facteur de croissance en fait un autre mécanisme de régulation du remodelage osseux.

Depuis leur découverte, les glycogènes synthase kinases 3 (GSK3) ont été associées à de multiples fonctions cellulaires, incluant notamment la prolifération et la survie cellulaire. La délétion homozygote de GSK3? chez les souris est létale au stade embryonnaire E13,5 et il a été démontré que l'apoptose massive des hépatocytes due à une hypersensibilité au TNF? serait la principale cause de la létalité suggérant que l'activité de GSK3? est nécessaire pour la survie cellulaire. Plusieurs études suggèrent une activité des GSK3 plus élevée dans certains types de cancers, particulièrement au niveau des adénocarcinomes pancréatiques. Différentes études proposent que les GSK3 pourraient réguler la voie NF?B et influencer la prolifération et la survie des cellules pancréatiques tumorales. Mes travaux de maîtrise visaient à déterminer le rôle des GSK3 dans la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Dans un premier temps, l'inhibition prolongée (24 à 72h) de l'activité des GSK3 a permis d'observer une diminution de l'activité métabolique des cellules pancréatiques tumorales humaines : MIA PaCa2 et PANC-1. Cette diminution semble être due en partie à une induction de l'apoptose et à une inhibition de la prolifération cellulaire. En effet, l'inhibition des GSK3 induit l'apoptose chez les cellules pancréatiques tumorales humaines (MIA PaCa2, PANC-1 et BxPC3) après 48 et 72h, mais non chez les cellules d'origine non-tumorale (HPDE6 et HEK293T). L'étude plus approfondie du mécanisme moléculaire de l'apoptose induit suite à l'inhibition des GSK3 par l'inhibiteur pharmacologique spécifique SB216763 démontre 1- l'activation des caspases 3 et 7, 2- l'augmentation de l'homologue BCL-2 pro-apoptotique BIM et 3- la diminution de l'homologue anti-apoptotique BCL-2. L'analyse des voies de signalisation associées à la survie cellulaire et à l'apoptose suite à l'inhibition des GSK3 a permis d'observer l'activation de la voie JNK-c-Jun qui contribuerait potentiellement à l'induction de l'apoptose. À cet égard, nous avons observé que la voie JNK est nécessaire 1- au clivage de PARP, 2- à l'activation de la caspase 7 et 3- à l'augmentation de BIM induit par l'inhibition des GSK3. De plus, la diminution de l'expression de c-Jun, une cible des JNK, à l'aide d'un siARN prévient la modulation de BIM par l'inhibition des GSK3, alors que l'induction de l'apoptose n'est pas bloquée. Donc, l'activation de la voie JNK-c-Jun semble également nécessaire à la régulation de l'homologue BCL-2 proapoptotique BIM. Nous avons ensuite observé que la voie MEKK1-JNK-c-Jun semble insuffisante pour induire l'apoptose des cellules PANC-1, suggérant que l'activation de la voie JNK pourrait requérir la régulation de d'autres voies afin d'induire l'apoptose. Dans un deuxième temps, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h inhibe la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. En effet, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h empêche l'atteinte du point de restriction en phase G1 du cycle cellulaire. Nous avons observé qu'en réponse au sérum les GSK3 sont inactivées de façon transitoire (0- 10h) avant d'être réactivées (10-16h). L'inhibition de l'activité des GSK3 lors de leur réactivation (10-16h) par le SB216763 prévient 1- l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et 2- l'augmentation d'E2F1 induites par le sérum et 3- diminue l'expression d'E2F4, suggérant un rôle des GSK3 dans la phase G1 tardive du cycle cellulaire. Également, nous avons observé la présence de complexes formés de GSK3-pRb et de GSK3?-E2F4 dans les cellules pancréatiques tumorales humaines. Ces observations suggèrent que l'activité des GSK3 pourrait contribuer à l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et pourrait également réguler directement l'activité des E2F. Bref, ces résultats suggèrent que l'activité des GSK3 est essentielle pour la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Les auteurs suggèrent donc que l'inhibition des GSK3 pourrait s'avérer un traitement potentiel du cancer pancréatique, en ciblant les cellules cancéreuses. [Symboles non conformes]

Caspase-7 is a member of a family of cysteine proteases that includes apoptotic initiators (caspases-8, -9 and -10) and executors (caspases-3, -6 and -7). During apoptosis, executioner caspases are cleaved by initiator caspases either by the extrinsic (death receptors) or by the intrinsic (mitochondrial) pathway of caspase activation. Caspase-7 is an obligate dimer in the cell and cleavage of the interdomain connector (IDC), which split the catalytic domain in two subunits, at either site 1 or site 2 allows the conversion of the enzyme from the zymogen (inactive) state to the active state through a conformation switch that leads to the creation of a substrate binding pocket and the catalytic site. During caspase-7 activation, a 23-residue N-terminal peptide is also cleaved. Consequently, caspase-7 displays different N-terminal residues from those of its zymogen. This can change the stability of caspase-7 according to the N-end rule, which relates the half-life of a protein with the residue presented at its N-terminus. This degradation pathway controls the ubiquitination of the protein based on the N-terminus. To replicate the different forms of caspase-7 produced during its activation process in a controlled manner, a TEV protease cleavage site [ENLYFQ[arrow down](S/A)] was strategically inserted to mimic the different possibilities of IDC cleavage: 1) cleavage at site 1 only, 2) cleavage at site 2 only, or 3) a double cleavage. This was done in order to obtain the N-terminal residues normally presented during the cleavage of caspase-7. These constructions have been also optimized to preserve the proteolytic activity of the enzyme with as little change as possible to the length of the IDC. These constructs were cleaved by TEV protease in vitro and in cellulo and allowed the activation of apoptosis. Furthermore, the cellular half-life of caspase-7 seems to be changed by its cleavage. In conclusion, we have developed an interesting tool for the study of caspase-7.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.