Protein phosphorylation is one of the major post-translational modifications to allow for signal transmission and fine tuning of metabolism on the cellular proteomic level. As such it is “one of the last instances” to modulate the activity of enzymes and hence to impact the cellular life irrespective of the basic conditions provided by the genome – and epigenome– controlled gene expression. The evolutionary increase in cellular complexity is reflected by highly sophisticated regulatory networks in multicellular eukaryotes based on the transfer of phosphate mostly onto the side chains of serine, threonine and tyrosine residues. Nature has chosen phosphate for inter- and intracellular communication, which is also an integral component of nucleic acids and can be regarded as the molecule of choice for life. Currently, life science is interested to unravel the network of reversible protein phosphorylation that is catalyzed by two antagonistic enzyme classes: the protein kinases and protein phosphatases. We are currently in the era of proteomics and enormously benefit from the progress of mass-spectrometry methods. This is documented by a huge number of “proteomic studies” that mostly provide a simple inventory of the existence of proteins – and/or their phosphorylated forms – under more or less defined conditions. So far, the physiological correlations could be established only in a few cases, e.g. by comparing two physiological conditions. Another strategy, which was addressed in this work, is the systematic screening of mutants defective in genes encoding either protein kinases or protein phosphatases. This approach benefits from the ease to predict these enzymes due to the presence of characteristic protein motifs. In combination with the major goal of this work – to shed light on the impact of protein phosphorylation in the mitochondrial (mt) compartment – the yeast Saccharomyces cerevisiae was chosen as a model system because of its respiro-fermentative metabolism, that allows for the maintenance of respiratory defective mutants. Indeed, this reverse genetic approach successfully revealed two kinases (Pkp1p, Pkp2p) and two phosphatases (Ppp1p, Ppp2p) as the key components regulating the pyruvate dehydrogenase complex by phosphorylation of serine 313 of its α- subunit Pda1p. In addition, evidence is provided that Pkp1p has an additional role in the assembly process of the PDH complex. Also, the effect of the deletion of the COQ8 gene (gene engaged in coenzyme Q synthesis; originally named ABC1) leading to respiratory deficiency, could be correlated with the phosphorylation of subunit Coq3p of the mitochondrial ubiquinone biosynthesis complex. Finally, in the case of the kinase Sat4p (protein involved in salt tolerance), overexpression of the enzyme was used as an alternative approach to unravel the molecular basis of the originally observed salt sensitivity of sat4 mutants. The data suggest that Sat4p has a direct or indirect role in the late steps of iron-sulfur (Fe/S) cluster assembly of the so-called “aconitase-type” enzymes in mitochondria, accompanied by a strongly reduced steady state concentration of the Fe/S-cluster protein aconitase. Interestingly, a secondary phenotype became apparent upon overexpression of Sat4p: the abundance of the lipoic acid containing mitochondrial proteome was markedly reduced. Most likely this phenotype is due to the fact that the synthesis and/or attachment of lipoic acid depend on a Fe/S-cluster bearing enzyme. In the course of the work it became clear that the regulatory (mt) protein phosphorylation network of yeast evolved to meet the criteria of a life adapted to the ecological niche on temporarily available sugar rich sources. Clearly, the transfer of the respective data to higher eukaryotes is limited. However, it shows that yeast is primarily an excellent model system for the principal molecular reactions shared with higher eukaryotes. / Phosphorylierungen von Aminosäuren ist eine der verbreitetsten post-translationalen Modifikationen für zelluläre Signalübertragungswege und zur Regulation des Metabolismus auf Proteom-Ebene. Mit der reversiblen Protein-Phosphorylierung eng verbunden ist die unabhängige Modulation der Aktivität von Enzymen ungeachtet der Genom- und Epigenom-basierten Genexpression. Die evolutionäre Zunahme der zellularen Komplexität äußert sich in zunehmend komplexeren Regulations-Netzwerken in mehrzelligen eukaryotischen Organismen basierend auf dem Transfer von Phosphatgruppen vorzugsweise auf die Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin. Die Natur hat evolutionär als Baustein der inter- und intrazellulären Kommunikation Phosphat gewählt, welches auch ein integraler Bestandteil der Nukleinsäuren ist und somit als das „Molekül der Wahl“ für das Leben bezeichnet werden darf. Die Lebenswissenschaften sind gegenwärtig daran interessiert das Netzwerk der Proteinphosphorylierung aufzuklären, welches durch zwei antagonistisch wirkende Enzymklassen, die Proteinkinasen und Proteinphosphatasen charakterisiert ist. Dabei profitieren wir gegenwärtig von den Fortschritten der „Proteomics-Ära“ auf dem Gebiet der massenspektrometrischen Proteinidentifizierung. Ausdruck dessen ist eine Vielzahl von Proteom-Studien, die jedoch meist nur eine einfache Inventarisierung der unter mehr oder weniger gut definierten zellulären Bedingungen existierenden Proteine in ihrer Phosphat-modifizierten oder unphosphorylierten Form darstellen. Die beteiligten Enzyme werden dabei kaum berücksichtigt. Insbesondere gilt dies für extra-cytoplasmatische Ereignisse. Bisher gelang es nur in wenigen Fällen eine Korrelation der physiologischen Rolle dieser Proteinmodifikation, z.B. durch den Vergleich der Phospho-Proteome unter zwei unterschiedlichen physiologischen Bedingungen, herzustellen. Eine andere Strategie, die auch Gegenstand dieser Arbeit ist, sieht ein Screening von Mutanten vor, die durch Deletionen von Genen, die für Proteinkinasen bzw. –phosphatasen kodieren, gekennzeichnet sind. Dieser Ansatz profitiert von der Existenz und leichten bioinformatischen Vorhersagbarkeit charakteristischer Kinase- bzw. Phosphatase- Sequenzmotive. In Kombination mit dem Hauptziel der Arbeit – Licht ins Dunkel der Proteinphosphorylierung im mitochondrialen Kompartiment zu bringen – wurde die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellsystem gewählt, insbesondere vor dem Hintergrund ihres fermentativen Metabolismus. Als Beleg der prinzipiellen Funktionalität des vorgeschlagenen Ansatzes konnten zwei Kinasen (Pkp1p, Pkp2p) und zwei Phosphatasen (Ppp1p, Ppp2p) als Schlüsselkomponenten der Regulation des Pyruvatdehydrogenase (PDH) Komplexes identifiziert und charakterisiert werden. Darüber hinaus konnte sowohl das Zielprotein der Phosphorylierung, Pda1p, die α-Untereinheit des Komplexes, als auch die modifizierte Aminosäure (Serin 313) experimentell bestätigt werden. Ferner konnte der Atmungsdefekt von Stämmen mit einer nicht-funktionellen Abc1p-Kinase mit dem Phosphorylierungszustand der Untereinheit Coq3p des Ubiquinon-Biosynthese Komplexes und dem Ausfall der Ubiquinonsynthese korreliert werden. Eine alternative Herangehensweise, die Überexpression einer Kinase, führte zur Identifizierung möglicher Zielproteine von Sat4p. Vergleichende Analysen des 2D-gelelektrophoretisch separierten mitochondrialen Genoms mit dem des Wildtyps legen die Vermutung nahe, dass Sat4p eine direkte oder indirekte Rolle bei der Regulation der „Aconitase-Typ“ Eisen-Schwefel (Fe/S) Proteine besitzt. Der darüber hinaus beobachtete Effekt einer Abnahme von Liponsäure-tragenden mitochondrialen Enzymen, ist wahrscheinlich sekundärer Natur und kann durch die Zugehörigkeit der Liponsäure-Synthase zur oben erwähnten Gruppe der „Aconitase-Typ“ -Fe/S-Proteine erklärt werden. Im Verlauf der Arbeit wurde deutlich, dass das regulatorische Netzwerk der Proteinphosphorylierung der Hefe eher den Kriterien einer evolutionären Adaptation an eine spezifische ökologische Nische – der temporären Verfügbarkeit zuckerreicher Substanzen – entsprechen. Das schränkt die Übertragbarkeit der gewonnen Einsichten in die Regulation des mitochondrialen Metabolismus auf höhere Eukaryonten ein. Es zeigt jedoch, dass Hefe in erster Linie ein exzellentes Modellsystem für die prinzipiellen molekulare Mechanismen ist, die sie mit den höheren Eukaryonten teilt.

Protein phosphorylation is one of the major post-translational modifications to allow for signal transmission and fine tuning of metabolism on the cellular proteomic level. As such it is “one of the last instances” to modulate the activity of enzymes and hence to impact the cellular life irrespective of the basic conditions provided by the genome – and epigenome– controlled gene expression. The evolutionary increase in cellular complexity is reflected by highly sophisticated regulatory networks in multicellular eukaryotes based on the transfer of phosphate mostly onto the side chains of serine, threonine and tyrosine residues. Nature has chosen phosphate for inter- and intracellular communication, which is also an integral component of nucleic acids and can be regarded as the molecule of choice for life. Currently, life science is interested to unravel the network of reversible protein phosphorylation that is catalyzed by two antagonistic enzyme classes: the protein kinases and protein phosphatases. We are currently in the era of proteomics and enormously benefit from the progress of mass-spectrometry methods. This is documented by a huge number of “proteomic studies” that mostly provide a simple inventory of the existence of proteins – and/or their phosphorylated forms – under more or less defined conditions. So far, the physiological correlations could be established only in a few cases, e.g. by comparing two physiological conditions. Another strategy, which was addressed in this work, is the systematic screening of mutants defective in genes encoding either protein kinases or protein phosphatases. This approach benefits from the ease to predict these enzymes due to the presence of characteristic protein motifs. In combination with the major goal of this work – to shed light on the impact of protein phosphorylation in the mitochondrial (mt) compartment – the yeast Saccharomyces cerevisiae was chosen as a model system because of its respiro-fermentative metabolism, that allows for the maintenance of respiratory defective mutants. Indeed, this reverse genetic approach successfully revealed two kinases (Pkp1p, Pkp2p) and two phosphatases (Ppp1p, Ppp2p) as the key components regulating the pyruvate dehydrogenase complex by phosphorylation of serine 313 of its α- subunit Pda1p. In addition, evidence is provided that Pkp1p has an additional role in the assembly process of the PDH complex. Also, the effect of the deletion of the COQ8 gene (gene engaged in coenzyme Q synthesis; originally named ABC1) leading to respiratory deficiency, could be correlated with the phosphorylation of subunit Coq3p of the mitochondrial ubiquinone biosynthesis complex. Finally, in the case of the kinase Sat4p (protein involved in salt tolerance), overexpression of the enzyme was used as an alternative approach to unravel the molecular basis of the originally observed salt sensitivity of sat4 mutants. The data suggest that Sat4p has a direct or indirect role in the late steps of iron-sulfur (Fe/S) cluster assembly of the so-called “aconitase-type” enzymes in mitochondria, accompanied by a strongly reduced steady state concentration of the Fe/S-cluster protein aconitase. Interestingly, a secondary phenotype became apparent upon overexpression of Sat4p: the abundance of the lipoic acid containing mitochondrial proteome was markedly reduced. Most likely this phenotype is due to the fact that the synthesis and/or attachment of lipoic acid depend on a Fe/S-cluster bearing enzyme. In the course of the work it became clear that the regulatory (mt) protein phosphorylation network of yeast evolved to meet the criteria of a life adapted to the ecological niche on temporarily available sugar rich sources. Clearly, the transfer of the respective data to higher eukaryotes is limited. However, it shows that yeast is primarily an excellent model system for the principal molecular reactions shared with higher eukaryotes.:1 SUMMARY 1 ZUSAMMENFASSUNG 3 2 INTRODUCTION 5 2.1 Why phosphate? 5 2.2 Protein phosphorylation in prokaryotes 6 2.3 Protein phosphorylation in mitochondria 7 2.4 Regulation of mammalian pyruvate dehydrogenase complex (PDH) by phosphorylation 9 2.5 Mammalian cytochrome c oxidase (COX) 10 2.6 Protein phosphorylation in yeast mitochondria 11 3 AIM OF THIS WORK 13 4 PROLOG 14 4.1 Critical evaluation of tools for phosphoproteomics 14 4.2 Introducing a new method for in gel profiling of phospho-proteins 17 4.3 In-gel screening of phosphorus of yeast mitochondrial proteins by LA-ICP-MS 20 4.4 Detection of phosphorylated subunits of ATPase 22 5 RESULTS 23 5.1 YIL042c and YOR090c encode the kinase and phosphatase of the Saccharomyces cerevisiae pyruvate dehydrogenase complex 28 5.2 Yeast Pyruvate Dehydrogenase Complex Is Regulated by a Concerted Activity of Two Kinases and Two Phosphatases 29 5.3 Proteomic analysis reveals a novel function of the kinase Sat4p in yeast mitochondria 30 5.4 Ubiquinone biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: the molecular organization of O –methylase Coq3p depends on Abc1p/Coq8p 53 6 DISCUSSION AND PERSPECTIVES 54 6.1 Mitochondrial phosphorylation in yeast 54 6.1.1 An evolutionary view 54 6.1.2 The yeast ABC1-kinase family 55 6.1.3 Regulation of yeast pyruvate dehydrogenase (PDH) complex 57 6.1.4 Regulation of iron sulfur cluster biogenesis 60 6.2 Challenges to investigate the network of (mt) protein phosphorylation 62 6.2.1 When is a kinase a mitochondrial kinase? 64 6.2.2 Epilog 66 7 LITERATURE 69 8 APPENDIX 78 8.1 Related publications 78 8.2 List of publications 80 8.3 ERKLÄRUNGEN 82 / Phosphorylierungen von Aminosäuren ist eine der verbreitetsten post-translationalen Modifikationen für zelluläre Signalübertragungswege und zur Regulation des Metabolismus auf Proteom-Ebene. Mit der reversiblen Protein-Phosphorylierung eng verbunden ist die unabhängige Modulation der Aktivität von Enzymen ungeachtet der Genom- und Epigenom-basierten Genexpression. Die evolutionäre Zunahme der zellularen Komplexität äußert sich in zunehmend komplexeren Regulations-Netzwerken in mehrzelligen eukaryotischen Organismen basierend auf dem Transfer von Phosphatgruppen vorzugsweise auf die Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin. Die Natur hat evolutionär als Baustein der inter- und intrazellulären Kommunikation Phosphat gewählt, welches auch ein integraler Bestandteil der Nukleinsäuren ist und somit als das „Molekül der Wahl“ für das Leben bezeichnet werden darf. Die Lebenswissenschaften sind gegenwärtig daran interessiert das Netzwerk der Proteinphosphorylierung aufzuklären, welches durch zwei antagonistisch wirkende Enzymklassen, die Proteinkinasen und Proteinphosphatasen charakterisiert ist. Dabei profitieren wir gegenwärtig von den Fortschritten der „Proteomics-Ära“ auf dem Gebiet der massenspektrometrischen Proteinidentifizierung. Ausdruck dessen ist eine Vielzahl von Proteom-Studien, die jedoch meist nur eine einfache Inventarisierung der unter mehr oder weniger gut definierten zellulären Bedingungen existierenden Proteine in ihrer Phosphat-modifizierten oder unphosphorylierten Form darstellen. Die beteiligten Enzyme werden dabei kaum berücksichtigt. Insbesondere gilt dies für extra-cytoplasmatische Ereignisse. Bisher gelang es nur in wenigen Fällen eine Korrelation der physiologischen Rolle dieser Proteinmodifikation, z.B. durch den Vergleich der Phospho-Proteome unter zwei unterschiedlichen physiologischen Bedingungen, herzustellen. Eine andere Strategie, die auch Gegenstand dieser Arbeit ist, sieht ein Screening von Mutanten vor, die durch Deletionen von Genen, die für Proteinkinasen bzw. –phosphatasen kodieren, gekennzeichnet sind. Dieser Ansatz profitiert von der Existenz und leichten bioinformatischen Vorhersagbarkeit charakteristischer Kinase- bzw. Phosphatase- Sequenzmotive. In Kombination mit dem Hauptziel der Arbeit – Licht ins Dunkel der Proteinphosphorylierung im mitochondrialen Kompartiment zu bringen – wurde die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellsystem gewählt, insbesondere vor dem Hintergrund ihres fermentativen Metabolismus. Als Beleg der prinzipiellen Funktionalität des vorgeschlagenen Ansatzes konnten zwei Kinasen (Pkp1p, Pkp2p) und zwei Phosphatasen (Ppp1p, Ppp2p) als Schlüsselkomponenten der Regulation des Pyruvatdehydrogenase (PDH) Komplexes identifiziert und charakterisiert werden. Darüber hinaus konnte sowohl das Zielprotein der Phosphorylierung, Pda1p, die α-Untereinheit des Komplexes, als auch die modifizierte Aminosäure (Serin 313) experimentell bestätigt werden. Ferner konnte der Atmungsdefekt von Stämmen mit einer nicht-funktionellen Abc1p-Kinase mit dem Phosphorylierungszustand der Untereinheit Coq3p des Ubiquinon-Biosynthese Komplexes und dem Ausfall der Ubiquinonsynthese korreliert werden. Eine alternative Herangehensweise, die Überexpression einer Kinase, führte zur Identifizierung möglicher Zielproteine von Sat4p. Vergleichende Analysen des 2D-gelelektrophoretisch separierten mitochondrialen Genoms mit dem des Wildtyps legen die Vermutung nahe, dass Sat4p eine direkte oder indirekte Rolle bei der Regulation der „Aconitase-Typ“ Eisen-Schwefel (Fe/S) Proteine besitzt. Der darüber hinaus beobachtete Effekt einer Abnahme von Liponsäure-tragenden mitochondrialen Enzymen, ist wahrscheinlich sekundärer Natur und kann durch die Zugehörigkeit der Liponsäure-Synthase zur oben erwähnten Gruppe der „Aconitase-Typ“ -Fe/S-Proteine erklärt werden. Im Verlauf der Arbeit wurde deutlich, dass das regulatorische Netzwerk der Proteinphosphorylierung der Hefe eher den Kriterien einer evolutionären Adaptation an eine spezifische ökologische Nische – der temporären Verfügbarkeit zuckerreicher Substanzen – entsprechen. Das schränkt die Übertragbarkeit der gewonnen Einsichten in die Regulation des mitochondrialen Metabolismus auf höhere Eukaryonten ein. Es zeigt jedoch, dass Hefe in erster Linie ein exzellentes Modellsystem für die prinzipiellen molekulare Mechanismen ist, die sie mit den höheren Eukaryonten teilt.:1 SUMMARY 1 ZUSAMMENFASSUNG 3 2 INTRODUCTION 5 2.1 Why phosphate? 5 2.2 Protein phosphorylation in prokaryotes 6 2.3 Protein phosphorylation in mitochondria 7 2.4 Regulation of mammalian pyruvate dehydrogenase complex (PDH) by phosphorylation 9 2.5 Mammalian cytochrome c oxidase (COX) 10 2.6 Protein phosphorylation in yeast mitochondria 11 3 AIM OF THIS WORK 13 4 PROLOG 14 4.1 Critical evaluation of tools for phosphoproteomics 14 4.2 Introducing a new method for in gel profiling of phospho-proteins 17 4.3 In-gel screening of phosphorus of yeast mitochondrial proteins by LA-ICP-MS 20 4.4 Detection of phosphorylated subunits of ATPase 22 5 RESULTS 23 5.1 YIL042c and YOR090c encode the kinase and phosphatase of the Saccharomyces cerevisiae pyruvate dehydrogenase complex 28 5.2 Yeast Pyruvate Dehydrogenase Complex Is Regulated by a Concerted Activity of Two Kinases and Two Phosphatases 29 5.3 Proteomic analysis reveals a novel function of the kinase Sat4p in yeast mitochondria 30 5.4 Ubiquinone biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: the molecular organization of O –methylase Coq3p depends on Abc1p/Coq8p 53 6 DISCUSSION AND PERSPECTIVES 54 6.1 Mitochondrial phosphorylation in yeast 54 6.1.1 An evolutionary view 54 6.1.2 The yeast ABC1-kinase family 55 6.1.3 Regulation of yeast pyruvate dehydrogenase (PDH) complex 57 6.1.4 Regulation of iron sulfur cluster biogenesis 60 6.2 Challenges to investigate the network of (mt) protein phosphorylation 62 6.2.1 When is a kinase a mitochondrial kinase? 64 6.2.2 Epilog 66 7 LITERATURE 69 8 APPENDIX 78 8.1 Related publications 78 8.2 List of publications 80 8.3 ERKLÄRUNGEN 82

Die Mitochondrien eukaryotischer Zellen sind an einer Reihe zellulärer Prozesse beteiligt und übernehmen essentielle Funktionen, wie die der Energiegewinnung aus der oxidativen Phosphorylierung. Sie weisen ein hohes Maß an struktureller Komplexität auf. Das gesamte Organell wird von der äußeren mitochondrialen Membran umgeben und ist durch diese gegenüber dem Zytoplasma abgegrenzt. Die innere mitochondriale Membran kann morphologisch in zwei Bereiche unterteilt werden: Der der äußeren Membran direkt gegenüberliegende Teil wird als „innere Grenzflächenmembran“ bezeichnet, während zahlreiche Einstülpungen die sogenannte „Cristaemembran“ bilden. Vorhergehende Studien lieferten Hinweise darauf, dass es sich bei der Subkompartimentierung der Innenmembran auch um eine funktionale Gliederung handeln könnte, da für zahlreiche mitochondriale Proteine eine heterogene Verteilung nachgewiesen werden konnte. Darunter befindet sich auch das Protein Oxa1 der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, das sowohl bei der Insertion von kernkodierten als auch von mitochondrial kodierten Proteinen eine zentrale Rolle spielt. In vorausgegangenen Arbeiten wurde belegt, dass Oxa1 bevorzugt in der inneren Grenzflächenmembran vorliegt, wenn die Hefen mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle wachsen. Diese Verteilung ist jedoch dynamisch und verändert sich in Abhängigkeit von den physiologischen Bedürfnissen der Zellen. Wachsen die Hefen mit einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle, weist Oxa1 eine präferentielle Lokalisation in der Cristaemembran auf. Eine Anreicherung in der Cristaemembran ist auch zu beobachten, wenn die hoch konservierte Aminosäure Tryptophan an Position 128 mit Phenylalanin substituiert wird. Die Substitutionsmutation oxa1-W128F führt darüber hinaus zu einer Verringerung der durchschnittlichen Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe. Hieraus ergab sich die Frage, ob die Komplexgröße und die submitochondriale Lokalisation von Oxa1 in direktem Zusammenhang stehen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe in Abhängigkeit zu der zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle untersucht. Es zeigte sich jedoch, dass die durchschnittlichen Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe, die in der inneren Grenzflächenmembran angereichert sind, ungefähr den Größen der Komplexe entsprechen, die bevorzugt in der Cristaemembran vorliegen. Demzufolge gibt es keinen Zusammenhang zwischen der Komplexgröße und der Lokalisation von Oxa1, weshalb der Veränderung der Lokalisation ein anderer Mechanismus zu Grunde liegen muss. Die Untersuchung der Variante Oxa1-W128F zeigte, dass diese im Vergleich zu Oxa1, wie bereits beschrieben, in kleineren Komplexen vorliegt, bei denen es sich sogar um Dimere sowie Tetramere von Oxa1 handeln könnte, und, dass die Verringerung der Komplexgrößen auf eine beeinträchtigte Homooligomerisierung zurückgeführt werden kann. Zusammen mit der Tatsache, dass neben Oxa1 selbst keine weiteren Interaktionspartner identifiziert werden konnten, legen diese Ergebnisse nahe, dass Oxa1 sowohl unter fermentativen als auch respiratorischen Bedingungen in größeren homooligomeren Komplexen agieren könnte und, dass seine Dynamik möglicherweise auf transiente Interaktionen mit Substraten zurückzuführen ist. Es ist bekannt, dass in S. cerevisiae neben Oxa1 noch weitere Proteine existieren, die ebenfalls Teil der Proteininsertionsmaschinerie der inneren mitochondrialen Membran sind. Dazu gehören Pnt1 und Mba1, über deren Verteilung in der inneren Membran bisher keine gesicherten Erkenntnisse vorlagen. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich heraus, dass auch Pnt1 und Mba1 heterogen verteilt sind. So ist sowohl für Pnt1 als auch für Mba1 bei Wachstum mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle eine Anreicherung in der inneren Grenzflächenmembran zu verzeichnen. Bei Wachstum mit einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle verschiebt sich die präferentielle Lokalisation von Pnt1 zu einer Anreicherung in der Cristaemembran, wie es bereits für Oxa1 beobachtet wurde. Mba1 hingegen liegt unverändert bevorzugt in der inneren Grenzflächenmembran vor. Somit konnte für die heterogene Verteilung von Pnt1 eine von den physiologischen Bedingungen abhängige Dynamik und für die heterogene Verteilung von Mba1 eine Statik nachgewiesen werden. Auf Grund des differenzierten Lokalisationsverhaltens von Mba1 im Vergleich zu Oxa1 und Pnt1, wurde eine nähere Charakterisierung der submitochondrialen Verteilung von Mba1 vorgenommen. Bei der Untersuchung der Ursachen der statischen Lokalisation von Mba1 auf molekularer Ebene, wurde festgestellt, dass bereits die Deletion von nur fünf Aminosäuren (mba1 1-273) sowie die Substitution einer einzelnen Aminosäure (mba1-I272A) im C-Terminus von Mba1 zu einer drastischen Veränderung der heterogenen Mba1-Verteilung führt. Die Untersuchung der Auswirkungen der Genmutationen auf die Funktion von Mba1 zeigte, dass es infolge der Deletionsmutation zu einer verminderten Respirationskompetenz der Zellen kommt, die auf eine Beeinträchtigung der Assemblierung eines Superkomplexes der Atmungskette (2 x KomplexIII / 2 x KomplexIV) zurückgeführt werden kann. Somit liefert die vorliegende Arbeit erstmals Hinweise darauf, dass die dokumentierte heterogene und statische Verteilung von Mba1 in der inneren Membran ausschlaggebend für die korrekte Funktionsweise von Mba1 ist. Möglicherweise wird der Funktionsort von Mba1 durch die Bindung eines bisher nicht eindeutig identifizierten Interaktionspartners bestimmt.

No description available.

Ein der Biologie zugrunde liegender Prozess ist die Fortpflanzung. Einzeller wachsen dazu heran und teilen sich. Grundlage hierfür sind ausreichend Nahrung und Ressourcen, um die eigene Masse und alle Zellbestandteile, insbesondere die DNS, zu verdoppeln. Fehler bei der Wachstumsregulation oder der DNS-Verdopplung können schwerwiegende Folgen haben und stehen beim Menschen im Zusammenhang z.B. mit Krebs. In dieser Arbeit werden mathematische Modelle für die Mechanismen zur Wachstumsregulierung und DNS-Verdopplung in der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, vorgestellt. Modellierung kann entscheident zum Verstehen von komplexen, dynamischen Systemen beitragen. Wir haben ein Modell für Einzellerwachstum entwickelt und leiten das Wachstumsverhalten von Zellkulturen von diesem Modell, mittels einer hierfür programmierten Software, ab. Außerdem haben wir ein Model für die Verdopplung der DNS entwickelt, um Auswirkungen verschiedener Aktivierungsmuster auf die Replikation zu testen. Zusätzlich wurde die Verlängerung entstehender DNS Stränge, Elongation, mit einem detaillierten, stochastischen Modell untersucht. Wir haben unsere Ergebnisse zur DNS-Verdopplung mit einer abschließenden Untersuchung ergänzt, die funktionelle Beziehungen von Genen aufzeigt, welche sich in der Nähe von Aktivierungsstellen der Verdopplung befinden. Folgende Einsichten in die komplexe Koordination von Wachstum und Teilung wurden gewonnen: (i) Wachstumskontrolle ist eine inhärente Eigenschaft von Hefezellpopulationen, welche weder Signale noch Messmechanismen benötigt, (ii) DNS Verdopplung ist robuster in kleinen Chromosomen mit hoher Dichte an Aktivierungsstellen, (iii) Elongation ist weitgehend uniform, weicht aber an genau definierten Stellen signifikant ab und (iv) katabole Gene häufen sich nahe der frühen Aktivierungsstellen und anabole Gene nahe der späten. Unsere Ergebnisse tragen zum Verständniss von zellulären Mechanismen zur Wachstumskontrolle und DNS-Verdopplung bei. / One of the most fundamental processes in biology is reproduction. To achieve this, single cellular organisms grow, proliferate and divide. The prerequisite for this is acquiring sufficient resources to double size and cellular components, most importantly the DNA. Defects in either sufficient gain in size or chromosomal doubling can be severe for the organism and have been related to diseases in humans, such as cancer. Therefore, the cell has developed sophisticated regulatory mechanisms to control the orderly fashion of growth and duplication. We have developed mathematical models to study systemic properties of size control and DNA replication in the premier eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae. Modeling can help understanding the complex nature of dynamic systems. We provide a single cell model to explore size control. We deduced population behavior from the single cell model through multi-cell simulations using a tailor-made software. Also, we implemented an algorithm that simulates the DNA replication process to test the impact of different replication activation patterns. Additionally, elongation dynamics were assessed with a fine-grained stochastic model for the replication machinery motion. We complemented our analysis of DNA replication by studying the functional association of genes and replication origins. Our systems-level analysis reveals novel insights into the coordination of growth and division, namely that (i) size regulation is an intrinsic property of yeast cell populations and not due to signaling or size sensing, (ii) DNA replication is more robust in small chromosomes with high origin density, (iii) the elongation process is strongly biased at distinct locations in the genome and (iv) catabolic genes are over-represented near early origins and anabolic genes near late origins. Our results contribute to explaining mechanisms of size control and DNA replication.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Cbs1p und Cbs2p, zwei spezifische Translationsaktivatoren der COB-mRNA. Im Mittelpunkt standen sowohl die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Cbs1p als auch ein Screening von Interaktionskandidaten, die mit Cbs1p und/oder Cbs2p physikalisch wechselwirken könnten. Cbs1p liegt als peripheres Membranprotein fest mit der inneren Mitochondrienmembran matrixseitig assoziiert vor. Dabei spielen möglicherweise hydrophobe und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen eine essentielle Rolle bei der Membranverankerung von Cbs1p. Durch die Identifizierug von atmungsdefekten Cbs1p-Mutanten, deren Mutationen in Bereichen mit Homologie zu RNA-bindenden Proteinen liegt, verstärken sich die Hinweise zur Beteiligung von Cbs1p an der direkten physikalischen Wechselwirkung mit dem 5´-leader der COB-mRNA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,, dass die abspaltbare Präsequenz nicht notwendig für einen mitochondrialen Import ist. Die Ergebnisse präzisieren und erweitern das vorliegende Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p (Michaelis, 1991). Aufgrund der Membranverankerung von Cbs1p wird auch die gebundene COB-mRNA in räumlicher Nähe zur Membran gebracht. Darüber hinaus definiert Cbs1p damit möglicherweise auch den Ort der Insertion des nascierenden Apocytochrom b in die Membran. Cbs2p vermittelt die Bindung zur kleinen Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen und könnte seinerseits ebenfalls in Interaktionen mit Untereinheiten des bc1-Komplexes involviert sein.

No description available.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Cbs1p und Cbs2p, zwei spezifische Translationsaktivatoren der COB-mRNA. Im Mittelpunkt standen sowohl die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Cbs1p als auch ein Screening von Interaktionskandidaten, die mit Cbs1p und/oder Cbs2p physikalisch wechselwirken könnten. Cbs1p liegt als peripheres Membranprotein fest mit der inneren Mitochondrienmembran matrixseitig assoziiert vor. Dabei spielen möglicherweise hydrophobe und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen eine essentielle Rolle bei der Membranverankerung von Cbs1p. Durch die Identifizierug von atmungsdefekten Cbs1p-Mutanten, deren Mutationen in Bereichen mit Homologie zu RNA-bindenden Proteinen liegt, verstärken sich die Hinweise zur Beteiligung von Cbs1p an der direkten physikalischen Wechselwirkung mit dem 5´-leader der COB-mRNA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,, dass die abspaltbare Präsequenz nicht notwendig für einen mitochondrialen Import ist. Die Ergebnisse präzisieren und erweitern das vorliegende Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p (Michaelis, 1991). Aufgrund der Membranverankerung von Cbs1p wird auch die gebundene COB-mRNA in räumlicher Nähe zur Membran gebracht. Darüber hinaus definiert Cbs1p damit möglicherweise auch den Ort der Insertion des nascierenden Apocytochrom b in die Membran. Cbs2p vermittelt die Bindung zur kleinen Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen und könnte seinerseits ebenfalls in Interaktionen mit Untereinheiten des bc1-Komplexes involviert sein.

No description available.