Theme of this thesis is the passing nature of things or ``impermanence{\crqq}. The theoretical part of thesis, it covers the philosophy of the theme and give personal view on the theme of impermanence, using quotes from experts in the field of philosophy. It discusses the sections chosen for the practical part of the thesis. The practical part of this thesis is divided in five basic sections {--} man, animal, tree, machine and rock. The next theoretical parts are devoted to colours, textures of material, action painting and gestical abstraction. The application of the techniques and processes in teaching is discussed. In conclusion, I give my personal interpretation of the theory and apply it to this thesis. The practical part of this thesis consists of a cycle of 10 paintings (60 x 80 cm) in acrylic. The cycle is devoted to man, animal, tree, machine and rock in relation to the central theme.

A artrite reumatoide (AR) é uma doença crônica, inflamatória, sistêmica, com manifestações autoimunes articulares e extra-articulares, como fraqueza e atrofia muscular. Apesar de terem profundo impacto funcional, os mecanismos envolvidos nesses processos em músculo esquelético têm sido pouco estudados. O objetivo desse trabalho foi descrever o envolvimento muscular e vias moleculares em um modelo experimental de artrite e em um modelo de atrofia por desuso. Ratas Wistar, 8-12 semanas foram separadas em três grupos: controle (CO), imobilizado com bota de cobre (IM) e artrite induzida por colágeno bovino tipo II (CIA). A locomoção espontânea e o peso dos animais foram avaliados semanalmente. As articulações tíbio-társicas e os músculos gastrocnêmicos foram processados e corados com hematoxilina-eosina (HE). Imunoblot foi realizado para quantificar MuRF- 1, miogenina e anti-LC3. O nível de significância foi considerado quando p<0,05. A análise histológica das articulações confirmou a severidade da doença. Na locomoção espontânea houve uma diferença significativa na distância, velocidade, número de vezes em pé e número de descanso com redução no grupo CIA, quando comparado ao grupo controle, de 90%, 90%, 75% e aumento de 70%, respectivamente. O peso corporal total, o peso do músculo gastrocnêmio, e o peso relativo do músculo reduziram 20%, 30% e 20% nos animais CIA, quando comparado ao grupo controle. A análise histopatológica identificou no músculo de CIA: atrofia de fibras perifasciculares, infiltrado inflamatório, fibras atróficas do tipo 2 e edema. A área seccional da miofibra estava reduzida em torno de 30% no grupo CIA e 60% no IM. Na quantificação proteína demonstrou aumento da expressão em 70% das proteínas MuRF-1 e miogenina no grupo CIA quando comparado ao grupo controle, resultado não observado em IM. Na quantificação da proteína LC3 não houve diferença entre os grupos. Esse estudo demonstrou que o desenvolvimento da artrite experimental está associado com perda de peso e da mobilidade, atrofia muscular e degradação muscular nesses animais. Pela primeira vez foi demonstrado que a atrofia muscular na artrite está associada com a própria doença e não com a imobilidade, visto que o grupo IM, apesar de atrofia mais muscular mais marcada, não apresentou ativação das vias de atrofia (MuRF-1 e miogenina) que foram observadas no grupo CIA. / Objective: Although causing great functional impact, the mechanisms of muscle wasting in RA have been poorly studied. The objective of this study is to describe the muscular involvement in an experimental model of arthritis and its pathways and compare with disuse atrophy. Methods: Female Wistar rats were separated in three groups: control (CO), collageninduced arthritis (CIA) and immobilized (IM). Spontaneous locomotion and weight were evaluated weekly. Gastrocnemius muscle was evaluated by histology and immunoblotting to measure LC3, MuRF-1 and myogenin expression. Significance was considered at p<0.05 level. Results: Histological analysis of the joint confirmed the severity of the arthropathy. There was significant difference in spontaneous locomotion (distance, velocity, number of times standing and number of times resting) in CIA group. Animal body weight, gastrocnemius muscle weight and relative muscle weight decreased 20%, 30% and 20% in CIA rats. Inflammatory infiltration, swelling and type 2 fiber atrophy was present in CIA gastrocnemius muscles, with reduced cross-sectional area by 30%, and 60% in IM. Imunoblotting analysis demonstrated increased expression of myogenin and MuRF-1 in CIA muscles by about 70%, while in IM remained similar to control. Conclusions: This study demonstrated that the development of experimental arthritis is associated to decreased mobility, weight loss, muscle atrophy, increased expression of markers of muscle proteolysis and regeneration. For the first time it is demonstrated that muscle atrophy in arthritis is associated with the disease itself, and not simply due to decreased mobility, since immobilized group presented no activation of the same atrophy pathways.

A miopatia esquelética em doenças sistêmicas é um importante preditor de mortalidade e prognóstico em diversas síndromes, incluindo a insuficiência cardíaca. Os danos músculo-esqueléticos em situações de comprometimento cardíaco são descritos pela literatura há décadas, entretanto, nenhum recurso farmacológico proposto até o momento mostrou-se eficiente em reverter esses prejuízos, ressaltando o papel do treinamento físico aeróbio. Apesar dos inegáveis benefícios desta terapia adjuvante no tratamento da insuficiência cardíaca, muito pouco se sabe sobre a intensidade de exercício capaz de otimizar os ganhos promovidos por esta intervenção. Dado isso, nesse estudo avaliamos a eficácia do treinamento físico aeróbio em alta intensidade na musculatura esquelética em ratos submetidos ao infarto do miocárdio, comparando-a com protocolo isocalórico realizado em intensidade moderada. Observamos que os animais infartados apresentaram alterações patológicas na musculatura esquelética, similarmente ao observado em pacientes com IC, como prejuízos em enzimas metabólicas fundamentais, atrofia muscular, perturbação da homeostase redox e ativação do complexo proteassomal 26S. Ambos os protocolos de treinamento físico aeróbio foram capazes de aprimorar substancialmente a capacidade funcional e potência aeróbia máxima nos animais infartados, prevenindo a queda da atividade máxima das enzimas hexoquinase e citrato sintase, restaurando a morfologia da musculatura esquelética e aumentando a distribuição de fibras musculares do tipo I, o que foi acompanhado por melhora do balanço redox e redução da atividade do complexo proteassomal 26S. Apesar do treinamento físico aeróbio em alta intensidade ter proporcionado resultados superiores ao protocolo de intensidade moderada em relação a capacidade funcional dos animais, as adaptações músculo-esqueléticas às diferentes intensidades de TFA apresentaram-se muito semelhantes / Impaired skeletal muscle performance in systemic diseases is shown to strongly predict mortality and long-term prognosis in a wide variety of syndromes, including heart failure. The clinical picture of skeletal muscle damage in cardiac situations has been described for decades. However, no pharmacological strategy proposed so far was shown to effectively prevent the onset of skeletal myopathy, reinforcing the role of aerobic exercise training in counteracting such phenomenon. Despite the well-known benefits of exercise training in sets of cardiac dysfunction, very little is known about the optimal exercise intensity to elicit maximal outcomes. Therefore, in the present study we compared the effects of high-intensity aerobic exercise training with those of an isocaloric moderate-intensity protocol on skeletal muscle adaptations in infarcted rats. Our data suggest that infarcted rats presented signs of skeletal myopathy resembling those observed in HF patients, such as metabolic enzymes impairment, skeletal muscle atrophy, disrupted redox balance and proteasomal overactivation. Here we show that both high- and moderate-intensity aerobic exercise training were able to substantially increase aerobic capacity in infarcted rats, preventing the decay of citrate synthase and hexokinase maximal activities, reestablishing normal skeletal muscle morphology to a healthy profile and increasing the number of type I muscle fibers. Such outcomes were accompanied by an improved redox balance and reduced proteasomal activity in skeletal muscle. Even though high-intensity aerobic interval training was superior to moderate-intensity in improving functional capacity, the observed adaptations in skeletal muscle were remarkably similar between the protocols. Therefore, our data allow us to conclude that high-intensity and moderate-intensity aerobic exercise training equally prevent skeletal myopathy induced by myocardial infarction in rats

Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram que a estimulação aguda dos receptores 2-adrenérgicos (2-AR) atenua a perda de massa muscular induzida pela desnervação motora (DEN) por meio de uma via dependente de AMPc/PKA. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ativação crônica destes receptores ainda são pouco conhecidos. Por outro lado, a ativação desta via de sinalização também está envolvida no controle da estabilidade dos receptores nicotínicos (AChR) na junção neuromuscular (JNM), sugerindo que a densidade dos AChR possa estar sob controle neuro-humoral. Desta forma, aventou-se a possibilidade de que além dos efeitos protetores na massa muscular, a ativação dos receptores 2-AR pudesse mediar a estabilização dos AChR na placa motora. Para testar essa hipótese, camundongos foram submetidos à DEN através da secção do nervo ciático, um protocolo clássico de indução de atrofia muscular e desestabilização dos AChR, e tratados com salina ou clembuterol (CB), um 2-agonista seletivo, por até 14 dias. Após 3 dias de DEN, observou-se redução da massa muscular e aumento do conteúdo proteico e expressão do RNAm de genes relacionados à ativação do sistema Ubiquitina-Proteassoma (atrogina-1 e MuRF1) e do sistema autofágico/lisossomal (catepsina L e LC3). A DEN também promoveu aumento no turnover dos AChR, no número de vesículas endocíticas e na expressão do RNAm para a subunidade 1 dos AChR. Após 7 dias, a DEN reduziu a expressão dos genes relacionados à atrofia e aumentou a atividade da via do AMPc/PKA independentemente do tratamento com CB. Na tentativa de elucidar os sinais extracelulares que produziam esta resposta adaptativa, foi demonstrado que neurônios catecolaminérgicos trafegam ao longo do nervo ciático e sua ablação pela DEN reduziu o conteúdo de noradrenalina muscular. Baseados nestes resultados, foi postulado a existência de uma hipersenbilidade às catecolaminas em músculos desnervados cronicamente. O tratamento com CB por 3 dias aboliu o aumento da expressão dos atrogenes induzido pela DEN e este efeito foi associado ao maior conteúdo de AMPc e de substratos fosforilados pela PKA. Além disso, o CB diminuiu a hiperexpressão do RNAm para catepsina L e LC3 induzida pela DEN de 7 dias. Embora o CB não tenha alterado a meia-vida dos AChR em músculos inervados e desnervados, houve um total bloqueio do aumento do número de vesículas endocíticas contendo o AChR em músculos desnervados e tratados com CB. Corroborando estes dados, o CB aumentou a incorporação de AChR novos nas JNM e este efeito foi também associado à maior expressão do RNAm para a subunidade 1-AChR em músculos desnervados. Esta ação do CB no turnover dos AChR parece ser direta uma vez que neuroniôs catecolaminérgicos presentes no nervo ciático ativam receptores 2-ARe a produção de AMPc especificamente na JNM. Em estudos in vitro, foi demonstrado que a estimulação colinérgica produzida pelo carbacol (10-4M) diminuiu a velocidade de síntese de proteínas, aumentou a proteólise total e a atividade do sistema proteolítico Ca2+-dependente em músculos soleus de ratos por meio da ativação dos receptores nicotínicos. Este efeito catabólico do carbacol foi completamente bloqueado pela adição de CB (10-4M) ao meio de incubação. Os dados obtidos no presente estudo permitem sugerir que a estimulação crônica dos 2-AR no músculo esquelético induz um efeito anti-catabólico pela supressão dos sistemas proteolíticos proteassomal e lisossomal, provavelmente através da via de sinalização do AMPc/PKA. A inibição destes sistemas pode estar relacionada ao aumento do turnover dos AChR, uma vez que a velocidade de incorporação destes receptores na JNM foi aumentada pelo CB. Além disso, os achados que mostram a associação entre neurônios noradrenérgicos e colinérgicos no nervo ciático, que conjuntamente inervam as JNM, e a co-localização de receptores 2-AR e AChR na sinapse permitem sugerir a existência de uma interação funcional entre o sistema colinérgico e adrenérgico na manutenção da massa muscular e da placa motora. / Previous studies from our laboratory have shown that the acute stimulation of 2-adrenergic receptor (2-AR) attenuates the muscle loss induced by motor denervation (DEN) through a cAMP/PKA dependent pathway. However, the molecular mechanisms involved in the chronic activation of these receptors are poorly understood. Furthermore, the activation of this signaling pathway is also involved in controlling the stability of nicotinic receptors (AChR) at the neuromuscular junction (NMJ), suggesting that the density of AChR may be under neurohumoral control. Thus, we postulated that besides the protective effects on muscle mass the activation of 2-AR receptors could mediate the stabilization of AChR in the motor plate. To test this hypothesis, mice were submitted to DEN through of the sciatic nerve section, a classical protocol of induction muscle atrophy and destabilization of AChR, and were treated with saline or clenbuterol (CB), a selective 2-agonist for 14 days. DEN decreased the muscle mass and increased the protein content and mRNA expression of genes related to the activation of the ubiquitin-proteasome system (atrogin-1 and MuRF1) and autophagic/lysosomal system (cathepsin L and LC3). DEN also promoted an increase in the turnover of AChR, number of endocytic vesicles and the expression of mRNA for the 1 subunit of AChR. Interestingly, chronic DEN induced down-regulation of atrophy related-genes, and increased the activity of cAMP/PKA pathway independently of CB treatment. In an attempt to elucidate the extracellular signals that produced this adaptive response, it was demonstrated that catecholaminergic neurons travels along the sciatic nerve and its ablation by DEN reduces muscle norepinephrine content. Based on these results, it was postulated the existence of a muscle adrenergic hypersensitivity to circulating catecholamines induced by chronic DEN. CB treatment for 3 days completely abolished the higher expression of atrogenes and this effect was associated with increased Camp content and PKA phosphorylated substrates. Furthermore, CB decreased the DEN-induced hyperexpression of cathepsin L and LC3 mRNA at 7 days. Although CB has not altered the half-life of AChR in innervated and denervated muscles, it produced a total blockage of the increased number of endocytic vesicles containing the AChR in denervated muscles. Consistently, CB increased the incorporation of new AChR and this effect was associated with an increased expression of the 1-subunit AChR mRNA in denervated muscles. This action of CB on AChR turnover appears to be direct, since catecholaminergic neurons are present in the sciatic nerve stimulating 2-AR and cAMP production specifically in the NMJ. Furthermore, in vitro studies demonstrated that cholinergic stimulation produced by carbachol (10-4M) decreased the rate of protein synthesis and increased the proteolytic activity of Ca2+-dependent system in rat soleus muscle through activation of nicotinic receptors. This catabolic effect of carbachol was completely blocked by the addition of CB (10-4M) to the incubation medium. These data suggest that chronic stimulation of 2-AR in skeletal muscle induces an anti-catabolic effect by suppressing proteasomal and lysosomal proteolytic systems, probably through the cAMP/PKA signaling. The inhibition of these systems seems to be related to the increased AChR incorporation into NMJ induced by CB treatment. Moreover, the association between noradrenergic and cholinergic neurons in the sciatic nerve, both of which innervate the motor endplates, and the co-localization of AChR and 2-ARat the synapse suggest the existence of a functional interaction between cholinergic and adrenergic systems in the maintenance of muscle mass and motor endplate.

Orientador: Maeli Dal Pai / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:59:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_RodrigoWagnerAlves_D.pdf: 5360593 bytes, checksum: 671f4fb61a48674646503b892003184f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A insuficiência cardíaca (IC) caracteriza-se por reduzida tolerância ao exercício físico devido à ocorrência precoce de fadiga e dispnéia. Esses sintomas ocorrem, em parte, devido à atrofia e mudanças no fenótipo do músculo esquelético. O treinamento físico aeróbico é considerado uma conduta proposta e aceita para minimizar as alterações musculares na IC. Assim, entender os mecanismos moleculares envolvidos nas alterações dos músculos cardíaco e esquelético nessa doença pode ser favorável para a elaboração de intervenções terapêuticas e para o direcionamento de programas de treinamento específicos. O objetivo deste trabalho foi investigar a estrutura, função e componentes moleculares do coração, além da expressão gênica e proteica dos agentes que mediam as vias atrófica e hipertrófica no músculo esquelético de ratos com IC submetidos ao treinamento aeróbico. Foram utilizados ratos Wistar machos (90 a 100g) com três a quatro semanas de idade para a indução da IC através de estenose aórtica (EAo) supravalvar. Após 18 semanas da cirurgia de EAo, quando os animais apresentavam disfunção cardíaca, diagnosticada por ecocardiograma, foram aleatoriamente divididos para realizarem 10 semanas (5 dias/semana) de treinamento físico aeróbico (AS-ET) ou não (AS-UN). A velocidade de treinamento foi relativa ao limiar de lactato, obtido em teste progressivo. Assim, após 28 semanas os três grupos foram submetidos à outra análise ecocardiográfica e então os animais foram pesados e mortos. O coração foi removido e o ventrículo separado do átrio para investigação da fibrose e quantificação gênica. Os músculos sóleo e plantar foram coletados e para análise morfométrica, bioquímica, proteica e gênica das fibras musculares. A avaliação da expressão gênica e proteica dos componentes foi realizada por PCR em tempo real (RT-qPCR), e por Western blotting, respectivamente. O soro sanguíneo foi utilizado para análise dos níveis de IGF-1 e TNF-? pelo método de ELISA. Ao final do experimento, o grupo AS-UN que demonstrou sinais de IC, apresentou sinais de fibrose e aumento de componentes relacionados com a degradação do músculo cardíaco. Os músculos sóleo e plantar apresentaram atrofia em conjunto com um aumento na expressão de fatores catabólicos, como TNF-?, NF?B, MAFbx, MuRF1, FoxO1, e miostatina. No entanto, no grupo submetido ao treinamento aeróbico (AS-ET), a deterioração da estrutura e função cardíaca foi prevenida em associação com a atenuação da perda de músculo esquelético e diminuição dos promotores de atrofia. Interessantemente, as alterações na expressão dos fatores anabólicos não foram observadas. Contudo, no músculo plantar foram mantidos níveis elevados de PGC1? pelo treinamento físico. Assim, o treinamento físico realizado durante a transição entre hipertrofia cardíaca e IC teve a capacidade tanto de atenuar o prejuízo da estrutura e função cardíaca quanto prevenir a atrofia do músculo esquelético; fato que não ocorreu por um aumento dos fatores anabólicos, mas sim através da atividade anti-catabólica, possivelmente causada por ação de PGC1?. Estes achados indicam o potencial terapêutico do treinamento aeróbico em bloquear a atrofia muscular induzida pela IC através da atenuação do aumento do estado catabólico / Abstract: Heart failure (HF) is associated with exercise intolerance due to early fatigue and dyspnea. These symptoms are related to atrophy and changes in the skeletal muscle phenotype. Aerobic exercise training is proposed and accepted to minimize muscle abnormalities in HF. Thus, elucidate the molecular mechanisms related to cardiac and skeletal muscle alterations in this disease may help in designing therapeutic interventions and for targeting specific training programs. The aim of if the aerobic training performed during the transition from cardiac hypertrophy to HF would alter the cardiac structure, function and molecular expression, in addition to gene and protein levels of components that mediate atrophic and hypertrophic pathways in skeletal muscle of rats with HF submitted to aerobic training. Three- to four-week-old male Wistar rats weighing 90¿100 g were submitted to aortic stenosis surgery. A total of 8 age-matched control animals underwent left thoracotomy without clip placement (Sham group). At 18 weeks after surgery, when the aortic stenosis animals (AS) presented ventricular dysfunction as measured by echocardiography, the AS animals were redistributed into 2 groups: aortic stenosis untrained (AS-UN, n = 8), in which the group of AS rats remained untrained over a 10-week period, and aortic stenosis exercise training (AS-ET, n = 8), in which the AS rats that were subjected to 10 weeks of aerobic ET. After 28 weeks, all 3 groups underwent another echocardiogram and were then euthanized. The heart was removed, and the atria and ventricles were separated to fibrosis and gene expression analysis. The soleus and plantaris muscles were harvested to subsequent analysis of muscle fibers morphometry, bichemistry, protein and gene. The evaluation of gene expression and protein levels was performed by real-time PCR (RT-qPCR) and Western blotting, respectively. The serum was used for analysis of IGF-1 and TNF-? by ELISA. At the end of the experiment, At 28 weeks, the AS-UN group presented HF signs in conjunction with soleus and plantaris muscle atrophy and an increase in the expression of TNF-?, NF?B, MAFbx, MuRF1, FoxO1, and myostatin catabolic factors. However, in the AS-ET group, the deterioration of cardiac function was prevented in association with a prevention of muscle wasting and a decrease in atrophy promoters. Interestingly, changes in anabolic factor expression (IGF-I, AKT, and mTOR) were not observed. Nevertheless, in the plantaris muscle, high PGC1? levels were maintained by ET. Thus, the ability of aerobic training performed during the transition from cardiac hypertrophy to HF to attenuate cardiac function was accompanied by a prevention of skeletal muscle atrophy that did not occur via an increase in anabolic factors but through anti-catabolic activity, presumably caused by PGC1? action. These findings indicate the therapeutic potential of aerobic training to block HF-induced muscle atrophy by counteracting the increased catabolic state / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dionete_AllinyCarolina_M.pdf: 7519445 bytes, checksum: 4e7fd1c1acc58852052f9bc4765da65b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O timo é um órgão linfóide primário localizado no mediastino anterior cuja função principal é o desenvolvimento das células T. Os precursores imaturos dos linfócitos T oriundos da medula óssea chegam ao timo através da junção córtico-medular e são denominados de timócitos. Estes timócitos passam por estágio denominados duplo-negativos (DN), não expressando os co-receptores CD4 e CD8, duplo positivos, expressando estes dois receptores e simples positivo, expressando somente um dos receptores. Desta forma, o completo desenvolvimento de células T torna-se dependente da constante migração dos precursores hematopoiéticos através do microambiente tímico que é composto por componentes linfóides e não linfóides. Já está bem documentada na literatura a importância que a matriz extracelular (MEC) exerce nos processos de migração dos timócitos. Durante todo este processo, os timócitos interagem com os componentes do microambiente tímico composto pela rede tridimensional formada por células epiteliais tímicas (TEC), macrófagos, células dendríticas, fibroblastos e componentes da matriz extracelular. Contudo, esta rede tridimensional pode ser remodelada pela ação de enzimas denominadas metaloproteinases de matriz (MMPs) que são capazes de degradar componentes da MEC revelando sítios de ligação para diversas integrinas e liberando fatores de crescimento e quimiocinas interligadas a esta rede. No timo já foram descritos vários membros da família das MMPs, como a MMP-2, 9, 14, 19 e ADAM 10, 17 e 28. Contudo, pouco se sabe sobre a atuação destas moléculas nos processos intratímicos . Estudos recentes do nosso grupo mostraram que a atrofia tímica induzida por P. berghei, um protozoário transmitido através da picada de um mosquito do gênero anófeles, leva a numerosas alterações no ambiente tímico. Assim, no presente trabalho pretende-se avaliar, quantitativamente e funcionalmente, possíveis alterações nas metaloproteinases MMP-2, 9, bem como nos seus inibidores TIMP-1, TIMP-2 durante a atrofia tímica observada após infecção pelo Plasmodium berghei NK65 / Abstract: The primary function of the thymus is to develop immature T-cells into cells that will be able to carry out immune functions. So, alterations in its microenvironment may disrupt intrathymic processes leading to an altered exportation of T cell to the periphery. We have recently showed that experimentally Plasmodium berghei-infected mice present severe thymic alterations characterized by atrophy with depletion of double-positive thymocytes, histological alterations with loss of delimitation between cortical and medullar regions, and altered expression of cytokines and its respective receptors. Besides, it was also observed that such alterations, conjunctively, are able to promote increase of thymocyte migratory activity. Considering that MMPs also have a crucial role in thymocyte migration, in this study we investigated alterations in the expression pattern and activity of matrix metalloproteinases MMP-2, 9, 14, 19 and ADAM-28, as well as in tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1, TIMP-2 and RECK, by using the same experimental model. Our results show differential expression pattern of MMPs and TIMPs mRNAs among infected and non-infected mice. Besides, an imbalance between MMPs and their inhibitors those results in altered proteolytic activity were observed in thymus from infected mice. We hypothesize that disturbed MMP and TIMP expression and activity have also a role in the altered thymocyte migration through intrathymic microenvironments observed during plasmodium infection / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Le muscle squelettique adulte est un tissu possédant la capacité fondamentale d’adapter sa taille à la demande fonctionnelle : il peut s’atrophier ou s’hypertrophier en réponse à une variation de la charge mécanique qui lui est appliquée. A l’heure actuelle, les facteurs impliqués dans la plasticité musculaire demeurent méconnus. D’une part, grâce à différents modèles d’atrophie musculaire, nous démontrons que le facteur de transcription Srf joue le rôle de médiateur de la mécano-transduction par la voie actine/Mrtfs/Srf. L’arrêt de l’activité mécanique provoque une accumulation nucléaire d’actine monomérique, une délocalisation de Mrtf-A, coactivateur de Srf, et une diminution de l’activité de Srf, se traduisant notamment par une baisse de la transcription Srf-dépendante. Les gènes cibles de Srf comptant un grand nombre de protéines sarcomériques, telles que l’α-actine squelettique, la réduction de leur expression pourrait participer à l’atrophie musculaire. De plus, nos travaux suggèrent que la diminution de l’activité de Srf pourrait influencer l’organisation du réseau mitochondrial et le flux autophagique par des mécanismes qui restent à élucider. D’autre part, en tirant parti d’un modèle d’invalidation conditionnelle et inductible de Srf dans les cellules satellites, nous montrons que le phénomène d’hypertrophie compensatoire requiert l’expression de Srf par les cellules satellites. L’absence de Srf n’altère ni la prolifération ni l’entrée en différenciation des myoblastes, néanmoins elle provoque un défaut de fusion des myoblastes aux fibres au cours de l’hypertrophie induite par surcharge. Ainsi, nos travaux démontrent que Srf est un acteur majeur de la plasticité musculaire, à la fois en tant que médiateur de la mécano-transduction par la voie actine/Mrtfs/Srf et par son implication dans la fusion des cellules satellites aux fibres musculaires, nécessaire à l’hypertrophie compensatoire. / Adult skeletal muscle is able to adapt its size to functional demand. It can undergo atrophy or hypertrophy according to mechanical load. To date, the molecules that mediate muscle plasticity remain unclear.Using different models inducing muscle atrophy, we show that the transcription factor Srf is a mediator of mechanotransduction through the actin/Mrtfs/Srf pathway. Mechanical load abolition leads to G-actin nuclear accumulation, delocalization of Mrtf-A, an Srf coactivator, and Srf activity downregulation. This results in a decrease in Srf-dependent transcription. Many Srf target genes encode sarcomeric proteins such as α-skeletal actin, thus a downregulation of Srf-dependent transcription could participate to muscle atrophy. In addition, our results suggest that Srf activity decrease could affect mitochondrial network organization and autophagic flux in a way that remains to be determined. Besides, using a satellite cell-specific conditional and inducible Srf knockout, we show that overload hypertrophy requires Srf expression by satellite cells. Myoblasts proliferation and early differentiation are not altered by Srf loss. However, mutant myoblasts are unable to fuse with myofibers during overload hypertrophy. Altogether, our results demonstrate that Srf is an important player in skeletal muscle plasticity: it is a mediator of mechanotransduction via the actin/Mrtfs/Srf pathway and its expression by satellite cells is required for myoblasts to fuse with myofibers during overload hypertrophy.

Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a neuronal degenerative disease caused by the mutation or loss of the Survival Motor Neuron (SMN) gene. The cause for the specific motor neuron susceptibility in SMA has not been identified. The high axonal transport/localization demand on motor neurons may be one potentially disrupted function, more specific to these cells. We therefore used a large-scale immunoprecipitation (IP) experiment, to identify potential interactors of SMN involved in neuronal transport and localization of mRNA targets. We identified KH-type splicing regulatory protein (KSRP), a multifunctional RNA-binding protein that has been implicated in transcriptional regulation, neuro-specific alternative splicing, and mRNA decay. KSRP is closely related to chick zipcode-binding protein 2 and rat MARTA1, proteins involved in neuronal transport/localization of beta-actin and microtubule-associated protein 2 mRNAs, respectively. We demonstrated that KSRP is arginine methylated, a novel SMN interactor (specifically with the SMN Tudor domain; and not with SMA causing mutants). We also found this protein to be misregulated in the absence of SMN, resulting in increased mRNA stability of KSRP mRNA target, p21cip/waf1. A role for SMN as an axonal chaperone of methylated RBPs could thus be key in SMA pathophysiology.

Des approches thérapeutiques visant à la stimulation de la régénération et/ou à l’inhibition des processus de dégénérescence neuromusculaire pourraient constituer des stratégies efficaces pour préserver le tonus musculaire des patients et augmenter ainsi leur espérance de vie. L’activation de la Calcineurine A (CnA), une phosphatase des sérines et thréonines, contrôle une large gamme de réseaux régulateurs dans le muscle squelettique, notamment en stimulant l’expression de gènes spécifiques des fibres musculaires lentes (de type I). La CnA est considérée comme un acteur clé de la réponse hypertrophique et du processus de régénération dans le muscle squelettique. L’activation de la CnA est ainsi considérée comme une stratégie potentielle pour stimuler la régénération musculaire dans les cas de myopathie. Nous avons identifié un aptamère peptidique qui active la CNA in vitro et in vivo. Dans un modèle murin d’atrophie musculaire induite par dénervation, l’aptamère a montré de significatives capacités thérapeutiques. L’effet curatif de l’aptamère a notamment été observable par une augmentation générale de la surface des muscles traités, mais aussi par un accroissement de la surface individuelle des fibres musculaires.Une augmentation du niveau de NFAT nucléaire dans ces fibres a été observée, en cohérence avec les capacités d’activation de la CnA par notre aptamère. Par ailleurs, une autre observation faite dans les muscles traités avec l’aptamère a été l’augmentation de noyaux centraux, caractéristiques de la présence de nouvelles fibres. Finalement, l’identification du site d’interaction entre la CnA et notre aptamère, permise par l’utilisation de plusieurs formes tronquées de la phosphatase, a offert un aperçu du mécanisme d’action de l’aptamère à l’échelle moléculaire. Dans l’ensemble, les études présentées ici ont offert la première démonstration qu’une activation directe de la CnA endogène a un impact significatif sur les processus cellulaires, résultant en la stimulation de la régénération musculaire et l’amélioration de l’état physiopathologique chez les modèles animaux utilisés. / Therapeutic approaches leading to the stimulation of regeneration, and/or inhibition of degeneration processes in neuromuscular disorders are believed to offer valid therapeutic strategies that would preserve muscle tone and contribute to the quality of life while lengthening patient life span. Activation of CalcineurinA (CnA), a threonine-serine phosphatase, controls gene regulatory programs in skeletal muscle by stimulating slow muscle fiber (type I) gene expression. This phosphatase has been also identified as a key mediator in the hypertrophic response and in skeletal muscle regeneration. Activation of CnA is, therefore, considered as a potentially interesting means of stimulating muscle regeneration in myopathies. We have identified a peptide aptamer that activates CnA in vitro, in cells and in vivo. In a mouse model for denervation-induced muscle atrophy, CnA-activating peptide aptamers show significant positive impact. This is reflected in larger overall muscle cross-sectional surface area due to an increased number of fibers and larger individual fiber surface area. Insight into the biological mechanism is afforded by observation of increased levels of nuclear NFAT transcription factor in these fibers, in agreement with peptide aptamer-mediated activation of CnA. Furthermore, a significant increase in central nuclei, characteristic of the presence of new fibers, is observed in muscles treated with the peptide aptamers specifically activating CnA. Identification of the specific binding site of the peptide aptamer on CnA was achieved using several truncations of the phosphatase, offering insight into the molecular mechanism of action. Together, these studies offer the first proof that direct activation of endogenous CnA has a measureable impact on cellular responses resulting in stimulation of muscle regeneration and enhancement of pathophysiological state in selected animal models. / Specifici approcci terapeutici diretti alla stimolazione della rigenerazione e/o dell’inibizione dei processi degenerativi in patologie neuromuscolari, sono considerati come strategie efficaci per preservare il tono muscolare e aumentare in questo modo la speranza di vita dei pazienti. L’attivazione della Calcineurin A (CnA), una treonina/serina fosfatasi, controlla una vasta gamma di vie di trasduzione nel muscolo scheletrico, stimolando in particolare l’espressione dei geni specifici delle fibre muscolari lente (tipo 1). La Cna rappresenta un elemento chiave nella risposta ipertrofica e nel processo di rigenerazione muscolare. Per questo motivo, l’attivazione della CnA é considerata come un’approccio terapeutico interessante per stimolare la rigenerazione muscolare nelle miopatie. Nel nostro laboratorio, abbiamo identificato un aptamero peptidico che attiva la CnA sia in vitro che in vivo. In un modello murino di atrofia muscolare indotta tramite denervazione, l’aptamero petidico risulta avere delle significative potenzialità terapeutiche. Tale effetto si riflette in un aumento della superficie totale delle sezioni trasversali dei muscoli trattati, dovuto all’aumento sia del numero delle fibre che alla loro superficie individuale. L’effetto dell’aptamero peptidico sull’attivazione della CnA , nelle fibre trattate in vivo é dimostrata dall’osservazione della localizzazione prevalentemente nucleare del fattore di trascrizione NFAT, principale substrato della CnA. Un notevole aumento di nuclei centrali, caratteristica principale del processo di rigenerazione muscolare, é inoltre osservato in queste fibre. L’identificazione del sito d’interazione dell’aptamero peptidico e la proteina tramite l’utilizzo di vari costrutti della CnA ha permesso di avanzare delle ipotesi sul meccanismo d’azione dell’aptamero a livello molecolare. In conclusione, gli studi esposti in questa tesi rappresentano la prima dimostrazione che la diretta attivazione della CnA endogena ha un notevole effetto sulla stimolazione della rigenerazione muscolare e porta al miglioramento dello stato fisio-patologico nei modelli murini utilizzati.

A atrofia muscular espinhal (AME) é uma doença rara e neurodegenerativa, que afeta crianças e adultos. Gera atrofia muscular, prejudica os movimentos voluntários e, em muitos casos, dificulta a comunicação oral. Esta dissertação é composta por dois artigos. O Estudo 1 objetivou revisar a literatura sobre o desenvolvimento cognitivo de pessoas com AME. O Estudo 2 objetivou avaliar o desempenho visual, cognitivo e motor de crianças com AME tipo 1 (AME-I). O primeiro estudo foi uma revisão sistemática, com levantamento dos últimos 25 anos (de 1992 a 2017) nas bases de dados PUBMED/Medline, Web of Science e Scielo. Os descritores utilizados foram: spinal muscular atrophy e cognition. O estudo 2 consistiu na avaliação de 24 crianças, divididas em dois grupos: 12 crianças com AME-I (3 a 9 anos, 9 meninos e 3 meninas) e 12 crianças saudáveis, pareadas por idade e sexo. As 24 crianças responderam a quatro tarefas de associação de figuras, com dificuldade crescente. As respostas foram detectadas por meio de um rastreador de olhar. Para o primeiro estudo foram localizados 43 artigos, desses, nove foram selecionados, de acordo com os critérios de inclusão e exclusão. O estudo apontou que o desempenho cognitivo de crianças com AME é heterogêneo. Três artigos indicaram que essas crianças têm desempenho cognitivo normal, três artigos indicaram que há atraso e outros três estudos relataram desempenho acima da média. De modo geral, as crianças com maior fraqueza muscular (AME-I) apresentaram maior comprometimento e estudos mais recentes detectaram esse atraso. O segundo estudo descreveu pior desempenho do grupo AME-I, em relação ao grupo controle (maior número de erros e maior tempo para execução das tarefas). Concluímos que, até o momento, poucos estudos investigaram aspectos cognitivos em crianças e adolescentes com AME. O desenvolvimento cognitivo de crianças com AME deve ser acompanhado, principalmente em crianças com AME-I. É necessário avaliar o desempenho cognitivo e, se necessário, propor intervenções para pessoas com AME. O desenvolvimento cognitivo adequado facilita a autonomia e interação. Os rastreadores de olhar podem estimular e aprimorar esse repertório / Spinal muscular atrophy (SMA) is a rare and neurodegenerative disease, affecting children and adults. SMA causes muscular atrophy and weakness, and, in many cases, impairs the development of oral communication. This dissertation is composed of two articles. Study 1 aimed to review the literature about the cognitive development of people with SMA. Study 2 aimed to evaluate the visual, cognitive and motor performance of children with SMA type 1 (SMAI). Study 1 reviewed the findings of the last 25 years (1992 to 2017), in PUBMED/Medline, Web of Science and Sicelo databases. The descriptors were: spinal muscular atrophy and cognition. Study 2 consisted of the evaluation of 24 children divided into two groups: 12 children with SMA-I (3 to 9 years of age, 9 boys and 3 girls) and 12 healthy children, matched by age and sex. The 24 children performed four figure-association tasks, with increasing difficulty. Responses were detected by an eye tracking device. For the first study, 43 articles were identified and nine were selected because they met the inclusion and exclusion criteria. The study pointed out that the cognitive performance of children with SMA is heterogeneous. Three articles indicated that children with SMA had normal cognitive performance, three observed delayed performance and three studies described cognitive performance as above average. In general, samples with children with more severe muscular weakness (SMA-I) showed some cognitive impairment and more recent studies detected this delay. The second study described poorer performance of the SMA-I group, compared to the control group (more errors and longer times). In conclusion, few studies investigated cognitive outcomes in children and adolescents with SMA. The cognitive development of children with SMA should be followed, especially children with SMA-I. More studies should evaluate and, if necessary, intervene to prevent cognitive impairment in people with SMA. The proper cognitive development facilitates autonomy and interaction. The eye tracker can stimulate and improve their repertoire