Le cycle cellulaire chez les bactéries est un processus très étudié mais il apparait que les modèles actuels ne rendent pas compte de la complexité et surtout de la diversité des machineries et des mécanismes de régulation impliqués. En fait, notre connaissance du cycle cellulaire repose sur l'étude de quelques organismes modèles. Or les analyses comparatives ont montré que certains systèmes et mécanismes décrits sont peu conservés et donc difficilement transposables d'un taxon à l'autre. Des approches évolutives telles que la phylogénomique peuvent être utilisées pour l'étude fonctionnelle de tels systèmes biologiques à l'échelle des bactéries. Ces approches permettent notamment de déterminer les évènements évolutifs clés qui ont conduit à une telle diversité mais également d'identifier des liens fonctionnels potentiels entre protéines. De plus, le développement des méthodes de séquençage à très haut débit a conduit à une accumulation de données génomiques sans précèdent, notamment chez les procaryotes. Dans ce contexte, j'ai réalisé une analyse phylogénomique à très large échelle des protéines impliquées dans le cycle cellulaire et sa régulation chez les Firmicutes. Mon objectif était de rechercher des patrons de coévolution entre familles protéiques pouvant refléter des liens fonctionnels. L'application des méthodes développées dans le cadre cette thèse aux protéines impliquées dans le cycle cellulaire chez les Firmicutes a permis de reconstruire l'histoire évolutive de ce processus cellulaire fondamental à l'échelle de ce phylum bactérien majeur. En particulier, j'ai pu mettre en évidence l'existence de quelques points chauds correspondant par exemple à l émergence des Bacilli ou des Streptococcaceae. L'émergence de ces taxa s'est accompagnée de nombreuses acquisitions et/ou de pertes de gènes ainsi que de nombreux réarrangements dans l'organisation des clusters de gènes codant pour ces protéines, suggérant que des changements majeurs se sont produits au niveau du cycle cellulaire et de sa régulation. J'ai également pu mettre en évidence de possibles liens fonctionnels qui n'ont jamais été décrits jusqu'à présent entre des gènes impliqués dans différentes machineries du cycle cellulaire. L'application de ces approches à l'ensemble des protéomes de Firmicutes a également permis d'identifier des protéines présentant des patrons de coévolution communs avec les protéines impliquées dans la division cellulaire et sa régulation, suggérant de possibles liens fonctionnels qu'il serait nécessaire de tester expérimentalement / The bacterial cell cycle is a very well studied process but current models don't reflect the complexity and diversity of involved molecular machineries and associated regulation mechanisms. In fact, our knowledge of cell cycle is based on study of a few model organisms. Yet, comparative analyses showed that some described systems and mechanisms are not conserved and not transposable from a taxon to another. Evolutionary approach such as phylogenomic can be used for functional studies of such systems at the bacterial scale. Those approaches allow to determine the key evolutionary events that lead to a such diversity but also to identify potential functional links between proteins. Furthermore, the development of high throughput sequencing methods leads to a big amount of genomic data, particularly for prokaryotes. In this context, I realized a very large scale phylogenomic analysis of proteins involved in cell cycle and its regulation in Firmicutes. My goal was to search some coevolution patterns between protein families reflecting potentially functional links. The application of methods that I developed during my PhD to cell cycle proteins allowed to reconstruct the evolutionary history of this cell process in Firmicutes. Notably, I highlighted some hot-spots corresponding for example to the emergence of Bacilli or Streptococcaceae. The emergence of such taxa has been accompanied by many acquisitions/losses of cell cycle genes but also many genomic rearrangements in gene clusters suggesting that major changes have occurred at the level of the cell cycle and its regulation. I also highlighted some potential functional links between genes involved in different machineries of cell cycle that have never been described. The application of these approaches to the entire proteomes of Firmicutes allowed to identify proteins presenting same evolution patterns than cell cycle proteins suggesting potential functional links that have to be experimentally tested

Depuis quelques années, des Toxi-Infections Alimentaires Collectives causées par la contamination de produits frais, comme les laitues, par des bactéries pathogènes entériques (Salmonella, Escherichia coli productrice de shigatoxines -ou STEC-) apparaissent de plus en plus nombreuses. La présence de ces bactéries dans cet environnement inhabituel est un risque sanitaire émergent majeur, d'autant plus que les bactéries entériques, pathogènes ou non, présentent fréquemment des résistances aux antibiotiques. Afin d’étudier la persistance des bactéries antibiorésistantes ou pathogènes sur des laitues, la caractérisation de plasmides de résistance portés par des souches de E. coli issues d’environnements aquatiques contaminés a été réalisé pour, par la suite, étudier leur implication potentielle dans l’adhésion des souches-hôtes sur différentes variétés de laitues. L’étude de la survie et de l’adhésion de souches de E. coli environnementales et de laboratoire, transformées avec les plasmides d’intérêt, sur de jeunes plants de laitues a permis de mettre en évidence trois points : 1) plus le temps de contact entre bactéries et feuilles augmente et moins la survie bactérienne est importante ; 2) il existe une différence de survie et d’adhésion selon les variétés de laitues étudiées ; 3) il existe une différence de survie et d’adhésion entre les souches de laboratoire et les souches environnementales, ces dernières étant en meilleur état métabolique et montrant une adhésion plus importante durant les 11-12 jours d’expérimentation. Après ces constatations de persistance des E. coli antibiorésistantes en conditions contrôlées, des études en champs sur 4 exploitations maraîchères normandes, possédant des itinéraires techniques différents, ont été réalisées. La recherche de pathogènes entériques, Salmonella et STEC, a été effectuée sur les laitues et une recherche de E. coli, témoin de contamination fécale, a été réalisée sur les laitues ainsi que dans l’eau d’irrigation d’un des sites. Les résultats révèlent une qualité microbiologique satisfaisante des parcelles étudiées (selon l’arrêté européen N°2073/2005) bien que des E. coli aient été régulièrement retrouvées au niveau des laitues, dont certaines antibiorésistantes. L’analyse de l’eau d’irrigation a montré la présence continue de E. coli, dont des souches présentant des profils d’antibiorésistance communs à ceux retrouvés sur les laitues, montrant que l’eau d’irrigation est l’une des sources critiques de contamination des végétaux en champs. / In recent years, foodborne diseases caused by fresh products contaminated, such as lettuce, with enteric pathogenic bacteria (Salmonella, Shigatoxin-producing Escherichia coli-or STEC-) increasingly. The presence of these bacteria in this unusual environment is a major emerging health risk, especially since enteric bacteria, whether pathogenic or not, are frequently resistant to antibiotics. To study the persistence of antibiotic-resistant or pathogenic bacteria on lettuce, the characterization of resistance plasmids carried by E. coli strains from contaminated aquatic environments was carried out in order to study their potential involvement in adhesion of host strains on different varieties of lettuce. The study of the survival and adhesion of environmental and laboratory E. coli strains, transformed with the plasmids of interest, on young lettuce plants allowed to highlight three points: 1) more time contact between bacteria and leaves increases and less bacterial survival is important; 2) there is a difference in survival and adhesion depending on the varieties of lettuce studied; 3) there is a difference in survival and adhesion between laboratory strains and environmental strains, the latter being in better metabolic state and showing greater adhesion during the 11-12 days of experimentation. After the persistence of antibiotic-resistant E. coli strains under controlled conditions, field studies on 4 Normandy vegetable farms, with different technical itineraries, were carried out. The search for enteric pathogens, Salmonella and STEC, was carried out on lettuce and a search for E. coli, a control of fecal contamination, was realized on the lettuce as well as in the irrigation water of one of the sites. The results reveal a satisfactory microbiological quality of the agricultural plots studied (according to the European decree N ° 2073/2005) although E. coli strains were regularly found at the lettuce level, including some antibiotic resistant. Analysis of the irrigation water showed the continued presence of E. coli strains, including strains with common antimicrobial resistance profiles to those found on lettuce, showing that irrigation water is one of the critical sources of plant contamination in the field.

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MD) qui sont des troubles intestinaux caractérisés par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal. Les MICI sont provoquées par un dysfonctionnement du système immunitaire de la muqueuse vers le microbiote intestinal chez les individus génétiquement prédisposés, menant à des réponses immunitaires pro-inflammatoires excessives. L'incidence de ces maladies augmente dans les pays développés et sont devenues de grands problèmes gastroentérologiques, surtout que les médicaments de traitement actuels sont associés à de graves effets collatéraux. Ainsi, les dernières recherches se concentrent sur le développement de nouvelles stratégies pour le traitement des MICI. Les probiotiques, en particulier celles qui appartiennent au groupe des bactéries lactiques (BL), se montrent capables de prévenir et de traiter les MICI en rétablissant l'équilibre du microbiote perturbé et en supprimant les réponses immunitaires pro-inflammatoires. Afin d'augmenter l’effet probiotique des BL, le clonage moléculaire et l'expression des molécules anti-inflammatoires ont été réalisés et les souches recombinantes des BL ont été évaluées comme un traitement alternatif pour les MICI. L'utilisation de ces souches, en particulier le modèle Lactococcus lactis, a montré son efficacité dans la lutte contre l'inflammation intestinale. Son administration comme thérapie pour traiter d'autres maladies inflammatoires du tractus gastro-intestinal, tels que la mucite, a également été évaluée. La mucite est un effet secondaire fréquent chez les patients subissant une radiothérapie ou une chimiothérapie qui affecte fortement leur qualité de vie. Comme pour les MICI, le traitement de la mucite est assez limité, seuls quelques médicaments et procédures décrits peuvent en effet contenir les ulcérations et l'inflammation. Par conséquent, ilest nécessaire de développer des traitementsalternatifs pour les MICI et la mucite. Le but de cette étude est de tester l'efficacité de la souche de L. lactis recombinante exprimant la protéine associée à la pancréatite I (PAP) afin de lutter contre les MICI et la mucite dans des modèles de souris. La PAP a été rapportée comme une protéine ayant des propriétés antimicrobiennes qui jouent un rôle important pour maintenir l'homéostasie intestinale. Tout d'abord, nous avons construit et confirmé l'expression de la PAP humaine par recombinant L. lactis. Ensuite, nous avons évalué l'effet thérapeutique de cette souche dans un modèle de souris de Dinitrobenzene acide sulfonique (DNBS) afin d’induire la colite. En outre, la livraison de PAP par lactocoques a protégé les animaux d’une perte de poids, de la perméabilité intestinale, et de lésions tissulaires. De plus, le traitement L. Lactis-PAP a diminué Th1 (IFN-y), Th2 (IL-4, IL-5) et Th17 (IL-17) de type-réponses immunitaires. On a également observé une expression élevée de régulation de cytokines TGF-β ainsi qu’une augmentation de la quantité de cellules T régulatrices chez les souris traitées. Les effets anti-inflammatoires des L. Lactis-PAP et des souches des produits laitiers L. lactis NZ9000 ont également été mesurés dans le modèle d'inflammation des muqueuses 5-Fluorouracil (5-FU). L'administration de L. lactis NZ9000 hébergeant le vecteur pSEC sans l'ADNc de PAP a été en mesure de prévenir les dommages histologiques, de réduire l’infiltration des éosinophiles et de la sécrétion d'IgA dans l'iléon de souris. D'autre part, L. lactis exprimant la PAP a conservé l'architecture muqueuse et a amélioré l'activité des cellules de Paneth. En même temps, nos résultats démontrent que L. lactis, exprimant PAP est une stratégie prometteuse pour traiter les MICI. En outre, la souche L. lactis NZ9000 de manière surprenante, a présenté des effets anti-inflammatoires chez les souris injectées avec du 5-FU. / Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD) are complex intestinal disorders characterized by chronic inflammation of the gastrointestinal tract (GIT). IBD are caused by a deregulation of the mucosal immune system toward the native intestinal microbiota in genetically predisposed individuals, leading to excessive pro-inflammatory immune responses in the GIT. The incidence of both diseases is increasing in developed countries turning CD and UC a main gastroenterological problem as current treatment drugs are associated with serious side effects. Thus, recent research is focusing on the development of new strategies for the treatment of IBD. Probiotic bacteria especially the ones belonging to the lactic acid bacteria (LAB) group, were shown to be capable of preventing and treating IBD by restoring the balance of disrupted microbiota and suppressing pro-inflammatory immune responses. In order to increase LAB probiotic effect, molecular cloning and expression of anti-inflammatory molecules are being carried out and LAB recombinant strains are also being evaluated as an alternative treatment for IBD. As the use of these strains, especially the model Lactococcus lactis, showed to be very effective in fighting intestinal inflammation, its administration as a therapy for treating other human GIT inflammatory diseases, such as mucositis, are also being evaluated. This disorder is a common side effect of patients undergoing radiotherapy or chemotherapy that strongly affects their quality of life. Like IBD, treatment for mucositis is very limited with few medicaments and procedures described to contain inflammation. Therefore, given the need to develop alternative treatments for both IBD and mucositis, this study aimed to test theefficacy of either dairy L. lactis NZ9000 or recombinant L. lactis strain expressing Pancreatitis Associated Protein I (PAP) to fight inflammation in mouse models of IBD and mucositis. PAP has been reported as a protein with antimicrobial properties that plays important roles to keep intestinal homeostasis. Firstly, we constructed and confirmed the expression of human PAP by recombinant L. Lactis. Afterwards, we evaluated the therapeutic effect of this strain in a mice model of dinitrobenzenosulfonic acid (DNBS)-induced colitis. Moreover, PAP delivery by lactococci protected animals from weight loss, intestinal permeability, and tissue damage. In addition, L. lactis-PAP treatment decreased Th1 (IFNγ), Th2 (IL-4, IL-5) and Th17 (IL-17) type-immune responses. It was also observed a higher expression of regulatory TGF-β cytokine and increased amount of T regulatory cells in treated mice. The anti-inflammatory effects of both L. lactis-PAP and dairy L. lactis NZ9000 strains were also measured in 5-fluoracil mucositis model. We showed that this model was successfully reproduced in BALB/c mice with an induction of acute inflammation in the small bowel of animals. Administration of L. lactis NZ9000 harboring pSEC vector without the cDNA of PAP was able to prevent histological damage, reduce eosinophils infiltrate and IgA secretion in the ileum of mice. On the other hand, L. lactis expressing PAP preserved mucosal architecture and improved Paneth cells activity. Taking together, our results demonstrate that L. lactis, expressing PAP peptide is a promising strategy to treat IBD. Moreover, L. lactis NZ9000 strain, derived from dairy L. lactis MG1363, surprisingly presented anti-inflammatory effects in mice injected with 5-FU.

Bien que divers mécanismes coopèrent pour empêcher les erreurs lors de la synthèse des protéines chez les bactéries, des erreurs traductionnelles de type « frameshift » (ETFs) ou « faux-sens » peuvent avoir lieu. En particulier, les ETFs ont été détectées à de faibles niveaux lors de la phase de croissance exponentielle et à des niveaux plus élevés durant la phase de croissance stationnaire chez Escherichia coli et Bacillus subtilis. Ces observations ont conduit les chercheurs à revoir le rôle de la "réponse stringente" dans la survenue des ETFs, qui constitue l’un des mécanismes clé de l'adaptation bactérienne aux changements nutritionnels. Elle découle de l'interaction entre un ribosome en cours de traduction et la protéines RelA/SpoT ce qui permet de détecter les ARNs de transfert (ARNts) non chargés et résulte en la production d'une molécule appelée (p)ppGpp . Dans une souche mutante relA incapable de synthétiser le (p)ppGpp, les ETFs sont fortement augmentées.Dans ce contexte, notre objectif principal a été de revisiter le rôle de la réponse stringente dans le contrôle des erreurs traductionnelles et de clarifier le rôle des deux métabolites antagonistes GTP et (p)ppGpp. Par exemple, le GTP stimule l'initiation de la traduction (en ciblant le facteur d'initiation IF2) alors que le (p)ppGpp inhibe l'initiation de la traduction (en rentrant en concurrence avec le GTP pour se fixer sur IF2).A cette fin, nous avons utilisé le modèle des bactéries à Gram positif B. subtilis, conçu trois systèmes rapporteurs distincts pour détecter les ETFs et construit une souche incapable de synthétiser du (p)ppGpp (appelée "(p)ppGpp0"). Nous avons observé qu'au cours de la croissance dans des milieux pauvres, les ETFs augmentent en l'absence de (p)ppGpp durant la phase exponentielle et que, contrairement à la souche sauvage, la souche (p)ppGpp0 présente un pic d’ETFs en milieu riche pendant la transition à la phase stationnaire. En contrôlant les niveaux intracellulaires de GTP dans la souche (p)ppGpp0, nous avons montré que l'abondance de GTP est le facteur qui déclenche l'apparition des ETFs. Néanmoins, après une "faible" induction de la biosynthèse du GTP conduisant à des taux de croissance sous-optimaux, le niveau d’ETFs forme toujours un pic lors de la transition vers la phase stationnaire, ce qui montre que le mode d'action du (p)ppGpp pour prévenir l'apparition des ETFs ne repose pas uniquement sur son action inhibitrice de la biosynthèse du GTP. Nous nous sommes alors concentrés sur l'effet inhibiteur du (p)ppGpp sur IF2 et avons mimé son action en injectant des drogues connues pour inhiber l'initiation de la traduction. Nous avons ainsi démontré qu'en réduisant l'initiation de la traduction lors de l'épuisement des aminoacyl-ARNts, la souche "(p)ppGpp0" est capable de contrôler de façon optimale le taux d’ETFs lors de la transition vers la phase stationnaire.Dans une deuxième partie, nous avons étudié comment la transcription et la traduction sont affectées par les variations du niveau de GTP et de (p)ppGpp. Nous avons observé que les gènes possédant un "+1" de transcription (TSS, « transcription start site ») composé de deux guanines (gènes artificiels et ARNs ribosomaux) ont vu leur taux de transcription positivement corrélés au taux de croissance à l'inverse des gènes possédant un TSS composé de deux adénines. Cette différence est encore plus prononcée pour la souche (p)ppGpp0 cultivée en milieu riche lors de l'ajout de guanosine (ce qui conduit à un niveau élevé de GTP).En conclusion, nous avons démontré que le (p)ppGpp contrôle le niveau d'erreurs traductionnelles lors de la croissance en régime permanent en abaissant les niveaux de GTP et lors d’un changement nutritionnel en inhibant spécifiquement l'initiation de la traduction, assurant une allocation parcimonieuse des ressources au sein de la bactérie. / Even though diverse mechanisms cooperate to prevent protein synthesis errors in bacteria, missense and translational frameshift errors (TFEs) can occur . In particular, TFEs were detected at low levels in the exponential growth phase and at higher levels in the stationary phase in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. This observation led researchers to revisit the role of the “stringent response” in the occurrence of TFEs since it is the key mechanism involved in the bacterial adaptation to nutritional downshifts. It relies on the interaction between the RelA/SpoT proteins and the translating ribosomes, which leads to the detection of uncharged tRNAs and to the production of an alarmone called (p)ppGpp. In a relA mutant strains unable to synthesize (p)ppGpp, translational errors are highly increased.In this context, the main goal of our work was to revisit the role of the stringent response in the translational error control and to clarify the role of the two key, antagonistic metabolites GTP and (p)ppGpp. Indeed, while GTP enhances translation initiation (targeting the initiation factor IF2) and elongation (targeting the elongation factor EF-Tu) , (p)ppGpp inhibits GTP biosynthesis (reducing the enzyme activity of Gmk, HprT and GuaB) and translation initiation (competing with GTP on IF2).For this purpose, we used the Gram positive model bacterium B. subtilis, designed three distinct reporter systems to detect TFEs and built a strain unable to synthesize (p)ppGpp (called “(p)ppGpp0”). We observed that during growth in poor media TFEs were increased in the absence of (p)ppGpp in the exponential phase (i.e. steady-state growth) and that by contrast to the wild type, the (p)ppGpp0 strain exhibited a TFE burst during the transition in rich medium to the stationary phase. By controlling intracellular levels of GTP in the (p)ppGpp0 strain, we showed that GTP abundance is the trigger factor of TFEs occurrence. Nevertheless, upon a "weak" induction of GTP biosynthesis leading to sub-optimal growth rates, the TFEs rate still peaked during the transition to the stationary phase, which demonstrated that the mode of action of (p)ppGpp to prevent TFEs occurrence did not only rely on its inhibition of GTP biosynthesis. We then focused on the (p)ppGpp inhibitory effect on IF2 and mimicked its action by injecting drugs known to inhibit translation initiation. Hence, we demonstrated that by reducing translation initiation (injecting drugs) upon aminoacyl-tRNAs depletion (p)ppgGp0 wild-strain type cells is are able to optimally control the rate of TFEs in the transition to the stationary phase. The same conclusion is obtained even in presence of a high GTP level.In a second part, we studied how transcription and translation are affected by variations in GTP and (p)ppGpp abundances. We observed that genes possessing a transcription start site (TSS) made of two guanines were more importantly transcribed at higher growth rates than genes possessing a TSS made of two adenines. This difference was even more pronounced for (p)ppGpp0 strains grown in rich medium upon guanosine addition (leading to a high level of GTP). Moreover, the ribosomal RNAs (rrns; for which the TSS is a guanine) synthesis level seemed to be positively correlated to GTP levels during exponential growth in poor and rich media as observed by the modulation of GTP biosynthesis.In conclusion, we demonstrated that (p)ppGpp controls the occurrence of translational errors during steady-state growth by decreasing GTP levels and during a nutritional downshift by specifically inhibiting translation initiation ensuring a parsimonious , which also globally affects resource allocation.

Les piles à combustible microbiennes, en tant que biotechnologie potentiellement durable, peuvent assurer la conversion directe de la matière organique en électricité en utilisant des biofilms bactériens comme biocatalyseurs. Dans un context politique où les législations françaises et européennes favorisent et imposent la revalorisation des déchets organiques provenant des industries ou des collectivités territoriales, les biopiles microbiennes semblent un moyen peu couteux et prometteur pour répondre à ce besoin. Cette thèse a pour objectif d'améliorer les connaissances sur la formation des biofilms électroactifs à la surface de l'anode, et de comprendre les mécanismes impliqués dans la compétition entre les bactéries électroactives et les autres communautés bactériennes dans le but d'améliorer la sélection des bactéries électroactives dans le biofilm anodique. Une attention particulière sera portée sur les forces de cisaillement comme un outil de control de la formation des biofilms anodiques. Ces recherches ont pour but à long terme d'améliorer la production d’électricité produite par les biopiles microbiennes, et plus particulièrement d’améliorer les performances du compartiment anodique, en vue d’appliquer cette technologie dans les stations d’épurations pour la réduction du coût énergétique du traitement des eaux usées. A travers cette thèse, différents points sur la dynamique des communautés bactériennes lors de la formation du biofilm ont été mis en évidence. La formation du biofilm est divisée en deux étapes. Dans un premier temps, les bactéries électroactives (EAB) non spécifiques se développent dans toutes les biopiles, produisant ou non de l'électricité et dans le milieu liquide comme sur l’anode. Les EAB spécifiques deviennent ensuite plus compétitives et prédominantes mais seulement dans les biopiles produisant de l'électricité et seulement dans le biofilm anodique. Cette deuxième étape correspond à une augmentation exponentielle de la production d'électricité. A partir de ces résultats, nous émettons l'hypothèse qu'une inhibition de la première étape devrait diminuer la compétition entre les EAB non spécifiques et spécifiques au cours de la colonisation anodique, et favoriser la croissance des EAB spécifiques dans le biofilm. Nous proposons d'utiliser la contrainte de cisaillement pour sélectionner les EAB spécifiques pendant l'étape d'adhésion en détachant les EAB non spécifiques. Dans un premier temps, pour cette étude, des biopiles avec une configuration de chambre à écoulement de cisaillement ont été conçues, construites et mises en place. Les résultats démontrent que sous une contrainte de cisaillement élevée, l'abondance des EAB spécifiques telle que Geobacter était très élevée, jusqu'à 30,14% en opposition à une contrainte de cisaillement faible où l'abondance relative était inférieure à 1%. En outre, la contrainte de cisaillement diminue le pourcentage de couverture de la surface anodique, ce qui montre que la sélection des EAB spécifiques se produit en détachant d'autres bactéries. Ainsi, la contrainte de cisaillement pourrait être utilisée pour sélectionner les EAB spécifiques durant les premières étapes d’adhésion. Enfin, l'effet de la contrainte de cisaillement sur la sélection microbienne au cours de la croissance du biofilm a été étudié. Ces résultats confirment les conclusions précédentes: les EAB spécifiques sont sélectionnées lorsque les contraintes de cisaillement sont plus élevées. Ce travail démontre le rôle majeur des contraintes de cisaillement dans la formation du biofilm L'utilisation de contraintes de cisaillement pourrait être un moyen de contrôler la sélection des EAB et la quantité de matières mortes dans les biofilms anodiques. C’est un facteur qui devrait être pris en compte dans l’architecture et la mise en place des réacteurs / Microbial fuel cells (MFCs), as a potentially sustainable biotechnology, can directly convert organic matter into electricity by using bacterial biofilms as biocatalysts. In a political context where European legislation favors and imposes the revalorization of organic waste from industries, MFC seems an inexpensive and promising technology to meet this need. The aim of this thesis is to improve knowledge of the formation of electroactive biofilms on the anodic surface, and to understand the mechanisms involved in the competition between electroactive bacteria (EAB) and other bacteria. Special attention will be paid to shear force as a tool to control the formation of anodic biofilms. First, bacterial successions have been studied under stationary conditions and in standard laboratory configurations. The results show that the formation of the biofilm is divided in two stages. At first, non-specific EAB grow in all MFCs, producing or not electricity. Then, specific EAB become predominant only in MFCs producing electricity and is associated to an exponential increase of electricity. From these results, we hypothesize that inhibition of the first step should decrease the competition between nonspecific and specific EAB. We propose to use the shear stress to select specific EAB during the adhesion. First, MFCs with a shear stress flow chamber configuration were designed, constructed and set up. The results show that the proportion of specific EAB such as Geobacter was higher, up to 30.14% as opposed to a lower shear stress (less than 1%). Then, the effect of shear stress on microbial selection during biofilm growth was studied. These results confirm the previous conclusions: specific EAB are selected when shear stress is higher. This work demonstrates the major role of shear stress in biofilm formation and could be a way to control the selection of EAB. This factor should be taken into account in the architecture and implementation of the reactors

La résistance aux antibiotiques est l'une des menaces les plus graves pour la santé mondiale de nos jours. L'émergence de bactéries multirésistantes encourage les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques et stratégies pour compenser leurs différents mécanismes de résistance. L'un de ces mécanismes de défense est la formation de biofilms. Sous cette forme, les bactéries développent une matrice extracellulaire protectrice les rendant plus résistantes à divers traitements antimicrobiens. Nous avons conçu et synthétisé des composés de déstabilisation des membranes avec des caractéristiques clés : un cation benzimidazolium ou imidazolium, une chaîne apolaire hydrophobe et/ou un site de reconnaissance des anions lipophiles. Ces caractéristiques leur confèrent une activité antimicrobienne accrue et une grande capacité à perturber les membranes cellulaires. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent via un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches de SARM (staphylococcus aureus résistant à la méthiciline) en tant que candidats antibiofilms prometteurs. Ces nouveaux agents ont le potentiel de se disperser et d'inhiber la formation de biofilms et pourraient avoir un impact positif sur la médecine humaine à l'avenir. / Antibiotic resistance is one of the most serious threats to global health nowadays. Emergence of resistant bacteria encourages researchers to develop new antibiotics and strategies to mitigate their different resistance mechanisms. One of these defense mechanisms is the formation of biofilms. In this form, bacteria develop a protective extracellular matrix making them more resistant to various antimicrobial treatments. We have designed and synthesized membrane destabilizing compounds with three key features: a benzimidazolium or an imidazolium cation, a hydrophobic apolar chain, and a lipophilic anion recognition site. These characteristics give these compounds increased antimicrobial activity and greater ability to disrupt cell membranes. These membrane-disrupting compounds act via a fast and efficient mechanism and showed good results against MRSA (methicillin-resistant staphylococcus aureus) strains as promising antibiofilms candidates. These new agents have the potential to disperse and inhibit the formation of biofilms and could have a positive impact on human medicine in the future.

Les bactéries lactiques (LAB) ont suscité ces dernières années un intérêt accru en agroalimentaire du fait de leur potentiel probiotique, i.e. des potentiels bénéfices santé associés à leur consommation. Les interactions adhésives entre bactéries et composants alimentaires sont susceptibles de jouer un rôle-clé à la fois sur la protection et la répartition des bactéries au sein de l’aliment, impactant donc leur action probiotique. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont pour objectif une meilleure compréhension de ces interactions, afin d’optimiser la fonctionnalité d’aliments contenant des LAB. En effet, le comportement adhésif de la majorité des LAB, ainsi que l’effet des interactions adhésives sur la structuration de l’aliment, sont encore mal connus. En outre, certaines étapes de fabrication alimentaire, telles que l’atomisation, peuvent être génératrices de stress pour les bactéries et donc partiellement compromettre leur capacité à adhérer. Dans le cas où ces bactéries seraient intégrées au sein d’une matrice adhésive, il est également légitime de s’interroger sur les effets de cette adhésion sur la protection des bactéries vis-à-vis du stress infligé. Une méthode de criblage haut-débit a d’abord été développée dans l’objectif d’évaluer rapidement l’affinité adhésive d’une centaine de souches vis-à-vis d’une gamme de biomolécules d’intérêt. Cette méthode a ensuite été appliquée à une collection de 73 souches LAB et a permis de dégager des caractéristiques communes parmi les souches adhérentes, notamment en termes de spécificité d’adhésion. Deux études (expérimentale et théorique) ont été menées conjointement sur l’impact du stress de cisaillement sur la fonctionnalité et l’intégrité des chaînes bactériennes. Ces études suggèrent que la rupture de chaînes bactériennes induite par un stress mécanique serait un processus protecteur de la fonctionnalité bactérienne. Le modèle construit prédit une régiosélectivité des dommages infligés aux cellules bactériennes en chaînes, dont l’intensité dépendrait également de la longueur de chaîne. Appliqué aux interactions adhésives bactéries-particules dans une matrice alimentaire soumise au cisaillement, le modèle suggère un impact défavorable de cette adhésion sur les dommages infligés aux bactéries, d’autant plus important que les particules sont de grande taille. Ce travail pluridisciplinaire apporte ainsi plusieurs éléments-clé qui seront utiles lors la conception et production d’aliments fonctionnels optimisés par rapport à leur action probiotique. / In the last decade, there has been an increasing interest in the potential health effects associated with consumption of Lactic Acid Bacteria (LAB) in foods. Adhesive interactions between bacteria and food components are likely to play a key role on bacterial probiotic action by modulating both bacterial protection and distribution within food matrices. Research presented in this thesis aims a better understanding of these interactions to help optimizing functional food design. Indeed, the adhesive behavior of most LAB, as well as the impact of adhesive interactions on food structuration, remain mostly unknown. Furthermore, some food manufacturing steps, such as spray-drying, may induce stress on bacteria, which can cause partial loss of bacterial adhesive capacities. In case of bacteria integrated within an adhesive matrix, the effect of adhesive interactions on bacterial protection from stress can also be questioned. A high-throughput screening method was first designed to screen quickly a hundred of strains for their adhesive affinities towards a given range of biomolecules of interest. This method was then applied to a 73-LAB strains collection which allowed identifying common characteristics amongst adhesive strains, especially in terms of adhesion specificity. Two studies (experimental and theoretical) were performed in parallel to determine the impact of shear stress on bacterial functionality and bacterial chains integrity. These studies suggest that the stress-induced breaking-down process of bacterial chains can be thought of as a functionality protective process. The proposed model predicts regioselectivity of damages inflicted to bacterial cells within a chain, which intensity would vary with chain length. When applied to bacteria-spherical component adhesive interactions within a food matrix submitted to shearing, the model suggests an unfavorable impact of adhesion on bacterial cell damages, which would be all the more important than spheres are big. This multidisciplinary research project points out several key findings that may help with designing more efficient food matrices for optimized LAB delivery.

Les maladies infectieuses dues aux bactéries Gram + sont causes de mortalité importante à travers le monde, et de récentes études ont mis en évidence le rôle pathologique de l’interféron de type I (I IFN) dans ces maladies. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) produisent des quantités importantes d’IFN de type I suite à la détection de virus. Des données récentes suggèrent que les pDC humaines pourraient également détecter des bactéries, mais les récepteurs impliqués restent inconnus. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé l’expression des récepteurs TLR2 / 1 par les pDC. Ces deux récepteurs permettent aux pDC de détecter les lipoprotéines bactériennes. Je montre que les pDC répondent aux bactéries Gram + (M. tuberculosis, S. aureus et L. monocytogenes) par la voie TLR2 / 1. Mon travail a montré que les pDC primaires humaines expriment TLR1 et TLR2 à la fois au niveau de l'ARNm et au niveau protéique. En réponse aux lipoprotéines bactériennes, la régulation des molécules costimulatrices par les pDCs est TLR1-dépendante tandis que la sécrétion d’I-IFN est TLR2-dépendante. De plus, TLR2 et TLR1 jouent des rôles distincts au cours du priming des cellules T CD4+ naïves par les pDCs, induisant une prolifération et différentiation en sous-populations Th1 / Th2 / Treg. Je démontre en outre que ces différences reposent sur les voies de signalisation distinctes de ces deux TLR. Ce travail de thèse pose ainsi les bases pour l’exploration du rôle des pDC dans les infections bactériennes humaines. / Infections by Gram+ bacteria are worldwide life-threatening diseases where new studies are highlighting the pathological role of Type I interferon (I IFN). Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are the main source of Type I IFN following viral sensing. Recent evidence suggests that human pDCs might sense bacteria. The receptors mediating bacterial sensing in pDCs are not known. During my thesis, I focused on the characterization of pDCs TLR2/1 receptors expression. These two receptors allow pDCs to sense Gram+ bacterial lipoproteins. My work showed that human primary pDCs express TLR1 and TLR2 at the mRNA and protein level. I show that pDCs respond to the Gram+ bacteria M. tuberculosis, S. aureus and L. monocytogenes through TLR2/1 pathway. In human primary pDC, I found that in response to bacterial lipoproteins up-regulation of costimulatory molecules is TLR1-dependent while IFN-I secretion is TLR2-dependent. TLR2 and TLR1 signalling play a different role in the pDCs priming of naïve CD4+ T-cells, inducing proliferation and differentiation to TH1/TH2/Treg subsets. I further demonstrate that these differences rely on the diverse signaling pathway activated by the two TLRs. This work provides the rationale to explore pDCs activity in human bacterial infection.

Les coûts de remise en forme que les macro et micro parasites imposent aux hôtes peuvent s'expliquer par trois facteurs principaux : (1) Les hôtes utilisent des réponses immunitaires contre les parasites pour prévenir ou contrôler l'infection. Les réponses immunitaires nécessitent de l'énergie et des nutriments pour produire et / ou activer les cellules immunitaires et les immunoglobulines, ce qui est coûteux, provoquant des compromis avec d'autres processus physiologiques comme la croissance ou la reproduction. (2) Le taux métabolique de l'hôte peut être augmenté parce que les dommages aux tissus et la réparation ultérieure de l'infection causée par le parasite peuvent être coûteux. (3) Le taux métabolique des hôtes peut augmenter et donc augmenter également leurs besoins en ressources. La compétition entre macro-parasites et hôtes peut priver les ressources de l'hôte. Les coûts de remise en forme que les macro et micro parasites imposent aux hôtes peuvent s'expliquer par trois facteurs principaux : (1) Les hôtes utilisent des réponses immunitaires contre les parasites pour prévenir ou contrôler l'infection. Les réponses immunitaires nécessitent de l'énergie et des nutriments pour produire et / ou activer les cellules immunitaires et les immunoglobulines, ce qui est coûteux, provoquant des compromis avec d'autres processus physiologiques comme la croissance ou la reproduction. (2) Le taux métabolique de l'hôte peut être augmenté parce que les dommages aux tissus et la réparation ultérieure de l'infection causée par le parasite peuvent être coûteux. (3) Le taux métabolique des hôtes peut augmenter et donc augmenter également leurs besoins en ressources. La compétition entre macro-parasites et hôtes peut priver les ressources de l'hôte. / The fitness costs that macro- and micro-parasites impose on hosts can be explained by three main factors: (1) Hosts use immune responses against parasites to prevent or control infection. Immune responses require energy and nutrients to produce and/or activate immune cells and immunoglobulins, and that is costly, causing trade-offs against other physiological processes like growth or reproduction. (2) The host’s metabolic rate can be increased because tissue damage and subsequent repair from the infection caused by parasite may be costly. (3) The metabolic rate of hosts may increase and hence also increase their resource requirements. Competition between macroparasites and hosts may deprive resources of host. Birds are hosts for many symbionts, some of them parasitic, that could decrease the fitness of their hosts. There is a huge diversity in potential parasites carried in a bird’s plumage and some can cause infection. Nest lining feathers are chosen and transported by adult birds including barn swallows Hirundo rustica to their nests, implying that any heterogeneity in abundance and diversity of microorganisms on feathers in nests must arise from feather preferences. we found that the effects of microorganisms on the behavior of birds may be a combination of positive and negative effects. There may be positive effects of antimicrobial activity on birds through the process of bacterial interference, consisting of certain bacteria impeding the establishment of competing bacterial strains by producing antibiotic substances. Meanwhile, the negative effects may imply that pathogenic or/and feather-degrading microorganisms may reduce fitness components of their hosts. These effects of microorganisms and hence the microbiome can be affected by the behavior of bird hosts.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre d’une cotutelle internationale entre l’Université de Bourgogne Franche-Comté en France et l’Université de Sherbrooke au Canada. Elle porte sur le développement d'un biocapteur miniature pour la détection et la quantification de bactéries dans des milieux liquides complexes. La bactérie visée est l’Escherichia coli (E. coli), régulièrement mise en cause dans des épidémies d'infections alimentaires, et parfois meurtrière.La géométrie du biocapteur consiste en une membrane en arséniure de gallium (GaAs) sur laquelle est déposé un film mince piézoélectrique d’oxyde de zinc (ZnO). L'apport du ZnO structuré en couche mince constitue un réel atout pour atteindre de meilleures performances du transducteur piézoélectrique et consécutivement une meilleure sensibilité de détection. Une paire d'électrodes déposée sur le film de ZnO permet de générer sous une tension sinusoïdale une onde acoustique se propageant dans le GaAs, à une fréquence donnée. La face arrière de la membrane, quant à elle, est fonctionnalisée avec une monocouche auto-assemblée (SAM) d'alkanethiols et des anticorps anti-E. coli, conférant la spécificité de la détection. Ainsi, le biocapteur bénéficie à la fois des technologies de microfabrication et de bio-fonctionnalisation du GaAs, déjà validées au sein de l’équipe de recherche, et des propriétés piézoélectriques prometteuses du ZnO, afin d’atteindre potentiellement une détection hautement sensible et spécifique de la bactérie d’intérêt. Le défi consiste à pouvoir détecter et quantifier cette bactérie à de très faibles concentrations dans un échantillon liquide et/ou biologique complexe.Les travaux de recherche ont en partie porté sur les dépôts et caractérisations de couches minces piézoélectriques de ZnO sur des substrats de GaAs. L’effet de l’orientation cristalline du GaAs ainsi que l’utilisation d’une couche intermédiaire de Platine entre le ZnO et le GaAs ont été étudiés par différentes techniques de caractérisation structurale (diffraction des rayons X, spectroscopie Raman, spectrométrie de masse à ionisation secondaire), topographique (microscopie à force atomique), optique (ellipsométrie) et électrique. Après la réalisation des contacts électriques, la membrane en GaAs a été usinée par gravure humide. Une fois fabriqué, le transducteur a été testé en air et en milieu liquide par des mesures électriques, afin de déterminer les fréquences de résonance pour les modes de cisaillement d’épaisseur. Un protocole de bio-fonctionnalisation de surface, validé au sein du laboratoire, a été appliqué à la face arrière du biocapteur pour l’ancrage des SAMs et des anticorps, tout en protégeant la face avant. De plus, les conditions de greffage d’anticorps en termes de concentration utilisée, pH et durée d’incubation, ont été étudiées, afin d’optimiser la capture de bactérie. Par ailleurs, l’impact du pH et de la conductivité de l’échantillon à tester sur la réponse du biocapteur a été déterminé. Les performances du biocapteur ont été évaluées par des tests de détection de la bactérie cible, E. coli, tout en corrélant les mesures électriques avec celles de fluorescence. Des tests de détection ont été réalisés en variant la concentration d’E. coli dans des milieux de complexité croissante. Différents types de contrôles ont été réalisés pour valider les critères de spécificité. En raison de sa petite taille, de son faible coût de fabrication et de sa réponse rapide, le biocapteur proposé pourrait être potentiellement utilisé dans les laboratoires de diagnostic clinique pour la détection d’E. coli. / This thesis was conducted in the frame of an international collaboration between Université de Bourgogne Franche-Comté in France and Université de Sherbrooke in Canada. It addresses the development of a miniaturized biosensor for the detection and quantification of bacteria in complex liquid media. The targeted bacteria is Escherichia coli (E. coli), regularly implicated in outbreaks of foodborne infections, and sometimes fatal.The adopted geometry of the biosensor consists of a gallium arsenide (GaAs) membrane with a thin layer of piezoelectric zinc oxide (ZnO) on its front side. The contribution of ZnO structured in a thin film is a real asset to achieve better performances of the piezoelectric transducer and consecutively a better sensitivity of detection. A pair of electrodes deposited on the ZnO film allows the generation of an acoustic wave propagating in GaAs under a sinusoidal voltage, at a given frequency. The backside of the membrane is functionalized with a self-assembled monolayer (SAM) of alkanethiols and antibodies anti-E. coli, providing the specificity of detection. Thus, the biosensor benefits from the microfabrication and bio-functionalization technologies of GaAs, validated within the research team, and the promising piezoelectric properties of ZnO, to potentially achieve a highly sensitive and specific detection of the bacteria of interest. The challenge is to be able to detect and quantify these bacteria at very low concentrations in a complex liquid and/or biological sample.The research work partly focused on the deposition and characterization of piezoelectric ZnO thin films on GaAs substrates. The effect of the crystalline orientation of GaAs and the use of a titanium / platinum buffer layer between ZnO and GaAs were studied using different structural (X-ray diffraction, Raman spectroscopy, secondary ionization mass spectrometry), topographic (atomic force microscopy), optical (ellipsometry) and electrical characterizations. After the realization of the electrical contacts on top of the ZnO film, the GaAs membrane was micromachined using chemical wet etching. Once fabricated, the transducer was tested in air and liquid medium by electrical measurements, in order to determine the resonance frequencies for thickness shear mode. A protocol for surface bio-functionalization, validated in the laboratory, was applied to the back of the biosensor for anchoring SAMs and antibodies, while protecting the top side. Furthermore, different conditions of antibody grafting such as the concentration, pH and incubation time, were tested to optimize the immunocapture of bacteria. In addition, the impact of the pH and the conductivity of the solution to be tested on the response of the biosensor has been determined. The performances of the biosensor were evaluated by detection tests of the targeted bacteria, E. coli, while correlating electrical measurements with fluorescence microscopy. Detection tests were completed by varying the concentration of E. coli in environments of increasing complexity. Various types of controls were performed to validate the specificity criteria. Thanks to its small size, low cost of fabrication and rapid response, the proposed biosensor has the potential of being applied in clinical diagnostic laboratories for the detection of E. coli.