O Tomato severe rugose virus (ToSRV) e o Tomato chlorosis virus (ToCV) estão entre as principais espécies de vírus que afetam a cultura do tomateiro atualmente no Brasil. Ambos possuem o mesmo vetor, a mosca-branca Bemisia tabaci MEAM1 (biótipo B), um inseto polífago e amplamente disseminado por todo país. Por este fato, infecções mistas destes vírus em lavouras de tomateiro são frequentes. No entanto, parâmetros epidemiológicos importantes para melhor compreensão das viroses associadas a esses vírus, quando em infecção simples ou mista em tomateiro, permanecem desconhecidos. Neste trabalho foram avaliados a cinética da invasão sistêmica e os períodos de latência e de incubação do ToSRV e do ToCV, em infecções simples e mista, em tomateiros. A cinética da invasão sistêmica foi analisada em tomateiros nos quais a folha inoculada foi destacada em diferentes intervalos de tempo após a inoculação. Os períodos de latência foram avaliados em tomateiros inoculados e que foram posteriormente utilizados como fontes de inóculo para a aquisição do(s) vírus por B. tabaci MEAM1, em ensaios de transmissão realizados em diferentes intervalos de tempo. Os períodos de incubação foram avaliados através da observação diária dos sintomas após a inoculação dos vírus nos tomateiros. O ToSRV e o ToCV iniciaram o movimento sistêmico em apenas um dia após a inoculação em tomateiro. Os períodos de latência do ToSRV, em infeções simples e mista, foram em média, 7 e 6 dias, respectivamente. Para o ToCV, os períodos médios de latência foram 13 dias em infecção simples e 11 dias em infecção mista. Os períodos de incubação do ToSRV, em infecções simples e mista, ocorreram, em média, 11 dias após os períodos de latência. O período de incubação do ToSRV foi influenciado pela idade da planta no momento da inoculação e também pela co-infecção com o ToCV. Os períodos de incubação do ToCV, em infecções simples e mista, ocorreram, em média, 17 e 20 dias após os períodos de latência, respectivamente. O início dos sintomas do ToCV não foi afetado pela idade da planta no momento da inoculação e nem pela co-infecção com o ToSRV. Estes resultados indicam que após a infecção o tomateiro rapidamente se torna uma fonte de inóculo do(s) vírus e passa a contribuir para a disseminação de ambos no campo. A defasagem de tempo entre os períodos de latência e de incubação do ToSRV e do ToCV nos tomateiros infectados revela que as plantas possibilitam a aquisição e subsequente transmissão dos vírus de um hospedeiro doente para um hospedeiro sadio antes de qualquer manifestação dos sintomas, fato que deve ser levado em consideração para o manejo destas fitoviroses no campo. / Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato chlorosis virus (ToCV) are among the main species of virus affecting tomato crops currently in Brazil. Both are transmitted by the same vector, the whitefly Bemisia tabaci MEAM1 (biotype B), a polyphagous insect widely disseminated throughout the country. Because of this fact, mixed infections of these viruses in tomato crops are frequent. However, important epidemiological parameters to better understand the diseases associated with these viruses, when in single or mixed infection in tomato, remain unknown. This study evaluated the kinetics of systemic invasion and latent and incubation periods of ToSRV and ToCV in single and mixed infections in tomato. The kinetics of systemic invasion was analyzed in tomato plants in which the inoculated leaf was detached at different time intervals after inoculation. The latent periods were evaluated in inoculated tomato plants which were later used as inoculum sources for the acquisition of ToSRV and/or ToCV by B. tabaci MEAM1, in transmission assays performed at different time intervals. Incubation periods were evaluated by daily observation of symptoms after inoculation of tomato plants. ToSRV and ToCV started the systemic movement just one day after inoculation in tomato plants. Average latent periods of ToSRV, in single and mixed infections, were 7 and 6 days, respectively. For ToCV, the average latent periods were 13 days in single infection and 11 days in mixed infection. ToSRV incubation periods, in single and mixed infections, occurred on average 11 days after the respective latent periods. The incubation period of ToSRV was influenced by the age of the plant at the time of inoculation and by the co-infection with ToCV. ToCV incubation periods, in single and mixed infections, occurred on average 17 and 20 days after the latent periods, respectively. The beginning of ToCV symptoms was not affected by the age of the plant at the time of inoculation or by co-infection with ToSRV. These results indicate that after infection, tomato plants rapidly become source of inoculum of the viruses and contribute to the dissemination of both in tomato crops. The mismatch between the latent and incubation periods of ToSRV and ToCV in infected tomato plants reveals that plants enable the acquisition and subsequent transmission of both viruses from a diseased to a healthy plant, prior to any manifestation of symptoms. Such knowlegment should be taken into consideration for the management of these viruses in tomato crops.

The lima bean (Phaseolus lunatus) is one of four cultivated species in the genus Phaseolus. The species was domesticated in South or Central America. It is one of the main cultivated legumes in the tropics and has a great potential as a source of vegetable protein to the population. Among its most important diseases are those caused by viruses, particularly by begomoviruses (family Geminiviridae). Infected plants display an intense yellow or golden mosaic, and have a drastically reduced yield. The objective of this work was to characterize the genetic structure of begomovirus populations infecting lima beans in the state of Alagoas, by analyzing complete DNA-A sequences. Lima bean plants with typical symptoms of begomovirus infection were collected in a number of areas around the states of Alagoas and Pernambuco during 2005. Total DNA was extracted and the presence of a begomovirus was confirmed by PCR. The viral genomic components were amplified using the DNA polymerase from phage phi29, and then cleaved with either BamH I or Hind III. Cleaved products were ligated to the pBluescript KS+ plasmid vector and the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli DH5α. Clones were submitted to cleavage with Hae III and, according to the obtained restriction pattern, 22 (20 from samples collected in Alagoas, and two from samples collected in Pernambuco) were selected for sequencing. Phylogenetic analysis was carried out with MEGA 4.0 using the Neighbour-Joining method. The genetic diversity of the population was evaluated using the DnaSP program, version 5. Analysis of the 22 sequences revealed that they all belonged to a single begomovirus species, Bean golden mosaic virus, with 90 to 94% nucleotide sequence identity with a BGMV isolate from soybean (access number FJ665283.1). All sequences clustered with other Brazilian BGMV isolates from common bean and soybean in the phylogenetic tree, although the two isolates from Pernambuco are closer to the soybean isolate than the 20 isolates from Alagoas. Thus, the lima bean isolates clustered based on their geographical origin. Analysis of the population indicated a high degree of genetic variability, significantly higher than that observed for two begomovirus populations from tomato obtained in the southeastern region of Brazil. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / A fava (Phaseolus lunatus) é uma das quatro espécies do gênero Phaseolus exploradas comercialmente. A espécie foi domesticada na América do Sul ou Central. É uma das principais leguminosas cultivadas na região tropical e apresenta potencial para fornecimento de proteína vegetal à população. Entre as doenças mais importantes estão as viroses, principalmente aquelas ocasionadas por begomovírus (família Geminiviridae). As plantas infectadas apresentam um mosaico amarelo intenso e têm a produtividade drasticamente reduzida. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a estrutura genética dos begomovírus que infectam fava no estado de Alagoas, através da análise da sequência completa do DNA-A. Plantas de fava com sintomas típicos de infecção por begomovírus foram coletadas em áreas produtoras localizadas nos estados de Alagoas e Pernambuco no ano de 2005. Foi então realizada a extração de DNA, e confirmada por PCR a presença de begomovírus. Os componentes genômicos foram amplificados utilizando-se a enzima DNA polimerase do bacteriófago phi29, clivados com as enzimas de restrição BamH I e Hind III, ligados ao vetor pBluescript KS+ e utilizados para transformação de Escherichia coli DH5α. Os clones foram submetidos a digestão com a enzima Hae III e, de acordo com o padrão eletroforético observado, 22 clones (20 provenientes de amostras de Alagoas e 2 de Pernambuco) foram selecionados para sequenciamento. A análise filogenética foi realizada utilizando-se o programa MEGA 4.0 através do método ―Neighbour-Joining‖. A avaliação de diversidade genética foi realizada utilizando-se o programa DnaSP versão 5. Análise das 22 sequências obtidas revelou que apenas uma espécie de begomovírus estava infectando as amostras de fava, o Bean golden mosaic virus, apresentando entre 90% e 94% de identidade de nucleotídeos com um isolado de BGMV de soja (acesso FJ665283.1). Todas as sequências obtidas agruparam-se com isolados de BGMV de soja e feijão do Brasil, e os isolados clonados a partir da amostra de fava coletada em PE possuem um relacionamento filogenético mais próximo com o isolado de BGMV de soja do que os isolados de Alagoas. Os isolados apresentaram agrupamento filogenético de acordo com sua origem geográfica, com os isolados de BGMV de fava de PE divergindo dos de AL. A análise da população de BGMV infectando fava indicou uma alta taxa de variabilidade genética, significativamente maior que a observada para duas populações de begomovírus que infectam tomateiro no sudeste brasileiro.

Begomoviruses are whitefly-transmitted, single-stranded DNA viruses which are often associated with weed plants, which may act as natural reservoirs of viruses that cause epidemics in crop plants. The aim of this study was to characterize the diversity of begomoviruses infecting weeds in Brazil, as a step to access their importance as natural reservoirs of these viruses. Total DNA was extracted from weeds collected in Viçosa (Minas Gerais state) and some municipalities of Alagoas state in 2009 and 2010. The viral genomes were amplified by RCA, cloned and sequenced. The sequences were used for comparisons with other begomoviruses, phylogenetic and recombination analyses. A total of 26 DNA-A clones were obtained. Sequence analysis indicated the presence of ten different begomoviruses. All isolates originating from samples of Blainvillea rhomboidea belonged to a single viral species, Blainvillea yellow spot virus (BlYSV), suggesting that BlYSV may be the only begomovirus present in this ubiquitous weed species. Four viruses represent new species, for which the following names are proposed: Sida yellow net virus (SiYNV) obtained from Sida micrantha, Sida mottle Alagoas virus (SiMoAV) obtained from Sida urens and Sida sp., Sida yellow blotch virus (SiYBV) and Sida yellow mosaic Alagoas virus (SiYMAV) obtained from S. urens. Recombination events were detected in the SiYBV isolates BR:Rla1:10 and BR:Rla2:10, with BR:CPH1:10 (also SiYBV) and an unknown virus as putative parents, and in the SiYNV isolate BR:Vic2:10, with BR:Vsa2:10 (SiMoAV) and Sida mottle virus (SiMoV) as putative parents. These results consitute further evidence that recombination is an important evolutionary process on the generation of genetic variability and on the evolution of begomoviruses. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / Begomovírus são vírus de DNA circular fita simples transmitidos por mosca branca, os quais são frequentemente associados com plantas daninhas, as quais podem servir como reservatórios naturais de vírus que causam epidemias em plantas cultivadas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a diversidade de begomovírus infectando plantas daninhas no Brasil, como um passo para acessar sua importância como reservatórios naturais desses vírus. DNA total foi extraído a partir de plantas daninhas coletadas em Viçosa (Minas Gerais) e alguns municípios do estado de Alagoas em 2009 e 2010. Os genomas virais foram amplificados por RCA, clonados e sequenciados. As sequências foram usadas para comparações com outros begomovírus e análises filogenética e de recombinação. Um total de 26 clones de DNA-A foram obtidos. Análise de sequência indicou a presença de dez diferentes begomovírus. Todos os isolados originários de Blainvillea rhomboidea pertenciam a uma única espécie viral, Blainvillea yellow spot vírus (BlYSV), sugerindo que BlYSV pode ser o único begomovírus presente nesta espécie de planta invasora. Quatro vírus representam espécies novas, para as quais os seguintes nomes são propostos: Sida yellow net virus (SiYNV) obtido de Sida micrantha, Sida mottle Alagoas vírus (SiMoAV) obtido de Sida urens e Sida sp., Sida yellow blotch virus (SiYBV) e Sida yellow mosaic Alagoas virus (SiYMAV) obtidos de S. urens. Eventos de recombinação foram detectados no SiYBV, isolados BR:Rla1:10 e BR:Rla2:10, com BR:CPH1:10 (também SiYBV) e um vírus desconhecido como possíveis parentais, e no SiYNV, isolado BR:Vic2:10, com BR:Vsa2:10 (SiMoAV) e Sida mottle virus (SiMoV) como possíveis parentais. Estes resultados constituem uma evidência adicional de que recombinação é um importante processo evolutivo na geração de variabilidade genética e evolução de begomovírus.

Made available in DSpace on 2015-03-26T12:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1674702 bytes, checksum: ab48c56e0fe4a5a3fc7dfa63a5d9e325 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Begomoviruses (family Geminiviridae) have one or two genomic components, infect dicotyledonous plants and are naturally transmitted by the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Begomoviruses cause diseases of major economic importance in many crops, especially in tropical and subtropical regions. In Brazil, a viral complex composed of at least eight species, including Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato yellow spot virus (ToYSV), is responsible for losses in tomato. The complete DNA-B sequences of ToRMV and ToSRV show an identity of 98.2% and the high identity of their common region sequences (96.2%) indicates that the two viruses may share the same DNA-B. For the successful establishment of a viral infection, several interactions are required between begomovirus and host proteins. In this work, experiments were conducted with the following objectives: (1) to analyze the importance of recombination and pseudorecombination in the generation of variability and adaptation to the host of ToRMV and ToSRV; (2) to examine the involvement of two components of the anaphase-promoting complex (APC7 and APC10) in begomovirus replication; (3) to detect and characterize host proteins which interact with the ToYSV movement protein, MP. For the first objective, Nicotiana benthamiana plants were inoculated with all possible combinations of ToRMV and ToSRV DNA-A and DNA-B. Additionally, recombination and nucleotide/amino acid sequence comparisons between ToRMV and ToSRV were performed. The results indicate that ToRMV has both a recombinant and pseudorecombinant origin, and that ToRMV exerts a negative interference over ToSRV. For the second objective, Arabidopsis thaliana plants overexpressing APC7, APC10 and different APC7 mutants were inoculated with Cabbage leaf curl virus (CaLCuV), and viral DNA accumulation was estimated in plants at 14 and 28 days post-inoculation (dpi). The results indicate that APC7 and APC10 negatively affect CaLCuV DNA accumulation, and that both the N-terminal and C-terminal portions of the APC7 protein are involved in this effect. For the third objective, leaves of N. benthamiana were agroinfiltrated with the "bait" construct NTAPi-MP, and 48 hours after agroinfiltration the leaves were collected for extraction and purification of protein heterocomplexes. However, this transient expression assay in leaves of N. benthamiana failed to detect interactions between ToYSV MP and host proteins. / Os begomovírus (família Geminiviridae) possuem um ou dois componentes genômicos, infectam plantas dicotiledôneas e são transmitidos naturalmente pela mosca- branca Bemisia tabaci (Homoptera:Aleyrodidae). Os begomovírus causam doenças de grande importância econômica em diversas culturas, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, um complexo viral composto por pelo menos oito espécies, incluindo o Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), Tomato severe rugose virus (ToSRV) e Tomato yellow spot virus (ToYSV), é responsável por grandes perdas na cultura do tomateiro. A sequência completa dos DNAs-B do ToSRV e ToRMV apresenta identidade de 98%, e a elevada identidade de sequência da região comum (96,2%) indica que os dois vírus podem compartilhar o mesmo DNA-B. Para o estabelecimento de uma infecção viral é necessária uma série de interações entre proteínas dos begomovírus e do hospedeiro. Neste trabalho, foram conduzidos experimentos com os objetivos de: (1) analisar a importância da recombinação e da pseudo-recombinação na geração de variabilidade e na adaptação ao hospedeiro dos begomovírus ToRMV e ToSRV; (2) analisar o envolvimento de APC7 e APC10, dois componentes do complexo promotor da anáfase, na replicação de begomovírus; (3) detectar e caracterizar proteína(s) do hospedeiro que interagem com a MP do begomovírus ToYSV. Para o primeiro objetivo, plantas de N. benthamiana foram inoculadas com todas as combinações possíveis entre o DNA-A e o DNA-B do ToRMV e do ToSRV. Análises de recombinação e das sequências de nucleotídeos e aminoácidos entre ToRMV e ToSRV também foram realizadas. Os resultados indicaram que o ToRMV apresenta uma origem recombinante e pseudo-recombinante, e que o ToRMV exerce uma interferência negativa sobre o ToSRV. Para o segundo objetivo, plantas de Arabidopsis thaliana superexpressando APC7 ou APC10 e diferentes mutantes para APC7 foram inoculadas com o begomovírus Cabbage leaf curl virus (CaLCuV) e o acúmulo de DNA viral foi estimado em plantas infectadas, aos 14 e 28 dias pós-inoculação (dpi). Os resultados indicaram que APC7 e APC10 afetam o acúmulo do CaLCuV, e que tanto a região N-terminal quanto a C-terminal de APC7 estão envolvidas neste efeito. Para o terceiro objetivo, folhas de N. benthamiana foram agroinfiltradas com a construção "isca" NTAPi-MP, e 48 horas após a agroinfiltração estas folhas foram coletadas para extração e purificação do heterocomplexo protéico. Entretanto, esse ensaio de expressão transiente em folhas de N. benthamiana não permitiu detectar interações entre a proteína MP do ToYSV e proteína(s) do hospedeiro.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-02T18:36:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T18:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) Previous issue date: 2005-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Geminiviridae é caracterizada pelo aspecto geminado da partícula viral e genoma composto por DNA circular de fita simples, com aproximadamente 2.600 nucleotídeos. É dividida em quatro gêneros, de acordo com o tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização do genoma e relacionamento filogenético. Os begomovírus possuem dois componentes genômicos, são transmitidos por mosca-branca e infectam espécies dicotiledôneas. No Brasil há diversos relatos de begomovírus causando sérias perdas nas culturas do feijoeiro e tomateiro. Embora a importância econômica dos begomovírus em soja seja secundária, a ocorrência desses patógenos nesta cultura é preocupante. Duas possíveis novas espécies de begomovírus, denominadas “vírus A” e “vírus B” foram isoladas e clonadas a partir de plantas de soja. Obteve-se a seqüência completa de nucleotídeos do DNA-B do “vírus A”, e uma seqüência parcial do DNA-A do “vírus B”. A comparação de seqüências e análise filogenética indica que o DNA-B do “vírus A” possui a máxima correspondência nucleotídica com o isolado B3 do Sida micrantha mosaic virus (SimMV), e o DNA-A do “vírus B” com o isolado A2 do SimMV. Entretanto os níveis de identidade são baixos, indicando que ambos os vírus realmente devem constituir novas espécies de begomovírus. Vírus de plantas, incluindo os begomovírus, têm sido utilizados com sucesso na construção de vetores para a indução de silenciamento gênico. Entretanto, existem poucos vetores eficientes para a inoculação em plantas de tomate e não há relatos para plantas de soja. Os dois componentes genômicos do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) encontram-se completamente seqüenciados e, o DNA-A foi utilizado para a construção do vetor viral pToR- A1.4 CP. A estratégia utilizada foi a construção de um clone infeccioso sem o gene da proteína capsidial, substituído por um sítio múltiplo de clonagem para 9 enzimas de restrição derivado do vetor pKS+. Este vetor viral baseado no ToRMV será um complemento e uma alternativa em estudos de genômica funcional de tomateiro e de soja, na análise de genes envolvidos em vários processos biológicos. / The Geminiviridae is a family of plant viruses characterized by twinned icosahedral viral particles and a circular single-stranded DNA genome, with approximately 2.600 nucleotides. It is divided into four genera according to the type of insect vector, host range, genomic organization and phylogenetic relationships. Begomoviruses have two genomic components, are transmitted by whitefly and infect dicotyledoneous species. In Brazil, begomoviruses cause serious losses in tomato and bean crops. Although the economic importance of the begomoviruses in soybean is secondary, the presence of these pathogens in this crop is cause of concern. Two possible new begomovirus species, named “virus A” and “virus B”, were isolated and cloned from soybean plants. The complete nucleotide sequence of the DNA-B from “virus A” and a partial sequence of the DNA-A from “virus B” were obtained. Sequence comparisons and phylogenetic analysis indicated that the DNA-B from “virus A” has a maximum nucleotide identity with the isolate B3 from Sida micrantha mosaic virus (SimMV), and that the DNA-A from “virus B” with the isolate A2 from SimMV. However, identity levels are low, indicating that both viruses could actually comprise novel begomovirus species. Plant viruses, including begomoviruses, have been used with success for the construction of vectors for the induction of gene silencing. However, there are few effective vectors for inoculation into tomato plants and none for soybean plants. Both genomic components of Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) have been completely sequenced and, the DNA-A was used for the construction of the viral vector pToR-A1.4 CP. The strategy used was the construction of an infectious clone without the capsid protein gene, replaced by a multiple cloning site for 9 restriction enzymes, derived from the pKS+ plasmid vector. This viral vector will be a complement and an alternative in functional genomics of tomato and soybean plants, in the analysis of genes involved in various biological processes. / Dissertação importada do Alexandria

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-24T20:14:44Z No. of bitstreams: 1 2015_NayhanneTizzodePaula.pdf: 55124476 bytes, checksum: 8f12f77624a62da5e1daf64f34fe7416 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-12-21T17:18:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_NayhanneTizzodePaula.pdf: 55124476 bytes, checksum: 8f12f77624a62da5e1daf64f34fe7416 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-21T17:18:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_NayhanneTizzodePaula.pdf: 55124476 bytes, checksum: 8f12f77624a62da5e1daf64f34fe7416 (MD5) / Os begomovírus (Família Geminiviridae) compreendem um importante grupo de patógenos de plantas, capazes de infectar um grande número de culturas e causar impacto na agricultura. Esses agentes possuem um genoma constituído por uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, e são transmitidos de maneira persistente e circulativa pela mosca branca (Bemisia tabaci). No Brasil, esses vírus são altamente incidentes e causam grandes danos às culturas do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e do tomateiro (Solanum lycopersicum). O objetivo desse trabalho foi utilizar a estratégia de RNA de interferência (RNAi) como forma de controle genético de begomoviroses associadas a essas duas culturas. Inicialmente, no caso do feijoeiro, o mecanismo de RNAi foi utilizado para gerar uma linhagem de feijão imune ao bean golden mosaic virus (BGMV). Nós avaliamos se moscas brancas virulíferas, infectadas pelo BGMV, poderiam diminuir sua carga de DNA viral, após se alimentarem em plantas de feijão geneticamente modificadas (GM), que expressam moléculas de pequenos RNAs interferentes (siRNAs), que tem como alvo o gene rep desse vírus. Esse estudo demonstrou que a quantidade de DNA viral foi significativamente reduzida em moscas brancas que se alimentaram em plantas de feijão GM (comparado a moscas que se alimentaram em plantas não- GM), em 52% e 84%, nos períodos de 4 e 8 dias respectivamente. A segunda parte desse trabalho teve como objetivo, avaliar o mecanismo de RNAi como ferramenta na obtenção de plantas de Nicotiana benthamiana transgênicas, com resistência ampla a begomovírus que infectam tomateiro no Brasil. Para isso, um cassete de interferência quimérico - que expressa um haipin RNA (hpRNA) correspondendo ao gene rep de distintas espécies de begomovírus - foi desenvolvido. Os resultados demonstraram que um maior número de plantas transgênicas permaneceram não infectadas, após terem sido desafiadas com uma menor pressão de inóculo do vírus tomato golden vein virus (TGVV) (≈ 250 ng/μL de DNA viral/planta). As plantas transgênicas também foram inoculamos com os vírus tomato rugose mosaic virus (ToRMV), tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) e tomato interveinal chlorosis virus xiii! ! !!!!!!!!! (ToICV), e foi demonstrado que o fenótipo de resistência a esses agentes possivelmente é dependente da zigose do transgene. Uma proporção de 77% das plantas transgênicas, que apresentaram o fenótipo de resistência, demonstraram ser homozigotas. / The begomovirus (Geminiviridae family) are an important group of plant pathogens that cause infection in a large number of crops and impact on agriculture. These agents have one or two molecules of single strand DNA, and are transmitted in a persistent and circulative manner by whitefly (Bemisia tabaci). In Brazil, these viruses have a high incidence and cause great damage to bean (Phaseolus vulgaris) and tomato (Solanum lycopersicum). The aim of this study was to use the molecular tool of RNA interference (RNAi) as a strategy of genetic control of begomovirus associated with these two crops. Initially, with respect to beans, the RNAi mechanism was used to generate a plant line that was immune to the bean golden mosaic virus (BGMV). We investigated if BGMV-viruliferous whiteflies, would reduce DNA viral amount after feeding on genetically modified (GM) bean plants expressing small interfering RNA (siRNAs) molecules, that target rep gene of the virus. This study demonstrated that BGMV DNA amount was significantly reduced in whiteflies feeding on GM-plants (compared with insects feeding on non-GM plants) over a period of 4 and 8 days at 52% and 84% respectively. The second part of this study aimed to evaluate the RNAi mechanism as a tool to obtain transgenic Nicotiana benthamiana plants with wide resistance to begomovirus infecting tomato in Brazil. For this, a chimeric cassete of interference - that expresses an intron-hairpin RNA (hpRNA) directed to the rep gene of different species of begomoviruses - was developed. The results showed that a higher number of transgenic plants remained uninfected after being challenged with a lower infection pressure of tomato golden vein virus virus (TGVV) (≈ 250 ng/μL viral DNA/plant). Transgenic plants were also inoculated with tomato rugose mosaic virus (ToRMV), tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) and tomato interveinal chlorosis virus (ToICV), and was demonstrated that phenotype resistance to these agents is possibly dependent on transgene zygosis. A proportion of 77% of the transgenic plants that showed resistance phenotype, proved to be homozygous.

O mosaico rugoso, causado pelo begomovirus ToSRV, é uma das principais doenças do tomateiro. Neste trabalho avaliou-se a eficácia de quatro inseticidas, ciantranilliprole foliar, ciantraniliprole solo, espiromesifeno e tiametoxam no controle das infecções primária e secundária do ToSRV, em tomateiros, transmitido por Bemisia tabaci biótipo B. Os tratamentos, confinados separadamente em gaiolas a prova de insetos, foram: controle, representado por tomateiros sadios e infectados, pulverizados com água, mais insetos avirulíferos; infecção primária, simulada com tomateiros sadios pulverizados com inseticida, mais insetos virulíferos e infecção secundária, simulada com tomateiros sadios e infectados com o ToSRV, pulverizados com inseticida, mais insetos avirulíferos. Nenhum inseticida foi eficiente no controle da infecção primária. No caso da simulação da infecção secundária, 4% e 16% respectivamente, dos tomateiros tratados com os inseticidas ciantraniliprole solo e ciantraniliprole foliar foram infectados, contra 84% e 74% de tomateiros infectados nos respectivos controles. Para os tratamentos com os inseticidas tiametoxam e espiromesifeno, na simulação da infecção secundária, 58% e 62% dos tomateiros foram infectados, respectivamente, contra 66% e 74% de plantas infectadas nos respectivos controles. O uso racional de inseticidas que reduzem a infecção secundária associado com a eliminação de fontes externas de inóculo poderá contribuir para o manejo da doença. / The severe mosaic, caused by ToSRV begomovirus, is a major disease of tomato. This study evaluated the efficacy of four insecticides, sprayed cyazypyr, drench cyazypyr, sprayed spiromesifen and thiamethoxam on controlling primary and secondary infections by ToSRV to tomato plants, transmitted by Bemisia tabaci biotype B. Treatments were confined separately in proof insects cages, which were: control, represented by healthy and infected tomato plants sprayed with water and aviruliferous insects releasing; primary infection, simulated by healthy tomato plants with insecticide spraying and viruliferous insects releasing, and secondary infection, simulated with healthy tomato plants and ToSRV infected tomato plants, sprayed with insecticide, and aviruliferous insects releasing. None of the insecticides was effective in controlling primary infection. In the case of secondary infection simulation, 4% and 16% of the tomato plants treated with soil and foliar cyazypyr insecticides, respectively, were infected; against 84% and 74% of infected tomato plants in their respective controls. For treatments with thiamethoxam and spiromesifen insecticides spraying, in secondary infection simulation, 58% and 62% of tomato plants were infected, respectively, versus 66% and 74% of infected plants in their respective controls. The rational use of insecticides to reduce secondary infection associated with elimination of external sources of inoculum may contribute to disease management.

Sabe-se que a grande maioria dos fitopatógenos depende quase que exclusivamente de vetores para disseminarem-se para novos hospedeiros, porém pouco foi estudado no que se refere aos efeitos dos micro-organismos sobre seus insetos vetores. Sendo Bemisia tabaci uma praga de elevada importância e vetora de inúmeros vírus para plantas cultiváveis, é de extrema relevância estudar os efeitos provocados pelos vírus sobre seu desempenho biológico. Assim, esta pesquisa objetivou: a) avaliar os efeitos direto e indireto dos begomovírus Tomato severe rugose vírus (ToSRV) e Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) sobre parâmetros biológicos de B. tabaci biótipo B e Q respectivamente, dos quais: duração e viabilidade do período ninfal; razão sexual; fecundidade; fertilidade e longevidade. Os resultados encontrados variam de positivos, neutros a negativos, dependendo do parâmetro, efeito e espécie do vírus estudado. Sendo assim, observou-se que há efeito direto de ambos os vírus na duração do período ninfal, sendo menor em insetos virulíferos que em sadios. Ademais, há um incremento no número médio de ovos depositados por insetos virulíferos com ToSRV (225,2 ovos/fêmea) quando comparado com insetos sadios (180,1 ovos/fêmea). Já TYLCV afetou diretamente a longevidade de machos os quais tiveram a duração da fase adulta incrementada quando virulíferos (30 dias) e 24 dias quando sadios. Há um efeito indireto negativo de ToSRV sobre a viabilidade ninfal de seu vetor, sendo de 52% quando estes são mantidos em plantas infectadas e 86% em plantas sadias de tomate. A razão sexual também foi afetada por este vírus, favorecendo as fêmeas, sendo de 2:1 a proporção entre fêmeas e machos em plantas infectadas. Ademais, a longevidade de machos foi reduzida drasticamente quando em plantas infectadas com ToSRV. Também foi detectado um efeito indireto positivo do TYLCV sobre a fecundidade de fêmeas de B. tabaci biótipo Q, as quais depositaram em média maior quantidade de ovos em plantas infectadas que em plantas sadias de tomate, sendo 52,8 e 33,2 ovos respectivamente. Tais resultados permitem concluir que, nas condições em que os ensaios foram realizados, ToSRV afeta diretamente de forma positiva seu vetor, enquanto possui efeitos indiretos principalmente negativos sobre parâmetros biológicos de B. tabaci biótipo B. Igualmente TYLCV possui efeitos diretos positivos sobre o biótipo Q da espécie de mosca-branca. Já indiretamente este vírus, diferentemente de ToSRV, afeta positivamente a biologia de seu vetor B. tabaci biótipo Q, favorecendo a fecundidade dos indivíduos que se desenvolveram em plantas infectadas de tomate. / It is known that the vast majority of pathogens relies almost exclusively vector for spreading to new hosts, but little has been studied regarding the effects of micro-organisms on its insect vectors. Bemisia tabaci is a pest of high importance vector of numerous virus to cultivated plants, it is extremely important to study the effects caused by viruses on its biological performance. Thus, this study aimed to: a) evaluate the direct and indirect effects of the begomovirus Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) on biological parameters of B. tabaci biotype B and Q respectively, of which duration and viability of nymphal development; sex ratio; fecundity; fertility and longevity. The results range from positive, neutral to negative, depending on the parameter, effect and species of the virus studied. Thus, it was observed that there is a direct effect of the both virus in the duration of nymphal development, being less than viruliferous insects in healthy individuals. Moreover, there is an increase in the average number of eggs laid by viruliferous insects with ToSRV (225,2 eggs / female) when compared with healthy insects (180,1 eggs / female). Already TYLCV directly affected the longevity of males which lasted adulthood increased when viruliferous (30 days and 24 when healthy). There is an indirect negative effect on the viability of ToSRV nymphal of its vector, and 52% when they are kept in infected plants and 86% in healthy tomato plants. The sex ratio was also affected by this virus, favoring females, with a ratio of 2:1 between females and males in infected plants. Furthermore, the longevity of males was reduced dramatically when plants infected with ToSRV. We also detected a positive indirect effect of TYLCV on fertility of female B. tabaci biotype Q, which placed greater average number of eggs in infected plants than on healthy plants of tomato, 52,8 and 33,2 eggs respectively. These results indicate that, under conditions in which the tests were performed, ToSRV directly affects positively its vector, while indirect effects has mostly negative on biological parameters of B. tabaci biotype B. TYLCV also has positive direct effects on the Q biotype of the whitefly species. Already indirectly this virus, unlike ToSRV, positively affects the biology of its vector B. tabaci biotype Q, favoring the fecundity of individuals that developed in infected tomato plants.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-20T18:12:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1756399 bytes, checksum: 4cd93ccd34ab97ff3909ee83598fa241 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T18:12:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1756399 bytes, checksum: 4cd93ccd34ab97ff3909ee83598fa241 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / A maioria dos begomovírus monossegmenados do Velho Mundo (família Geminiviridae) estão associados a DNAs satélites, classificados como alfa- e betassatélites. Os alfassatélites são capazes de replicar-se de forma autônoma, mas dependem do vírus auxiliar para o movimento, encapsidação e transmissão pelo inseto vetor (Bemisia tabaci). Recentemente, o Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) foi encontrado em associação com o begomovírus Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), infectando plantas de Euphorbia heterophylla no Brasil. Compreender a dinâmica da interação entre begomovírus e DNAs satélite em plantas não cultivadas, tais como E. heterophylla, é importante porque eles podem ser transferidos para plantas cultivadas, dado o hábito polífago de B. tabaci. Este estudo teve como objetivos: (i) analisar as diferenças fenotípicas da infecção pelo EuYMV na presença e na ausência do EuYMA; (ii) avaliar se a proteína alfa-Rep do EuYMA possui atividade supressora de silenciamento de RNA; (iii) comparar a transmissão do EuYMV por B. tabaci MEAM1, na ausência e na presença do EuYMA. Foram coletadas amostras (n=165) de E. heterophylla em diversos estados do Brasil. Clones infecciosos foram gerados para realizar-se a caracterização biológica e inoculação das plantas. EuYMV foi detectado em 126 amostras e EuYMA foi detectado em apenas seis amostras. Isoladamente, o EuYMV causa clorose internerval e mosaico amarelo. Em associação com o EuYMA, os sintomas são mais severos, caracterizados por mosaico amarelo muito mais intenso, encarquilhamento foliar e redução do crescimento. O DNA-A do EuYMV pode infectar E. heterophylla na ausência do DNA-B, provocando ou não um mosaico amarelo atenuado. A sequência codificadora completa do gene alfa-Rep do EuYMA foi clonada em vetor binário e transformada em células de Agrobacterium tumefaciens. Um ensaio de supressão de silenciamento de RNA foi realizado com esta construção em plantas de Nicotiana benthamiana. Os resultados indicam que a proteína alfa-Rep do EuYMA não atua como supressora de silenciamento de RNA. Foi realizado um ensaio de transmissão do EuYMV por B. tabaci, na presença e ausência de EuYMA, em duas repetições biológicas. Vinte plantas foram utilizadas para cada tratamento. Isoladamente, o EuYMV foi transmitido para 17 e 18 plantas na primeira e segunda repetição, respectivamente. Em associação com EuYMA, o vírus foi transmitido para 15 e 14 plantas na primeira e segunda repetição, respectivamente, uma diferença estatisticamente significativa. Assim, os resultados indicam que o EuYMA afeta negativamente a transmissão do EuYMV pelo vetor, consequentemente afetando a disseminação do vírus no campo. / The majority of Old World monopartite begomoviruses (family Geminiviridae) are associated with satellite DNAs, classified as alpha- and betasatellites. Alphasatellites are capable of autonomous replication, but depend on the helper virus for movement, encapsidation and transmission by the insect vector (Bemisia tabaci). Recently, Euphorbia yellow mosaic alphasattelite (EuYMA) was found in association with Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), infecting Euphorbia heterophylla plants in Brazil. Understanding the dynamics of the interaction between begomoviruses and satellite DNAs in non-cultivated plants, such as E. heterophylla, is important as they can be transferred to cultivated plants, given the polyphagous habit of B. tabaci. The objectives of this study were: (i) to analyze phenotypic differences of EuYMV infection in the presence and absence of EuYMA; (ii) to evaluate whether the alpha-Rep protein of EuYMA possesses RNA silencing suppressor activity; (iii) to compare the transmission of EuYMV by B. tabaci MEAM1 in the absence and presence of EuYMA. Samples (n=165) of E. heterophylla were collected in several states of Brazil. Infectious clones were generated to perform the biological characterization and inoculation. EuYMV was detected in 126 samples and EuYMA was detected only in six samples,. Alone, EuYMV causes interveinal chlorosis and yellow mosaic. In combination with EuYMA, the symptoms are more severe, characterized by a more intense yellow mosaic, leaf shriveling and stunting. The DNA-A of EuYMV can infect E. heterophylla in the absence of the DNA-B, causing attenuated yellow mosaic or no symptoms at all. The complete coding sequence of the alpha-Rep gene of EuYMA was cloned in a binary vector and transformed in Agrobacterium tumefaciens. An RNA silencing supression assay was performed with this construct in Nicotiana benthamiana plants. The results indicate that the alpha-Rep protein of EuYMA does not act as an RNA silencing suppressor. A transmission assay of EuYMV by B. tabaci, in the presence and absence of EuYMA, was performed in two biological replications. Twenty plants were used for each treatment. Alone, EuYMV was transmitted to 17 and 18 plants, in the first and second replication respectively. In association with EuYMA, the virus was transmitted to 15 and 14 plants, in the first and second replication respectively, a difference which was statistically significant. Thus, our results indicate that EuYMA negatively affects the transmission of EuYMV by the vector, consequently affecting the spread of the virus in the field.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2474594 bytes, checksum: 6cdab11f886d77e7d0c8a3d024dde318 (MD5) Previous issue date: 2008-07-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The genus Begomovirus (family Geminiviridae) includes viruses with a genome comprised of one or two molecules of circular, single-stranded DNA, transmitted to dicot species by the whitefly Bemisia tabaci. In Brazil, after the introduction of the B biotype of B. tabaci in the early 1990s, the incidence of begomoviruses in tomato has become frequent, with several reports of new viral species. Some of these species have become prevalent under field conditions, including Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). The purpose of this study was to characterize two isolates of these species through the cloning of their whole genomes followed by molecular analysis, and the production of infectious clones for determination of their host ranges. Total DNA extracts of infected plants were used for whole genome amplification using the phi29 phage DNA polymerase. The amplification products were cloned into plasmids and completely sequenced. Sequence analysis indicated that the DNA-A and DNA-B of ToSRV-[BR:Pir1:05] and ToYVSV- [BR:Pda30:05] isolates had greater than 90% identities with other isolates of ToSRV and ToYVSV, respectively. The molecular analysis indicated that the DNA-A of the BR:Pir1:05 isolate may be the result of a recombination event, in which the virus acquired the rep ORF of Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) and the cp ORF of an unidentified virus. Analysis of the DNA-B of the same isolate indicated the existence of a relationship with viruses that infect weed/wild hosts in Brazil, corroborating the hypothesis that viruses present in wild hosts led to the virus currently found in tomatoes. Additionally, because of the high identity observed between the DNA-B of ToSRV-[BR:Pir1:05] and ToRMV, it is possible that this genomic component is shared by the two viruses. In host range assays, plants showing latent infections were observed for both isolates. Such plants can act as natural reservoirs and serve as a primary source of inoculum for host plants of economic importance such as the tomato. The infectious clones of ToYVSV- [BR:Pda30:05] had low infectivity in the host range assays. It is possible that the inoculation method was not effective in the transmission of this isolate, or one or both clones could contain mutations that reduce the efficiency of their replication. / O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA fita simples, transmitidos a espécies de plantas dicotiledôneas pela mosca-branca Bemisia tabaci. No Brasil, após a introdução do biótipo B de B. tabaci no início da década de 1990, a incidência de begomovírus em tomateiro tornou-se freqüente, com vários relatos de novas espécies virais. Algumas dessas espécies tornaram-se prevalentes em condições de campo no Brasil, incluindo o Tomato severe rugose virus (ToSRV) e o Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). O objetivo deste trabalho foi caracterizar dois isolados dessas espécies, por meio da clonagem de seus genomas completos seguida de análise molecular, e da obtenção de clones infecciosos para determinação de suas gamas de hospedeiros. Extratos de DNA total de plantas infectadas foram utilizados para a amplificação do genoma viral completo utilizando-se a DNA polimerase do fago φ29. Os produtos da amplificação foram clonados em plasmídeos e completamente seqüenciados. A análise das seqüências do DNA-A e DNA-B dos isolados ToSRV- [BR:Pir1:05] e ToYVSV- [BR:Pda30:05] indicou valores de identidade acima de 90% com outros isolados de ToSRV e ToYVSV, respectivamente. A análise molecular indica que o DNA-A do isolado BR:Pir1:05 pode ser resultado de um evento de recombinação, no qual o vírus adquiriu a ORF rep do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) e a ORF cp de um vírus não identificado. A análise do DNA-B do mesmo isolado indica a existência de relacionamento com vírus que infectam plantas daninhas/silvestres no Brasil, reforçando a hipótese de que vírus presentes em hospedeiros silvestres deram origem aos vírus atualmente encontrados em tomateiro. Adicionalmente, devido à alta identidade observada entre os DNAs-B dos isolados BR:Pir1:05 e do ToRMV, é possível que este componente genômico seja compartilhado pelos dois vírus. Nos testes de gama de hospedeiros, plantas apresentando infecções latentes foram observadas para os dois isolados. Tais plantas podem atuar como reservatórios naturais e servir de fonte de inóculo primário para plantas hospedeiras de importância econômica, como o tomateiro. Os clones infecciosos do isolado BR:Pda30:05 apresentaram baixa infectividade nos testes de gama de hospedeiros. É possível que o método de inoculação não tenha sido eficiente na transmissão deste isolado, ou que os clones apresentem mutações que reduzam a eficiência de sua replicação.