La insulina estimula la captació de MeAIB, àcid alfa-(metil)aminoisobutíric, en el múscul esquelètic. Aquest compost és un anàleg aminoacídic no metabolitzable que és transportat, juntament amb un ió Na+, pel sistema A de transport d'aminoàcids.La insulina estimula la captació a través del sistema A de manera ràpida (max. als 60 min) i independent de síntesi protèica. Des d'un punt de vista cinètic, la insulina provoca una estimulació en la Vmax del transport, sense alterar la Km, per la qual cosa es pot pensar que o bé la insulina provoca un augment en el nombre de transportadors en la membrana plasmàtica, o bé la insulina activa la velocitat de transport intrínseca a cada transportador. En aquesta acció de la insulina no participen microtúbuls ni microfilaments a nivell del múscul esquelètic. La insulina també activa la captació de MeAIB al fetge, però en aquest teixit l'efecte és dependent de síntesi protèica i hi participen els microtúbuls.El sistema A pot activar-se per un dejuni aminoacídic, fenomen que rep el nom de "regulació adaptativa". La regulació adaptativa activa el sistema A de manera dependent de síntesi protèica, i en aquest cas també hi participen els microtúbuls.La insulina no activa el sistema A a través de la producció d'alteracions en el gradient electroquímic de Na(+).En l'estudi dels mecanismes transductors de l'acció de la insulina sobre el sistema A observem que aquesta acció requereix d'una adequada activitat tirosina quinasa del receptor de la insulina. En la transducció del senyal no semblen participar les proteïnes G sensibles a toxina colèrica o a toxina pertúsica, ni tampoc la proteïna quinasa C. La fosfolipasa C administrada exògenament, mimetitza parcialment l'acció de la insulina sobre el sistema A; els productes de la reacció catalitzada per aquest enzim són els diacilgliceroIs, els quals podrien tenir algun paper en el mecanisme de transducció de la insulina, en ]a seva acció sobre el sistema A.Respecte als mecanismes que regulen negativament l'acció de la insulina sobre el sistema A, hem observat que la proteïna quinasa C inhibeix parcialment la captació de MeAlB estimulada per la insulina; el nivell al que interactua la proteïna quinasa C és posterior al receptor de la insulina, ja que aquest no resulta afectat, ni en activitat de "binding", ni en activitat tirosina quinasa, per coneguts activadors de la proteïna quinasa C, els esters de forbol.La fosfolipasa C també provoca una inhibició de l'acció de la insulina sobre el sistema A. Donat que els diacilglicerols activen la proteïna quinasa C, pot especular-se que indirectament la fosfolipasa e també inhibeix l'acció de la insulina a través d'una estimulació de la proteïna quinasa C.Comparativament hem realitzat estudis de l'acció de la insulina sobre la captació d'anàlegs no metabolitzables de la glucosa, la 3-O-metilglucosa, en el múscul esquelètic. Així, mentre que Ja proteïna quinasa C podria participar en la transducció d'aquesta acció de la insulina, l'activació d'aquest enzim pels esters de forbol no provoca alteracions en la captació de glucosa estimulada per la insulina. La fosfolipasa C reprodueix igualment aquesta situació, marcant les diferències respecte al que succeeix amb el transport d'aminoàcids. Malgrat aquestes diferencies, la transducció de l'acció de la insulina sobre el transport de glucosa tampoc requereix de proteïnes G sensibles a toxina pertúsica o a toxina colèrica mentre sí que requereix d'una adequada funcionalitat del receptor de la insulina.Agents que activen la producció intracel.lular de cAMP no alteren l'acció de la insulina sobre la captació de MeaIB o de 3-O-metilglucosa, la qual cosa és índex d'una no participació de la proteïna quinasa A en la regulació negativa de l'acció de la insulina. / Insulin stimulates amino acid uptake through the system A in skeletal muscle. This stimulation is maximal at 60 min or insulin addition, and is independent of protein synthesis and microtubules or microfilaments activity. Insulin action on system A in muscle is characterized by an increased Vmax without changes in Km. In this regard, the effect of insulin on muscle broadly differs from the stimulatory action on system A in liver which is dependent on protein synthesis and on microtubular function.System A co-transports amino acids and Na(+) ions. Insulin does not stimulate system A through changes in electrochemical gradient of Na(+).This action of insulin requires an adequate tyrosine kinase activity of the insulin receptor. In the transduction of the insulin action, there are not G proteins sensitive to pertussis toxin or cholera toxin. Protein kinase C is not involved in the biochemical pathway that lead to activation of system A in skeletal muscle.It has been previously reported that some of insulin effects can be negatively regulated by activation of protein kinases such as protein kinase C or cAMP-dependent protein kinase. In this regard, we have found that activation of protein kinase C with TPA or by addition or PL-C inhibits insulin action of system A. However cAMP-inducing agents such isoproterenol, a beta-adrenergic agonist, cholera toxin -which activates Gs- or forskolin -which stimulates adenilate ciclase-, did not modify insulin action on system A in skeletal muscle.Thus protein kinase A does not seem to play a role in the regulation of insulin effect on amino acid uptake in muscle.

El rellotge biològic és l'estructura del sistema nerviós encarregada de generar i mantenir els ritmes de les diferents variables de l'organisme. En els mamífers, aquest rellotge biològic és el nucli supraquiasmàtic (NSQ), constituït per dos nuclis localitzats en la part inferior de l'hipotàlem. En cada nucli s'hi diferencien, anatòmicament i neuroquímica, dues zones: una ventrolateral i una dorsomedial. Aquestes zones estan interconnectades y reben aferències de senyals externs a l'organisme i d'altres zones del sistema nerviós; també envien eferències cap a altres zones, de l'hipotàlem o de fora d'ell. La via aferent més destacable és el tracte retinohipotalàmic, que porta informació fòtica al NSQ des de la retina. Aquesta via actua sobre la part VL.Actualment es creu que el sistema circadiari està format per un conjunt d'oscil·ladors que actuen de forma acoblada generant un ritme únic, constituint, d'aquesta forma, un sistema multioscil·lador.En la natura, el canvi cíclic més evident és l'alternança entre llum i foscor. Aquesta és la referència temporal o zeitgeber més important per als éssers vius. Això provoca que els organismes hagin desenvolupat una adaptació cap a aquesta alternança entre dia i nit donant lloc, en totes les seves variables, a ritmes circadiaris amb el mateix període que l'entorn; és a dir, amb un període molt proper a 24 hores. En condicions de laboratori, la submissió d'animals a cicles de llum-foscor inferiors a 24 hores, per exemple de 22 hores, provoca la generació de dos ritmes simultàniament. Un component, que segueix el cicle extern de llum-foscor, i que és el component dependent de la llum (LDC) i un altre, de naturalesa endògena, que és el component no dependent de la llum (NLDC). S'ha demostrat que el LDC està dirigit per la part ventrolateral, mentre que el NLDC, per la part dorsomedial. Aquest patró tan anòmal és la dissociació.L'objectiu general d'aquesta tesi és l'estudi de la dissociació del sistema circadiari en diferents variables fisiològiques i els tractaments que són capaços de revertir aquest fenomen. Els objectius específics són: 1) Estudiar els ritmes de diferents variables fisiològiques i observar si experimenten dissociació; 2) Estudiar la influència que exerceix el fotoperíode al qual l'organisme ha estat sotmès durant l'alletament en la posterior aparició del fenomen de la dissociació; 3) Provar diferents tractaments que modifiquin els components rítmics del patró dissociat.La principal aportació d'aquesta tesi és que sota cicles de llum-foscor de 22 hores, tant la temperatura com l'activitat motora presenten dos components circadiaris, però de manera diferenciada: l'activitat motora segueix el component rítmic que depèn de la llum, mentre que la temperatura segueix el component no dependent de la llum. També es conclou que la temperatura no és tan dependent de l'activitat motora, sinó que també presenta una regulació circadiària. Una altra conclusió que es pot extreure d'aquest treball és que l'exposició a cicles de llum-foscor de 22 hores durant el naixement i l'alletament impedeix la desincronització entre els ritmes d'activitat motora i temperatura de les rates, la qual cosa indica la importància de les influències ambientals en el desenvolupament del sistema circadiari de la rata. Per altra part, es mostra que l'alimentació restringida administrada cada 24 hores a rates amb el sistema circadiari dissociat dóna lloc a un patró d'activitat motora complex, format per tres components circadiaris, la qual cosa mostra la flexibilitat del sistema circadiari. L'administració de melatonina i diazepam en aigua de beguda afavoreix el reacoblament dels ritmes circadiaris dissociats: Per últim, l'administració de xocs electroconvulsius modifica els ritmes manifestos d'activitat motora i de temperatura sense afectar el marcapàs circadiari. / The suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus (SCN) is considered to be the most important structure of the mammal circadian system, since it generates and coordinates the circadian rhythmicity of the organisms. It consists of two nuclei located in the lower part of the hypothalamus. Under cyclic environmental conditions, the animals adequate the endogenous period to be equal to that of the external cycle, that is, animals entrain to the cyclic outside world. Since the most important zeitgeber that animals are exposed to is the light-dark cycle, they have adapted all their variables to circadian rhythms with a period similar than 24 hours . Under laboratory conditions, when rats are submitted to light-dark cycles of 22 or 23 hours, they show two circadian components simultaneously: the Light Dependent Component (LDC), that follows the same period as the external LD cycle, and the Non-Light Dependent Component (NLDC), that runs free with a period longer than 24 hours. LDC coincides with the expression of clock genes in the ventrolateral region of the SCN, while the NLDC coincides with expression in the dorsomedial area. This anomalous pattern is called dissociation.The aim of this thesis is the study of the circadian system dissociation in different physiological variables and the possible reversion of this phenomenon.The main conclusion is that under light-dark cycles of 22 hours, motor activity and temperature rhythms show two circadian components, but motor activity follows the LDC, while body temperature follows the NLDC. Also, it is concluded that body temperature shows a circadian regulation, independent of the motor activity. Another conclusion of this thesis is that the early exposure to a short T-cycle such as T22 impedes the desinchronization between the motor activity and body temperature rhythms in rats. Moreover, it is shown that restricted feeding administered every 24 hours to dissociated rats give rise to a complex motor activity pattern, with three circadian components. The administration of melatonin and diazepam in drinking water, favour the coupling of the dissociated circadian rhythms. Finally, the administration of electroconvulsive shocks modifiy the motor activity and body temperature rhythms without affect the circadian pacemaker.

ANTECEDENTSEl coneixement de Ies diferents activitats de transport d'aminoàcids prové de l'anàlisi del transport d'aquests en cèl.lules o vesícules de membrana provinents del teixit que es vol analitzar. A causa de la presència escassa d'aquestes proteïnes en la membrana i també la seva baixa estabilitat, conèixer la proteïna responsable de la funció per una estratègia clàssica de purificació-reconstitució presenta moltes dificultats. A més, és possible que algunes entitats de transport estiguin formades per diferents polipèptids amb propietats fisicoquímiques diferents, i encara és més difícil poder arribar a tenir una fracció totalment pura del transportador analitzat. Davant d'aquestes dificultats, l'expressió funcional en oòcits de "Xenopus" representa una estratègia altemativa per a l'aïllament molecular de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids, sempre que les seves activitats siguin detectables en expressar-les en l'oòcit.D'aquesta forma, el nostre grup va expressar activitat independent de Na+ de transport d'aminoàcids injectant en oòcits poli(A)+ de ronyó de conill. Aquesta activitat de transport era d'especificitat àmplia per a aminoàcids neutres i bàsics, i era saturable amb una K(m) al voltant de 0.6 mM. El missatger responsable d'aquesta activitat tenia una mida entre 1.8 i 2.4 kb (evidenciat per separació del poli(A)+ per mida en gradients de sacarosa i injecció de les diferents fraccions en l'oòcit). Amb aquestes evidències, el nostre grup, en col.laboració amb el grup del professor Heini Murer, va clonar per expressió funcional un cDNA que en expressar-se en oòcits induïa la mateixa activitat que es veia en injectar el poli(A)+ de ronyó. A més, l'activitat d'aquest poli(A)+ s'inhibia en incubar aquest amb un oligo antisentit generat a partir de la seqüència d'aquest cDNA. Aquesta proteïna es va anomenar rBAT ("related to b(0,+) amina acid transport activity"), ja que l'activitat que induïa en oòcits era molt similar a la descrita en blastòcits de ratoli (b(0,+) per Van Winkle. La diferencia que hi havia entre aquestes dues activitats era que rBAT també induïa transport de cistina. Independentment, dos grups diferents van clonar la mateixa proteïna de rata. El transport induït per rBAT en oòcits de "Xenopus" era saturable, amb K(m) per a aminoàcids bàsics i cistina entre 50-100 mil.limicres i variable per a aminoàcids neutres que depenen del grup radical: l'afinitat era més alta quan més gran era el grup radical. Així, a per aminoàcids com la L-leucina la K(m) era de l'ordre de mil.limicres, per a altres com ara la L-alanina, de l'ordre de mM i, finalment l'L-glicina no era transportada. Aquesta activitat de transport no és estereoselectiva, els D-aminoàcids es transporten d'igual forma que els L-aminoàcids.Per tranferència Northem es va analitzar l'expressió de l'RNA missatger. En condicions d'alta astringència, el cDNA d'l'BAT hibrida amb transcrits de 2.2 i 3.8 kb presents en ronyó i mucosa intestinal. Aquestes diferències de mida es deuen a diferències en poliadenilació, fet que es va demostrar posteriorment en clonar-se el cDNA de 3.8 kb emprant també expressió funcional. En condicions de baixa astringència hi ha presència de senyal en cervell (3.8 i 5.4 kb) i en fetge (2.2 kb). Es pensa que deuen ser transcrits homòlegs però no idèntics, ja que no són protegits en un assaig de protecció a RNAases fent servir una sonda d'rBAT de rata. La seqüència d'aminoàcids deduïda a partir de la seqüència de nucleòtids permetia predir una proteïna de 677 aminoàcids amb un pes molecular de 78 kD. A partir de l'anàlisi d'hidrofobicitat i estudis fets amb sistemes de traducció "in Vitro" es va suggerir que la proteïna rBAT seria una glicoproteïna de membrana de tipus II (el domini N-terminal seria citosòlic) amb un únic domini transmembrana. El grup de S. Tate va estudiar més tard la topologia de la proteïna rBAT mitjançant anticossos policlonals dirigits contra diferents parts de la proteïna i, així, va deduir la presència de 4 dominis transmembrana, i que els extrems N i C-terminal són citosòlics. Aquest tipus d'estructura no era usual per als transportadors de membrana descrits fins a aquell moment, fet que va fer plantejar la qüestió de si aquesta proteïna era un transportador per si mateix, un activador de sistemes de transport endògens en l'oòcit, o si formava part d'un complex heterooligomèric amb proteïnes ja presents en l'oòcit.En mirar el banc de dades de gens clonats, es va trobar que el domini extraceI.lular presentava una homologia alta amb una família d'enzims relacionats amb el catabolisme dels sucres. En canvi, la proteïna rBAT no presenta aquesta activitat, ja que presenta una mutació en un residu implicat en el centre actiu de reconeixement dels sucres. A més, es va trobar que rBAT presentava un 30% d'identitat i un 50% de similitud amb la cadena pesada de l'antigen 4F2 (4F2hc). L'antigen 4F2 (també anomenat CD98) és no heterodimer format per una proteïna glicosilada de 85 kD (4F2hc) que havia estat clonada fent servir l'anticòs monoclonal anti-eD98, unit covalentment per ponts disulfurs a una proteïna d'uns 40 kD altament hidrofòbica, no gIicosilada i que no s'havia pogut microseqüenciar. Es desconeixia la funció que tenia 4F2hc, només s'havia suggerit la seva implicació en el cicle cel.lular, ja que és un marcador de proliferació i també se l'havia implicat en la modulació dels nivells intracel.lulars de calci.Sorprenentment, en injectar 4F2hc en l'oòcit, es va observar un increment d'una activitat de transport descrita per Rosa Devés com y(+)L en eritròcits. Aquesta activitat es caracteritza per una inducció de transport d'aminoàcids dibàsics de fomm independent de sodi i neutres de forma dependent de sodi. S'ha demostrat que l'efecte del sodi sobre el transport d'aminoàcids neutres consisteix en la reducció de l'afinitat en unes 50 vegades. La predicció d'estructura de 4F2hc deduïda a partir de la seqüència d'aminoàcids era la d'una proteïna amb un únic domini transmembrana, fet que va plantejar els mateixos dubtes que amb la proteïna rBAT respecte a quina era l'entitat molecular responsable del transport.En analitzar en més detall la seqüència d'aminoàcids de les dues proteïnes es va observar que hi havia un residu de cisteïna, just després del primer domini transmembrana que estava conservat en ambdues proteïnes. Es va hipotetitzar que aquest residu seria el responsable de la formació d'un pont disulfur amb la possible subunitat lleugera de la qual no es coneixia la seqüència.D'aquesta forma es van identificar dues proteïnes, rBAT i 4F2hc, com una nova família de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids. En aquell moment, i a causa del fet que l'BAT induïa transport de cistina en oòcits, es va plantejar la hipòtesi que rBAT fos un gen candidat per a la cistinúria. La cistinúria és una malaltia autosòmica recessiva que presenta com a fenotip bioquímic la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina. A causa de la solubilitat baixa de la cistina, aquesta precipita formant càlculs renals. Per demostrar aquesta hipòtesi, s'havien de trobar nous fets experimentals que estiguessin d'acord amb totes les alteracions descrites per a aquesta malaltia. Així, es va estudiar la localització subcel.lular i l'expressió durant el desenvolupament de la proteïna rBAT. Es va demostrar que la proteïna l'BAT es localitza en el domini apical del túbul proximal S3 i que la seva expressió era postnatal. Aquests fets coincidien amb el que es coneixia del transport de cistina i del lloc on residia el defecte causant de la cistinúria. D'aquesta forma, tots els fets apuntaven a rBAT com a gen candidat.Com a primer pas per detenninar si aquesta hipòtesi era certa, el nostre grup va aïllar i caracteritzar el cDNA corresponent a l'rBAT humà i es va iniciar la recerca de mutacions (principalment de tipus puntual) mitjançant la tècnica coneguda com SSCP en la seqüència codificant del gen d'individus cistinúrics. Així, es van descobrir 6 mutacions puntuals, entre les quals destacava la mutació Met461Thr, per trobar-se en homozigosi. Per mutagènesi dirigida es va construir un cDNA de rBAT humà amb aquesta mutació i es va analitzar funcionalment en oòcits. Es va observar que aquest mutant presentava un defecte en el transport mesurat tres dics després de la injecció, fet que reafirmava la implicació d'rBAT en la cistinúria. Sorprenentment, en realitzar el transport sis dies després de la injecció es va veure que no hi havia diferències respecte a la proteïna salvatge. Per poder explicar aquest comportament de manera més detallada i reafirmar de manera més forta la implicació d'rBAT en la cistinúria, vaig construir i analitzar el mutant Met467Lys, resultats que explico més endavant en l'apartat de "resultats".Aixi i tot, nos resultats obtinguts pel grup d'A Busch a Tübingen, en coI.laboració amb el nostre grup, van suscitar gran controvèrsia. Aquests resultats demostraven que l'activitat induïda per rBAT estava d'acord amb un intercanviador d'aminoàcids. Diferents grups van publicar que no podien comprendre com un intercanviador podria servir com a mecanisme de reabsorció d'aminoàcids. A més, cal recordar, que el fenotip de la cistinúria consisteix en la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina, mentre que rBAT també indueix transport d'aminoàcids neutres. L'explicació d'aquest interrogant ha estat també un dels objectius de la meva tesi.Un detall important i no comentat fins ara és que la cistinúria és una malaltia heterogènia. S'han descrit tres tipus de cistinúria basant-se en les concentracions d'aminoàcids bàsics i cistina en homozigots i heterozigots per a la malaltia i en funció de l'absorció intestinal.El nostre grup va observar quc hi havia famílies on no hi havia una cosegregació entre el locus rBAT i la cistinúria, fet que plantejava la possibilitat que la cistinúria fos una malaltia deguda a mutacions en diferents gens, Una anàlisi més precisa del fenotip d'aquestes famílies va permetre dir que els tipus II i III de cistinúria no són causats per mutacions en rBAT. Quins podrien ser aquests altres gens candidats de cistinúria? Un possible candidat seria un altre transportador de cistina que estigués en els segments S1 i S2 del túbul renal. En aquesta línia, Segal, el 1977, va detectar fent servir vesicules apicals de ronyó de rata dos components de transport de cistina: un d'afinitat alta i capacitat baixa compartit amb aminoàcids bàsics (que podria correspondre a l'activitat deguda a rBAn i no altre d'afinitat baixa (K., =0.93 mM) i capacitat alta. A més, per estudis de microperfusió en túbuls aïllats, Vòlkl i Silbemagl van demostrar que al voltant del 90% de la cistina infosa pel túbul era reabsorbida pel túbul contornejat distal i que aquesta reabsorció era inhibida per fenilalanina a una concentració de 10 mM. Així, el gen o els gens responsables d'aquest sistema de transport podrien ser també gens de cistinúria. Un altre gen candidat seria la possible subunitat lleugera, que igual que per a la proteïna 4F2hc estaria lligada a rBAT per ponts disulfur. Quines evidències hi ha sobre la presència d'aquesta subunitat?:1. Si es fan experiments de transferència western fent servir un anticòs dirigit contra la proteïna rBAT amb membranes de ronyó, el pes que es detecta és diferent en funció de la presència o no d'agents reductors. Així, en absència d'agents reductors es detecten bandes de 125 kD de mobilitat electroforètica i de més alt pes molecular, mentre que la seva movilitat en presència d'agents reductors és de 94 kD. En tractar amb endoglicosidasa F aquesta banda de 94 kD passa a tenir una mobilitat que està d'acord amb el pes molecular deduït a partir de la seqüència d'aminoàcids. Per experiments de transferència western en gels de dues dimensions (primera dimensió no reductora, segona dimensió reductora) i per experiments de "crosslinking" amb reducció posterior, s'ha observat que la banda de 94 kD forma part d'aquest complex. Malauradament, no s'ha pogut immunoprecipitar aquest complex com s'havia fet en el cas de l'antigen 4F2, que demostrava directament que aquestes dues proteïnes interaccionen directament.2. L'expressió de la proteïna rBAT en cèl.lules heteròlogues (COS, MDCK) no suposa cap activitat de transport: la proteïna o no arriba a la membrana o si hi arriba no indueix cap activitat de transport. En aquestes cèl.lules transfectades no s'han detectat per transferència western aquestes bandes de pes molecular més alt (125 kD).3. Ens podem preguntar llavors si podem detectar aquests complexos de pes molecular més alt en l'oòcít de "Xenopus". En condicions no reductores s'ha observat una lIeugera banda de 125 kD (en comparació amb la intensilat de la banda de 94 kD), banda que s'ha postulat que seria homòloga a la detectada en membranes de ronyó.Així, totes aquestes evidències experimentals estan a favor d'un model on la proteïna rBAT estaria associada a una altra proteïna ("subunitat lleugera") mitjançant ponts disulfur. Aquesta possible proteïna seria, doncs, un altre gen candidat de cistinúria.OBJECTIUSTenint en compte els antecedents descrits en l'apartat anterior es van plantejar els següents tres objectius inicials:1. Reafirmar la implicació d'rBAT en la malaltia cistinúria construint per mutagènesi dirigida cDNA d'rBAT que continguessin alteracions en la seqüència d'aminoàcids.Així es va construir el mutant Met467Lys i es va caracteritzar en oòcits l'activitat induïda per intentar explicar el possible defecte que patien pacients cistinúrics que tinguessin la proteïna rBAT amb aquesta alteració.2. Intentar comprendre els mecanismes dc reabsorció d'aminoàcids bàsics i cistina partint de les activitats induïdes per rBAT i 4F2hc en l'oócit de "Xenopus". D'aquesta manera també es volia comprendre com alteracions en l'activitat b(0,+) induïda per rBAT podrien explicar el fenotip cistinúric.3. Estudiar el paper de les proteïnes rBAT i 4F2hc com a components i/o activadors dels sistemes de transport b(0,+) i (+)L respectivament.Es volia detenninar primer quina era l'estructura del transportador per poder identificar més tard quina era l'entitat molecular responsable del transport i aixi entendre com aquestes dues proteïnes (la cadena lleugera i la cadena pesada) interaccionaven entre si.CONCLUSIONS1. Es reafirma la implicació del gen rBAT en la cistinúria de tipus 1. Dues de les mutacions trobades en pacients cistinúrics, Met467Lys i Met46TThr, no són completament funcionals a causa d'un problema en el trànsit cap a la membrana plasmàtica.2. El transportador b(0,+) funciona com un intercanviador obligatori d'aminoàcids amb estequiometria 1:1. En aquesta tesi hem vist que el potencial de membrana i l'intercanvi amb aminoàcids neutres són les principals forçes que penneten acumular aminoàcids. Aquest mecanisme explica completament el fenotip de la cistinúria de tipus I. El transportador y(+)L també funciona com un intercanviadar d'aminoàcids, però de forma asimètrica ja que únicament permet la sortida d'aminoàcids bàsics, a causa probablement de les baixes concentracions de sodi intracel·lulars.3. Els transportadors b(0,+) i y(+)L formen part d'una gran família de transportadors heteromultimèrics constituïts per dues subunitats: una subunitat llengera (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-l, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, etc) responsable de l'especificitat de substracte, i una subunitat pesada (4F2he, rBAT), necessària per a l'expressió en superfície de la subunitat lleugera. Aquestes dues proternes interaccionen a través d'un pont disulfur entre 2 residus de cisteïna que estan altament conservats. A part d'aquesta interacció covalent, són necessàries altres interaccions entre altres dominis com ara l'extrem C-terminal d'rBAT. Així, rBAT determina propietats funcionals del transportador b(0,+).4. La mutació L334R trobada en un pacient espanyol amb LPI i la mutació V170M trobada en pacients jueus amb cistinúria de tipus no-I, provoquen un defecte en la funció de la proteïna y(+)LAT-1 i b(0,+)AT, respectivament.5. S'ha identificat una nova família de transportadors lisosomals formada per 3 membres, MfP, LyCAT i LyMAT. LyCAT funciona com un transportador lisosomal d'aminoàcids bàsics, mentre que LyMAT funciona com un transportador lisosomat de múltiples aminoàcids. El domini C-terminal d'aquestes proteïnes en determina la locaIització subcel·lular. Estudis posteriors permetran implicar el transportador Iisosomal LyCAT en la regulació de la síntesi de NO en macròfags, com permeten suggerir les dades obtingudes en la present tesi. / l. It is reaffirmed the implication of the gene rBAT in the type I cystinuria. Two of the mutations found in cystinuric patients, Met467Lys and Met467Thr, are not thoroughly functional due to a problem in the travel toward the plasma membrane.2. The carriers b(0,+) operates as a obligatory exchanger of amino acids with 1: 1 stoichiometry. In this thesis, we have seen that the membrane potential and the exchange with neutral amino acids are the principal forces that permit to accumulate amino acids. This mechanism fully explains the phenotype of the type I cystinuria. The carrier y(+)L also operates as an exchanger of amino acids, but in a asymmetrical way, since solely permits the exit of basic amino acids, because probably of the lower intracellular sodium concentrations.3. The carriers b(0,+) and y(+)L form part or a great heteromultimerics carriers family constituted by two subunits: a light subunit (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-I, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, ... ) responsible for the substrate specificity and a heavy subunit (4F2hc, rBAT) necessary for the expression in surface or the light subunit. These two proteins interact to through a disulfur bridge between two residues of cisteine that are highly preserved. In addition to this covalent interaction, they are necessary other domains as the extreme C-terminal of rBAT. Then, rBAT it determines functional properties or the transporter.4. The mutation L334R found in a Spanish patient with LPI and the mutation Vl70M found in Jewish patients with non-type I cystinuria provoke a defect in the function of the proteins y(+)LAT-I and b(0,+)AT, respectively.5. It has been identified a new family of lysosomal carriers formed by 3 members: MTP, LyCAT and LyMAT. LyCAT operates as a lysosomal carrier of basic amino acids, while LyMAT operates as a Iysosomal carrier of multiples amino acids. The C-terminal domain or these proteins determines their subcelular localization. Subsequent studies will alIow to imply the Iysosomal carrier LyCAT, in the regulation of the synthesis of NO in macrophages, as permit to suggest the data obtained in the present thesis.

Comprising over 70% of the Earth's surface, water is undoubtedly the most precious natural resource that exists on our planet. Without the seemingly invaluable compound comprised of hydrogen and oxygen, life on Earth would be non-existent: it is essential for everything on our planet to grow and prosper. Although we as humans recognizethis fact, we disregard it by polluting our rivers, lakes, and oceans. Subsequently, we areslowly but surely harming our planet to the point where organisms are dying at a very alarming rate. In addition to innocent organisms dying off, our drinking water has become greatly affected as is our ability to use water for recreational purposes. In order to combat water pollution, we must understand the problems and become part of the solution.When is compared with other options of processing, biological treatment of residualwater is considered a cheap and attractive alternative to eliminate various types ofcontaminants. The effíciency of the biological process depends on many factors such asthe concentration of the contaminants, the chemical structure of the composed, the pHand the presence of inhibitory compounds in wastewater. Although some organic contaminants can be degraded through biological process, many other composed synthetic and natural are not biodegradable.On the hand, several chemical processes as advanced oxidation processes (AOP's) canbe use for mineralization of many organic contaminants. The doubt that presents theseprocesses is the use of expensive reagents. A potential viable solution proposed during last two decays is the combination of these processes with biological processing. In these combined processes, the chemical process would be utilized like pre-treatment step to enhance the biodegradability and elimínate the toxicity of the effluents, while the total mineralization would be completed in the biological process. For it, it is interesting to monitor the changes in the biodegradability of the effluents along thechemical process, this may be use to determine the optimum pre-treatment time. In the literature various indicators have been proposed to follow the biodegradability, where the ratios BOD5/COD and BOD5/TOC are the most utilized (BOD: Biological oxygen demand); COD: Chemical oxygen demand; TOC: total organic carbón). In general, are municipal wastewater was taken as reference values. Thus, it is considered that an effluent is biodegradable when the relation BOD5/COD is over 0.4 or BOD5/TOC over 1.0 (Metcalf & Eddy, 1985).The AOP's are defined like those processes that imply the generation of radicals highlyreagents (especially radical hidroxilo) in suffícient quantities. Although most organicmatter can be degraded by these processes, other compounds as the acetic acids,maleico and oxálico, acetona or cloroformo are not attacked by these radicals (Bigda,1995). The advantage of AOP's comes from the fact that radicals can be formed through different processes.In this study, AOP's based on photo-oxidation well be used for treatment of water contained Phenol and 2,4-dichlorophenol. In the first chapter of this work a general literature review the reactions are presented in which a series of methods for the treating refractory were proposed, among them is found the adsorption in active carbon, humid oxidation, supercritical oxidation, electrochemical oxidation, chemical oxidation in its two parts classics and advanced oxidation. For all, a small bibliographical search as well previous publication in elimination of phenol (POH) and 2,4-dichlorophenol(DCP) are presented. Moreover, it was presented a basic explanation of the characteristics of the biological processing and its operational types. At the end of this chapter, it has been introduced a figure (Figure 3.4) that shows a possible strategy to treat any type of wastewater depending on the organic load and the biodegradability.With respect to the results, the thesis present a framework of the combination of AOP's and biological treatment. In this case, synthetic residual water containing phenol (POH) and 2,4-diclorophenol (DCP) and textile dyes.These compound associates as contaminants in different types of water. They appear in different types of industrial effluents and included among the 130 priority contaminants gives by US EPA and theEuropean Union.A study of the behaviour of these substances for a possible biological degradation showed that all presented low biodegradability, and some as the DCP and textile dyes were inhibited for biomass. Thus, it was necessary to seek alternatives treatment processes.In a first part of this work, the degradation of these composed was studied by means ofadvanced oxidation processes (AOP's), based on the use of the process of photooxidation, in this case, direct irradiation with light UV or UVA, and combination thesesources of light with; UV(A)/H202, UV(A)/Fe(III),UV(A)/Fe(II)/H202 and the processFenton. These experiments were performed in four different, two of them are type tubular and the other two are type stirred tank. The followed variables along the process were the concentration of the contaminants, pH, initial concentration of the H202, Conc. Initial of Fe(II), time of irradiation and total organic carbon (TOC).The effect of irradiation time in the degradation of both the POH and DCP was studied. Also, kinetic of the reactions were followed. Results show that direct UV photolysis is not efficient for DCP and POH elimination. First order reaction constant of aprox.0.0056 min-1 and 0.0066 min-1 was obtained for POH and DCP, respect.)Also the combinations of this process with other hydroxyl radical sours were studied,for e. j., the effect of the quantity of peroxide or Fa(II), or the black light irradiationwith UV at (300-420 nm) vs. 254 nm. By means of the combination H202/UV/Fe removals percentages of 100 DCP and POH were achieved. During these reactions, by-products were identified, for POH it was identified caticlos, quinone and hidroquinoin. In the case of DCP, only it was possible to identify the clorobenzoquinona and some carboxylic acids.As it was mentiond above, the hostility that AOP's presents is use of expensive reagents, and a possible alternative is the combination with biological process. In this study also, some strategies for these types of combination have been established, that was possible by means of a study of the improvement in the biodegradability of the treated solutions. In a second part of the work, therefore, the effect of these processeswas studied in the biodegradability enhancement of the solutions. The better resultswere obtained by means of the process photo-Fenton, the ratios BOD5/COD increasedfrom O up to 0.92 and 0.48 for solutions of 100 ppm of POH and DCP respectively.After time of irradiation of 30 min and initial concentrations of H2 02 of 65 ppm and 300 ppm, respectively. Later the improvement of the biodegradability of the treated solutions, was studied the biodegradation of some solutions pre-tried of POH and DCP.Respect the DCP treated, the results have shown that activated sludge of a municipal wastewater plant could be adequate for the treatment of the pre-oxidize solutions and that was possible through co-digestion of the same with a residual water. By means of the combination photo Fenton -biological treatment. It was achieved up to a 89 of organic matter elimination. Continuing this line of investigation, it was developed alsoa complete combined processes consist of DCP pre-treated via Photo oxidation and aerobic and anaerobio biological reactors type SBR (sequencing batch reactor). By means of this process, elimination of organic matter up to 93 of TOC was obtained in a signifícant cycle time. The same strategy was applied to phenol, in this part a comparison has been established between single and coupled processes, the results havebeen shown that good improvement in organic matter take place in the combined processes.Finally, the use of the photo oxidation processes was examined to eliminate the colour and improvement the biodegradability of dyes solutions. The results have shown that these processes can be use efficiently for colour elimination and biodegradability improvement of dyes solutions.

No description available.

La utilització de composts com substrats de cultiu i/o l'ús d'agents de control biològic són una alternativa als mitjans de control de fitopatògens mitjançant fitosanitaris químics. Aquesta tesi consta de 4 capítols. En el Capítol I es va estudiar la capacitat de 5 composts procedents de residus municipals i agrícoles de suprimir la malaltia produïda pel patogen foliar Botrytis cinerea en plantes de cogombre. Els cinc composts van ser capaços de reduir la incidència i severitat de la malaltia en comparació amb els substrats de cultiu estàndard (2 torbes comercials). La reducció de la malaltia es va associar al subministrament de Ca, Mo i Si per part dels composts, a cert grau d'estrès salí produït en la planta, així com a l'alta activitat microbiològica dels composts. En el Capítol II es descriu el desenvolupament d'un mètode basat en la cromatografia líquida acoblada a detecció per espectrometria de masses en tàndem per a la quantificació simultània de les hormones àcid salicílic i àcid jasmònic en extractes vegetals. El mètode es va aplicar per a estudiar l'efecte de la colonització de l'arrel de plantes de cogombre per part de l'agent de control biològic Trichoderma asperellum T34 o la infecció per part del patogen Rhizoctonia solani. No es va observar cap efecte de T34 aplicat a l'arrel a 105 ufc/ml sobre els nivells d'aquestes hormones. R. Solani, va produir l'increment de les dues hormones, tant en arrel com en cotilèdon. En el Capítol III es va estudiar l'efecte de T34 aplicat a l'arrel de la planta de cogombre a 105, 106 i 107 ufc/ml sobre l'activitat peroxidasa, els nivells d'àcid salicílic i jasmònic i el proteoma dels cotilèdons en les primeres hores de la interacció. T34 activa l'activitat peroxidasa i eleva els nivells de les hormones estudiades de forma depenent a la concentració. A 105 no s'observen efectes. T34 aplicat a l'arrel a 107 ufc/ml és capaç de produir canvis el proteoma dels cotilèdons afectant l'expressió de proteïnes relacionades amb la defensa contra patògens. Aquest mateix tractament és capaç d'induir en la planta resistència sistèmica contra el patogen foliar Pseudomonas syringae pv. lachrymans. En el Capítol IV es va comprovar la capacitat de T34 aplicat a 105 ufc/ml per a induir resistència sistémica en Arabidopsis enfront dels patògens foliars Pseudomonas syringae pv. tomato, Hyaloperonospora parasitica i Plectosphaerella cucumerina. Aquesta resistència sistèmica és semblant a la induced systemic resistance (ISR) produïda per rizobacteris no patogènics. L'ús d'Arabidopsis mutants va permetre establir que la ISR induïda per T34 és independent d'àcid salicílic i depenent de NPR1 i MYB72. A més, la ISR induïda per T34 es basa en el priming ja que precondiciona a les plantes a expressar el gen LOX2 i el bloqueig d'espores de patògens mitjançant cal·losa de forma mes ràpida i intensa quan posteriorment responen a un atac. / This thesis consists in 4 chapters. In Chapter I we checked the ability of 5 composts from municipal an agricultural wastes to suppress disease produced by the foliar pathogen Botrytis cinerea in cucumber plants. The 5 studied composts were able to reduce disease incidence and disease severity compared to standard growth media (2 commercial peats). The reduction in disease was related to the supply of Ca, Mo and Si to the plants, a certain degree of salt stress and the high microbial activity of the composts. In Chapter II we describe a method based in liquid chromatography coupled to mass spectrometry to simultaneously quantify salicylic and jasmonic acids in crude plant extracts. No effect on the hormones was found when the biological control agent Trichoderma asperellum T34 was applied to the roots at 105 cfu/ml. Rhizoctonia solani infection increased both hormones in both cotyledons and roots. In Chapter III we studied the effect of T34 applied to the roots at 105, 106 and 107 cfu/ml on peroxidase activity, salicylic and jasmonic acids levels and proteome of cucumber cotyledons during the early hours after the interaction. T34 affects peroxidase activity and hormone levels depending on the concentration. No effects at 105. T34 applied to the roots at 107 cfu/ml is able to produce changes to the proteome affecting the expression of defense related proteins. This treatment is also able to induce systemic resistance against the foliar pathogen Pseudomonas syringae pv. lachrymans. In Chapter IV we checked the ability of T34 applied at 105 cfu/ml to induce systemic resistance in Arabidopsis against the foliar pathogens Pseudomonas syringae pv. tomato, Hyaloperonospora parasitica and Plectosphaerella cucumerina. This systemic resistance is similar to induced systemic resistance (ISR) triggered by non pathogenic rhizobacteria. The use of Arabidopsis mutants allowed us to establish that ISR induced by T34 is salicylic acid independent but is dependent on NPR1 and MYB72. In addition ISR triggered by T34 is based on priming as it primes plants for enhanced LOX2 gene expression as well as callose deposition when plants face an stress.

La consolidació d'un model intensiu per a la ramaderia comporta la necessitat d'aplicar estratègies de gestió optimitzades. En relació a les dejeccions del bestiar, la gestió cal fonamentar-la en tres punts bàsics: la minimització en origen, la planificació de la fertilització del sòl i la implementació de tecnologies de tractament complementàries. Tot i que és possible adoptar diferents criteris com a limitant en el moment de planificar la gestió de fems i purins, el nitrogen acostuma a ser el més important. El propòsit d'aquesta tesi doctoral és aprofundir en l'estudi de tractaments que permetin afrontar un problema d'excedent de nitrogen derivat de la generació de purins. Concretament, s'emfatitza en la caracterització de processos biològics relacionats amb l'eliminació de nitrogen, utilitzant la modelització matemàtica com a eina bàsica de treball. Dues alternatives han estat considerades: i) el procés de nitrificació-desnitrificació (NDN) implementat en un reactor discontinu seqüencial (SBR), i ii) el procés SHARON (nitritació parcial en un quimiòstat aerobi) combinat amb el procés Anammox (oxidació anaeròbia de l'amoni), una alternativa de tractament en principi més sostenible que l'anterior actualment en incipient fase de desenvolupament.S'ha desenvolupat un model matemàtic per tal de simular el procés biològic de NDN, incloent a més, fenòmens de precipitació de sals i de transferència líquid-gas. Per fer-ho, s'ha considerat al pH com a variable d'estat, doncs la seva dinàmica afecta a l'equilibri químic, la disponibilitat de substrats per al creixement de la biomassa i els possibles fenòmens d'inhibició. Aquest plantejament ha habilitat l'establiment d'un model suficientment flexible per tal d'adaptar-se a un ampli rang de càrrega nitrogenada. La implementació informàtica s'ha dut a terme utilitzant el llenguatge de programació Fortran. El calibratge del model aplicat al tractament de fracció líquida de purins s'ha efectuat utilitzant tècniques respiromètriques. Una anàlisi de sensibilitat prèvia ha permès identificar aquells paràmetres i processos amb major influència en la resposta del model i, per tant, orientar el disseny experimental. Una vegada en disposició del model calibrat, s'ha realitzat un estudi d'optimització del cicle de tractament del SBR operat amb el propòsit d'eliminar nitrogen. Finalment, la bondat d'aquestes previsions ha estat validada experimentalment.Una versió simplificada del model inicial ha permès simular el procés SHARON. S'ha realitzat una primera estimació de paràmetres cinètics utilitzant dades experimentals històriques obtingudes en un bioreactor alimentat amb un substrat sintètic. En base a les previsions del model, s'ha discutit sobre l'efecte de determinats paràmetres en les característiques de l'efluent del tractament, concretament en la relació nitrit/amoni. Serà aquesta proporció entre ambdues formes nitrogenades la que determinarà l'aptitud de l'efluent SHARON per ser sotmès a un posterior procés Anammox.Com a conclusió general, cal considerar la modelització matemàtica com a una eina fonamental per tal de desenvolupar estratègies optimitzades de gestió de dejeccions ramaderes basades en l'eliminació de nitrogen. El procés convencional de nitrificació-desnitrificació implementat en sistemes discontinus tipus SBR representa una alternativa madura per tal de donar solució a situacions d'excedent de nitrogen vinculades a la gestió dels purins. Els requeriments energètics relacionats amb l'aeració són, però, el principal limitant en quant a una major implementació. Nous desenvolupaments biotecnològics en principi més eficients energèticament, com és el cas del procés SHARON-Anammox, podrien desplaçar en un futur proper el procés tradicional de NDN sempre i quan premisses com robustesa, flexibilitat o senzillesa siguin garantides. / La consolidación de un modelo intensivo para la ganadería comporta la necesidad de aplicar estrategias de gestión optimizadas. En relación a las deyecciones del ganado, la gestión debe fundamentarse en tres puntos básicos: la minimización en origen, la planificación de la fertilización del suelo y la implementación de tecnologías de tratamiento complementarias. Aunque es posible adoptar diferentes criterios como limitante en el momento de planificar la gestión de estiércoles y purines, el nitrógeno acostumbra a ser el más importante. El propósito de esta tesis doctoral es profundizar en el estudio de tratamientos que permitan afrontar un problema de excedente de nitrógeno derivado de la generación de purines. Concretamente, se enfatiza en la caracterización de procesos biológicos relacionados con la eliminación de nitrógeno, utilizando la modelización matemática como herramienta básica de trabajo. Dos alternativas han sido consideradas: i) el proceso de nitrificación-desnitrificación (NDN) implementado en un reactor discontinuo secuencial (SBR), y ii) el proceso SHARON (nitritación parcial en un quimiostato aerobio) combinado con el proceso Anammox (oxidación anaerobia del amonio), una alternativa de tratamiento en principio más sostenible que la anterior actualmente en incipiente fase de desarrollo.Se ha desarrollado un modelo matemático que ha permitido simular el proceso biológico de NDN, incluyendo además, fenómenos de precipitación de sales y de transferencia líquido-gas. Para hacerlo, se ha considerado al pH como variable de estado, pues su dinámica afecta al equilibrio químico, la disponibilidad de sustratos para el crecimiento de la biomasa y los posibles fenómenos de inhibición. Este planteamiento ha habilitado el establecimiento de un modelo suficientemente flexible como para adaptarse a un amplio rango de carga nitrogenada. La implementación informática se ha realizado utilizando el lenguaje de programación Fortran. La calibración del modelo aplicado al tratamiento de fracción líquida de purines se ha efectuado utilizando técnicas respirométricas. Un análisis de sensibilidad previo ha permitido identificar aquellos parámetros y procesos con mayor influencia en la respuesta del modelo y, por lo tanto, orientar el diseño experimental. Una vez en disposición del modelo calibrado, se ha realizado un estudio de optimización del ciclo de tratamiento del SBR operado con el propósito de eliminar nitrógeno. Finalmente, la bondad de estas previsiones ha sido validada experimentalmente.Una versión simplificada del modelo inicial ha permitido simular el proceso SHARON. Se ha realizado una primera estimación de parámetros cinéticos utilizando datos experimentales históricos obtenidos en un birreactor alimentado con sustrato sintético. En base a las previsiones del modelo, se discute sobre el efecto de determinados parámetros en las características del efluente del tratamiento, concretamente en la relación nitrito/amonio. Será esta proporción entre las dos formas nitrogenadas la que determinará la aptitud del efluente SHARON para ser sometido a un posterior proceso Anammox.Como conclusión general, debe considerarse la modelización matemática como una herramienta fundamental para desarrollar estrategias optimizadas de gestión de deyecciones ganaderas basadas en la eliminación de nitrógeno. El proceso convencional de nitrificación-desnitrificación implementado en sistemas discontinuos tipo SBR representa una alternativa madura para dar solución a situaciones de excedente de nitrógeno vinculadas a la gestión de los purines. Los requerimientos energéticos relacionados con la aireación son el principal limitante en cuanto a una mayor implementación de esta tecnología. Nuevos desarrollos biotecnológicos más eficientes energéticamente, como es el caso del proceso SHARON-Anammox, podrían desplazar en un futuro próximo el proceso tradicional de NDN siempre y cuando premisas como robusteza, flexibilidad o sencillez sean garantizadas. / The consolidation of an intensive model for livestock farming calls for the application of optimized management strategies. As far as livestock waste is concerned, management should be based on three main aspects: on-site minimization, land fertilization planning and the implementation of complementary treatment technologies. Although various criteria may be considered as limiting when planning manure and slurry management, nitrogen is usually considered the most important. The aim of the present dissertation was to study different treatment options for tackling the problem of nitrogen surplus derived from slurry generation. It was specifically emphasised the characterization of biological processes related to nitrogen removal, using modelling as basic working tool. Two main alternatives were considered: i) the nitrification-denitrification (NDN) process using a sequencing batch reactor (SBR), and ii) the SHARON process (partial nitritation in an aerobic chemostat) coupled with the Anammox process (anaerobic ammonium oxidation), a treatment alternative that is, at least in principle, more sustainable than the previous, but which is currently still at an incipient stage of development.A mathematical model was developed, which allowed to simulate the biological process of NDN also taking into consideration salt precipitation and liquid-gas transfer phenomena. pH was considered state variable due to its effects on chemical equilibrium reactions, substrates availability for biomass growth and potential inhibition phenomena. This approach enabled to establish a model that was sufficiently flexible for application to a wide range of nitrogen loading rates. Computations were made using the Fortran programming language. Respirometric techniques were used for model calibration when treating liquid fraction of pig slurry. Sensitivity analysis helped to identify the parameters and processes with greater influence on the response of the model and, consequently, on the orientation of subsequent experimental designs. Once the calibrated model was available, an optimization study of the SBR cycle was conducted. Finally, the goodness of the model was experimentally validated.A simplified version of the initial model was constructed in order to simulate the SHARON process. A preliminary estimation of kinetic parameters was performed using historical experimental data obtained from a bioreactor fed with a synthetic substrate. The effects of certain parameters on the characteristics of treated effluent were subsequently discussed based on predictions made by the model, particularly focussing on the nitrite/ammonium ratio. This proportion between the two forms of nitrogen will determine the suitability of the SHARON effluent for a subsequent Anammox process.As general conclusion, mathematical modelling should be considered as a key tool for developing optimized livestock waste management strategies based on nitrogen removal. Conventional nitrification-denitrification process implemented in discontinuous SBR type systems represents a mature alternative for solving situations of nitrogen surplus derived from slurry management. However, the energy requirements associated with the aeration are the main limitation to a wider implementation of this technology. New, and more energy efficient, biotechnological developments such as the SHARON-Anammox process could replace the traditional NDN process in the near future if considerations like robustness, flexibility and simplicity can be ensured. / StreszczenieWzmocnienie intensywnego modelu hodowli trzody chlewnej wymaga zastosowania optymalnych strategi zarządzania. Zarządzanie odpadami towarzyszącymi hodowli trzody chlewnej powinno być oparte na trzech głównych aspektach: minimalizacji w miejscu powstania, planowaniu nawożenia gleby i zastosowaniu komplementarnych rozwiązań technicznych. Mimo, iż przy planowaniu ograniczenia ilości obornika różne kryteria mogą być brane pod uwagę, to azot zwykle odgrywa główną rolę. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej jest przestudiowanie rozwiązań, które pozwolą stawić czoło problemowi nadmiaru azotu powstałego przy produkcji obornika. Położono w niej nacisk na modelacje matematyczne, które zostały użyte do charakteryzacji biologicznego procesu usuwania azotu. Wzięto pod uwagę dwie alternatywy: i) nitryfikacja-denitryfikacja (NDN), proces wykorzystujący sekwencyjne reaktory porcjowe (SBR), oraz ii) proces SHARON (częściowa nitrytacja w chemostacie tlenowym) razem z początkowym procesem Anammox (beztlenowe utlenianie amonu), który jest zastosowaniem alternatywnym, w zasadzie bardziej zrównoważonym niż poprzednie, ale obecnie będącym w początkowej fazie rozwoju.Został rozwinięty matematyczny model, który umożliwił symulację biologicznego procesu NDN, włączając w to także wytrącanie się soli oraz fenomen przemiany płynu w gaz. Czynnik pH został określony jako stale zmienny z powodu jego wpływu na stan równowagi chemicznej reakcji, na dostępność substratów dla rozwoju biomasy oraz na potencjalny fenomen zachamowania. To podejście umożliwiło ustalenie modelu, który był wystarczająco elastyczny aby móc go zastosować do szerokiej rangi rozpiętości załadunku nitrogenu. Zastosowanie komputerowe zostało przeprowadzone przy użyciu języka programującego Fortran. Do uzyskania wzoru modelu, aplikowanego do traktowania frakcji płynnej odchodu wieprzowego, zostały użyte techniki respirometryczne. Analiza czułości pomogła w identyfikacji tych parametrów i procesów, z wyższym wpływem na odpowiedź modelu, i konsekwentnie na kierunek kolejnych eksperymentów. Kiedy już ustalono model wzorcowy zaczęto przeprowadzać optymalizację cyklu SBR, którego celem była oczywiście eliminacja nitrogenu. Na końcu, prawidłowość tych symulacji została potwierdzona eksperymentalnie.Na potrzeby symulacji procesu SHARON została stworzona uproszczona wersja początkowego modelu. Wstępna ocena parametrów kinetycznych została przedstawiona przy użyciu historycznych danych eksperymantalnych uzyskanych z bioreaktora z syntetycznym substratem. W oparciu na przewidywaniach modelu dyskutuje się na temat wpływu pewnych parametrów na właściwości oczyszczania scieków, konkretnie w relacji do współczynnika azotyn/amon. Ta proporcja pomiędzy dwoma formami nitrogenu zdeterminowała stosowność procesu SHARON dla kolejnego procesu Anammox.Podsumowując, matematyczny model powinien byc uważany jako kluczowy środek do optymalizacji strategii zarządzania odchodami opartymi na usuwaniu azotu. Konwencjonalne procesy NDN, oraz częściowo te które zostały zastosowane w systemie SBR reprezentują dojrzałą alternatywę rozwiązania kwesti nadmiaru azotu. Głównym ograniczeniem w szerszym zastosowaniu tej technologii są wymagania energetyczne zwiazane z napowietrzaniem. Nowe rozwiązania biotechnologiczne, które są bardziej energooszczędne, takie jak proces SHARON-Anammox mogą w bliskiej przyszlosci zastąpić tradycjonalny proces NDN zakladając, iż zostaną zapewnione takie koncepcje jak krzepkość, elastyczność oraz przejrzystość.

The use of simulation as an upgrading tool has been tested on real wastewater treatment plants (WWTP). Currently, the new WWTP have the possibility to monitor some process variables as the flows, oxygen concentrations and, some physical properties as temperature or pH. This thesis has been divided in two main sections: i) the use of the GPS-X software as an upgrading tool for real WWTP and ii) the use of the wavelet filter for the analysis of the online data / Els objectius que es planteja la present tesi doctoral són: i) efectuar una revisió dels models mecanístics de depuració d’aigües residuals, ii) avaluar-ne la fiabilitat en la simulació d’estacions depuradores d’aigües residuals reals, iii) estudiar la problemàtica de disposar de gran quantitat de dades en línia, iv) presentar la tècnica de filtrat de dades amb wavelets i v) avaluar la capacitat de filtrat de les wavelets en les dades disponibles en línia d’una EDAR urbana que enregistra els cabals d’operació i concentracions d’oxigen dissolt en línia

Para obtener un control biológico adecuado de las plagas presentes en un cultivo es importante determinar las relaciones tróficas que existen entre los enemigos naturales y su efecto sobre el control de estas plagas. Dos de estas interacciones, la depredación intragremial y el canibalismo, pueden condicionar el éxito de los programas de control biológico produciendo efectos aditivos o negativos sobre las poblaciones de la plaga. Para determinar la ingesta de todos los estados de desarrollo de la presa se utilizan técnicas moleculares basadas en la detección de ADN de la presa dentro de los depredadores. Estas técnicas también se utilizan para la evaluación del parasitismo dentro del huésped, dada la dificultad de identificar estadios juveniles mediante otros métodos. Esta Tesis se ha centrado en el estudio de las relaciones tróficas existentes en el control biológico del cultivo del tomate. Se han utilizado tanto métodos de observación directa como métodos moleculares para estudiar las relaciones tróficas presentes entre dos de las principales plagas, las moscas blancas Bemisia tabaci y Trialeurodes vaporariorum, sus parasitoides Eretmocerus mundus y Encarsia pergandiella y sus depredadores Macrolophus pygmaeus y Nesidiocoris tenuis. En el primer capítulo se estudió la depredación de M. pygmaeus y N. tenuis sobre B. tabaci, T. vaporariorum, E. mundus y E. pergandiella en campos comerciales de tomate, utilizándose marcadores moleculares específicos de estas especies. Se observó que M. pygmaeus y N. tenuis depredaron fundamentalmente moscas blancas, aunque también depredaron sus parasitoides. La detección molecular permitió detectar depredación sobre parasitoides en invernaderos con muy baja densidad de presa. Por otra parte, se observó que la detección molecular de la presa se relacionaba positivamente con la abundancia de adultos de la plaga. Asimismo, se observó una mayor voracidad en N. tenuis que en M. pygmaeus. En el segundo capítulo se estudió la depredación intragremial entre los depredadores M. pygmaeus y N. tenuis y de ellos sobre E. mundus. Se observó que, aunque la supervivencia de las ninfas de estos depredadores no disminuyó cuando coexistieron, sí disminuyó la depredación sobre la plaga. La depredación sobre el parasitoide fue elevada, aunque el parasitismo de E. mundus sobre B. tabaci no se vio significativamente afectado por la presencia de los depredadores. La mortalidad de B. tabaci causada por ambos depredadores y E. mundus resultó ser aditiva, y por ello posiblemente más eficaz para el control de la plaga. En el tercer capítulo se estudiaron los efectos letales y subletales de las interacciones conspecíficas (canibalismo) y heterospecíficas (depredación intragremial) de M. pygmaeus y N. tenuis. Las hembras de N. tenuis depredaron ninfas de segundo-tercer estadio de M. pygmaeus. Cuando coexistieron ninfas de M. pygmaeus y N. tenuis no se produjo depredación intragremial ni canibalismo, sugiriendo un comportamiento poco agresivo de las ninfas. Sin embargo, cuando coexistieron hembras de ambas especies se observó tanto canibalismo como depredación intragremial, generalmente asociadas a la ausencia de presa alternativa. Otros efectos asociados a esta interacción fueron una disminución de la descendencia de los depredadores cuando se encontraban a elevada densidad, tanto en la coexistencia conspecífica como en la heterospecífica, y mayores daños en planta causados por N. tenuis cuando coexistía con M. pygmaeus en ausencia de presa. Así pues, mientras que la coexistencia de depredadores y parasitoides no parece perjudicial para el control biológico, la coexistencia de los dos depredadores, M. pygmaeus y N. tenuis, sí puede llegar a serlo a densidades elevadas. Por ello, es recomendable determinar la abundancia de M. pygmaeus y N. tenuis al aplicar programas de control biológico basados en la conservación y/o la inoculación de estas dos especies, especialmente cuando el nivel de plaga sea bajo. / Knowledge of trophic relationships between natural enemies and their effect on the control of the pests is essential to obtain a suitable biological control in the crops. Two interactions, intraguild predation and cannibalism, can affect the success of biological control programs. Nowadays molecular techniques based on DNA detection are used in order to detect all prey developmental stages ingested by predators, and to detect parasitoids within their host, because the difficulty to identify young stages using traditional methods. This Thesis has focused on the trophic relationships between two important pests of tomato crop, the whiteflies Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum, its parasitoids Eretmocerus mundus and Encarsia pergandiella, and their predators Macrolophus pygmaeus and Nesidiocoris tenuis. The combination of direct observation and molecular methods has been used. In chapter 1 predation of M. pygmaeus and N. tenuis on B. tabaci, T. vaporariorum, E. mundus and E. pergandiella was studied under field conditions, observing that predators mainly preyed on whiteflies, but also on their parasitoids. In chapter 2 intraguild predation between M. pygmaeus, N. tenuis and E mundus was studied. A lower predation was observed on B. tabaci when both predators coexisted. There was also a high predation on E. mundus, although its parasitism on B. tabaci was not significantly affected. The mortality of B. tabaci caused by both predators and E. mundus was additive, and therefore more effective the pest control. In chapter 3 the effects of lethal and sublethal conspecific and heterospecific interactions (cannibalism and intraguild predation respectively) of M. pygmaeus and N. tenuis were studied. Nesidiocoris tenuis females preyed on the second-third stage of M. pygmaeus. When predator females coexisted, mortality was observed usually associated to the absence of alternative prey. A lower progeny was obtained as result of female coexistence at high density, as well as more N. tenuis damages in presence of M. pygmaeus. Therefore, the coexistence of M. pygmaeus and N. tenuis can affect biological control. It is therefore advisable to determine the abundance of both predators when biological control strategies based on these two predators should be applied, particularly if the pest level is low.

La soca EPS125 ha mostrat ser un efectiu agent de control biològic de diferents patògens fúngics de postcollita en diferents fruits. Degut a la seva elevada eficàcia, es va plantejar desenvolupar aquesta soca comercialment i per aquest motiu en el present treball es plantejà complementar la informació necessària pel seu registre. D'acord amb els resultats obtinguts mitjançant proves fenotípiques i genotípiques, la soca EPS125 queda inclosa dins l'espècie Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans-Erwinia herbicola). En relació a la utilització de fonts de carboni, en el perfil i contingut d'àcids grassos cel·lulars i en el polimorfisme en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica (MRFLP), la soca EPS125 mostrà trets característics que la diferencien d'altres soques. Els dos marcadors moleculars (125.2 i 125.3) específics per la soca EPS125 dissenyats en el present treball mostraren ser semiespecífics per la seva detecció mitjançant la tècnica PCR i Real Time PCR. Quedant pendent l'anàlisi d'especificitat de l'ús combinat dels dos marcadors moleculars en una reacció PCR multiplex. P. agglomerans EPS125 ha mostrat ser molt efectiva en el control de Penicillium expansum en poma amb una dosi efectiva mitjana de 2.7x105 a 7x105 ufc/ml, i una ratio de 25-101 cèl·lules de la soca EPS125 per inactivar una espora del patogen segons el model de saturació hiperbòlica. Segons les aproximacions fenotípiques i estudis genotípics realitzats, sembla que els mecanismes de biocontrol utilitzats per la soca EPS125 contra P. expansum en poma estan directament relacionats amb la capacitat de formació de biofilm per aquesta soca. / Strain EPS125 has shown effectiveness against a wide range of fungal pathogens in a large variety of fruit. However, to develop this strain as commercial biopesticide an extensive characterization is essential. For this reason, the objective of this PhD thesis was to complete the necessary information for its future registration.According to morphological and biochemical tests, strain EPS125 pertain to Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans-Erwinia herbicola) species. This strain showed typical traits different from other bacteria in relation to the ability to use several carbon sources, the fatty acid profiles and the macrorestriction fragment length polymorphism (MRFLP) pattern. The two DNA molecular markers of P. agglomerans EPS125 (125.2 and 125.3) obtained in the present work were semispecific in the detection of strain EPS125 by means of PCR and Real Time PCR. However, the combined use of the two primer sets in a multiplex PCR reaction would be specific. P. agglomerans EPS125 was highly effective against P. expansum in apple fruit having a median effective dose from 2.7x105 to 7x105 cfu/ml and a ratio of 101 and 25 EPS125 cells to inactivate one pathogen spore according to the hyperbolic saturation model. Biocontrol mechanisms used by P. agglomerans EPS125 against P. expansum in apple fruit may be related with the ability of biofilm formation by this strain as show phenotypic approaches and genotypic studies.