Die F-ATP-Synthase nutzt die elektrochemische Differenz des Protons über eine Membran zur Synthese von ATP. Sie setzt sich aus dem katalytisch aktiven F1-Teil und dem membranständigen FO-Teil zusammen. In FO wird durch die protonenmotorische Kraft (pmf) ein Drehmoment erzeugt, das zur Synthese von ATP in den 3 katalytischen Untereinheiten genutzt wird. Mechanisch gesehen besteht das Motorenzym aus einem Rotor, der sich gegen einen Stator dreht. Ein an FO gekoppeltes Actinfilament diente als Reporter für die Orientierung und Biegsamkeit der Rotoruntereinheiten. Das molekulare Koordinatensystem, gewonnen aus der Kristallstruktur der mitochondrialen F-ATP-Synthase, wurde mit den Koordinatensystem des aktiven Enzyms aus E. coli korreliert. Das ATP hydrolysierende Enzym wartet auf die Bindung von ATP, gefolgt von einem 80°-Schritt. Anschließend wird während des katalytischen Wartezustands ATP hydrolysiert, gefolgt von einem 40°-Schritt. Mittels einer Disulfidbrücke zwischen Rotor und Stator wurde das aktive Enzym in einer Orientierung festgehalten, die der Kristallstruktur entspricht. Diese Orientierung stimmt mit der Stellung des aktiven Enzyms sowohl im katalytischen Wartezustand als auch im ADP-inhibierten Zustand überein. In der Kristallstruktur sind 2 katalytische Zentren mit Nukleotiden besetzt. Dagegen sind im aktiven Enzym während der katalytischen Pause alle 3 katalytischen Zentren besetzt. Durch Schließen von Disulfidbrücken zwischen Rotor und Stator wurden die inneren Elastizitätsparameter des inhibierten und elastisch relaxierten Enzyms anhand des Ausschlags des Actinfilaments bestimmt. Der elastisch biegsame Bereich liegt zwischen den Angriffspunkten der thermodynamischen Kräft, d.h. der pmf in FO und dem Phophatpotential in F1. Die Energie des Drehmoments wird in den Rotoruntereinheiten elastisch gespeichert und anschließend für die Synthese von ATP genutzt. Die elastische Kopplung sorgt für eine hohe kinetische Effizienz und eine hohe Umsatzrate.

Colicin A is a water-soluble toxin that forms a voltage-gated channel in the cytoplasmic membrane of target bacteria. In the present thesis, we aimed at studying the closed channel state, the membrane insertion mechanism, the acidic pH induced molten globule state and the interaction of colicin A in living E. coli cells. For that, we used Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy in combination with site-directed spin labeling (SDSL) method to explore the structural details of colicin A. The EPR studies of the membrane-bound colicin A (reconstituted into proteoliposomes) suggest the transmembrane orientation of the hydrophobic hairpin in the closed channel state. The pH dependent membrane insertion studies indicate that the membrane binding efficiency is significantly enhanced at pH < 3. Moreover, in the presence of a membrane potential, the pH induced membrane-bound state is able to open channels in the liposomes. The membrane-bound conformation (induced by acidic pH) is similar to the conformation of reconstituted colicin A which support the umbrella model for the closed channel state of colicin A. The studies on pH dependent conformational changes suggest that colicin A forms a molten globule at pH 2. The molecular details of pH induced conformational changes were analyzed by molecular dynamic simulations. The results of the MD simulations agree with the EPR results. Conformational changes of colicin A upon interaction with living E. coli cells could also be followed. Comparison between colicin A in wild type (WT) cells and tolB knock-out mutants suggest that the observed conformational changes originate from colicin A which has been already translocated to the inner membrane.

In this work 3 different proteins are subjected to investigations on their structural, dynamic and functional properties by SDSL EPR spectroscopy, combined with in silico structure prediction and modeling: the pore-forming bacterial toxin colicin A in its membrane-bound form and its corresponding immunity protein Cai, and the Na+/proline symporter PutP. Colicin A (ColA) is a plasmid-encoded water-soluble pore-forming toxin produced by certain E. coli strains that kills unprotected cells of related strains by inserting a pore-forming subdomain into the cytoplasmic membrane to form voltage-dependent ion channels. Detailed structural data for the membrane-bound channel, in the closed as well as in the open state, is still missing, thus in the present study, the in vitro investigation by site-directed spin labeling and EPR spectroscopy has been substantially extended. The results indicate that a larger fraction of the protein than previously suggested penetrates into the hydrophobic core of the membrane, and distance measurements by pulse and cw EPR spectroscopy provide evidence that ColA in lipid bilayer membranes forms an oligomeric structure. Pulse EPR distance measurements under in vivo conditions reveal clear indications for an oligomeric ColA structure also in vivo. The results of all EPR measurements were combined to construct a dimer model for the colicin A closed channel state conformation. The immunity protein Cai, an integral inner membrane protein, protects the producing E. coli cell from the cytotoxic activity of its corresponding toxin (colicin A), by preventing channel opening by a yet unknown mechanism. ESR measurements for single spin label probes attached to ColA in the presence and absence of the immunity protein Cai reveal a clear influence on the ColA helices of the pore-forming domain in the presence of Cai as previously postulated. The data suggest that Cai induces a conformational change in/for the voltage sensor helix H6 of ColA, forming a “locked” inactive channel conformation that is not capable of voltage sensing and channel opening. Initial experiments with spin labeled wt-Cai in the presence and absence of unlabeled ColA suggest a more compact structure in the presence of ColA. PutP is an integral membrane protein located in the cytoplasmic membrane of E. coli, being responsible for the coupled transport of Na+ and proline in a 1:1 stoichiometry. It belongs to the family of sodium solute symporters (SSSF). Three dimensional structural data for PutP are at the moment not available, but a homology model has been developed based on the crystal structure of another member of this protein family, the Na+/galactose symporter vSGLT of Vibrio parahaemolyticus. The observed periodicity in spin label mobility and polarity measurements suggest a secondary structure of the extracellular Loop eL4 of PutP of two α-helical segments eL4a and eL4b, and imply the idea of eL4 functioning as an external gate to the SSSF. The ligand-induced changes observed in mobility, polarity and accessibility upon substrate binding support this notion, thus providing further insights into the mechanistic basis of sodium solute symport.

In this work, the evolutionary biophysics approach is applied to the two of the largest protein superfamilies present in human genomes, namely P-loop fold nucleoside triphosphatases (P-loop NTPases) and G-protein coupled receptors (GPCRs). This approach combines comparative analysis of protein structures and sequences with molecular modeling techniques in order to reveal not only the conservation of particular residues among proteins within each superfamily but also their role in the fundamental mechanisms underlying common functions. The study of the hydrolysis activation mechanism in P-loop NTPases started with the molecular dynamics simulations of Mg-NTP complexes (Mg-ATP and Mg-GTP) in the presence of K+, NH4+, and Na+ ions. These simulations showed that in the presence of large cations (K+ and NH4+), the conformation of the phosphate chain of ATP and GTP is extended, with large distances between alpha- and gamma-phosphates. This conformation is similar to the shape of ATP and GTP molecules (or their analogs) in the crystal structures of various P-loop NTPases. To clarify the role of monovalent cations in P-loop NTPases, MD simulations were conducted for two cation-dependent GTPases: tRNA modification GTPase MnmE and translation factor EF-Tu. MD simulations of Mg-GTP/EF-Tu complex bound to the tRNA and ribosome fragment in the presence of K+ ions have shown consistent binding of a potassium ion from the solution between alpha- and gamma-phosphates (AG site), similar to the cation binding in MnmE and other cation-dependent P-loop GTPases. In both proteins, binding of K+ ion in the AG site led to the rotation of gamma-phosphate, making this group more eclipsed with alpha-phosphate. The new rotated position of gamma-phosphate was stabilized by a novel H-bond with the backbone nitrogen of the K-3 residue (relative to the ubiquitously conserved Lys) of the P-loop motif. The activation mechanism observed in MD simulations of MnmE and EF-Tu could be envisioned as basic for P-loop NTPases, as these cation-dependent proteins are among the most ancient members of the P-loop superfamily. This mechanism was used as a basis for extensive comparative analysis of representative proteins from all major classes of P-loop NTPases. Based on the established conservation and presence of the key features in active sites of P-loop NTPases, the chain of events where rotation of gamma-phosphate triggers the nucleophilic attack and gamma-phosphate cleavage has been proposed as the basic universal activation mechanism of NTP hydrolysis in P-loop NTPases. The second part of this work explores the activation of GPCRs as sodium-translocating receptors. Crystal structures of the novel Na-pumping microbial rhodopsin along with the recent avalanche of GPCR structures provided the basis for comparative structure analysis, focused on investigating the similarities in the Na-binding sites of the two superfamilies. Structure superposition of GPCRs and microbial rhodopsins (MRs) based on comparison of their Na-binding sites was used to produce structure-guided sequence alignments of the two superfamilies. The only residue universally conserved between the two superfamilies was Trp in the helix 6/F (Trp6.48 in GPCRs). In both families, the signaling mechanism directly involves this residue, which is likely to be an ancient feature inherited from the common ancestor of MRs and GPCRs – the Na-pumping light-activated rhodopsin. The similarity of GPCRs with light-activated sodium pumps endorses the suggestion that GPCRs may also function as Na+ ion translocators. A model of GPCR activation accompanied by translocation of Na+ was constructed to demonstrate how this mechanism can explain the voltage sensitivity of certain Class A GPCRs. Two modes of activation were modeled – one where Na+ ion is transported into the cytoplasm and the one where Na+ ion is expelled to the intracellular space. The two modes quantitatively describe the behavior of voltage-activated and voltage-suppressed GPCRs, respectively. Finally, further structure scrutiny and rotamer analysis provided a plausible pathway of Na+ transmembrane translocation through the helical bundle of GPCRs.

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Die Proteinfaltung ist ein Prozess der molekularen Selbstorganisation, bei dem sich eine lineare Kette von Aminosäuren zu einer definierten, funktionellen dreidimensionalen Struktur zusammensetzt. Der Prozess der Faltung ist ein thermisch getriebener diffusiver Prozess durch eine Gibbs-Energie-Landschaft im Konformationsraum für die Struktur der minimalen Energie. Während dieses Prozesses zeigt die freie Enthalpie des Systems nicht immer eine monotone Abnahme; stattdessen führt eine suboptimale Kompensation der Enthalpie- und der Entropieänderung während jedes Faltungsschrittes zur Bildung von Freien-Enthalpie-Faltungsbarrieren. Diese Barrieren und damit verbundenen hochenergetischen Übergangszustände, die wichtige Informationen über Mechanismen der Proteinfaltung enthalten, sind jedoch kinetisch unzugänglich. Um den Prozess der Barrierebildung und die strukturellen Merkmale von Übergangszuständen aufzudecken, werden Proteine genutzt, die über barrierefreie Pfade falten – so genannte “downhill folder“. Aufgrund der geringen Faltungsbarrieren werden wichtige Interaktionen der Faltung zugänglich und erlauben Einblicke in die ratenbegrenzenden Faltungsvorgänge. In dieser Arbeit vergleichen wir die Faltungsdynamiken von drei verschiedenen Varianten eines Lambda-Repressor-Fragments, bestehend aus den Aminosäuren 6 bis 85: ein Zwei-Zustands-Falter λWT (Y22W) und zwei downhill-folder-artige Varianten, λYA (Y22W/Q33Y/ G46,48A) und λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). Um auf die Kinetik und die strukturelle Dynamik zu greifen zu können, werden Einzelmolekülkraftspektroskopische Experimente mit optische Pinzetten mit Submillisekunden- und Nanometer-Auflösung verwendet. Ich fand, dass die niedrige denaturierende Kraft die Mikrosekunden Faltungskinetik von downhill foldern auf eine Millisekunden-Zeitskala verlangsamt, sodass das System für Einzelmolekülstudien gut zugänglich ist. Interessanterweise zeigten sich unter Krafteinwirkung die downhill-folder-artigen Varianten des Lambda-Repressors als kooperative Zwei-Zustands-Falter mit deutlich unterschiedlicher Faltungskinetik und Kraftabhängigkeit. Drei Varianten des Proteins zeigten ein hoch konformes Verhalten unter Last. Die modellfreie Rekonstruktion von Freien-Enthalpie-Landschaften ermöglichte es uns, die feinen Details der Transformation des Zwei-Zustands-Faltungspfad direkt in einen downhill-artigen Pfad aufzulösen. Die Auswirkungen von einzelnen Mutationen auf die Proteinstabilität, Bildung der Übergangszustände und die konformationelle Heterogenität der Faltungs- und Entfaltungszustände konnten beobachtet werden. Interessanterweise zeigen unsere Ergebnisse, dass sich die untersuchten Varianten trotz der ultraschnellen Faltungszeit im Bereich von 2 μs in einem kooperativen Prozess über verbleibende Energiebarrieren falten und entfalten, was darauf hindeutet, dass wesentlich schnellere Faltungsraten notwendig sind um ein downhill Limit vollständig zu erreichen. / Protein folding is a process of molecular self-assembly in which a linear chain of amino acids assembles into a defined, functional three-dimensional structure. The process of folding is a thermally driven diffusive search on a free-energy landscape in the conformational space for the minimal-energy structure. During that process, the free energy of the system does not always show a monotonic decrease; instead, sub-optimal compensation of enthalpy and entropy change during each folding step leads to formation of folding free-energy barriers. However, these barriers, and associated high-energy transition states, that contain key information about mechanisms of protein folding, are kinetically inaccessible. To reveal the barrier-formation process and structural characteristics of transition states, proteins are employed that fold via barrierless paths – so-called downhill folders. Due to the low folding barriers, the key folding interactions become accessible, yielding insights about the rate-limiting folding events. Here, I compared the folding dynamics of three different variants of a lambda repressor fragment, containing amino acids 6 to 85: a two-state folder λWT (Y22W) and two downhill-like folding variants, λYA (Y22W/Q33Y/G46,48A) and λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). To access the kinetics and structural dynamics, single-molecule optical tweezers with submillisecond and nanometer resolution are used. I found that force perturbation slowed down the microsecond kinetics of downhill folders to a millisecond time-scale, making it accessible to single-molecule studies. Interestingly, under load, the downhill-like variants of lambda repressor appeared as cooperative two-state folders with significantly different folding kinetics and force dependence. The three protein variants displayed a highly compliant behaviour under load. Model-free reconstruction of free-energy landscapes allowed us to directly resolve the fine details of the transformation of the two-state folding path into a downhill-like path. The effect of single mutations on protein stability, transition state formation and conformational heterogeneity of folding and unfolding states was observed. Noteworthy, our results demonstrate, that despite the ultrafast folding time in a range of 2 µs, the studied variants fold and unfold in a cooperative process via residual barriers, suggesting that much faster folding rate constants are required to reach the full-downhill limit.

Die heterogene Struktur von aus Rattenhirn isolierten Synaptischen Vesikeln wird untersucht mittels Daten aus Kleinwinkel-Röntgenstreuexperimenten unter Berücksichtigung von Daten erhalten durch cryogene Elektronenmikroskopie, dynamische Lichtstreuung und biochemische Analysen. Es werden niedrig aufgelöste Strukturmodelle des funktionellen Synaptischen Vesikels unter quasi-physiologischen Bedingungen vorgeschlagen. Details des Dichteprofils der Membran, einschließlich Beiträgen von Lipiden und Proteinen werden bestimmt. Die typische Konformation und die allgemeine laterale Organisation der Proteine in Mikrodomänen werden ermittelt. Entropische Beiträge zur freien Energie aufgrund möglicher Bildung und Auflösung der Proteinmikrodomänen auf dem Synaptischen Vesikel werden untersucht. Ferner werden zellfreie Fusionssysteme mittels dynamischer Lichtstreudaten charakterisiert und mögliche Anwendungen von Kleinwinkel-Röntgenstreuung für die Untersuchung von Membran-Fusionsprozessen erörtert.

Kaliumionen (K⁺) sind die am häufigsten vorkommenden anorganischen Kationen in Pflanzen. Gemessen am Trockengewicht kann ihr Anteil bis zu 10% ausmachen. Kaliumionen übernehmen wichtige Funktionen in verschiedenen Prozessen in der Pflanze. So sind sie z.B. essentiell für das Wachstum und für den Stoffwechsel. Viele wichtige Enzyme arbeiten optimal bei einer K⁺ Konzentration im Bereich von 100 mM. Aus diesem Grund halten Pflanzenzellen in ihren Kompartimenten, die am Stoffwechsel beteiligt sind, eine kontrollierte Kaliumkonzentration von etwa 100 mM aufrecht.<br><br> Die Aufnahme von Kaliumionen aus dem Erdreich und deren Transport innerhalb der Pflanze und innerhalb einer Pflanzenzelle wird durch verschiedene Kaliumtransportproteine ermöglicht. Die Aufrechterhaltung einer stabilen K⁺ Konzentration ist jedoch nur möglich, wenn die Aktivität dieser Transportproteine einer strikten Kontrolle unterliegt. Die Prozesse, die die Transportproteine regulieren, sind bis heute nur ansatzweise verstanden. Detailliertere Kenntnisse auf diesem Gebiet sind aber von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Integration der Transportproteine in das komplexe System des pflanzlichen Organismus. <br><br> In dieser Habilitationsschrift werden eigene Publikationen zusammenfassend dargestellt, in denen die Untersuchungen verschiedener Regulationsmechanismen pflanzlicher Kaliumkanäle beschrieben werden. Diese Untersuchungen umfassen ein Spektrum aus verschiedenen proteinbiochemischen, biophysikalischen und pflanzenphysiologischen Analysen. Um die Regulationsmechanismen grundlegend zu verstehen, werden zum einen ihre strukturellen und molekularen Besonderheiten untersucht. Zum anderen werden die biophysikalischen und reaktionskinetischen Zusammenhänge der Regulationsmechanismen analysiert. Die gewonnenen Erkenntnisse erlauben eine neue, detailliertere Interpretation der physiologischen Rolle der Kaliumtransportproteine in der Pflanze. / Potassium ions (K⁺) are the most abundant anorganic cations in plants. They can constitute up to 10% of the plant dry weight. Potassium ions play important roles in different processes in the plant. For example, they are essential for growth and for metabolism. Many important enzymes work optimally at a K⁺ concentration within the range of about 100 mM. Therefore, plant cells maintain a controlled potassium concentration of approximately 100 mM in their compartments, which are involved in metabolism. <br><br> The uptake of potassium ions from the soil and their transport within the plant and within a plant cell is accomplished by different potassium transporter proteins. However, the maintenance of a stable K⁺ concentration is only possible if the activity of these transporter proteins is subject to strict control. Up today the processes regulating the transporter proteins are only rudimentarily understood. More detailed knowledge in this area is, however, of central importance for the understanding of the integration of the transporter proteins into the complex system of the plant organism. <br><br> This Habilitation-thesis summarizes own publications, in which the investigations of different regulation mechanisms of plant potassium channels are described. These investigations cover a spectrum of different protein-biochemical, biophysical and plant-physiological analyses. In order to understand the regulation mechanisms, on the one hand their structural and molecular characteristics are examined. On the other hand the biophysical and reaction-kinetic properties of the regulation mechanisms are analyzed. The obtained insights allow a new, more detailed view on the physiological role of potassium transporter proteins in the plant.