Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T15:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_MoniqueCulturatoPadilha_M.pdf: 7402848 bytes, checksum: 64244a22fab0eb94170d857f28da8e50 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o principal regulador da angiogênese e da permeabilidade vascular, foi recentemente reconhecido como neurotrófico, neurogênico e neuroprotetor, sendo, portanto, regulado positivamente em muitos processos neuropatológicos. Neste modelo experimental de quebra da barreira hematoencefálica (BHE) pelo veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), a expressão do VEGF e seus receptores tirosina-quinase, Flt-1 e Flk-1 e de seus RNAs mensageiros foi investigada no hipocampo e cerebelo de ratos Wistar (Rattus norvegicus) por imunohistoquímica (IHQ), western blotting (WB) e reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR). Paralelamente, a integridade da BHE foi avaliada através da expressão das proteínas da via paracelular, Ocludina e ?-catenina, e da principal proteína da membrana basal, a Laminina, que estão presentes no endotélio na interface sangue-cérebro. O estudo foi realizado em ratos de 14 dias (neonatos) e de 8-10 semanas (adultos jovens) para avaliar diferenças em função da idade na funcionalidade da BHE e na possível mediação dos efeitos neurotóxicos do PNV pelo VEGF. A via escolhida para administração de PNV (1,7 mg/kg em 0,5ml de salina 0,9%) foi intraperitoneal, devido sua administração mais favorável nos animais neonatos. Os tempos de 2, 5 e 24 horas após a administração de PNV visaram investigar a expressão das proteínas, RNAs mensageiros e uma possível mediação pelo VEGF na fase aguda do envenenamento. A administração do PNV provocou sinais imediatos de intoxicação nos animais, os quais foram mais severos e imediatos nos neonatos do que nos adultos. No hipocampo, os dados do WB mostraram aumento da expressão de VEGF, Flt-1 e Flk-1 e respectivos RNAs mensageiros, que foram concomitantes com o desenvolvimento de edema perivascular e diminuição da expressão da Ocludina, ?-catenina e Laminina. Os dados da IHQ mostraram que a imunorreatividade de VEGF ocorreu nos corpos dos neurônios piramidais e dendritos nos subcampos CA1, CA2, CA3 e giro denteado do hipocampo, em contraste com a marcação nuclear de Flt-1 e Flk-1. O PNV aumentou visivelmente a imunomarcação das três proteínas. No cerebelo, os dados do WB e IHQ mostraram que o PNV induziu aumento na expressão dos componentes do sistema VEGF/Flt-1/Flk-1. Células presentes na camada granular e molecular que não mostraram marcação nos animais controles passaram a ser positivas nos animais xviii envenenados, principalmente as células de Purkinje. Os animais adultos apresentaram aumentos mais proeminentes no sistema VEGF/Flt-1/Flk-1 do cerebelo do que os recémnascidos; nestes, o PNV induziu diminuição na expressão da Ocludina, ?-catenina e Laminina, enquanto nos adultos a diminuição ocorreu apenas na Ocludina e ?-catenina. O veneno da aranha P. nigriventer contem peptídeos neurotóxicos que causam excitabilidade na neurotransmissão nervosa por modificarem a fisiologia dos canais de sódio, potássio e cálcio. Uma vez que a dinâmica das alterações descritas diferiu entre regiões cerebrais e entre animais neonatos e adultos jovens, sugerimos particularidades regionais e de funcionalidade, tanto da BHE, como dos neurônios imunorreativos em resposta ao PNV. Estes resultados são os primeiros a demonstrar alterações do sistema VEGF/Flt-1/Flk-1 no hipocampo e cerebelo que cursam com sinais neuroexcitotóxicos dos animais que foram tratados com o veneno / Abstract: Vascular endothelial growth factor (VEGF), a major regulator of developmental angiogenesis and vascular permeability, was recently recognized as neurotrophic, neurogenic and neuroprotector, hence being upregulated in many neuropathological processes. In this experimental model of blood brain barrier (BBB) breakdown by the Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), the expression of VEGF and its receptor tyrosine kinases, Flt-1 and Flk-1 and their mRNAs was investigated in the hippocampus and cerebellum of Wistar rats (Rattus norvegicus) by immunohistochemistry (IHC), western blotting (WB) and real time polymerase chain reaction (qPCR). Simultaneously, the BBB integrity was assessed through expression of paracellular pathway proteins, ?- catenin and Occludin, and the main basement membrane protein, Laminin, which are present in the endothelium blood-brain interface. The study was performed in rats by 14 days (neonates) and 8-10 weeks (young adults) to assess differences related to age in the BBB functionality and the possible mediation of the PNV neurotoxic effects by VEGF. The via chosen for PNV administration (1.7 mg/kg in 0.5 ml of 0.9% saline) was intraperitoneally, due to more favorable application in neonate animals. The times of 2, 5 and 24 hours after PNV administration aimed to investigate the expression of proteins, mRNAs, and possible mediation by VEGF in acute envenomation. The PNV administration provoked immediate signs of intoxication in animals, which were more severe and immediate in neonates than in adults. In hippocampus, the WB data showed increased expression of VEGF, Flt-1 and Flk-1 and their mRNAs, which were concomitant with the development of perivascular edema, and decreased expression of Occludin, ?-catenin and Laminin. IHC data show that VEGF immunoreactivity occurred in the bodies and dendrites of pyramidal neurons in the subfield CA1, CA2, CA3 and dentate gyrus of the hippocampus, in contrast with nuclear staining of Flt-1 and Flk-1. The PNV visibly increased immunostaining of the three proteins. In cerebellum, the WB data and IHC showed that the PNV induced an increase in the expression of VEGF/Flt-1/Flk-1 system components. Cells in the granular and molecular layer showed no marking in the control animals became positive in animals envenomed, especially Purkinje cells. Adult animals showed increases more prominent in the VEGF/Flt-1/Flk-1 system of the cerebellum than xx neonates; in these animals, the PNV induced decrease in expression of Occludin, ?-catenin and Laminin, while in adults the decrease occurred only in Occludin and ?-catenin. The venom of the spider P. nigriventer contains peptides that cause excitability in the nervous neurotransmission by modifying the physiology of sodium, potassium and calcium channels. Since the dynamics of the changes described differed between brain regions and among neonates and young adult animals, we suggest regional specificities and functionality of BHE and immunoreactive neurons in response to PNV. These results are the first to demonstrate changes in the hippocampus and cerebellum VEGF/Flt-1/Flk-1 system that courses with neuroexcitotoxic signs of animals that were treated with venom / Mestrado / Farmacologia / Mestra em Farmacologia

Orientadores: Maria Alice Cruz-Hofling, Carla Beatriz Collares Buzato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maluf_LucianaLeSueur_D.pdf: 4903601 bytes, checksum: e268232610cdb57ab9b546daa40ae6cc (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado

Orientador: Sofia Fernanda Gonçalves Zorzella Pezavento / Resumo: A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica e desmielinizante do Sistema Nervoso Central (SNC) que desencadeia diferentes graus de incapacidade física e cognitiva. Os tratamentos para a EM são baseados principalmente em drogas imunomoduladoras visando redução da gravidade e da frequência de recidivas, uma vez que não há cura para a doença. Estudos em modelo experimental de EM, denominado encefalomielite autoimune experimental (EAE) têm demonstrado o efeito imunomodulador da vitamina D (Vit D3) tanto na imunidade inata quanto na adaptativa. Neste contexto, nosso objetivo foi avaliar se a intervenção precoce com Vit D3 é capaz de bloquear a neuroinflamação em um modelo experimental de EM. Para isto, camundongos C57BL/6 fêmeas foram imunizados com MOG (glicoproteína da mielina do oligodendrócito) associada ao Adjuvante Completo de Freund e tratadas com Vit D3 por via intraperitoneal. A Vit D3 diminuiu, de forma significativa, a incidência e o escore clínico da doença. Este efeito protetor foi acompanhado da diminuição de entrada de linfócitos no SNC e também de redução no processo de desmielinização e expressão de MHCII em macrófagos e micróglia. A eficácia da Vit D3 também foi associada com controle local do estresse oxidativo, ou seja, nos animais tratados ocorreu normalização dos níveis de peroxidação lipídica e de proteína carbonil e também de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase). A terapia com Vit D3 também determino... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multiple sclerosis (MS) is a chronic and demyelinating inflammatory disease of the Central Nervous System (CNS) that triggers different degrees of physical and cognitive disability. Treatments for MS are mainly based on immunomodulatory drugs that reduce severity and frequency of relapses. Studies in an experimental model of MS, called experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated the immunomodulatory effect of vitamin D (Vit D3) in both innate and adaptive immunity. In this context, our objective was to evaluate whether early intervention with Vit D3 was able to block neuroinflammation in EAE. Encephalomyelitis was induced in female C57BL / 6 mice by immunization with MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) associated with Freund's Complete Adjuvant and two doses of pertussis toxin. Mice were treated with Vit D3 intraperitoneally. Treatment significantly decreased the incidence and clinical score of the disease. This protective effect was associate to decreased lymphocyte infiltration in the CNS and also reduced demyelination and MHCII expression in macrophages and microglia. Vit D3 also determined local control of oxidative stress, that is, normalization of the levels of lipid peroxidation and carbonyl protein and also of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase). Vit D3 therapy reduced NLRP3, caspase-1 and local IL-1β mRNA expression in the CNS. In addition, this precocious Vit D3 therapy normalized the blood-bra... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-09Bitstream added on 2014-06-13T20:16:24Z : No. of bitstreams: 1 marangoni_nr_me_araca.pdf: 326349 bytes, checksum: 7dc73435330e73a5c923b91991a9e1f1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A leishmaniose visceral canina, causada pelo protozoário Leishmania (Leishmania) chagasi, é uma doença de grande ocorrência principalmente na América Latina. A caracterização das lesões sistêmicas associadas à infecção pelo parasita tem sido amplamente estudada, entretanto, poucos autores elucidam a patogenia na forma nervosa. Com o objetivo de compreender melhor os mecanismos envolvidos na inflamação do sistema nervoso central de cães naturalmente infectados por L. chagasi, amostras de liquor e plexo coróide foram colhidas e submetidas à zimografia para a detecção de metaloproteinases (MMPs). Amostras do plexo coróide e liquor de cães sadios foram avaliadas como controle. Os géis de zimograma foram analisados quanto à presença e atividade proteolítica das metaloproteinases -2 e -9. Formas inativas das proteases foram detectadas no plexo coróide, sendo que o Grupo de animais positivos não diferiu do negativo. No liquor foram encontradas formas ativas e inativas das MMPs-2 e -9 e a atividade proteolítica das mesmas diferiu entre os Grupos positivo e negativo. A MMP-2 teve maior detecção nos animais negativos e a MMP-9 nos positivos. O aumento da MMP- 9 no liquor dos cães doentes representa seu possível envolvimento na patogenia das lesões encefálicas ao ocasionarem o rompimento das barreiras hematoencefálica e/ou hematoliquórica, permitindo a passagem de células e proteínas envolvidas no processo inflamatório / Canine visceral leishmaniasis, caused by the protozoan Leishmania (Leishmania) chagasi, is a disease with high occurrence in Latin America. The characteristics of the systemic lesions related to the infection have been widely studied, but few studies clarify the disease on a neurological aspect. With the aim of a better understanding of the inflammation mechanisms within the central nervous system of dogs naturally infected by L. chagasi, some samples of cerebrospinal fluid and choroid plexus were collected and submitted to zymography to detect metalloproteinases (MMPs). Samples of choroid plexus and cerebrospinal fluid from healthy dogs were evaluated as control. The zymogram gels were analysed taking into account the presence and the proteolytic activity of metalloproteinase -2 and -9. Inactive forms of the proteases were detected in the choroid plexus, and the group of positive animals did not differ from negative ones. In the cerebrospinal fluid, active and inactive forms of MMP-2 and -9 were found, and their proteolytic activity differed between negative and positive groups. MMP-2 had higher detection in the negative animals and MMP-9 in the positive ones. The increasing of MMP-9 in the cerebrospinal fluid of infected dogs represents its possible involvement in the brain injuries, by causing the disruption of blood-cerebrospinal fluid barrier and/or blood-brain-barrier, allowing the passage of cells and proteins involved in inflammation process

Resumo:A leishmaniose visceral é uma importante doença parasitária com distribuição mundial e que afeta homens e animais. Existem relatos de envolvimento encefálico durante a infecção, mas sua patogenia ainda não foi completamente elucidada. Com o presente estudo, objetivamos a avaliação de quimiocinas relacionadas com a resposta inflamatória no encéfalo e marcadores da integridade da barreira hematoencefálica em cães naturalmente infectados. Também foi estabelecido um modelo experimental murino que permite a avaliação da dinâmica da infecção, bem como localização do parasita e resposta inflamatória in vivo. Cães naturalmente infectados apresentaram um perfil específico de quimiocinas no encéfalo, altamente quimioatrativo para linfócitos T, além de evidente perda da integridade da barreira hematoencefálica, com elevado quociente de albumina e altas concentrações de anticorpos anti-Leishmania no líquido cefalorraquidiano. Utilizando inovadoras técnicas moleculares e de imagiologia in vivo, foi possível determinar a presença do parasita no encéfalo de camundongos Balb/c experimentalmente infectados, bem como sua localização intra-craniana. A inflamação no encéfalo, avaliada nos primeiros quatro meses pós-infecção, apresentou duas fases distintas, uma fase aguda nos primeiros quatorze dias, e uma fase de reinflamação após três meses de infecção. Conjuntamente, os dados desse estudo permitiram confirmar o envolvimento encefálico durante a leishmaniose visceral, e reforçam o fato de que o comprometimento encefálico tem sido negligenciado durante a leishmaniose visceral / Abstract:Visceral leishmaniasis is an important parasitic disease, with worldwide distributions that affects humans and animals. There are reports of brain involvement during the infection; however, its pathogenesis has not been completely elucidated. Therefore, with this study, we aimed the evaluation of the inflammatory response in the brain and the integrity of the blood-brain barrier in naturally infected dogs, and the establishment of an experimental mice model that could allow the evaluation of the infection dynamics, as well as the localization of the parasite and the inflammatory response in vivo. Naturally infected dogs presented a specific chemokine profile in the brain, highly attractive to T-lymphocytes, besides the evident blood-brain barrier disruption, with increased albumin quota and elevated concentrations of anti-Leishmania antibodies in the cerebrospinal fluid. Using molecular techniques and state-of-the-art in vivo imaging tools, we could determine the presence of parasites in the brain of experimentally infected Balb/c mice, as well as its intracranial localization. Brain inflammation, evaluated during four months post-infection, presented two distinct phases, one acute phase in the first fourteen days, and one phase of re-inflammation after three months of infection. Altogether, the data from this study allow us to confirm that the brain is affected during visceral leishmaniasis, and reinforce the fact that the brain involvement has been neglected during visceral leishmaniasis / Orientador:Gisele Fabrino Machado / Banca:Karen Regina Lemos / Banca:Valéria Marçal Felix de Lima / Banca:Cáris Maroni Nunes / Banca:Antonio Carlos Alessi / Doutor

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:20:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_RafaellaFabianaCarneiro_M.pdf: 1664553 bytes, checksum: 346b9075da4d999b30fc615fe83733fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neisseria meningitdis, ou meningococo, é uma bactéria comensal da nasofaringe humana. Contudo, algumas linhagens meningocócicas ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica e causam enfermidades como meningite e septicemia. Como a espécie humana é o único hospedeiro natural para esse patógeno, estudos in vitro com modelos celulares são uma ferramenta importante para a análise da interação entre o meningococo e seu hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes linhagens de N. meningitidis na adesão celular, morfologia e expressão de quimiocinas inflamatórias em culturas in vitro de células humanas. Tais parâmetros também foram avaliados em um sistema in vitro de co-cultura celular entre células de origem nervosa e endotelial a fim de mimetizar a barrreira hematoencefálica humana. Os resultados obtidos indicam que a adesão de diferentes linhagens bacterianas em células humanas de sítios específicos do processo infeccioso do meningococo, como Hep-2 (laringe), NCIH460 (pulmão), Hec1b (endotelial) e NG97 (neuroglia) foi capaz de mimetizar o processo fisiopatológico deste microrganismo. Em condições in vitro, células de origem nervosa mostraram-se mais suscetíveis à infecção nos parâmetros avaliados como uma elevada expressão de TNF-?, quimiocina característica em infecções meningocócicas. A linhagem B4 destacou-se entre as linhagens meningocócicas estudadas, apresentando elevados percentuais de adesão em células humanas com valor máximo de adesão em NG97. Células HEp-2 apresentaram poucas alterações morfológicas significativas frente à infecção por N. meningitidis. Tais resultados podem estar associados ao fato do trato respiratório superior ser o habitat natural do meningococo, no qual a interação entre este patógeno e as células hospedeiras seja comensal e não-invasiva. O modelo mimético de barreira hematoencefálica, realizado em transwell, indicou comunicação entre as células que o compõem e uma maior expressão dos níveis de quimiocinas inflamatórias quando comparada à infecção desta bactéria por cada uma das células estudadas isoladamente. Tal modelo foi capaz de mimetizar a barreira hematoencefálica, fato o que torna possível sua aplicação em estudos da passagem de fármacos e outros patógenos por essa barreira. / Abstract: Neisseria meningitidis,or meningococci, is a commensal bacterium of the human nasopharynx. However, occasionally some meningococcal strains can cross the respiratory mucosa and the blood-brain barrier and cause life-threatening diseases such as meningitis and septicaemia. Since the human species is the only natural host for this pathogen, in vitro studies with cellular models are an important tool for the analysis of the meningococci and its host. The aim of this present work was to value the influence of several strains of N. meningitidis in cellular adhesion, morphology and inflammatory chemokines expression in human cells cultivated in vitro. These parameters were also evaluated in a co-cultivated cellular system with glial and endothelial cells aiming mimicking the human blood brain barrier. The results indicate that the adhesion of different bacterial strains from specific sites of infectious process of meningococci as Hep-2 (larynges), NCIH460 (lung), Hec1b (endothelial) and NG97 (glial cells) was capable of mimicking, partially, the pathophysiology of this microorganism. In in vitro conditions, cells from nervous origin showed more susceptibility to infection then others in this evaluated parameters such as a high TNF-? expression, a common chemokine in meningococcals diseases. The B4 strain distinguished from the others by presenting high rates of adhesion in human cells with maximum value on NG97. HEp-2 cells showed few expressives morphologic alterations after meningococcal infection. These results may be associated with the fact that the upper human respiratory tract is the meningoccci natural habitat, in which the interaction between this pathogen and host cells are commensal and not-invasive.The mimicking blood-brain barrier model, performed in transweel, has demonstrated some communication between the cells and greater expression of inflammatory chemokines when compared to the infection in isolated cells. This model was capable of mimicing the blood-brain barrier, which makes its application possible in studies of drugs and others pathogens who might crossover though this barrier. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T00:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_CatarinaRaposoDias_D.pdf: 35688895 bytes, checksum: dc0574f3ff57450c0d5ff8840699f5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Venenos animais são fontes de substâncias neuroativas, algumas capazes de provocar paralisia e convulsão em mamíferos, com visível ação no sistema nervoso central (SNC). O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) é composto por neurotoxinas que causam, experimentalmente, permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE). A BHE é uma entidade tanto física, quanto molecular, composta pelos microvasos sanguíneos cerebrais, pelos pés astrocitários e pericitos adjacentes engajados no controle do tráfego de moléculas na interface sangue-cérebro. A BHE, embora imprescindível à manutenção da homeostase no SNC, pode representar um obstáculo ao acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. Nossa proposta foi investigar a ação sistêmica do PNV após 15 min, 2 e 5 h da injeção i.v. em ratos Wistar adultos através de: (1) alterações na expressão das proteínas juncionais, de efluxo e transportador de glicose da BHE; (2) alterações na expressão da proteína conexina-43 (constituinte das junções comunicantes) e da proteína fosfatase pPP2A, uma vez que a fosforilação de resíduos de tirosina das proteínas juncionais tem papel no controle da integridade paracelular; (3) ativação de vias neuronais e sua modulação pelo óxido nítrico (NO). (4) Reação inflamatória e gliose reativa de astrócitos in vivo e in vitro e sua possível modulação pelo NO, (5) Purificação e identificação de toxinas do PNV com ação na BHE. A expressão das proteínas juncionais encontrava-se diminuída aos 15 min e 2 h, porém às 5 h pós-PNV a expressão das proteínas investigadas estava total ou parcialmente recuperada, sugerindo ser esse um dos mecanismos de abertura da BHE. Igualmente, a expressão da proteína de efluxo aumentou indicando mecanismo de clearance do agente tóxico. A expressão da conexina-43, e da pPP2A estavam aumentadas aos 15 min e diminuída às 5 h da injeção do PNV, mostrando não só que as comunicações célula-célula e o mecanismo de adesão célulacélula foram afetados, mas também que as alterações podem ser transitórias. Ademais, vias neuronais foram ativadas em áreas motoras e em núcleos do hipotálamo o que explicaria o comprometimento motor (convulsão, paralisia) e os sinais neurovegetativos (sialorréia, hipertensão, estresse respiratório, edema pulmonar, anúria) vistos em animais envenenados. Muitas dessas vias apontam modulação nitrérgica dos sinais tóxicos do envenenamento, uma vez que a inibição da síntese de NO pelo 7- nitroindazol (7-NI) diminuiu a ativação neuronal em algumas áreas e exacerbou em outras. Os astrócitos incubados com PNV, corroborando com estudos in vivo, expressaram citocinas pró-inflamatórias e apresentaram gliose reativa, porém a inibição da síntese do NO atenuou esses efeitos, confirmando que o NO tem um importante papel nos efeitos do PNV. Toxinas F8a-1 e F10a-1, purificadas do PNV, foram identificadas como responsáveis pela permeabilização da BHE, embora não esteja excluída a contribuição de outros componentes. O entendimento da ação do PNV e de suas toxinas no tecido neural e na BHE pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para uso clínico e em pesquisa. / Abstract: Animal venoms are source of neuroactive substances, some of them able to provoke paralysis and convulsion in mammals, indicating action on the central nervous system (CNS). The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV) is composed of neurotoxins that cause, experimentally, blood-brain barrier (BBB) permeabilization. The BBB is both a physical and molecular entity, constituted by the cerebral microvessels and surrounding astrocytic end-feet and pericytes, all involved in the control of the traffic of molecules at the blood-brain interface. Even so the BBB presence is essential for the maintenance of CNS homeostasis; it also represents an obstacle for the therapeutical drugs access into the neural microenvironment. Our proposal was to investigate acute changes (15 min, 2 and 5 h) after PNV i.v. injection in adult Wistar rats through evaluation of the: (1) alterations in the expression of the BBB-junctional proteins, -efflux proteins, and -glucose transporter; (2) alterations in the expression of connexin-43 protein (gap junctions constituent) and protein phosphatase 2A (pPP2A, since phosphorylation of tyrosine residues from junctional proteins plays a role in controlling junctional integrity); (3) activation of neuronal pathways and its modulation by the nitric oxide (NO). (4) In vivo and in vitro astrocytes inflammatory reaction and reactive gliosis after incubation with PNV and its possible modulation by NO. (5) Purification and determination of BBB-acting from toxins PNV. The expression of the junctional proteins was diminished at 15 min and 2 h post-PNV exposure; however at 5 h the expression of most of the proteins investigated was total or partially recovered, suggesting that this might be one of the BBB opening mechanisms. Similarly, the venom increased the efflux protein expression, indicating ongoing clearance of toxic agents from the neural tissue. The expression of both connexin-43 and pPP2A increased after 15 min and diminished after 5 h of PNV injection, showing not only that cell-cell communication and cell-cell adhesion mechanism were affected, but that these alterations were transitory. Activated neuronal pathways have been observed in brain motor areas and hypothalamic nucleus, explaining the motor impairment (convulsion, paralysis) and neurovegetative signs (salivation, hypertension, respiratory stress, pulmonary edema, anuria) observed in the envenomed animals. Many of these neuronal pathways point to a nitrergic modulation of the envenomed toxic signs, since that NO synthesis inhibition by 7-nitroindazol (7-NI) decreased the neuronal activation in some areas and enhanced in others. The astrocytes incubated with PNV, in agreement with in vivo studies, expressed pro-inflammatory cytokines and presented reactive gliosis, however the pretreatment with 7- NI attenuated these effects, confirming that NO have an important role in the PNV effects. The F8a-1 and F10a-1 toxins, fractionated from the crude PNV, were identified as responsible by BBB permeabilization; despite, other venom components contribution can not be discarded. The understanding of the action of the venom of Phoneutria nigriventer and its toxins in the neural tissue and BBB can contribute for the development of useful tools for clinical and research purposes. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Alice da Cruz-Höfling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T16:36:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_EdileneSiqueira_M.pdf: 11448561 bytes, checksum: 00aace7be2d8fec579aea2fd4166f813 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Neste trabalho investigamos a permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) pela peçonha da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) através da via transcelular no cerebelo de ratos. As cavéolas foram analisadas nas células endoteliais pela expressão de proteínas associadas à sua formação (caveolina-1, Cav-1 e dinamina-2, Din2) e internalização (caveolina-1 fosforilada, pCav-1 e quinase da família Src, SKF), e nos astrócitos com avaliação da caveolina-3 (Cav-3) e da conexina-43 (Cx43) (formadora de junções comunicantes). A ação do PNV sobre o endotélio também foi avaliada pela ativação (acoplamento) ou inativação (desacoplamento) da enzima eNOS, produtora de óxido nítrico (NO). As estruturas que compõe a BHE foram avaliadas através de microscopia eletrônica de transmissão. Inicialmente, o estudo de Cav-1 contemplou sua localização, expressão gênica e proteica após o envenenamento em diferentes idades, ratos neonatos eram mais suceptíveis ao envenenamento do que ratos adultos. Após PNV, a imunomarcação para Cav-1 foi mais evidente na camada granular e molecular e em neurônios de Purkinje. A expressão Cav-1 e Din2 (foramdoras das vesículas e seu gargalo, respectivamente) aumentou em períodos de envenenamento agudo (1 h), de recuperação (5 h) e na ausência de sinais clínicos (24 h); em contrapartida SKF e pCav-1 envolvidas na internalização caveolar foram superexpressas em períodos opostos (às 2 h e 72 h). O PNV induziu aumento da metaloproteinase-9 da matriz (MMP9), importante mediadora de quebra da BHE e aumentou a formação e o tráfego de vesículas no endótelio após envenenamento. A análise de eNOS revelou desacoplamento (aumento de monômeros) nos períodos de envenenamento agudo (1-2 h) com progressivo retorno e super-expressão de dímeros (re-acoplamento) às 72 h; essas alterações foram relacionadas à ação do PNV sobre os níveis intracelulares de cálcio investigado pelo aumento na expressão de calmodulina e confimado pela localização de calbindina-D28. Os dados revelam a interferência do PNV sobre a homeostase endotelial e função vascular ao afetar o sistema eNOS/NO, importante controlador do tônus vascular. Nos astrócitos, as cavéolas são formadas por Cav-3 e sua superexpressão é associada a doenças neurológicas. O PNV aumentou significativamente os níveis basais de Cav-3 em astrócitos GFAP positivos (astrogliose reativa) em períodos de aumento de Cx43 (às 1, 5 e 24 h), e na vigência de edema citotóxico nos pés astrocitários e alterações nos contatos sinápticos axo-dendríticos e axo-somáticos. Em conjunto os resultados revelam que: (a) a quebra da via transcelular da BHE pelo PNV tem aumento da endocitose via cavéolas; (b) componentes da unidade neurovascular, como endotélio, astrócitos e neurônios estão intimamente envolvidos; (c) no endotélio, os efeitos são mediados pelo sistema eNOS/NO; (d) a SKF ativa o sistema endocítico e de transporte vesicular; (e) nos astrócitos, a dinamica expressão de Cx43 e Cav-3 e o retorno aos níveis basais em paralelo com a ausência de sinais de intoxicação nos animais (72 h) dá evidências de que ambas as proteínas interagem na resposta astrocitária. Os dados permitem sugerir que a presença de peptídeos neurotóxicos no veneno de Phoneutria nigriventer estão no centro dos efeitos aqui relatados / Abstract: In this work, we investigated the blood-brain barrier (BBB) permeabilization induced by Phoneutria nigriventer venom (PNV) in the transcellular route of rats¿ cerebellum. Caveolae was analyzed in endothelial cells accessing the expression of proteins involved in caveolae formation (caveolin-1, Cav-1 and dynamin-2, Dyn2) and internalization (phosphorylated Caveolin-1, pCav-1 and Src kinase family, SKF), in astrocytes caveolae role were evaluated with caveolin-3 (Cav-3) and connexin-43 (Cx43) (gap-junction main protein). PNV action on the endothelium was also investigated through activation (coupling) or inactivation (uncoupling) of eNOS enzyme, responsible for nitric oxide (NO) production. BBB components were evaluated using transmission electron microcopy. Initially, Cav-1 study addressed its localization along with Cav-1 protein and gene expression after envenoming in different age animals, neonate rats were more susceptible to envenoming than adult rats. After PNV, Cav-1 labeling was intense in granular and molecular layers and in Purkinje neurons. Cav-1 and Dyn2 (responsible for caveolae vesicles formation and scission, respectively) expression increased in periods of acute envenomation (1 h), recovery (5 h) and in the absence of clinical signals (24 h); in opposition SKF and pCav-1 involved in caveolae internalization were overexpress in opposite periods (at 2 h and 72 h). PNV induced increases in matrix metaloproteinases-9 (MMP9) an important BBB breakdown mediator, and increases in vesicles formation and traffic in the endothelium after envenoming. The study of eNOS activity revealed uncoupling (increasing in eNOS monomers) in acute periods after envenomation (1 h and 2 h) and progressive return followed by overexpression of dimers (re-coupling) at 72 h; those alterations were related to PNV action on calcium intracellular levels confirmed by Calmodulin increased expression and confirmed using Calbindin-D28 localization. Data revealed PNV interference on endothelial homeostasis and vascular function once affects the eNOS/NO system, an important vascular tonus controller. In astrocytes, caveolae are formed by Cav-3 and its overexpression is related to neurological disorders. PNV increased the basal levels of Cav-3 in GFAP-positive astrocytes (reactive astrogliosis) in the same periods as increased Cx43 (at 1, 5 e 24 h), during cytotoxic edema in astrocytes end-feet and alterations in axo-dendrites and axo-somatic synaptic contacts. Together, the results revealed that: (a) the BBB breakdown in transcellular route by PNV involves upregulation of caveolae endocytosis (b) the neurovascular unit components such as the endothelium, astrocytes and neurons are intimal involved (c) in the endothelium the effects are mediated by the eNOS/NO system and (d) SKF activates endocytic system and vesicular transport; (e) in the astrocytes, Cx43 and Cav-3 dynamic expression and their return to basal level in parallel with the absence of toxic signals in the animals (72 h) provides evidence that both protein interacts in astrocytes response. The data allows us to suggest that the neurotoxic peptides presented in Phoneutria nigriventer venom are in the center of the effects reported here / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural