1. Aufgrund der Resultate mit der Mutante MM10, die trotz Disulfidbrücke noch unverminderte Aktivität und Rotation zeigte, wurde der Frage nachgegangen, ob der EF1-Komplex in der Lage ist, die Rotation durch einen Bruch der alpha-helikalen Struktur von gamma oder durch Rotation um eine Einfachbindung der Disulfidbrücke aufrechtzuerhalten. Quervernetzungen vom Hexagon mit gamma in der Mitte und am unteren Ende konnten das Enzym blockieren. Von den vier betrachteten Mutanten KG11, MM26, MM25 und MM24 fiel der MM26 bereits nach der Isolierung raus. Der MM25 wies nicht mehr als 70% Quervernetzung auf. Bei dem KG11 und dem MM24 konnte jedoch eine 99%-ige Quervernetzung nachgewiesen werden. Mit diesen zwei Cystein-Doppelmutanten wurden weitere Quervernetzungen gefunden, die ebenso wie der MM10 aktiv nach Oxidation sind, aber tiefer im Enzym liegen und die ATP-Hydrolyse trotz Blockade durch Quervernetzung aufrecht erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass eine Rotation um die Einzelbindungen innerhalb der Disulfidbrücke unwahrscheinlich ist, und daher die Aktivität des quervernetzten Enzyms nur durch eine Aufwindung der gamma-Helix erklärt werden kann. 2. Die Voraussetzung für ein EFOF1-Kostrukt zum optischen Nachweis der Relativrotation unter Synthesebedingungen war der Einbau von zwei verschiedenen Tags zur spezifischen Bindung. Von den vier Mutanten SE3, SE4, SW7 und WH1 zeigten die beiden SE-Mutanten keine Stabilität bei der Isolierung im Bezug auf die Kopplung zwischen FO- und F1-Teil. Mit dem SW7-EFOF1 wurde eine Mutante gefunden, die mit einer guten Aktivitäts- und Rotationsausbeute nach einer Aufreinigung mittels Streptactin-Affinitätchromatographie durch ihre Stabilität als Ausgangspunkt für das Rotationsexperiment unter ATP-Synthese dienen kann. Der WH1, dessen atp-Operon dem des SW7 gleicht, brachte trotz seines veränderten Vektorursprungs keine Verbesserung.

Regulation of size and growth is a fundamental problem in biology and often closely related to functionality and fitness. A prominent example is the mitotic spindle, whose size needs to be perfectly tuned to ensure proper chromosome segregation during cell division. It is known that spindle size generally scales with cell volume, most likely as a result of limiting components. However, this relation breaks down in very large cells where spindles have a maximum size. How the size and microtubule mass are set and why spindles show an upper size limit in large cells is still not understood. Spindles mainly consist of highly dynamic short microtubules that turn over very quickly in comparison to the lifetime of the entire structure. Thus, microtubules need to be constantly created throughout the spindle, a process called nucleation. Understanding the role of microtubule nucleation in setting the size of spindles is limited by the fact that little is known about the rate, distribution, and regulation of microtubule nucleation in these structures. This is partly due to the lack of methods to measure microtubule nucleation in spindles. During this work, I developed an assay based on laser ablation to probe microtubule nucleation in monopolar spindles assembled in Xenopus laevis egg extract. Using this new method in combination with quantitative microscopy, I found that microtubule nucleation in these structures is spatially regulated. Furthermore, I observed that nucleation is stimulated by pre-existing microtubules leading to new microtubule growth in their physical proximity. Combining my experimental results on nucleation with theory and further biochemical perturbations, I show that this autocatalytic nucleation mechanism is limited by the availability of active nucleators. In spindles, the amount of active nucleators decreases with distance from the chromosomes. Thus, this mechanism provides an upper limit to spindle size even when resources are not limiting.

Mechano-chemical processes in biological systems play an important role during the morphogenesis of cells and tissues. In particular, they are responsible for the dynamic organisation of active stress, which itself results from non-equilibrium processes and leads to flows and deformations of material. The generation of active stress often occurs in thin biological structures, such as the cellular cortex or epithelial tissues, which motivates the theoretical concept of an active surface. In this thesis, we study the dynamics of curved and deforming active surfaces. More specifically, we are interested in the dynamics of mechano-chemical processes on these surfaces, as well as in their interaction with the surface shape and external forces. To study the interplay of mechano-chemical processes with shape changes of the material, we consider the fully self-organised shape dynamics using the theory of active fluids on deforming surfaces. We then develop a numerical approach to solve the corresponding force and torque balance equations. We further examine how the stability of surface shapes is affected by mechano-chemical processes. We show that the tight coupling between chemical processes and surface mechanics gives rise to the spontaneous generation of specific surface shapes, to shape oscillations and to directed surface flows that resemble peristaltic motion. In the following part, we explore the mechano-chemical self-organisation of active fluids on fixed surfaces, focussing on mechanical interactions with surrounding material. We introduce a description in which active surface flows set a surrounding passive fluid into motion. We then study two scenarios. First, inspired by the cellular cortex and its interactions with the cytoplasm, we consider a fluid that is enclosed by the surface. We find that mechanical interactions with the surrounding passive fluid enable an isotropic active surface to spontaneously generate patterns with polar asymmetry and to form a contractile ring in a fully self-organised fashion. Second, we consider the case where the passive fluid surrounds the active surface on the outside. This description leads to the model of a microswimmer, which is characterised by an onset of motion due to spontaneous symmetry breaking on the active surface. Most biological materials are viscoelastic, such that they show viscous and elastic responses if mechanical stress is applied on different time scales. In the final part of this thesis, we therefore consider a surface whose response to self-organised active stress is described by a Maxwell model. We identify a minimal time scale for the relaxation of elastic stress, beyond which spatio-temporal, mechano-chemical oscillations on the surface can spontaneously emerge. In summary, we identify and characterise in this thesis various processes that result from the self-organisation of active surfaces. The underlying coupling between surface mechanics and a chemical organisation of stress in the material represents a key feature of morphogenetic processes in biology. Furthermore, we develop several numerical approaches that will enable to study alternative constitutive relations of active surfaces in the future. Overall, we contribute theoretical insights and numerical tools to further the understanding of the emerging spatial organisation and shape generation of active surfaces. / Mechanochemische Prozesse spielen eine wichtige Rolle für die Morphogenese von biologischen Zellen und Geweben. Sie sind insbesondere verantwortlich für die dynamische Organisation von aktiver mechanischer Spannung, welche Nicht-Gleichgewichtsprozessen entstammt und zu Flüssen und Verformungen von Material führt. Aktive mechanische Spannung wird häufig in dünnen biologischen Strukturen erzeugt, wie zum Beispiel dem Zellkortex oder dem Epithelgewebe, was die Einführung von aktiven Flächen als theoretisches Konzept motiviert. In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir die Dynamik von gekrümmten und sich verformenden aktiven Flächen. Dabei interessieren wir uns insbesondere für die Dynamik mechanochemischer Prozesse auf diesen Flächen, sowie für deren Wechselwirkung mit der Flächenform und externen Kräften. Zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen mechanochemischen Prozessen und Flächenverformungen nutzen wir die hydrodynamische Theorie aktiver Fluide auf sich verformenden Flächen und betrachten eine vollständig selbstorganisierte Flächendynamik. Wir entwickeln eine Methode zur Bestimmung numerischer Lösungen des Kräfte- und Drehmomentgleichgewichts auf Flächen und untersuchen wie die Stabilität von Flächenformen durch mechanochemische Prozesse beeinflusst wird. Wir zeigen, dass die enge Kopplung zwischen chemischen Prozessen und der Mechanik von Flächen zur spontanen Erzeugung spezifischer Formen, zu Formoszillationen und zu gerichteten Flüssen führt, welche eine peristaltische Bewegung nachbilden. Im Folgenden untersuchen wir die mechanochemische Selbstorganisation aktiver Fluide auf festen Flächen und betrachten mechanische Wechselwirkungen mit umgebendem Material. Dazu beschreiben wir ein umgebendes passives Fluid, welches durch aktive Flüsse auf der Fläche in Bewegung versetzt wird. Im Rahmen dieser Beschreibung untersuchen wir zwei Szenarien. Inspiriert durch die Wechselwirkung des Zellkortex mit dem Zytoplasma, betrachten wir zuerst ein Fluid, welches durch die Fläche eingeschlossen wird. Wir zeigen, dass die mechanische Wechselwirkung einer isotropen, aktiven Fläche mit dem umgebenden Fluid es ermöglicht, Muster mit einer polaren Asymmetrie, sowie einen kontraktilen Ring spontan und selbstorganisiert zu bilden. Danach betrachten wir ein passives Fluid, welches die Fläche außen umgibt. Diese Beschreibung führt zu einem Modell für einen Mikroschwimmer, welcher durch eine spontane Symmetriebrechung auf der aktiven Fläche beginnt sich durch das passive Fluid zu bewegen. Die meisten biologischen Materialien verhalten sich viskoelastisch, sodass deren mechanische Antwort je nach Zeitskala einer applizierten mechanischen Spannung viskos und elastisch ausfallen kann. Im abschließenden Teil dieser Arbeit betrachten wir daher eine Fläche, deren mechanische Antwort auf aktive Spannung durch ein Maxwell-Modell beschrieben wird. Wir bestimmen eine minimale Zeitskala für die Relaxation von elastischer Spannung, welche das spontane Einsetzen räumlich-zeitlicher Oszillationen aktiver mechanischer Spannung kennzeichnet. Zusammengefasst identifizieren und charakterisieren wir in dieser Arbeit eine Reihe von Prozessen, welche der Selbstorganisation aktiver Flächen entspringen. Die zugrundeliegende Kopplung zwischen der Mechanik von Flächen und einer chemischen Organisation aktiver mechanischer Spannung stellen ein Schlüsselprinzip morphogenetischer Vorgänge in der Biologie dar. Zusätzlich entwickeln wir eine Reihe numerischer Methoden, welche es in Zukunft erlauben weitere Beschreibungen aktiver Flächen zu untersuchen. Damit trägt diese Arbeit neue theoretische Einsichten und numerische Algorithmen zur Verbesserung des Verständnisses der emergenten räumlichen Organisation und Formerzeugung aktiver Flächen bei.

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Die Proteinfaltung ist ein Prozess der molekularen Selbstorganisation, bei dem sich eine lineare Kette von Aminosäuren zu einer definierten, funktionellen dreidimensionalen Struktur zusammensetzt. Der Prozess der Faltung ist ein thermisch getriebener diffusiver Prozess durch eine Gibbs-Energie-Landschaft im Konformationsraum für die Struktur der minimalen Energie. Während dieses Prozesses zeigt die freie Enthalpie des Systems nicht immer eine monotone Abnahme; stattdessen führt eine suboptimale Kompensation der Enthalpie- und der Entropieänderung während jedes Faltungsschrittes zur Bildung von Freien-Enthalpie-Faltungsbarrieren. Diese Barrieren und damit verbundenen hochenergetischen Übergangszustände, die wichtige Informationen über Mechanismen der Proteinfaltung enthalten, sind jedoch kinetisch unzugänglich. Um den Prozess der Barrierebildung und die strukturellen Merkmale von Übergangszuständen aufzudecken, werden Proteine genutzt, die über barrierefreie Pfade falten – so genannte “downhill folder“. Aufgrund der geringen Faltungsbarrieren werden wichtige Interaktionen der Faltung zugänglich und erlauben Einblicke in die ratenbegrenzenden Faltungsvorgänge. In dieser Arbeit vergleichen wir die Faltungsdynamiken von drei verschiedenen Varianten eines Lambda-Repressor-Fragments, bestehend aus den Aminosäuren 6 bis 85: ein Zwei-Zustands-Falter λWT (Y22W) und zwei downhill-folder-artige Varianten, λYA (Y22W/Q33Y/ G46,48A) und λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). Um auf die Kinetik und die strukturelle Dynamik zu greifen zu können, werden Einzelmolekülkraftspektroskopische Experimente mit optische Pinzetten mit Submillisekunden- und Nanometer-Auflösung verwendet. Ich fand, dass die niedrige denaturierende Kraft die Mikrosekunden Faltungskinetik von downhill foldern auf eine Millisekunden-Zeitskala verlangsamt, sodass das System für Einzelmolekülstudien gut zugänglich ist. Interessanterweise zeigten sich unter Krafteinwirkung die downhill-folder-artigen Varianten des Lambda-Repressors als kooperative Zwei-Zustands-Falter mit deutlich unterschiedlicher Faltungskinetik und Kraftabhängigkeit. Drei Varianten des Proteins zeigten ein hoch konformes Verhalten unter Last. Die modellfreie Rekonstruktion von Freien-Enthalpie-Landschaften ermöglichte es uns, die feinen Details der Transformation des Zwei-Zustands-Faltungspfad direkt in einen downhill-artigen Pfad aufzulösen. Die Auswirkungen von einzelnen Mutationen auf die Proteinstabilität, Bildung der Übergangszustände und die konformationelle Heterogenität der Faltungs- und Entfaltungszustände konnten beobachtet werden. Interessanterweise zeigen unsere Ergebnisse, dass sich die untersuchten Varianten trotz der ultraschnellen Faltungszeit im Bereich von 2 μs in einem kooperativen Prozess über verbleibende Energiebarrieren falten und entfalten, was darauf hindeutet, dass wesentlich schnellere Faltungsraten notwendig sind um ein downhill Limit vollständig zu erreichen.:I Theoretical background 1 1 Introduction 3 2 Protein folding: the downhill scenario 5 2.1 Protein folding as a diffusion on a multidimensional energy landscape 5 2.2 Downhill folding proteins 7 2.2.1 Thermodynamic description of downhill folders 7 2.2.2 Identification criteria for downhill folders 8 2.3 Lambda repressor as a model system for studying downhill folding 9 2.3.1 Wild-type lambda repressor fragment λ{6-85} 10 2.3.2 Acceleration of λ{6-85} folding by specifific point mutations 11 2.3.3 The incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 14 2.4 Single-molecule techniques as a promising tool for probing downhill folding dynamics 17 3 Single-molecule protein folding with optical tweezers 19 3.1 Optical tweezers 19 3.1.1 Working principle of optical tweezers 19 3.1.2 The optical tweezers setup 21 3.2 The dumbbell assay 22 3.3 Measurement protocols 23 3.3.1 Constant-velocity experiments 23 3.3.2 Constant-trap-distance experiments (equilibrium experiments) 24 4 Theory and analysis of single-molecule trajectories 27 4.1 Polymer elasticity models 27 4.2 Equilibrium free energies of protein folding in optical tweezers 28 4.3 Signal-pair correlation analysis 29 4.4 Force dependence of transition rate constants 29 4.4.1 Zero-load extrapolation of rates: the Berkemeier-Schlierf model 30 4.4.2 Detailed balance for unfolding and refolding data 31 4.5 Direct measurement of the energy landscape via deconvolution 32 II Results 33 5 Efficient strategy for protein-DNA hybrid formation 35 5.1 Currently available strategies for protein-DNA hybrid formation 35 5.2 Novel assembly of protein-DNA hybrids based on copper-free click chemistry 37 5.3 Click-chemistry based assembly preserves the native protein structure 40 5.4 Summary 42 6 Non-equilibrium mechanical unfolding and refolding of lambda repressor variants 45 6.1 Non-equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor λWT 45 6.2 Non-equilibrium unfolding and refolding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 48 6.3 Summary 52 7 Equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor variants 53 7.1 Importance of the trap stiffness to resolve low-force nanometer transitions 54 7.2 Signal pair-correlation analysis to achieve millisecond transitions 56 7.3 Force-dependent equilibrium kinetics of λWT 59 7.4 Equilibrium folding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 61 7.5 Summary 65 8 Model-free energy landscape reconstruction for λWT, incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 69 8.1 Direct observation of the effect of a single mutation on the conformational heterogeneity and protein stability 71 8.2 Artifacts of barrier-height determination during deconvolution 75 8.3 Summary 76 9 Conclusions and Outlook 79 / Protein folding is a process of molecular self-assembly in which a linear chain of amino acids assembles into a defined, functional three-dimensional structure. The process of folding is a thermally driven diffusive search on a free-energy landscape in the conformational space for the minimal-energy structure. During that process, the free energy of the system does not always show a monotonic decrease; instead, sub-optimal compensation of enthalpy and entropy change during each folding step leads to formation of folding free-energy barriers. However, these barriers, and associated high-energy transition states, that contain key information about mechanisms of protein folding, are kinetically inaccessible. To reveal the barrier-formation process and structural characteristics of transition states, proteins are employed that fold via barrierless paths – so-called downhill folders. Due to the low folding barriers, the key folding interactions become accessible, yielding insights about the rate-limiting folding events. Here, I compared the folding dynamics of three different variants of a lambda repressor fragment, containing amino acids 6 to 85: a two-state folder λWT (Y22W) and two downhill-like folding variants, λYA (Y22W/Q33Y/G46,48A) and λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). To access the kinetics and structural dynamics, single-molecule optical tweezers with submillisecond and nanometer resolution are used. I found that force perturbation slowed down the microsecond kinetics of downhill folders to a millisecond time-scale, making it accessible to single-molecule studies. Interestingly, under load, the downhill-like variants of lambda repressor appeared as cooperative two-state folders with significantly different folding kinetics and force dependence. The three protein variants displayed a highly compliant behaviour under load. Model-free reconstruction of free-energy landscapes allowed us to directly resolve the fine details of the transformation of the two-state folding path into a downhill-like path. The effect of single mutations on protein stability, transition state formation and conformational heterogeneity of folding and unfolding states was observed. Noteworthy, our results demonstrate, that despite the ultrafast folding time in a range of 2 µs, the studied variants fold and unfold in a cooperative process via residual barriers, suggesting that much faster folding rate constants are required to reach the full-downhill limit.:I Theoretical background 1 1 Introduction 3 2 Protein folding: the downhill scenario 5 2.1 Protein folding as a diffusion on a multidimensional energy landscape 5 2.2 Downhill folding proteins 7 2.2.1 Thermodynamic description of downhill folders 7 2.2.2 Identification criteria for downhill folders 8 2.3 Lambda repressor as a model system for studying downhill folding 9 2.3.1 Wild-type lambda repressor fragment λ{6-85} 10 2.3.2 Acceleration of λ{6-85} folding by specifific point mutations 11 2.3.3 The incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 14 2.4 Single-molecule techniques as a promising tool for probing downhill folding dynamics 17 3 Single-molecule protein folding with optical tweezers 19 3.1 Optical tweezers 19 3.1.1 Working principle of optical tweezers 19 3.1.2 The optical tweezers setup 21 3.2 The dumbbell assay 22 3.3 Measurement protocols 23 3.3.1 Constant-velocity experiments 23 3.3.2 Constant-trap-distance experiments (equilibrium experiments) 24 4 Theory and analysis of single-molecule trajectories 27 4.1 Polymer elasticity models 27 4.2 Equilibrium free energies of protein folding in optical tweezers 28 4.3 Signal-pair correlation analysis 29 4.4 Force dependence of transition rate constants 29 4.4.1 Zero-load extrapolation of rates: the Berkemeier-Schlierf model 30 4.4.2 Detailed balance for unfolding and refolding data 31 4.5 Direct measurement of the energy landscape via deconvolution 32 II Results 33 5 Efficient strategy for protein-DNA hybrid formation 35 5.1 Currently available strategies for protein-DNA hybrid formation 35 5.2 Novel assembly of protein-DNA hybrids based on copper-free click chemistry 37 5.3 Click-chemistry based assembly preserves the native protein structure 40 5.4 Summary 42 6 Non-equilibrium mechanical unfolding and refolding of lambda repressor variants 45 6.1 Non-equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor λWT 45 6.2 Non-equilibrium unfolding and refolding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 48 6.3 Summary 52 7 Equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor variants 53 7.1 Importance of the trap stiffness to resolve low-force nanometer transitions 54 7.2 Signal pair-correlation analysis to achieve millisecond transitions 56 7.3 Force-dependent equilibrium kinetics of λWT 59 7.4 Equilibrium folding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 61 7.5 Summary 65 8 Model-free energy landscape reconstruction for λWT, incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 69 8.1 Direct observation of the effect of a single mutation on the conformational heterogeneity and protein stability 71 8.2 Artifacts of barrier-height determination during deconvolution 75 8.3 Summary 76 9 Conclusions and Outlook 79

Calcium imaging has been used as a promising technique to monitor the dynamic activity of neuronal populations. However, the calcium trace is temporally smeared which restricts the extraction of quantities of interest such as spike trains of individual neurons. To address this issue, spike reconstruction algorithms have been introduced. One limitation of such reconstructions is that the underlying models are not informed about the biophysics of spike and burst generations. Such existing prior knowledge might be useful for constraining the possible solutions of spikes. Here we describe, in a novel Bayesian approach, how principled knowledge about neuronal dynamics can be employed to infer biophysical variables and parameters from fluorescence traces. By using both synthetic and in vitro recorded fluorescence traces, we demonstrate that the new approach is able to reconstruct different repetitive spiking and/or bursting patterns with accurate single spike resolution. Furthermore, we show that the high inference precision of the new approach is preserved even if the fluorescence trace is rather noisy or if the fluorescence transients show slow rise kinetics lasting several hundred milliseconds, and inhomogeneous rise and decay times. In addition, we discuss the use of the new approach for inferring parameter changes, e.g. due to a pharmacological intervention, as well as for inferring complex characteristics of immature neuronal circuits.

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Rhodopsin ist der Photorezeptor der Stäbchenzellen in der Retina von Vertebraten und wird als Prototyp für die gesamte Gruppe der GPCRs beforscht. Trifft ein Photon auf das Protein, so wird der über eine Schiffbase kovalent gebundene Chromophor von seiner 11-cis- in die All-trans-Konfiguration isomerisiert und setzt infolgedessen den Aktivierungsprozess in Gang. Dieser mündet in der aktiven Rezeptorkonformation, die das G-Protein Transducin aktivieren kann und dadurch eine Kaskade weiterer Aktivierungsschritten einleitet, die letztlich ein Nervensignal verursachen. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der späten Aktivierungsschritte und ihrer Ursache-Wirkungs-Beziehungen. Zu diesem Zweck wurden Blitzlichtphotolyse, Elektronenspinresonanz (EPR) mit Spinlabeling (SDSL), UV/vis-Spektroskopie, FTIR-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie angewandt. Kinetische Messungen wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, um die Abfolge der mit den unterschiedlichen Techniken zugänglichen Aktivierungsschritte aufzuklären. Nach der Bildung des absorptionsspektroskopisch definierten Meta-II-Zustands bewegt sich die Helix TM6 in einem späteren Schritt als ganzes nach außen und markiert damit den Übergang von Meta-IIa zu Meta-IIb. Dadurch wird die bis dahin in der Membran verborgene D(E)RY-Region für das Umgebungsmedium zugänglich und nimmt ohne Zeitverzögerung ein Proton auf, wodurch der Meta-IIb*H+-Zustand gebildet wird. Die verfügbaren Daten sprechen dafür, dass das D(E)RY-Motiv bei der Aktivierung des Transducins sowohl die Alpha- als auch die Gamma-Untereinheit desselben bindet. Die Bindung von zu Transducin-Abschnitten analogen Peptiden kann dann erfolgen, wenn die Helix TM6 im nach außen bewegten Zustand ist, und führt zur Abgabe von bis zu zwei Protonen vom aktivierten Rhodopsin. Sowohl das D(E)RY- und das NPxxY(x)5,6F-Motiv als auch die beiden Zustände Meta-IIb und Meta-IIb*H+ könnten relevant für den sequenziellen Transducin-Aktivierungsmechanismus sein. / Rhodopsin is the photoreceptor in the rod cells of the vertebrate retina. It is considered as a prototype of the whole group of GPCRs. Upon absorption of a photon the chromophore, which is covalently bound through a Schiff base, is isomerized from its 11-cis into the all-trans configuration. This initiates the activation process and finally results in the active receptor conformation which is capable of activating the G protein transducin and thereby triggers a cascade of further activation steps which finally cause a nerve signal. The aim of this work was the clarification of the late activation steps and their cause-and-effect chain. For this purpose flash photolysis, electron paramagnetic resonance (EPR) with spin labeling (SDSL), UV/vis spectroscopy, FTIR spectroscopy and fluorescence spectroscopy were applied. Kinetic measurements were executed under identical conditions in order to elucidate the sequence of activation steps, which are accessible with the different techniques. After formation of the spectroscopically defined Meta-II state helix TM6 moves outward as a rigid body, thereby marking the transition from Meta-IIa to Meta-IIb. Therefore the D(E)RY region, which is until then buried in the membrane, gets accessible to the surrounding solution. It consequently takes up a proton without delay, thus forming the Meta-IIb*H+ state. Available data argue for the D(E)RY motif binding both the Alpha and the Gamma subunit of transducin during activation of the latter. The binding of peptides which are analogous to sections of transducin is possible when helix TM6 is in the outward position. It causes the release of up to two protons from the activated rhodopsin. Both the D(E)RY motif and the NPxxY(x)5,6F motif as well as both the states Meta-IIb and Meta-IIb*H+ are potentially relevant for the sequential transducin activation mechanism.