A doença meningocócica (DM) é, ainda hoje, um sério problema de saúde pública, estando associada a elevadas taxas de morbidade e letalidade no mundo. A DM evoca proteção imunológica persistente contra a doença em pessoas com sistema imunológico normal. Em contraste, a proteção induzida por vacinas meningocócicas sempre requer a administração de doses reforço (booster) da vacina. No Brasil, Neisseria meningitidis dos sorogrupos C (MenC) e B (MenB) são as principais causas de DM durante os últimos anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem sido apontada como um fator de risco para a mortalidade da DM. Um dos pilares do tratamento do HIV é a utilização de vacinas para doenças imuno-preveníveis. A vacina conjugada anti-MenC é frequentemente recomendada para crianças e adolescentes infectados pelo HIV no Brasil e em muitos outros países. Poucos estudos têm abordado os mecanismos pelos quais as vacinas meningocócicas geram e sustentam a memória imunológica. Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de linfócito T (LT) CD4 de memória contra o meningococo após a infecção; 2) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de LT CD4 de memória e linfócito B de memória (LBm) contra o meningococo após o booster da vacina cubana VA-MENGOC-BC em voluntários imunizados há aproximadamente 17 anos; 3) investigar a resposta de anticorpos funcionais (bactericidas e opsonizantes) após imunização com a vacina conjugada anti-MenC (CRM197) em indivíduos infectados pelo vírus HIV. Após a infecção, 83% dos pacientes diagnosticados como tendo DM pelo teste de látex e/ou cultura tiveram títulos de anticorpos bactericidas protetores, mas não houve uma associação entre os títulos de anticorpos bactericidas e a concentração de imunoglobulina total específica. Houve aumento na frequência de linfócitos T de memória central (TCM) (mediana de 15%) ativados, principalmente após estímulo com a cepa MenC. Nos voluntários pré-vacinados, 3 de 5 indivíduos soroconverteram 7 ou 14 dias após a administração da dose booster. Houve um aumento importante da população TCM 14 dias após o booster, mas sem ativação celular diferenciada dos grupos controles. Observamos resposta positiva de LBm na maioria dos voluntários, mas sem correlação com os anticorpos bactericidas. Em relação aos pacientes HIV positivos, os resultados mostraram a necessidade de uma segunda dose da vacina, já que apenas 15% soroconverteram a uma única dose e a segunda dose resultou em soroconversão de cerca de 55% dos indivíduos. Observamos correlação positiva (r= 0,43) e significativa (P= 0,0007) entre os anticorpos opsonizantes e bactericidas após a vacinação. Não observamos diferenças significativas quando relacionamos os títulos de anticorpos bactericidas com o número absoluto de LT CD4 P= 0,051) e LT CD4 nadir (P= 0,09) entre os pacientes que soroconverteram (n= 43) ou não soroconverteram (n= 106) após a primeira dose. Desta forma, os resultados desta tese indicaram que: 1) os pacientes convalescentes da DM adquirem anticorpos bactericidas após infecção por N. meningitidis; 2) nos voluntários vacinados, a dose booster da vacina anti-MenB não foi plenamente eficaz em ativar a memória imunológica através da produção de anticorpos bactericidas ou ativação de LTm; 3) os pacientes HIV positivos necessitam de uma dose booster da vacina conjugada anti-MenC. / Meningococcal disease (MD) is still a serious public health problem and is associated with high morbidity and mortality rates worldwide. MD evokes persistent immune protection against disease in people with normal immune systems. In contrast, protection induced by meningococcal always requires booster injections of the vaccine. In Brazil, Neisseria meningitidis serogroup C (MenC) and B (MenB) have been the main causes of MD for the past years. Currently, there is no universal vaccine against serogroup B. HIV infection has been implicated as a risk factor for the mortality of meningococcal disease. One of the cornerstones of HIV treatment is the use of vaccines for immunopreventable diseases. The anti-MenC conjugated vaccine is often recommended for children and adolescents infected with HIV in Brazil and many other countries. Few studies have addressed the mechanisms by which meningococcal vaccines generate and sustain immunological memory. The aims of this study were: 1) to evaluate the response of bactericidal antibody and memory CD4 T lymphocyte against meningococcus after infection; 2) to evaluate the bactericidal antibody response and memory T cells and memory B cells against meningococcal booster after the Cuban vaccine VA-MENGOC-BC in volunteers immunized for about 17 years; 3) to investigate the functional antibody response (bactericidal and opsonizing) after immunization with anti-MenC conjugated vaccine (CRM197) in individuals infected with HIV. After infection, 83% of patients diagnosed as having DM by latex and/or culture test, had protective titers of bactericidal antibodies, but there was no association between the titers of bactericidal antibodies and the total specific immunoglobulin concentration and an increase in frequency of TCM (median of 15%) activated mainly after stimulation with MenC strain. In pre-vaccinated volunteers, 3 of 5 subjects seroconverted 7 or 14 days after administration of the booster dose. There was a significant increase in TCM population 14 days after the booster dose but without differentiated cell activation of control groups. We observed positive response of memory B lymphocyte in most volunteers, but no correlation with bactericidal antibodies. Regarding HIV infected patients, the results showed the need for a second vaccine dose in this population since only about 15% responded to a single dose and second dose resulted in seroconversion in about 55 % of individuals. We observed a positive (r= 0,43) and significant (P= 0,0007) correlation between the opsonizing and bactericidal antibody after vaccination. No significant differences when we relate the titles of bactericidal antibodies with the absolute number of CD4 (P= 0,051) and CD4 nadir (P= 0,09) among patients who seroconverted (n= 43) or not seroconverted (n= 106) after the first dose. Thus, the results indicated that: 1) convalescent patients of DM acquire bactericidal antibodies after infection with N. meningitides; 2) in vaccinated volunteers, the booster dose of anti-MenB vaccine was not fully effective in activating the immune memory by production of bactericidal antibodies or activation of memory CD4 T lymphocyte; 3) HIV-positive patients need a booster dose of the anti-MenC conjugated vaccine.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / In this study, the Eucalyptus staigeriana essential oil (ESO) was nanoencapsulated and determined the bactericidal effect of its active principle against two strains of pathogenic mircrorganisms, as a preliminary study for use in food preservation. The process occurred by forming a nanoemulsion and spray-drying, using the cashew gum (CG) as encapsulating material. The nanoparticles were characterized by analysis of particle size distribution, zeta potential, absorption spectroscopy in the infrared Fourier transform spectroscopy (FTIR), thermal analysis (TGA/DSC), in vitro release kinetics, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and stability of the encapsulated. Was also determined the Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of nanoparticles, essential oil, and cashew gum to evaluate its antimicrobial activity against Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Gram-positive) and Salmonella Enteritidis IAL 1132 (Gram-negative). The nanoparticles had size ranging from 27.70  3.42 nm to 432.67  41.47 nm in accordance with the formulation, and negatively charged surface. The presence of ESO in the nanoparticles is observed through changes in peak resolutions of the spectra obtained by FT-IR. Thermal analysis showed the main events of mass loss of the samples associated with the degradation of CG. The content of ESO nanoencapsulated varied between 4.76% and 7.12%. The increase in the proportion of CG favored the rapid release of oil in water due to the increased hydrophilic character, and enhance the ability of the nanoparticles to retain the ESO in the polymeric shell during the 365 days. The results for MBC indicated a bactericidal action of the nanoencapsulated oil, and pure oil more efficient in Gram-positive. However, the nanoparticles showed better results against Gram-negative bacteria, due to a possible synergistic effect between the CG and ESO. / Neste trabalho, o Ãleo essencial de Eucalyptus staigeriana (OES) foi nanoencapsulado e determinado o efeito bactericida de seu princÃpio ativo contra duas cepas de mircrorganismos patogÃnicos, como um estudo preliminar para utilizaÃÃo na conservaÃÃo de alimentos. O processo ocorreu atravÃs da formaÃÃo de uma nanoemulsÃo e secagem em spray-drying utilizando a goma de cajueiro (GC) como material encapsulante. As nanopartÃculas foram caracterizadas atravÃs das anÃlises de tamanho e distribuiÃÃo de partÃcula, potencial zeta, espectroscopia de absorÃÃo na regiÃo do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), anÃlise tÃrmica (TGA/DSC), cinÃtica de liberaÃÃo in vitro, cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) e estabilidade do encapsulado. Foi tambÃm determinada a ConcentraÃÃo Bactericida MÃnima (CBM) das nanopartÃculas, do Ãleo essencial e da goma de cajueiro para avaliar sua aÃÃo antimicrobiana contra Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Gram-positiva) e Salmonella Enteritidis IAL 1132 (Gram-negativa). As nanopartÃculas apresentaram tamanho que variaram de 27,70  3,42 nm a 432,67  41,47 nm, de acordo com a formulaÃÃo, e a superfÃcie carregada negativamente. A presenÃa do OES nas nanopartÃculas à observada atravÃs de modificaÃÃes nas resoluÃÃes de pico dos espectros obtidos por FTIR. A anÃlise tÃrmica evidenciou os principais eventos de perda de massa das amostras associados à degradaÃÃo de GC. O teor de OES nanoencapsulado variou entre 4,76 % e 7,12 %. O aumento na proporÃÃo de GC favoreceu a uma rÃpida liberaÃÃo do Ãleo em Ãgua devido ao aumento do carÃter hidrofÃlico, alÃm de aumentar a capacidade das nanopartÃculas em reter o OES no invÃlucro polimÃrico no decorrer dos 365 dias. Os resultados para CBM indicaram uma aÃÃo bactericida do Ãleo nanoencapsulado e do Ãleo puro mais eficiente na bactÃria Gram-positiva. No entanto, as nanopartÃculas mostraram um resultado melhor contra a bactÃria Gram-negativa, devido a um possÃvel efeito sinÃrgico entre a GC e o OES.

This work describes the production and characterization of colloidal solution of silver nanoparticles (AgNPs) and insertion of this colloidal solution in a polymeric ma-trix of epoxy resin. The first stage of this work was the preparation of AgNPs in colloi-dal solution, using AgNO3 as the precursor, ethylene glycol as a medium and dispersant sodium citrate as reducing agent and stabilizer. Were also measured the temporal sta-bility of the solution of AgNPs for possible use over time. The colloidal solution of Ag-NPs was characterized by UV-Vis, DLS (dynamic light scattering) and Zeta potential and through its measures. We found that the colloidal solution of AgNPs is composed of stable nanoparticles, and spherical with average diameter around 10 to 12 nm. In the second stage the preparation and characterization of polymeric matrix of epoxy resin with different solution concentrations (2 ml, 5 ml, 8 ml and 10 ml) of AgNPs inseted manually into the matrix. Structural characterization of components of the polymeric matrix was performed using the techniques of FTIR spectroscopy (Fouri-er transform infrared) and Raman. The indication of the presence of AgNPs and their state of dispersion in the epoxy matrix was studied by UV-Vis spectroscopy and TEM (transmission electron microscopy), and through the results showed the presence of nanoparticles in a dispersed and an average size around 50 nm. Thermogravimetric analysis (TGA) to check the maximum thermal stability of nanocomposite were per-formed. The TGA results indicated that the degradation temperature of the polymer underwent a slight decrease with increasing the volume of solution to resin AgNPs in-serted. In addition, analysis was performed microhardness of the epoxy resin produced with different concentrations of AgNPs solution and subjected to heat treatment. Ac-cording to the microhardness tests, the presence of ethylene glycol in the epoxy matrix significantly altered their microhardness values, acting as a plasticizer. / Neste trabalho descreve-se a produção e caracterização de solução coloidal de nanopartículas de prata (AgNPs) e a inserção dessa solução coloidal em uma matriz polimérica de resina epóxi. A primeira etapa desse trabalho consistiu na síntese de AgNPs em solução coloidal, utilizando AgNO3 como o precursor, o etilenoglicol como meio dispersante e o citrato de sódio como agente redutor e estabilizante. Também foram realizadas medidas de estabilidade temporal da solução de AgNPs, para possí-veis usos ao longo do tempo. A solução coloidal de AgNPs foi caracterizada pela espec-troscopia UV-Vis, DLS (espalhamento dinâmico da luz) e potencial Zeta, e através de suas medidas, constatou que a solução coloidal de AgNPs foi composta de nanopartí-culas estáveis, esféricas e com diâmetro médio em torno de 10 12 nm.Na segunda etapa foi realizada a preparação e caracterização de matriz polimé-rica de resina epóxi com diferentes concentrações (2 ml, 5 ml, 8 ml e 10 ml) de solução de AgNPs inseridas manualmente à matriz. A caracterização estrutural dos componen-tes da matriz polimérica foi realizada utilizando-se as técnicas de espectroscopia por FTIR (infravermelho por transformada de Fourier) e Raman. A indicação da presença das AgNPs e do seu estado de dispersão na matriz epóxi foi estudado empregado a espectroscopia UV-Vis e MET (microscopia eletrônica de transmissão), e por meio dos resultados, constatou-se a presença das nanopartículas de forma dispersa e com um tamanho médio em torno de 50 nm. Foram realizadas análises termogravimétricas (TGA) para verificar a estabilidade térmica da resina epóxi. Os resultados de TGA indi-caram que a máxima temperatura de degradação do polímero sofreu uma leve redu-ção com o aumento do volume de solução de AgNPs inserida à resina. Além disso, também foram realizadas análises de microdureza Vickers da resina epóxi produzida com diferentes concentrações de solução de AgNPs e submetidas a tratamento térmi-co. De acordo com os ensaios de microdureza, a presença do etilenoglicol na matriz epóxi alterou significativamente seus valores de microdureza, atuando como plastifi-cante.

As fosfolipases A2 (PLA2s, E.C. 3.1.1.4) pertencem a uma superfamília de enzimas que realizam a clivagem de fosfolipídios da membrana celular em ácidos graxos e lisofosfolipídios, numa reação dependente de cálcio. As PLA2s apresentam um importante papel em várias funções celulares, incluindo manutenção dos fosfolipídios celulares, geração de prostaglandinas e leucotrienos, tradução de sinais, proliferação celular e contração muscular. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de uma fosfolipase A2 ácida tóxica(BmooTX-I) isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. A BmooTX-I foi purificada por uma combinação de cromatografias em resinas de troca iônica (DEAE-Sephacel), exclusão molecular (Sephadex G-75) e interação hidrofóbica (Phenyl-Sepharose CL-4B). A confirmação do grau de pureza foi realizada através de análise por espectrometria de massa MALDI TOF da BmooTX-I reduzida (monômero, 13.802,66 Da) e não reduzida (dímero, 27.506,38 Da), da focalização isoelétrica (pI 4,2) e de SDS-PAGE. A região N-terminal da enzima apresentou alta homologia com outras PLA2s Asp49 de peçonhas de serpentes. A BmooTX-I apresentou também elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, induzir a liberação de PGI2 por HUVECs e apresentar efeito citotóxico sobre células tumorais, bactérias e fungos. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila (BPB) neutralizou a atividade enzimática e de inibição da agregação plaquetária. A determinação da miotoxicidade foi realizada através da dosagem dos níveis de CK no plasma de camundongos previamente injetados com a toxina. A análise histopatológica das fibras musculares demonstrou a presença de infiltrado inflamatório e líquido intercelular, ambos confirmados pela análise ultra-estrutural. O presente trabalho deverá contribuir para a elucidação e determinação da composição bioquímica dos venenos animais, já que as fosfolipases A2 ácidas tóxicas possuem mecanismos de ação ainda não totalmente esclarecidos. / Phospholipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) belong to a superfamily of enzymes that perform the cleavage of phospholipids of cell membranes in fatty acids and lysophospholipids in a calcium dependent reaction. PLA2s have an important role in several cellular functions, including maintenance of cellular phospholipids, the generation of prostaglandins and leukotrienes, translation signals, cell proliferation and muscle contraction. This study aimed at the structural and functional characterization of an acidic and toxic phospholipase A¬2 (BmooTX-I) isolated from Bothrops moojeni snake venom. BmooTX-I was purified by a combination of chromatographic steps on resins of ion exchange (DEAE Sephacel), molecular exclusion (Sephadex G-75) and hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose CL-4B). The confirmation of the purity degree was analyzed by MALDI TOF mass spectrometry of reduced BmooTX-I (monomer, 13,802.66 Da) and not reduced (dimer, 27,506.38 Da), by isoelectric focusing (pI 4.2) and by SDS-PAGE. The N-terminal region of the enzyme showed high homology with other Asp49 PLA2s of snake venoms. BmooTX-I also presented high phospholipase activity and induced moderate edema in vivo. Furthermore, this enzyme was capable of inhibiting platelet aggregation and plasma coagulation, inducing the release of PGI2 by HUVECs, also showing cytotoxic effects on tumor cells, bacteria and fungi. Treatment of the enzyme with the p-bromophenacyl bromide (BPB) neutralized the enzymatic activity and the inhibition of platelet aggregation. The determination of myotoxicity was accomplished through the determination of the CK levels in plasma of mice previously injected with the toxin. The histopathological analysis of muscle fibers showed the presence of inflammatory infiltration and intercellular fluid, both confirmed by ultrastructural analysis. This work contributes to the elucidation and determination of the biochemical composition of animal venoms, since the mechanisms of action of toxic acidic phospholipases A2 are not yet fully understood.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-08-24T13:49:29Z No. of bitstreams: 2 Adrieli_Toledo2018.pdf: 1064570 bytes, checksum: b4b7ab870d6f9388d0d57ae7ea9c766d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:49:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Adrieli_Toledo2018.pdf: 1064570 bytes, checksum: b4b7ab870d6f9388d0d57ae7ea9c766d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Scientific researches with Brazilian native species have aroused a growing interest in the search for active compounds with biological potential. The fruit species Eugenia involucrata DC. (Myrtaceae), known as “cerejeira-do-mato”, is popularly used in the form of tea with antidiarrheal and digestive action. In the literature, although researches with the fruit because to its commercial value, studies with the leaves of the species are scarce, being few data related to the biological activities of this plant. Therefore, the objective of this work was to identify the chemical components of the essential oil by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and to perform the phytochemical exploration of the plant extracts through colorimetric visualization and / or precipitate formation. In addition, the antimicrobial activity by the broth microdilution technique and the antioxidant activity by the 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) method were evaluated. In the analysis of the essential oil by GC-MS 28 compounds were identified, all sesquiterpenes, corresponding to 89.41% of the essential oil. The antimicrobial activity of the oil was observed for all Gram-positive bacteria tested and for yeast C. albicans. The essential oil presented a reduction capacity of DPPH up to 66.81%, evidencing its antioxidant potential. The phytochemical prospection of the extracts detected the presence of saponins, steroids, flavonoids and tannins. The antimicrobial and antioxidant activities were observed in all extracts tested. The extracts that presented the best results were: methanolic with antimicrobial activity between 3.12 and 25 mg.mL-1 and antioxidant percentage of 95.85% in the concentration of 1.0 mg.mL-1; and the ethanolic with antimicrobial activity between 3.12 and 50 mg.mL-1 and antioxidant activity of 92.84% in the concentration of 1.0 mg.mL-1. It is suggested that the biological activities found for the essential oil are related to its major compounds: elixene (26.53%), β-caryophyllene (13.16%), α-copaene (8.41%) and germacrene D (7.17%). Regarding the extracts, due to the proven presence of flavonoids and tannins, it is suggested that these phenolic compounds are related to the activities found. / As pesquisas científicas com espécies nativas brasileiras têm despertado um crescente interesse na busca por compostos ativos com potencial biológico. A espécie frutífera Eugenia involucrata DC. (Myrtaceae), conhecida por cerejeira-do-mato, é popularmente usada na forma de chá com ação antidiarreica e digestiva. Na literatura, apesar de pesquisas com o fruto devido ao seu valor comercial, estudos com as folhas da espécie são escassos, sendo encontrados poucos dados relacionados as atividades biológicas dessa planta. Diante disso, este trabalho objetivou identificar os componentes químicos do óleo essencial por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e realizar a prospecção fitoquímica dos extratos vegetais por meio da visualização colorimétrica e/ou na formação de precipitado. Além disso, foi avaliada a atividade antimicrobiana pela técnica de microdiluição em caldo e a atividade antioxidante pelo método do 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). Na análise do óleo essencial por CG-EM identificou-se 28 compostos, todos sesquiterpenos, correspondendo a 89,41% do óleo essencial. A atividade antimicrobiana do óleo foi observada para todas as bactérias Gram-positivas testadas e para a levedura C. albicans. O óleo essencial apresentou capacidade redutora de radicais DPPH de até 66,81%, evidenciando seu potencial antioxidante. A prospecção fitoquímica dos extratos detectou a presença de saponinas, esteroides, flavonoides e taninos. As atividades antimicrobiana e antioxidante foram observadas em todos os extratos testados. Os extratos que apresentaram os melhores resultados foram: metanólico com atividade antimicrobiana entre 3,12 e 25 mg.mL-1 e percentual antioxidante de 95,85% na concentração de 1,0 mg.mL-1; e o etanólico com atividade antimicrobiana entre 3,12 e 50 mg.mL-1 e atividade antioxidante de 92,84% na concentração de 1,0 mg.mL-1. Sugere-se que as atividades biológicas encontradas para o óleo essencial estejam relacionadas aos seus compostos majoritários: elixeno (26,53%), β-cariofileno (13,16%), α-copaeno (8,41%) e germacreno D (7,17%). Referente aos extratos, devido a comprovada presença de flavonoides e taninos, sugere-se que estes compostos fenólicos estejam relacionados as atividades encontradas.

Un récent rapport de l’OMS met en garde les autorités de santé sur l’émergence de résistances chez les bactéries et le développement de souches bactériennes multi-résistantes aux traitements antibiotiques actuels. La progression de ces phénomènes est dû à différents facteurs. L’environnement hospitalier concentre un usage important de traitements antibiotiques et représente ainsi un terreau favorable au développement de résistances chez les bactéries. Le staphylocoque doré, ainsi que sa souche résistante (SARM), s’avèrent problématiques et entraînent un grand nombre de maladies nosocomiales. Dans ce contexte, il est primordial de mettre au point de nouveaux agents antibactériens permettant de lutter contre ces bactéries. Les liquides ioniques (sels à point de fusion bas) démontrent d’importantes propriétés antibactériennes. Néanmoins les mécanismes de cet effet bactéricide n’ont pas encore été établis. Ainsi nous nous proposons, dans un premier temps, de synthétiser des liquides ioniques di-cationiques afin d’étudier les différents facteurs structuraux qui régissent leur activité antibactérienne. Dans un second temps, nous concevrons des liquides ioniques à base de phosphoniums fonctionnalisés avec une sonde fluorescente. En exploitant les propriétés spectroscopiques, nous tenterons d’observer leurs interactions avec les cellules bactériennes. Enfin, nous nous proposons d'utiliser les phosphoniums comme agents de fonctionnalisation de surface dans le but de mettre au point des surfaces aux qualités bactéricides intrinsèques. Pour ce faire nous utiliserons différentes méthodes comme la conception de monocouches auto-assemblées ou l’électropolymérisation. / A recent WHO report warns the health authorities about the emergence of new bacterial resistances and the development of multi-resistant strains against current antibiotics treatments. The growth of those resistances is due to several factors. The hospital environment concentrates a significant use of antibiotics and disinfectant representing a favorable ground for bacterial resistance development. Among them the Staphylococcus aureus and its methicillin resistant strain (MRSA) represent a crucial issue in care environments and is a major cause of hospital acquired infections. In this context, it is essential to develop new antibacterial agents to fight against these bacteria. Ionic liquid are low melting point salts, they show significant antibacterial properties. However, the fact that the mechanisms of action of their bactericidal effect have not been established yet constitutes a major obstacle to their development as bactericidal agents. Thus, we propose to synthetize ammonium- and phosphonium-based di-cationic ionic liquids in order to study the different structural factors that govern their antibacterial activity. Then we will develop phosphonium based ionic liquids functionalized with a fluorescent probe. By taking advantage of their spectroscopic properties we will try to observe their interactions with bacterial cells. Finally, we propose to use the phosphonium salts as surface functionalization agents in order to design surfaces with intrinsic antibacterial properties. To do so, we will use innovative methods such as conception of self-assembled monolayers or electropolymerization technics.

Dans un contexte d'usage raisonné des antibiotiques lié au développement des résistances bactériennes, il est pertinent de chercher à optimiser les profils d'exposition plasmatique qui conduiraient à la meilleure efficacité de l'antibiotique sur les bactéries pathogènes. La charge bactérienne n'est pas stationnaire tout au long du développement d'une infection, mais elle augmente spontanément ou diminue avec un traitement antibactérien efficace. L'objectif de cette thèse était d'évaluer l'influence de la variation de la charge bactérienne sur l'efficacité des antibiotiques et du système immunitaire.Au cours d'un premier travail, nous avons montré que dans les conditions de réalisation de tests de sensibilité in vitro (détermination de CMI), une dégradation de certains antibiotiques se produisait, d'amplitude variable selon les molécules testées. Cette dégradation peut être responsable d'une augmentation des valeurs de CMI et de CMB. Les variations observées étaient cependant inférieures à une dilution au demi dans une gamme de concentrations. Cette dégradation ne devrait pas avoir d'impact significatif sur les résultats des tests de sensibilité aux antibiotiques concernés, excepté dans des cas particuliers comme des pathogènes à croissance très lente. Dans un deuxième travail, nous avons étudié in vitro chez E. coli et S. aureus l'effet de la taille de l'inoculum bactérien sur l'activité bactéricide de 2 céphalosporines, la céphalexine et le cefprozil. Nous avons observé une diminution de l'activité bactéricide des 2 céphalosporines avec l'augmentation de la taille de l'inoculum chez E. coli et S. aureus. Nous avons également montré une efficacité et une puissance moins importante des 2 céphalosporines sur S. aureus par rapport à E coli.Dans un troisième temps, nous avons développé un système incluant les trois composantes suivantes : une bactérie - S. aureus -, des cellules du système immunitaire - des macrophages murins issus de la moelle osseuse - et un antibiotique -la céphalexine-. Dans ce système, nous avons fait varier la taille de l'inoculum bactérien de départ ainsi les concentrations en antibiotique. Une augmentation de la phagocytose bactérienne et de la mortalité des macrophages ont été observées avec l'augmentation de la charge bactérienne. L'activité bactéricide des macrophages était saturable et en présence d'une charge bactérienne trop importante, une partie des macrophages sont devenus un réservoir de S. aureus phagocytés. En présence de la céphalexine, qui a une distribution exclusivement extracellulaire, les quantités de bactéries extracellulaires, " candidates " à la phagocytose, ont diminué. Ainsi, en présence de céphalexine et pour les charges bactériennes initiales les plus faibles, les capacités de survie et de bactéricidie des macrophages ont été préservées. Cette action n'a cependant plus été visible en présence de gros inocula bactériens pour lesquels l'action limitée de la céphalexine n'a pas permis de prévenir la saturation des macrophages et ses conséquences. Le modèle à trois composantes que nous avons développé constitue une première étape dans le développement de modèles in vitro qui associent des éléments de l'immunité innée aux modèles pharmacologiques classiques bactéries/antibiotiques, avec l'objectif d'optimiser l'évaluation préclinique de molécules antibactériennes. / As one of the current pre-eminent public health concerns is to reasonably use antibiotics in order to limit antibacterial resistance development, it appears relevant to determine the plasmatic exposition profile that would lead to the best efficiency of the antibiotic on pathogenic bacteria. The bacterial load is not stationary during an infection but it increases or decreases with an effective antibiotic treatment. The aim of this thesis was to evaluate the influence of variation of the bacterial load on antibiotic and immune system activity.First, we showed that during antibacterial sensibility tests, such as standard MIC determination, some antibiotics underwent abiotic degradation during incubation, with a magnitude depending on the drug tested. This degradation can increase MIC and MBC values. However, the observed discrepancy (less than one twofold dilution) suggests that this would only be clinically significant in special cases such as slow-growing bacteria.Then, we studied, with E. coli and S. aureus, the in vitro effect of the bacterial inoculum size on bactericidal activity of 2 cephalosporins, cephalexin and cefprozil. We observed a decrease of bactericidal activity of both cephalosporins with an increase of the initial inocula of E. coli and S. aureus. A decreased efficacy and potency of the 2 cephalosporins against S. aureus compared to E. coli was also found. Finally, we developed an in vitro 3-components model including a bacterium -S. aureus-, cells of the immune system -murine bone-marrow-derived macrophages- and an antibiotic -cephalexin-. Within this system, we tested several initial bacterial inoculum sizes and different antibiotic concentrations. Increased bacterial phagocytosis and macrophage mortality were observed with increasing bacterial inocula. Bactericidal activity of macrophages was saturable and faced to a large bacterial inoculum, some macrophages became a reservoir for living S. aureus. With cephalexin, which is an extracellular antibiotic, extracellular bacteria diminished over time implying a diminution of the bacteria to be phagocytosed by macrophages. Thus, macrophages bactericidal and survival abilities were preserved with cephalexin and small bacterial inocula. This effect of the antibiotic was no longer visible with highest bacterial inocula for which limited action of cephalexin did not allow to prevent macrophages bursting. The tripartite model we developed is a first step toward innovative in vitro models combining elements of innate immunity with classical bacteria/antibiotics pharmacological models, with the objective of optimising preclinical evaluation of antibacterial drugs.

A hidroxiapatita (HA) tem sido amplamente utilizada como material de implante por possuir alta similaridade com a composição dos ossos e ter capacidade de formar ligações químicas fortes com o tecido ósseo. Entretanto, a adsorção fácil de moléculas orgânicas (proteínas, aminoácidos e polissacarídeos) pela HA também favorece a adsorção e replicação de bactérias, aumentando os casos de infecções relacionados a esse biomaterial. Visando contribuir para o avanço de novos biomateriais com propriedades antibacterianas, foram produzidas neste trabalho hidroxiapatitas contendo nanopartículas de prata (AgNPs) com diferentes proporções (0,01; 0,05; 0,10 e 0,25% m/m). A primeira etapa do trabalho consistiu na obtenção do pó de HA por precipitação química e na produção de AgNPs em suspensões coloidais por meio de síntese que utiliza a quitosana como agente redutor e estabilizante. Na segunda etapa, as AgNPs foram adsorvidas na HA pelo método de imersão do pó usando um dos coloides sintetizados, obtendo-se quatro hidroxiapatitas contendo AgNPs (HA-AgNPs) nas formas de pó e disco. Na terceira e última etapa, os materiais produzidos foram caracterizados utilizando diversas técnicas e os pós (HA e HA-AgNPs) foram submetidos a avaliações in vitro. O efeito antibacteriano foi avaliado frente a cepas de S. aureus e E. coli utilizando métodos qualitativos e quantitativos. A adesão bacteriana sobre a superfície dos discos foi observada por microscopias eletrônica de varredura (MEV) e confocal de varredura a laser. A citotoxicidade in vitro foi avaliada utilizando cultura de células contendo linhagem de osteoblastos (MG-63). Nesse ensaio, a viabilidade dos osteoblastos foi estudada usando o teste da resazurina; a atividade enzimática foi investigada através da fosfatase alcalina (ALP); e a adesão dos osteoblastos foi observada por MEV. Os resultados mostraram que a HA produzida é nanométrica e que as AgNPs sintetizadas são estáveis e esféricas, com diâmetros variando entre 5-10 nm. Técnicas de MEV, EDS e ICP-AES confirmaram a presença de prata nas HA-AgNPs. As demais caracterizações não mostraram alterações relevantes na estrutura, morfologia e características de superfície (hidrofobicidade e carga líquida). No entanto, a atividade antibacteriana dos materiais mostrou-se eficiente para ambas as cepas e com uma redução de 99,9% das colônias bacterianas em quase todos os materiais já nas primeiras 4 h. Também foi encontrado que a eliminação foi maior tanto para E. coli quanto utilizando materiais em pó. O estudo da adesão bacteriana confirmou os resultados anteriores mostrando efeito superior para quase todas HA-AgNPs produzidas comparado a HA, exceto para o material com menor proporção de AgNPs (0,01% m/m). Por outro lado, os testes de viabilidade, ALP e adesão demonstraram que a HA-AgNPs com maior quantidade de AgNPs (0,25% m/m) tem um efeito negativo sobre os osteoblastos. Considerando ambos os efeitos de citotoxicidade e antibacteriano, aliado a metodologia simples e de baixo custo envolvido na produção desses materiais, sugere-se que a HA contendo entre 0,05 0,10% m/m das AgNPs sintetizada pode ser a mais favorável para o desenvolvimento proposto visando futuras aplicações biomédicas. / Hydroxyapatite (HA) has been widely used as implant material due to its high similarity with the bone composition and its capacity to form strong chemical bonds with the bone tissue. However, the easy adsorption of organic molecules (proteins, amino acids and polysaccharides) by the HA also favors bacteria adsorption and replication, increasing the cases of infection related to this biomaterial. Aiming to contribute to the advancement of new biomaterials with antibacterial properties, were produced in this work hydroxyapatites containing silver nanoparticles (AgNPs) with different ratios (0.01, 0.05, 0.10 and 0.25% m/m). The first step of this work consisted in obtaining the HA powder by chemical precipitation and production of AgNPs colloidal suspensions by synthesis using chitosan as a reducing agent and stabilizer. In the second step, the AgNPs were adsorbed to the HA matrix by the powder immersion method using onde of the synthesized colloids, resulting in four hydroxyapatites containg AgNPs (HA-AgNPs) in disk and powder forms. In the third and final step, the materials produced were characterized using several techniques, with the powders (HA and HA-AgNPs) evaluated in vitro. The antibacterial effect was evaluated against strains of S. aureus and E. coli using qualitative (ágar diffusion test) and quantitative (bacterial colony counts) methods. The bacterial adhesion over the disks surface were observed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy. Cytotoxicity was evaluated in vitro using cell culture containing the osteoblast lineage (MG- 63). In this assay, osteoblasts viability was studied using the resazurin test; the enzyme activity was investigated by alkaline phosphatase (ALP), and osteoblast adhesion was observed by SEM. The results showed that the HA produced is nanometric and the synthesized AgNPs are stable and spherical with diameters ranging from 5-10 nm. SEM, EDS and ICP-AES techniques confirmed the presence of silver in the HA-AgNPs. The others characterizations showed no significant changes in the structure, morphology and surface characteristics (hydrophobicity and net charge). However, the materials antibacterial activity was effective for both strains and with reduction of 99.9% of bacterial colonies in almost all materials within the first 4 h. It was also found that the removal was as great for E. coli as for powder materials. The bacterial adhesion study confirmed previous results showing superior effect for almost all HA-AgNPs produced compared to HA, except for the material with the lowest proportion of AgNPs (0.01% m/m). On the other hand, viability tests, ALP and adhesion demonstrated that HA-AGNPS with higher AGNPS quantities (0.25% m/m) has a negative effect on osteoblasts. Considering both cytotoxicity and antibacterial effects, combined with the simple methodology and low cost involved in the production of these materials, it is suggested that the HA containing synthesized AgNPs ranging from 0.05 to 0.10% m/m can be the most favorable for the development of the proposed material for future biomedical applications.

No description available.

No description available.