Peroxidases atuam catalisando a redução do peróxido de hidrogênio à água a fim de minimizar o dano celular e modular, direta ou indiretamente, respostas celulares dependentes da sinalização operada por esta espécie reativa de oxigênio. Análises prévias, feitas em bancos de dados de sequências genômicas, permitiram a identificação de uma nova heme peroxidase não-animal (ascorbato peroxidase-relacionada ou APx-R), a qual foi descrita pela primeira vez em 2011 em um estudo publicado pelo nosso grupo de pesquisa. O trabalho detalhado nos próximos capítulos desta tese teve como objetivo caracterizar a participação de APx-R no metabolismo antioxidante vegetal através de abordagens filogenéticas e funcionais. Os resultados apresentados nos capítulos dois e três mostram que APx-R é uma peroxidase de classe I, filogeneticamente relacionada à ascorbato peroxidase, citocromo-c peroxidase e catalase peroxidase. Em Arabidopsis thaliana, APx-R codifica uma proteína cloroplastídica que atua regulando os processos de germinação e maturação da semente. A superexpressão de APx-R in planta afetou drasticamente a viabilidade das sementes, sugerindo que os níveis de expressão deste gene devem ser rigorosamente controlados para permitir o desenvolvimento da planta. Além disso, as análises filogenéticas aqui apresentadas levaram à identificação de uma nova família de peroxidases (intitulada ascorbato peroxidase-like ou APx-L), adicionando um novo componente ao complexo sistema antioxidante vegetal. / Peroxidases act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cell injury and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genome databases, we identified a non-animal heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) present from basal to vascular plants, which was initially described in a study published by our group in 2011. The work described hereafter aimed to characterize APx-R participation in the antioxidant metabolism through phylogenetic and functional approaches. The results presented on chapters two and three showed that APx-R is a class I peroxidase, phylogenetically related to ascorbate peroxidase, cytochrome-c peroxidase and catalase peroxidase. In Arabidopsis thaliana, APx-R gene encodes a chloroplast protein which acts regulating germination and seed maturation processes. The overexpression of APx-R in planta impaired seed viability, showing that APx-R expression level must be tightly controlled in order to enable plants to develop properly. In addition, the phylogenetic analysis here presented allowed the identification of a new peroxidase family, called ascorbate peroxidase-like (APx-L), which adds a new component into plant antioxidant metabolism.

Peroxidases atuam catalisando a redução do peróxido de hidrogênio à água a fim de minimizar o dano celular e modular, direta ou indiretamente, respostas celulares dependentes da sinalização operada por esta espécie reativa de oxigênio. Análises prévias, feitas em bancos de dados de sequências genômicas, permitiram a identificação de uma nova heme peroxidase não-animal (ascorbato peroxidase-relacionada ou APx-R), a qual foi descrita pela primeira vez em 2011 em um estudo publicado pelo nosso grupo de pesquisa. O trabalho detalhado nos próximos capítulos desta tese teve como objetivo caracterizar a participação de APx-R no metabolismo antioxidante vegetal através de abordagens filogenéticas e funcionais. Os resultados apresentados nos capítulos dois e três mostram que APx-R é uma peroxidase de classe I, filogeneticamente relacionada à ascorbato peroxidase, citocromo-c peroxidase e catalase peroxidase. Em Arabidopsis thaliana, APx-R codifica uma proteína cloroplastídica que atua regulando os processos de germinação e maturação da semente. A superexpressão de APx-R in planta afetou drasticamente a viabilidade das sementes, sugerindo que os níveis de expressão deste gene devem ser rigorosamente controlados para permitir o desenvolvimento da planta. Além disso, as análises filogenéticas aqui apresentadas levaram à identificação de uma nova família de peroxidases (intitulada ascorbato peroxidase-like ou APx-L), adicionando um novo componente ao complexo sistema antioxidante vegetal. / Peroxidases act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cell injury and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genome databases, we identified a non-animal heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) present from basal to vascular plants, which was initially described in a study published by our group in 2011. The work described hereafter aimed to characterize APx-R participation in the antioxidant metabolism through phylogenetic and functional approaches. The results presented on chapters two and three showed that APx-R is a class I peroxidase, phylogenetically related to ascorbate peroxidase, cytochrome-c peroxidase and catalase peroxidase. In Arabidopsis thaliana, APx-R gene encodes a chloroplast protein which acts regulating germination and seed maturation processes. The overexpression of APx-R in planta impaired seed viability, showing that APx-R expression level must be tightly controlled in order to enable plants to develop properly. In addition, the phylogenetic analysis here presented allowed the identification of a new peroxidase family, called ascorbate peroxidase-like (APx-L), which adds a new component into plant antioxidant metabolism.

Peroxidases atuam catalisando a redução do peróxido de hidrogênio à água a fim de minimizar o dano celular e modular, direta ou indiretamente, respostas celulares dependentes da sinalização operada por esta espécie reativa de oxigênio. Análises prévias, feitas em bancos de dados de sequências genômicas, permitiram a identificação de uma nova heme peroxidase não-animal (ascorbato peroxidase-relacionada ou APx-R), a qual foi descrita pela primeira vez em 2011 em um estudo publicado pelo nosso grupo de pesquisa. O trabalho detalhado nos próximos capítulos desta tese teve como objetivo caracterizar a participação de APx-R no metabolismo antioxidante vegetal através de abordagens filogenéticas e funcionais. Os resultados apresentados nos capítulos dois e três mostram que APx-R é uma peroxidase de classe I, filogeneticamente relacionada à ascorbato peroxidase, citocromo-c peroxidase e catalase peroxidase. Em Arabidopsis thaliana, APx-R codifica uma proteína cloroplastídica que atua regulando os processos de germinação e maturação da semente. A superexpressão de APx-R in planta afetou drasticamente a viabilidade das sementes, sugerindo que os níveis de expressão deste gene devem ser rigorosamente controlados para permitir o desenvolvimento da planta. Além disso, as análises filogenéticas aqui apresentadas levaram à identificação de uma nova família de peroxidases (intitulada ascorbato peroxidase-like ou APx-L), adicionando um novo componente ao complexo sistema antioxidante vegetal. / Peroxidases act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cell injury and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genome databases, we identified a non-animal heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) present from basal to vascular plants, which was initially described in a study published by our group in 2011. The work described hereafter aimed to characterize APx-R participation in the antioxidant metabolism through phylogenetic and functional approaches. The results presented on chapters two and three showed that APx-R is a class I peroxidase, phylogenetically related to ascorbate peroxidase, cytochrome-c peroxidase and catalase peroxidase. In Arabidopsis thaliana, APx-R gene encodes a chloroplast protein which acts regulating germination and seed maturation processes. The overexpression of APx-R in planta impaired seed viability, showing that APx-R expression level must be tightly controlled in order to enable plants to develop properly. In addition, the phylogenetic analysis here presented allowed the identification of a new peroxidase family, called ascorbate peroxidase-like (APx-L), which adds a new component into plant antioxidant metabolism.

FONTENELE, A. V. de. Defesa antioxidativa em plantas de arroz duplamente silenciadas nas APXs citosólicas e expostas a estresses abióticos. 93 f. 2011. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T17:21:05Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Rejected by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br), reason: descrição on 2013-05-20T19:16:48Z (GMT) / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:16Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_adevfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) Previous issue date: 2011 / The aim of this study was to characterize physiological and biochemical aspects that show if rice plants (Oryza sativa) knockdown on cytosolic ascorbate peroxidase enzyme (cAPX) are more susceptible to oxidative stress than the wild type plants. APX is an important enzyme from oxidative metabolism of plants, acting on regulation of the endogenous levels of hydrogen peroxide (H2O2). For this, rice plants knockdown on cAPX (Apx1/2s) and wild type (WT) were used for the experimentation. The plants were silenced by interference RNA technical (iRNA) and were grown for 35 days into 1.5 L pots containing nutritive solution under greenhouse conditions. The experiment I was performed with leaves segments immersed in methyl viologen (MV) 50 μM for 24h and the experiment II was performed by application of the following treatments: salt stress, high light and MV. The results from experiment I shown Apx1/2s plants have a higher level of H2O2 high than the levels found on WT rice plants, suggesting that Apx1/2s plants present a level of H2O2 near a level of cell signaling. The fact of WT plants had accumulated H2O2 1h after the treatment suggest the necessity of a signaling H2O2 level for stimulate defense systems. Apx1/2s plants unlike of WT plants presented a constant decline on H2O2 content, indicating a likely H2O2 scavenging excess. After 3h of treatment the chloroplastic enzymes SOD, APX and PHGPx presented upper active in Apx1/2s plants, in control and stress, compared with WT plants. These results suggest the existence of an antioxidant system quite active in the Apx1/2s plants. In experiment II the Apx1/2s plants presented no differences in the photochemical parameters when compared with WT plants, even possessing a smaller photosynthesis under controlled conditions. The energy dissipation (NPQ) in the Apx1/2s plants under high light was, in average, higher than WT plants, suggesting better energy dissipation. Even with efficient energy dissipation, the plants could not avoid the excess of energy in the photosystem and they suffered photoinhibition and damage in photosynthetic apparatus (Fv/Fm). In relation the WT plants, Apx1/2s plants presented a higher activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and PHGPx under controlled conditions, probably intending compensate the lack of cAPX. In the MV treatment the chloroplastic PHGPx was stimulated above 100% in the Apx1/2s plants, indicating that these plants can repair oxidative damage faster than the WT plants. The results suggest that Apx1/2s plants, despite the absence of cAPX, activated additional security systems to compensate the lack of cAPX and respond quickly and efficiently to stress situations. / O objetivo do presente trabalho foi caracterizar aspectos fisiológicos e bioquímicos que mostrem se plantas de arroz (Oryza sativa) deficientes da enzima citosólica peroxidase do ascorbato (cAPX) são mais suscetíveis ao estresse oxidativo do que as plantas com cAPX. A APX é uma importante enzima do metabolismo oxidativo de plantas, atuando na regulação dos níveis endógenos do peróxido de hidrogênio (H2O2). Para isso, plantas deficientes em cAPX (Apx1/2s) e plantas não transformadas (WT) foram utilizadas para a experimentação. As plantas foram silenciadas pela técnica do RNA de interferência (iRNA) e cultivadas por 35 dias em vasos de 1.5 L contendo solução nutritiva sob condições de casa de vegetação. O experimento I foi realizado com segmentos de folhas imersos em metil-viologênio (MV) 50 M durante 24h, e o experimento II foi realizado pela aplicação dos seguintes estresses abióticos: salinidade, alta luminosidade e MV. Os resultados do experimento I mostraram que as plantas Apx1/2s possuem um nível basal de H2O2 maior do que os níveis encontrados nas plantas WT, sugerindo que as plantas Apx1/2s apresentam um nível de H2O2 próximo de um nível de sinalização celular. O fato das plantas WT terem acumulado H2O2 após 1h de tratamento sugere a necessidade de um nível sinalizador de H2O2 para ativação dos sistemas de defesa. As plantas Apx1/2s ao contrario das WT apresentaram uma queda constante no conteúdo de H2O2, indicando uma provável remoção do excesso de H2O2. Após 3h de tratamento as enzimas SOD, APX e PHGPx de cloroplasto apresentaram atividade superior nas plantas Apx1/2s, tanto no controle quanto no estresse, comparadas com as plantas WT. Esses resultados sugerem existência de um sistema antioxidante bastante ativado nas plantas Apx1/2s. No experimento II as plantas Apx1/2s não apresentaram diferenças nos parâmetros fotoquímicos quando comparadas com as plantas WT, mesmo possuindo uma menor fotossíntese em condições controle. A dissipação do excesso de energia (NPQ) nas plantas Apx1/2s tratadas com luz foi, em média, maior que das plantas WT, indicando uma possível maior eficiência na dissipação de energia. Mesmo com eficiente dissipação de energia ambas as plantas não conseguiram evitar energia excessiva no fotossistema e acabaram sofrendo fotoinibição e danos no aparato fotossintético (Fv/Fm). Em relação às plantas WT, as Apx1/2s apresentaram maior atividade das enzimas antioxidativas SOD, CAT e PHGPx nas condições controle, na provável tentativa de compensar a ausência da cAPX. No tratamento com MV a isoforma cloroplástica da PHGPx foi estimulada em mais de 100% nas plantas Apx1/2s, indicando que essas plantas podem reparar danos oxidativos com mais rapidez que as WT. Os dados sugerem que as plantas Apx1/2s, apesar da ausência da cAPX, ativam sistemas adicionais de proteção antioxidativa para compensar essa ausência e responder mais rápida e eficientemente a situações de estresse.

LIMA, A.B.de. Respostas Oxidativas em Plantas de Arroz Duplamente Silenciadas em APX Citosólica Submetidas a Estresses Abióticos. 117 f. 2011. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T18:54:07Z No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) Previous issue date: 2011 / O H2O2 é tido como molécula sinalizadora de vários eventos celulares e seu nível endógeno é controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estão distribuídas na célula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosólicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas são as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinação de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulação positiva da atividade de APX associada com menor acúmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosólica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condições controle. Em condições estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatório mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosólica e cloroplástica juntamente com antioxidantes não enzimáticos. Além disso, as APx1/2s submetidas a inibição irreversível de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintético e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosólica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatórios foram ativados para mitigar os possíveis efeitos negativos do acúmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosólicas de APX não são as enzimas mais importantes no controle dos níveis de H2O2, visto que plantas com ausência destas isoformas completam o ciclo de vida e são capazes de enfrentar situações de estresse. Além disso, é possível afirmar que a ação coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsáveis pela manutenção do equilíbrio redox celular em condições estressantes em plantas de arroz, diferente do que é noticiado para a planta-modelo Arabdopsis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências de Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:37:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221568.pdf: 1304790 bytes, checksum: 9564055aa620285f703ef5b9817c49e9 (MD5) / A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) resulta em alterações efetivas e complexas no sistema imunológico, caracterizada por uma depleção de linfócitos CD4+, as quais acompanham o aumento progressivo dos níveis plasmáticos da carga viral. Entre os mecanismos envolvidos nesta progressão, está a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), proveniente do estresse oxidativo gerado pela própria ativação crônica do sistema imune. A ação de EROs, assim como por constituintes virais, favorece a replicação viral via ativação de NF-kB e a depleção de linfócitos por apoptose, com conseqüente comprometimento do sistema imune. O objetivo desse estudo, duplo cego, controlado por placebo, foi investigar e comparar o possível efeito dos compostos antioxidantes ascorbato (CewinÒ, 2g/dia) e N-Acetil-Cisteína (NAC)(FluimucilÒ,600mg/dia), quando associados ao efeito inibidor da replicação viral dos antirretrovirais, através de parâmetros virológicos e celulares em pacientes soropositivos para o HIV-1. Foram avaliados: a carga viral do HIV-1, linfócitos CD4+, CD8+, relação CD4/CD8, percentual de células vivas, em apoptose e mortas, globulinas, IgA, IgG, IgM e b-2 microglobulina. Participaram do estudo 38 pacientes; destes, 13 foram suplementados com ascorbato 2g/dia, 10 suplementados com NAC, 800 mg/dia, e 15 fizeram uso de placebo. As análises foram realizadas antes do início do tratamento e após 60, 120 e 180 dias. Os resultados obtidos demonstraram significativa diminuição da carga viral em todos os grupos, em decorrência da terapia antirretroviral, acompanhada de um aumento significativo no número de linfócitos CD4+ e relação CD4/CD8, bem como diminuição significativa dos níveis de globulinas, IgA, IgG, IgM. Os resultados demonstraram ainda, um efeito significativo da suplementação com ascorbato sobre o percentual de linfócitos vivos, em apoptose, e sobre os níveis de b-2 Microglobulina. Neste estudo, conclui-se que a suplementação com ascorbato, 2g/dia, via oral, associada à terapia antirretroviral, propiciou um aumento na viabilidade dos linfócitos circulantes em pacientes HIV+, o que sugere um efeito benéfico na reconstituição do sistema imune nos pacientes que fazem uso do ascorbato. A NAC, entretanto, não apresentou nenhum resultado significante.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O H2O2 à tido como molÃcula sinalizadora de vÃrios eventos celulares e seu nÃvel endÃgeno à controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estÃo distribuÃdas na cÃlula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosÃlicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas sÃo as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinaÃÃo de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulaÃÃo positiva da atividade de APX associada com menor acÃmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosÃlica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condiÃÃes controle. Em condiÃÃes estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatÃrio mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosÃlica e cloroplÃstica juntamente com antioxidantes nÃo enzimÃticos. AlÃm disso, as APx1/2s submetidas a inibiÃÃo irreversÃvel de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintÃtico e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosÃlica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatÃrios foram ativados para mitigar os possÃveis efeitos negativos do acÃmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosÃlicas de APX nÃo sÃo as enzimas mais importantes no controle dos nÃveis de H2O2, visto que plantas com ausÃncia destas isoformas completam o ciclo de vida e sÃo capazes de enfrentar situaÃÃes de estresse. AlÃm disso, à possÃvel afirmar que a aÃÃo coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsÃveis pela manutenÃÃo do equilÃbrio redox celular em condiÃÃes estressantes em plantas de arroz, diferente do que à noticiado para a planta-modelo Arabdopsis. / Plants in the field are exposed to multiple stresses, such as salinity, drought, high light, heat/cold and others, resulting in different physiological responses. T o evaluate the consequences of some of these stresses to the photosynthetic apparatus and an tioxidative metabolism, 30 day old rice plants , were submitted to the following treatments: control (without NaCl and at 27 ÂC), heat stress (without NaCl and at 42 ÂC), salt stress (with 100 mM NaCl and at 27 ÂC) and combined stress (salt+heat). The contr ol and salt stress treatments lasted 8 days and the heat and combined stress treatments lasted 6 hours. At the end of the experimental period, gas exchange, chlorophyll fluorescence and electrolyte leakage were measured and the leaves were collected for bi ochemical determinations. I solated salt and heat stress es were not sufficient to cause damage in the photochemical apparatus and heat stress only modifie d stomatal aperture. In combined heat and salt stress , the results indicate that photosynthetic process es were affected at the level of CO 2 assimilation and quantum efficiency. E lectrolyte leakage, TBARS and H 2 O 2 content were elevated in sal t +heat treatment, but in isolate d heat stress the TBARS was decreased. Reduced ascorbate and glutathione were similarly decrease d in plants exposed to the combination of salt and heat. A ll enzymes examin ed here were differently modulated in experimental treatment s . Taken together, the data indicates more intense impairment of photosynthesis in rice plants in the c ombination of the salt and heat, however the effective modulation of the antioxidative system was eff ective in establishing a new redox homeostasis and providing tolerance to abiotic stress.

Submitted by Helena Bejio (helena.bejio@unioeste.br) on 2017-11-22T18:59:05Z No. of bitstreams: 2 Daiana LB Franca 2016.pdf: 861200 bytes, checksum: 32ce3c922ac5969d272d83b1d94ae315 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-22T18:59:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Daiana LB Franca 2016.pdf: 861200 bytes, checksum: 32ce3c922ac5969d272d83b1d94ae315 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Ethanol has been studied as an inhibitor of ethylene biosynthesis, which can be of great benefit for the post-harvest conservation of fruits. However, studies have shown that some climacteric fruits, such as banana, did not respond to ethanol. The ability of the banana to absorb ethanol may be limited and interfere with its ethylene regulatory action. The objective of this work was to evaluate the effect of exposure time and ethanol dose on ethylene production, respiration, antioxidant enzymes and postharvest preservation of 'Prata' banana. A first sample of bananas was exposed to ethanol vapor (100 μL) for 10.0 hours. Another sample of bananas was exposed to 50, 100 and 150 μL of ethanol and then stored for 12 days. Respiratory rate, ethylene production, activities of the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), phenylalanine ammoniumase (FAL) and polyphenoloxidase (PPO), physicochemical characteristics and degradation were evaluated. The respiration rate and ethylene production of ethanol treated bananas (71.13 mg CO2 kg-1 h-1 and 0.009 μg C2H4 kg-1 h-1, respectively) were lower than the control fruits (101.58 mg kg -1 h -1 and 0.014 μg kg -1 h -1, respectively), but this occurred only with 4 hours of exposure to ethanol, during which time there was a peak of ethanol uptake in the fruit. Ethanol caused higher SOD and CAT activity and less APX activity of banana bark only in the first two hours of exposure, but this was not related to ethylene production or respiratory rate. Ethanol influenced changes in PPO and FAL activities after the peak of its maximum absorption by the fruit (4 hours). During storage, ethanol caused a decrease in the ethylene production of the fruits, but there was no effect of the doses. Ethanol did not influence the respiratory rate, sugar conversion, texture and loss of fresh banana mass during storage. This study showed that ethanol has an effect on the metabolism of ethylene, but that this has no reflection on some quality parameters of 'Prata' banana. On the other hand, ethanol was able to delay the degradation of the fruit, and this is commercially advantageous. / O etanol tem sido estudado como um inibidor da biossíntese de etileno, o que pode ser de grande benefício para a conservação pós-colheita de frutos. Entretanto, estudos mostraram que alguns frutos climatéricos, como a banana, não mostraram resposta ao etanol. A capacidade da banana em absorver etanol pode ser limitada e interferir na sua ação reguladora do etileno. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tempo de exposição e da dose de etanol sobre a produção de etileno, respiração, enzimas antioxidantes e conservação pós-colheita da banana ‘Prata’. Uma primeira amostra de bananas foi exposta ao vapor de etanol (100 µL) por 10,0 horas. Outra amostra de bananas foi exposta a 50, 100 e 150 µL de etanol e depois foi armazenada por 12 dias. A taxa respiratória, produção de etileno, atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX), fenilalanina amonialiase (FAL) e polifenoloxidase (PPO), características físicoquímicas e degradação, foram avaliadas. A taxa respiratória e a produção de etileno das bananas tratadas com etanol (71,13 mg CO2 kg-1 h-1 e 0,009 µg C2H4 kg-1 h-1, respectivamente) foram inferiores aos frutos do controle (101,58 mg kg-1 h-1 e 0,014 µg kg-1 h-1, respectivamente), mas isso ocorreu apenas com 4 horas de exposição ao etanol, período no qual houve um pico de absorção de etanol no fruto. O etanol causou maior atividade de SOD e CAT e menor atividade da APX da casca das bananas apenas nas duas primeiras horas de exposição, mas isso não esteve relacionado com a produção de etileno ou taxa respiratória. O etanol influenciou mudanças nas atividades de PPO e FAL após o pico de sua máxima absorção pelo fruto (4 horas). Durante o armazenamento, o etanol causou diminuição da produção de etileno dos frutos, mas não houve efeito das doses. O etanol não influenciou a taxa respiratória, a conversão de açúcares, a textura e a perda de massa fresca da banana durante o armazenamento. Este estudo mostrou que o etanol tem efeito sobre o metabolismo do etileno, mas que isso não tem reflexo sobre alguns parâmetros de qualidade da banana ‘Prata’. Por outro lado, o etanol foi capaz de atrasar a degradação do fruto, e isso é vantajoso comercialmente.

Peroxirredoxinas (Prxs) são enzimas que desempenham papéis centrais no metabolismo redox celular, são proteínas abundantes reduzindo peróxidos com uma velocidade extraordinária. As Prxs estão presentes em todos os grupos taxonômicos, possuem várias isoformas com diferentes funções, tais como antioxidantes, chaperonas moleculares e reguladores da transdução de sinal. São peroxidases tióis dependentes baseadas em um resíduo de cisteína catalítico podendo ser divididas em 1-Cys ou 2-Cys, dependendo do número de resíduos de cisteínas envolvidos na catálise. Inicialmente a redução das Prxs foi descrita por ser estritamente dependente de tióis, no entanto nosso grupo demonstrou que o ascorbato também poderia reduzir o sulfênico intermediário das 1-Cys Prx (1-Cys Prx-SOH) em diferentes organismos. Esses dados representam um quebra no paradigma antioxidante tiól específico, mostrando que o ascorbato pode reduzir os ácidos sulfênicos nas 1-Cys Prx. Para obter evidências que o ascorbato possa ser considerado um redutor biológico das 1-Cys Prx, foi necessário determinar a constante de segunda ordem, uma vez que em células, outros compostos podem competir com este antioxidante. Devido a problemas técnicos, este foi um desafio por muitos anos. Neste trabalho, descrevemos a caracterização cinética da redução de ácidos sulfênicos por ascorbato em diferentes proteínas. Primeiramente, a redução das 1-Cys Prx-SOH foi analisado usando a enzima de A. fumigatus (AfPrxA) que apresenta similaridade de 37% com a Prdx6 (1-Cys Prx humana) e foi considerada uma enzima bastante estável. Inicialmente, realizamos a análise bi-substrato utilizando eletrodos específicos para H2O2 (Free Radical Analyzer 4100 da World Precision Instruments Inc.), através de uma abordagem de estado estacionário. AfPrxA decompõem H2O2 em uma reação ascorbato dependente com boa eficiência (kcat/KM asc = 7.4 x 103 M-1s-1), através de um mecanismo Bi-Bi Ping-Pong. Para apoiar ainda mais esses resultados, desenvolvemos uma abordagem cinética independente, baseada na competição entre diclorofenolindofenol (DCPIP) e ácidos sulfênicos por ascorbato. DCPIP é um sensor redox, cuja a coloração azul é perdida quando reduzido. Primeiramente, confirmamos que o DCPIP foi reduzido por ascorbato com uma constante de segunda ordem de 718 M-1s-1, similar a valores descritos na literatura anteriormente. Este método validou nossas condições de ensaio, permitindo determinar a constante de segunda ordem de reação entre AfPrxA-SOH e ascorbato (1,5 x 103 M-1s-1) a pH 7,44, 25ºC através da abordagem de pseudo-primeira ordem. Portanto, por dois métodos diferentes, demonstramos que o ascorbato reduz a AfPrxA-SOH com constantes de velocidade na ordem de 103 M-1s-1. Este ensaio também nos permitiu determinar as constantes de segunda ordem para as 1-Cys Prx de diferentes organismos como bactéria, levedura, planta e mamíferos. Em todos os casos, as constantes de velocidade foram na ordem de 103 M-1s-1. Posteriormente, analisamos se a 2-Cys Prx de levedura (Tsa1), que possui uma mutação na cisteína de resolução por um resíduo de serina (Tsa1-C170S) poderia adquiri atividade ascorbato dependente. Novamente, a forma ácido sulfênico da Tsa1-C170S foi reduzida por ascorbato na mesma ordem de grandeza de 103 M-1s-1. Em adição, decidimos investigar a redução dos Cys-SOH por ascorbato em outras proteínas como Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e Papaína que também possuem um ácido sulfênico como produto da oxidação. A constante de segunda ordem obtida da reação com ascorbato foi novamente à mesma ordem de grandeza (103 M-1s-1). Em conclusão, a redução de ácidos sulfênicos presentes nas Prxs por ascorbato pode ser considerada relevante em compartimentos subcelulares em que este redutor esteja presente em grandes quantidades. Além disso, o ascorbato pode reduzir ácidos sulfênicos de outras proteínas, e esta interação pode representar uma nova via na biologia redox que ainda precisa ser explorada in vivo / Peroxiredoxins (Prxs) are enzymes that play central roles in cellular redox metabolism, since they reduce peroxides with extraordinary rates and are abundant proteins. Prxs are found in all kingdoms with multiple isoforms, performing multiple functions such as antioxidants, molecular chaperones, and regulators of signal transduction. Prxs are Cys-based, thiol-dependent peroxidases with remarkable catalytic efficiency that can be divided into 1-Cys or 2-Cys, depending on the number of Cys residues involved in catalysis. Initially, reduction of Prxs was described to be strictly dependent on thiols, but later we showed that ascorbate can also reduce the sulfenic intermediate of 1-Cys Prx (1-Cys Prx-SOH) from various organisms. These data represented a breakthrough in the thiol-specific antioxidant paradigm, as ascorbate can also reduce sulfenic acids in 1-Cys Prx. To gain evidences that ascorbate could be a biological reductant for 1-Cys Prx it was necessary to determinate the respective second order rate constant, since in cells other compounds might compete with this antioxidant. Due to technical issues, this was a challenge for many years. In this work, we describe the kinetic characterization of sulfenic acid reduction by ascorbate in several proteins. Firstly, the reduction of 1-Cys Prx-SOH by ascorbate was analyzed using an enzyme from A. fumigatus (AfPrxA) that is 37% similar to PRDX6 (human 1-Cys Prx) and was quite stable. Initially, a steady-state, bi-substrate approach was followed by means of a specific H2O2 electrode (Free Radical Analyzer 4100, World Precision Instruments Inc.). AfPrxA decomposed H2O2 in an ascorbate dependent manner with good efficiency (kcat/KM asc = 7.4 x103 M-1s-1), through a Bi-Bi Ping-Pong mechanism. To further support these findings, we developed an independent, competitive kinetic approach based on the competition between dichlorophenolindophenol (DCPIP) and sulfenic acid to ascorbate. DCPIP is a redox sensor, whose blue color is lost when reduced. Firstly, we confirmed that in our conditions DCPIP was reduced by ascorbate with a second-order rate constant of 718 M-1s-1, similar to values previously described. This procedure validated our assay conditions and allowed us to proceed in the competitive method for the determination of the second order rate constant of the reaction of AfPrxA-SOH with ascorbate (1,5 x 103M-1s-1) at pH 7.44, 25ºC by pseudo first order approach. Therefore, by two independent approaches, we showed that ascorbate reduced AfPrxA-SOH with rate constants in the 103 M-1s-1 range. It also allowed us to determine the second order rate constants for the reduction 1-Cys Prxs from other organisms such as bacteria, yeast, plant and mammal. In all cases, the rate constants were in the 103 M-1s-1 range. Subsequently, we analyzed whether a recombinant yeast 2-Cys Prx (Tsa1), whose resolving Cys (Cysr) was mutated to a serine residue (Tsa1-C170S) acquired the ascorbate dependent activity. Again, the sulfenic acid form of Tsa1-C170S was reduced by ascorbate in the same 103 M-1s-1 range. In addition, we decided to investigate the reduction of Cys-SOH by ascorbate in other proteins like glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and Papain that also have a sulfenic acid as product of their oxidation. The second order rate constants obtained for the reaction with ascorbate were again in the same range (103 M-1s-1). In conclusion, the reduction of sulfenic acids present in Prx by ascorbate might be relevant in the subcellular compartments in which this reductant is present at high levels, capable to compete with other reductants. Furthermore, ascorbate can reduce sulfenic acid in other proteins, and this interaction may represent a new route in redox biology that has yet be explored in vivo

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:40:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 214255.pdf: 1658518 bytes, checksum: c5817b005a84e2f801ce18d9dcb5a96c (MD5) / Os pacientes infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) apresentam diminuição dos níveis séricos de antioxidantes e aumento simultâneo na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), caracterizando um estado crônico de estresse oxidativo. A ativação imune crônica que ocorre desde os estágios iniciais da infecção é responsável pelo aumento da produção das EROs, que favorecem a replicação viral através da ativação de fatores de transcrição, como NF-kB e AP-1, e a depleção dos linfócitos por apoptose. Os elevados níveis de apoptose verificados nesses pacientes são responsáveis pelo comprometimento do sistema imune e progressão para AIDS. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da suplementação com 800 mg/dia de a-tocoferol e 2.000 mg/dia de ascorbato sobre a viabilidade celular e a evolução da infecção pelo HIV em pacientes submetidos à terapia antirretroviral, através da avaliação de marcadores laboratoriais. Participaram deste estudo 47 voluntários soropositivos para o HIV, destes, 13 foram suplementados com ascorbato, 14 com a-tocoferol e 20 fizeram uso de placebo. As análises laboratoriais foram realizadas antes do início do tratamento e após 60, 120 e 180 dias. Os resultados obtidos demonstraram o efeito adicional da suplementação sobre o aumento dos níveis de viabilidade celular (p=0,002) e diminuição dos níveis de apoptose (p=0,0001), independentes da terapia antirretroviral. Os níveis séricos de IgA apresentaram diminuição no grupo suplementado com a-tocoferol, no entanto não houve diferença estatística (p=0,490). Da mesma forma, houve uma tendência de melhores resultados dos níveis séricos de IgM no grupo suplementado com ascorbato (p=0,511). Para os marcadores CD4, CD8, relação CD4/CD8 e níveis plasmáticos de RNA do HIV, não observamos efeito adicional da suplementação com ascorbato ou a-tocoferol. A partir desses resultados concluímos que a suplementação com ascorbato e a-tocoferol constituem uma ferramenta importante na manutenção da viabilidade celular e recuperação do sistema imune em pacientes infectados pelo HIV.