Os eritrócitos dos mamíferos são anucleados e desprovidos de organelas citoplasmáticas, contando somente com o ciclo da glicólise, o ciclo das pentoses e algumas enzimas anexas, o que garante o fornecimento de energia calórica sob a forma de adenosina-5\'-trifosfato (ATP) e de energia redutora sob a forma de nicotinamida adenosina dinucleotídeo reduzida (NADH), nicotinamida adenosina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) e glutationa reduzida (GSH). A via glicolítica possui o desvio denominado de ciclo de Rapaport-Luebering, onde há a síntese de 2,3- difosfoglicerato (2,3-DPG), que é um importante metabólito e atua como modulador da afinidade da hemoglobina ao O2. Havendo poucos estudos comparativos sobre o metabolismo eritrócitário dos mamíferos propôs-se investigar as atividades das enzimas glicolíticas, anexas (2,3-difosfogliceratomutase, glicose-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogliconato desidrogenase) e a concentração dos compostos intermediários adenosina-5\' -trifosfato e 2,3-difosfoglicerato. Mamíferos das ordens Primates, Rodentia, Camivora, Lagomorpha, Artiodactyla, Didelphimorphia e Xenarthra oriundos da Fundação Parque Zoológico de São Paulo e Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP foram investigados. O sangue foi colhido em ACD, os eritrócitos foram lavados em solução fisiológica a 4°C e hemolisados em solução hemolisante 1:20 por congelamento e descongelamento e as atividades das seguintes enzimas foram determinadas de acordo com Beutler (Red Cell Metabolism, a Manual of Biochemical Methods, Ed. Grune & Stratton, 3rd ed, 1984): hexoquinase, glicose fosfato isomerase , fosfofrutoquinase, aldolase, triose fosfato isomerase, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, fosfoglicerato quinase, monofosfogliceromutase, enolase, piruvato quinase, lactato desidrogenase, bem como a 2,3-difosfoglicerato mutase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogluconato desidrogenase, os metabólitos intermediários 2,3-difosfoglicerato e adenosina-5\'-trifosfato. As enzimas e os compostos intermediários estudados apresentaram grande variabilidade entre as espécies de mamíferos estudadas. Foi observada correlação positiva entre a atividade da triose fosfato isomerase e a 2,3-difosfoglicerato mutase e os teores de adenosina-5\'-trifosfato das espécies, bem como correlação positiva entre a 2,3-difosfoglicerato mutase em relação ao 2,3-difosfoglicerato. Os teores de adenosina-5\'-trifosfato mantiveram-se dentro de um patamar estável, ao redor de 4.000 a 6.000 nmoles / gHb, com as exceções das espécies das ordens Carnivora (Panthera leo, Leopardus pardalis, Canis lupus and Chrysocyon brachyurus) e Artiodactyla (Cervus elaphus), que exibiram teores ao redor de 2.000 a 3.000 nmoles / g Hb. Já os valores da concentração de 2,3-difosfoglicerato apresentaram variação considerável entre as espécies e ordens estudadas. / Mammalia red cells are non-nucleated and do not have cytoplasm organeles as well, and present the glycolytc pathway, the pentose shunt to attend the requirements in caloric energy as adenosine-5-triphosphate (ATP) and reducing power as reduced nicotinamide adenosine dinucleotide (NADH) and reduced nicotinamide adenosine dinucleotide phosphate (NADPH) and reduced glutathione (GSH). The glycolytic pathway exhibit besides the Luebering-Rappaport shunt, in which the 2,3-diphosphoglycerate is formed, which regulates the hemoglobin affinity to the molecular oxygen. As there are not so many studies on comparative about mammalian red cell metabolism, it was decided to study the glycolytic enzyme activities, the glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, 2,3-diphosphoglycerate mutase and the metabolites adenosine-5-triphosphate and 2,3-diphosphoglycerate (2,3-DPG). Mammalia representatives from Primates, Rodentia, Carnívora, Lagomorpha, Artyodactyla, Didelphimorphia and Xenarthra orders, obtained from Fundação Parque Zoológico de São Paulo and Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP, were studied. The blood was collected in ACD, the red cells were washed in saline at 4° C, lysed 1:20 in hemolysing solution by freeze-and-thaw, and the following enzymes were assayed according to Beutler (Red Cell Metabolism, a Manual of Biochemical Methods, Ed. Grune & Stratton, 3rd ed, 1984): hexokinase, glucose-6-phosphate isomerase, phosphofructo kinase, aldolase, triose phosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase, monophosphoglycerate mutase, enolase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase activities, as well as 2,3-diphosphoglycerate mutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase activities, and adenosine-5-triphosphate, 2,3-diphophoglycerate concentrations. A remarkable variation among the studied species was observed. However, it was detected a significant positive correlation between the adenosine-5-triphosphate concentrations and triosephosphate isomerase and 2,3-diphosphoglycerate mutase activities, as well as significant positive correlation between 2,3-diphosphoglycerate concentration and 2,3-diphosphoglycerate mutase activity in all studied species as a whole. Most of studied species exhibited a steady ATP concentration range between 4,000 and 6,000 nmoles.g Hb -1 but the Artiodactyla (Cervus elaphus) and Carnivora (Panthera leo, Leopardus pardalis, Canis Lupus and Chrysocyon brachyurus,) which presented values between 2,000 and 3,000 nmoles Hb - 1. However, the 2,3-DPG concentration showed remarkable variation among the studied species and orders.

Os eritrócitos dos mamíferos são anucleados e desprovidos de organelas citoplasmáticas, contando somente com o ciclo da glicólise, o ciclo das pentoses e algumas enzimas anexas, o que garante o fornecimento de energia calórica sob a forma de adenosina-5\'-trifosfato (ATP) e de energia redutora sob a forma de nicotinamida adenosina dinucleotídeo reduzida (NADH), nicotinamida adenosina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) e glutationa reduzida (GSH). A via glicolítica possui o desvio denominado de ciclo de Rapaport-Luebering, onde há a síntese de 2,3- difosfoglicerato (2,3-DPG), que é um importante metabólito e atua como modulador da afinidade da hemoglobina ao O2. Havendo poucos estudos comparativos sobre o metabolismo eritrócitário dos mamíferos propôs-se investigar as atividades das enzimas glicolíticas, anexas (2,3-difosfogliceratomutase, glicose-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogliconato desidrogenase) e a concentração dos compostos intermediários adenosina-5\' -trifosfato e 2,3-difosfoglicerato. Mamíferos das ordens Primates, Rodentia, Camivora, Lagomorpha, Artiodactyla, Didelphimorphia e Xenarthra oriundos da Fundação Parque Zoológico de São Paulo e Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP foram investigados. O sangue foi colhido em ACD, os eritrócitos foram lavados em solução fisiológica a 4°C e hemolisados em solução hemolisante 1:20 por congelamento e descongelamento e as atividades das seguintes enzimas foram determinadas de acordo com Beutler (Red Cell Metabolism, a Manual of Biochemical Methods, Ed. Grune & Stratton, 3rd ed, 1984): hexoquinase, glicose fosfato isomerase , fosfofrutoquinase, aldolase, triose fosfato isomerase, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, fosfoglicerato quinase, monofosfogliceromutase, enolase, piruvato quinase, lactato desidrogenase, bem como a 2,3-difosfoglicerato mutase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogluconato desidrogenase, os metabólitos intermediários 2,3-difosfoglicerato e adenosina-5\'-trifosfato. As enzimas e os compostos intermediários estudados apresentaram grande variabilidade entre as espécies de mamíferos estudadas. Foi observada correlação positiva entre a atividade da triose fosfato isomerase e a 2,3-difosfoglicerato mutase e os teores de adenosina-5\'-trifosfato das espécies, bem como correlação positiva entre a 2,3-difosfoglicerato mutase em relação ao 2,3-difosfoglicerato. Os teores de adenosina-5\'-trifosfato mantiveram-se dentro de um patamar estável, ao redor de 4.000 a 6.000 nmoles / gHb, com as exceções das espécies das ordens Carnivora (Panthera leo, Leopardus pardalis, Canis lupus and Chrysocyon brachyurus) e Artiodactyla (Cervus elaphus), que exibiram teores ao redor de 2.000 a 3.000 nmoles / g Hb. Já os valores da concentração de 2,3-difosfoglicerato apresentaram variação considerável entre as espécies e ordens estudadas. / Mammalia red cells are non-nucleated and do not have cytoplasm organeles as well, and present the glycolytc pathway, the pentose shunt to attend the requirements in caloric energy as adenosine-5-triphosphate (ATP) and reducing power as reduced nicotinamide adenosine dinucleotide (NADH) and reduced nicotinamide adenosine dinucleotide phosphate (NADPH) and reduced glutathione (GSH). The glycolytic pathway exhibit besides the Luebering-Rappaport shunt, in which the 2,3-diphosphoglycerate is formed, which regulates the hemoglobin affinity to the molecular oxygen. As there are not so many studies on comparative about mammalian red cell metabolism, it was decided to study the glycolytic enzyme activities, the glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, 2,3-diphosphoglycerate mutase and the metabolites adenosine-5-triphosphate and 2,3-diphosphoglycerate (2,3-DPG). Mammalia representatives from Primates, Rodentia, Carnívora, Lagomorpha, Artyodactyla, Didelphimorphia and Xenarthra orders, obtained from Fundação Parque Zoológico de São Paulo and Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP, were studied. The blood was collected in ACD, the red cells were washed in saline at 4° C, lysed 1:20 in hemolysing solution by freeze-and-thaw, and the following enzymes were assayed according to Beutler (Red Cell Metabolism, a Manual of Biochemical Methods, Ed. Grune & Stratton, 3rd ed, 1984): hexokinase, glucose-6-phosphate isomerase, phosphofructo kinase, aldolase, triose phosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase, monophosphoglycerate mutase, enolase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase activities, as well as 2,3-diphosphoglycerate mutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase activities, and adenosine-5-triphosphate, 2,3-diphophoglycerate concentrations. A remarkable variation among the studied species was observed. However, it was detected a significant positive correlation between the adenosine-5-triphosphate concentrations and triosephosphate isomerase and 2,3-diphosphoglycerate mutase activities, as well as significant positive correlation between 2,3-diphosphoglycerate concentration and 2,3-diphosphoglycerate mutase activity in all studied species as a whole. Most of studied species exhibited a steady ATP concentration range between 4,000 and 6,000 nmoles.g Hb -1 but the Artiodactyla (Cervus elaphus) and Carnivora (Panthera leo, Leopardus pardalis, Canis Lupus and Chrysocyon brachyurus,) which presented values between 2,000 and 3,000 nmoles Hb - 1. However, the 2,3-DPG concentration showed remarkable variation among the studied species and orders.

Foi levado a efeito estudo sobre formas múltiplas de aldolase de músculo de coelho. A enzima foi purificada a pH 7,5 por eluição com substrato a partir de coluna de fosfocelulose. A enzima foi ainda cristalizada por diálise dessas preparações contra solução saturada de sulfato de amônio. Formas múltiplas de aldolase foram obtidas por fracionamento a diferentes pI por eletrofocalização em gradiente de Ampholine na faixa de pH entre 7,0 a 10,0. Nessas condições foram separados cinco híbridos resultantes da associação ao acaso das sub-unidades α e β, os quais foram analisados em estado de dissociação a partir de proteínas carboximetiladas e separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de uréia 8M. Foi também estudado o aparecimento de sub-unidade α e β em músculo de coelhos de idades que variavam de 1 a 240 dias, verificando-se que em coelhos de 1 dia existia apenas a proteína α4, surgindo sub-unidades β já em animais de 10 dias. / Not available.

Insetos abrangem o maior número de espécies descritas, estando distribuídos por praticamente todos os nichos ecológicos. O tubo digestivo destes animais consiste na principal interface entre estes e o meio externo. Assim, o estudo das enzimas digestivas, ou proteínas relacionadas ao processo digestivo em insetos, faz-se fundamental para a tentativa de desenvolver novos métodos de controle que ajam via canal alimentar, como o uso de plantas transgênicas para controlar insetos fitófagos (Felton & Gatehouse, 1996). Diptera superiores são os únicos animais, além dos vertebrados, que apresentam uma região ácida em seu intestino médio (Vonk & Western, 1984). Assim, o estudo da digestão ácida nestes organismos permite-nos examinar em detalhe este interessante paralelismo evolutivo (muito revelador se incluir também aspectos moleculares). Para realização deste estudo foram escolhidas duas enzimas relacionadas com a digestão ácida em Diptera: uma aspártico-proteinase de Musca domestica, semelhante à catepsina D, e uma lisozima digestiva de Drosophila melanogaster. Para purificar a aspártico-proteinase intestinal de M. domestica, ventrículos anterior e médio de larvas deste inseto foram homegeneizados e centrifugados, sendo o sobrenadante resultante utilizado como fonte de enzima. A combinação de uma cromatografia em coluna de troca iônica seguida de uma filtração em gel mostrou-se como a melhor para a obtenção da aspártico-proteinase intestinal de larvas de M. domestica totalmente purificada. Clones de lisozima de D. melanogaster (LysD) e de A. darlingi (Lysdar) foram utilizados na construção de vetores de expressão a seguir usados na transformação de E. coli linhagem OrigamiTMB (DE3) e P. Pastoris GS115 (his4). As bactérias transformadas com vetor pT7-dar (que continha o gene Lysdar), quando induzidas por IPTG, foram capazes de expressar uma proteína, cujo peso molecular em gel de SDS-PAGE é de cerca de 14 kDa, como o esperado. A lisozima hipotética foi encontrada em corpos de inclusão, que solubilizados por SDS 3% resultaram em proteína inativa. Colônias de P. pastoris transformadas com o vetor pPIC-9-D (contendo o gene LysD) foram submetidas a reação em cadeia com DNA polimerase. Aquelas que geraram produtos de PCR de tamanho coerente com o de uma lisozima foram cultivadas e posteriormente, induzidas por metanol. P. pastoris é capaz de secretar a lisozima induzida. Assim, alíquotas do meio de indução foram utilizadas em ensaios enzimáticos para a detecção da atividade da lisozima intestinal de D. melanogaster. A lisozima é expressa em P. pastoris em grande quantidade (12 mg/L) e com atividade preservada. Foi verificado que há uma intima relação entre a força iônica do meio e o pH ótimo da lisozima intestinal recombinante de D. melanogaster. O pH ótimo é deslocado para valores mais ácidos quando em forças iônicas maiores. Em contrapartida, os valores de atividade obtidos para a lisozima D recombinante de D. melanogaster decrescem com o aumento da força iônica do meio. / Insects are the most numerous of living beings and are found in almost all habitats. The midgut of these animals is the main interface between them and their enviroment. Thus, the study of digestive enzymes or of other proteins relateded to the insect digestive process is putatively useful for the development of new insect control strategies. Houseflies (higher Diptera) are the only animals, besides vertebrates, that present an acidic region in the midgut (Vonk & Western, 1984). Due do that, a detailed analysis of the acidic digestion in these insects may disclose molecular evolutionary paralellisms between those animals. Two enzymes were chosen along the aims discussed: a Musca domestica aspartic-proteinase, similar to cathepsin D and a digestive lysozyme from Drosophila melanogaster. To purify the cathepsin D-like proteinase from M. domestica larvae, larval foreguts and midguts were homogeneized, centrifuged, and the resulting supernatant was used as an enzyme source. Ion-exchange chromatography followed by a gel filtration of enzyme extract resulted in a homogeneous preparation of the enzyme. Clones of lysozyme from D. melanogaster (LysD) and A. darling (Lysdar) were used in the construction of expression vectors, which were used to transform E. coli cells (OrigamiTM B(DE3)) and P. pastoris GS115 (his4). Bacteria transformed with pT7-dar (the expression vector which contained the gene Lysdar), when induced by IPTG, expressed a protein with a molecular weight of 14 kDa, as expected for lysozyme. This protein was found in inclusion bodies that were solubilized in 3% SDS resulting in a protein with no activity. After choosing at random P. pastoris colonies transformed with the expression vector pPIC9-D (containing the gene LysD), they were submited to a PCR. The colonies with 366pb products were grown and induced by methanol. P. pastoris was engineered to excrete the expressed proteins. In accordance to that, about 12 mg of lysozyme were recovered from each litter of culture medium. Recombinant D. melanogaster lysozyme D was more active at acid pH values, when present in media with physiological ionic strengths, and its Km value increased with the ionic strength of media. This is agreement with data obtained with lysozyme D isolated from D. melanogaster midgut. The results support the assertion that this enzyme may be used in crystalographic and site mutagenesis studies to reveal the molecular basis of its catalytic properties.

A trealase intestinal de Tenebrio molitor foi purificada após três etapas cromatográficas (interação hidrofóbica, troca iônica e gel filtração), obtendo-se uma recuperação de 46 %, uma atividade específica de 16,5 U/mg de proteína e um enriquecimento de 73 vezes. A proteína purificada apresenta uma massa molecular de 58 kDa estimada por plotes de Ferguson, pH ótimo de 5,3 e Km de 0,43 ± 0,03 mM. Estudos de inibição com a enzima purificada mostraram que a mesma é inibida competitivamente por amigdalina (Ki = 0,22 mM), prunasina (Ki = 0,43 mM), florizina (Ki = 0,50 mM), floretina (Ki = 0,008 mM), metil-α-manosídeo (Ki = 0,43 mM), salicina (Ki = 186 mM), e glucono-δ-lactona (Ki = 1,4 mM). Mandelonitrila apresentou inibição mista com Ki = 3,8 e -α = 1,5. A enzima não apresentou inibição por 1,10 fenantrolina, gentibiose, metil-α-glucosídeo e Tris, em concentração de mM, 10 mM, 200mM, e 264 Mm, respectivamente. Experimentos de inibição, inibição múltipla e de proteção da enzima contra modificadores de resíduos específicos de aminoácidos permitiram idealizar um esquema para o sítio ativo da trealase. Esse sítio ativo teria dois sítios assimétricos para a ligação de glicose. Em um dos sub-sítios liga-se o inibidor floritina e no outro os inibidores metil-α-manosídeo e glucono-δ-lactona. Nesse último está presente um resíduo de histidina que tem como papel modular o pKa do carboxilato catalítico. Esse e o resíduo de arginina que atua como doador de prótons, encontra-se na região entre os dois sub-sítios. RT-PCR foi usado para clonar o cDNA codifica a trealase intestinal de T. molitor. Esta proteína é solúvel e apresenta massa molecular prevista pela sequência de 61 kDa. Tomando por base a seqüência de aminoácidos, esta trealase pode ser classificada na família 37 das glicosídeo hidrolases e faz parte do clã G, onde não se conhecem quais são os grupos envolvidos em catálise e nem a estrutura tridimensional de seus componentes. / Intestinal trehalase was purified from Tenebrio molitor larvae after three chromatographic steps (hidrophobic, interaction, ion exchange chromatography and gel filtration). The pure enzyme has an specific activity of 16.5 U/mg, molecular mass of 58 kDa, optimum pH of 5.3 and Km of 0.43 ± 0.03 mM. Amygdalin (Ki = 0.22 mM), prunasin (Ki = 0.43 mM), phlorizin (Ki = 0.50 mM), phloretin (Ki = 0.008 mM), methyl-α-mannoside (Ki = 43 mM), salicin (Ki = 186 mM), and glucone-δ-lactone (Ki = 1.4 mM) are competitive inhibitors of the enzyme. Mandelonitrile (the aglycon of the glucosides amygdalin and prunasin) is a non-competitive mixed-type inhibitor (Ki = 3.8 mM and α = 1.5). Gentiobiose, methyl-α-glucoside, 1,10 phenanthroline and Tris in concentrations of 10 mM, 200 mM, 4 mM, and 264 mM, respectively, were unable to inhibit the enzyme. We designed a model for trehalase active site, taking into account inhibition and multiple inhibition experiments plus protection afforded by competitive inhibitors against the chemical modification of amino acid residues. The site has two assimetric subsites for glucose binding. Phloretin binds to subsite II and methyl-α-mannoside and glucone-δ-lactone bind to subsite I. In this subsite, one His residue modulates the p(Ka of the carboxylate group that acts as a nucleophile in catalysis. The carboxylate and one Arg residue, that acts as a proton donor, are placed in the region between the two subsites. Using RT-PCR techniques, the cDNA coding for T. molitor intestinal trehalase was cloned. From the sequence, we can suppose that the enzyme is soluble and calculate that the molecular mass of the protein would be 61 kDa. T. molitor trehalase can be classified as a member of family 37 of glycoside hydrolases. No member of this family has their catalytical groups nor its 3D structure known.

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

β-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em β-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma β-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sfβgli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das β-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES‡ e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sfβgli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sfβgli50 mutantes a partir de uma \"biblioteca\" de mutantes geradas por mutagênese aleatória in vivo. As análises de \"contatos\" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sfβgli50 mutantes. Estas 46 Sfβgli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando \"vias de conexão\", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma \"via\" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sfβgli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração na plataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos. / The β-glycosidases of family 1 of the glycoside hydrolases (GH 1) are one of the most important groups of enzymes. These enzymes are involved in a high diversity of physiological functions. The main objective of this study was the analysis of the molecular bases of the specificity for substrate of a β-glycosidase from the larvae of Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Initially the role of residues E190, E194, K201 and M453 of Sfβgli50 in modulation of the specificity for the substrate was investigated through site-directed mutagenesis experiments and enzyme kinetic analysis. These residues corresponds to the those found in the aglycone binding site of Zea mays and Sorghum bicolor β-glycosidases. The results showed that E190 favors the binding of the initial portion of alkyl-type aglycones (up to the sixth methylene group) and also the first glucose unit of oligosaccharidic aglycones, whereas a balance between interactions with E194 and K201 determines the preference for glucose units versus alkyl moieties. E194 favors the binding of alkyl moieties, while K201 is more relevant for the binding of glucose units, in detriment of its favorable interaction with alkyl moieties. In addition, M453 favors the binding of the second glucose unit of oligosaccharidic aglycones and also of the initial portion of alkyl-type aglycones. None of these residues interact with the terminal portion of alkyl-type aglycones. It was also demonstrated that E190, E194, K201 and M453 similarly contribute to stabilize ES‡. Their interactions with aglycone are individually weaker than those formed by residues interacting with glycone, but their joint catalytic effects are similar. Finally, these interactions with aglycone do not influence glycone binding. In the second part of this study, new Sfβgli50 residues or portions that participated in the modulation of the substrate specificity were identified. In order to reach this objective, 14 Sfβgli50 mutants were seleted from a \"library\" generated by random mutagenesis in vivo. Based on the \"contacts\" or hydrogen bounds involving these 14 mutated residues 32 additional mutant Sfβgli50 were constructed. These 46 Sfβgli50 mutant were produced in bacteria, purificated and characterized. The results suggest that these residues ways be grouped in \"connective pathways\", a set of residues that contact each other. Mutations in residues that compose a \"pathways\" may be propagated through its connections reaching the Sfβgli50 active site. This propagation may be mediated by alterations in the spatial positioning and the set of non covalent interactions of these residues. Finally, several of these \"connective pathways\" contact a common point in the active site, the basal platform of the glycone subsite, W444.

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

A trealase intestinal de Tenebrio molitor foi purificada após três etapas cromatográficas (interação hidrofóbica, troca iônica e gel filtração), obtendo-se uma recuperação de 46 %, uma atividade específica de 16,5 U/mg de proteína e um enriquecimento de 73 vezes. A proteína purificada apresenta uma massa molecular de 58 kDa estimada por plotes de Ferguson, pH ótimo de 5,3 e Km de 0,43 ± 0,03 mM. Estudos de inibição com a enzima purificada mostraram que a mesma é inibida competitivamente por amigdalina (Ki = 0,22 mM), prunasina (Ki = 0,43 mM), florizina (Ki = 0,50 mM), floretina (Ki = 0,008 mM), metil-α-manosídeo (Ki = 0,43 mM), salicina (Ki = 186 mM), e glucono-δ-lactona (Ki = 1,4 mM). Mandelonitrila apresentou inibição mista com Ki = 3,8 e -α = 1,5. A enzima não apresentou inibição por 1,10 fenantrolina, gentibiose, metil-α-glucosídeo e Tris, em concentração de mM, 10 mM, 200mM, e 264 Mm, respectivamente. Experimentos de inibição, inibição múltipla e de proteção da enzima contra modificadores de resíduos específicos de aminoácidos permitiram idealizar um esquema para o sítio ativo da trealase. Esse sítio ativo teria dois sítios assimétricos para a ligação de glicose. Em um dos sub-sítios liga-se o inibidor floritina e no outro os inibidores metil-α-manosídeo e glucono-δ-lactona. Nesse último está presente um resíduo de histidina que tem como papel modular o pKa do carboxilato catalítico. Esse e o resíduo de arginina que atua como doador de prótons, encontra-se na região entre os dois sub-sítios. RT-PCR foi usado para clonar o cDNA codifica a trealase intestinal de T. molitor. Esta proteína é solúvel e apresenta massa molecular prevista pela sequência de 61 kDa. Tomando por base a seqüência de aminoácidos, esta trealase pode ser classificada na família 37 das glicosídeo hidrolases e faz parte do clã G, onde não se conhecem quais são os grupos envolvidos em catálise e nem a estrutura tridimensional de seus componentes. / Intestinal trehalase was purified from Tenebrio molitor larvae after three chromatographic steps (hidrophobic, interaction, ion exchange chromatography and gel filtration). The pure enzyme has an specific activity of 16.5 U/mg, molecular mass of 58 kDa, optimum pH of 5.3 and Km of 0.43 ± 0.03 mM. Amygdalin (Ki = 0.22 mM), prunasin (Ki = 0.43 mM), phlorizin (Ki = 0.50 mM), phloretin (Ki = 0.008 mM), methyl-α-mannoside (Ki = 43 mM), salicin (Ki = 186 mM), and glucone-δ-lactone (Ki = 1.4 mM) are competitive inhibitors of the enzyme. Mandelonitrile (the aglycon of the glucosides amygdalin and prunasin) is a non-competitive mixed-type inhibitor (Ki = 3.8 mM and α = 1.5). Gentiobiose, methyl-α-glucoside, 1,10 phenanthroline and Tris in concentrations of 10 mM, 200 mM, 4 mM, and 264 mM, respectively, were unable to inhibit the enzyme. We designed a model for trehalase active site, taking into account inhibition and multiple inhibition experiments plus protection afforded by competitive inhibitors against the chemical modification of amino acid residues. The site has two assimetric subsites for glucose binding. Phloretin binds to subsite II and methyl-α-mannoside and glucone-δ-lactone bind to subsite I. In this subsite, one His residue modulates the p(Ka of the carboxylate group that acts as a nucleophile in catalysis. The carboxylate and one Arg residue, that acts as a proton donor, are placed in the region between the two subsites. Using RT-PCR techniques, the cDNA coding for T. molitor intestinal trehalase was cloned. From the sequence, we can suppose that the enzyme is soluble and calculate that the molecular mass of the protein would be 61 kDa. T. molitor trehalase can be classified as a member of family 37 of glycoside hydrolases. No member of this family has their catalytical groups nor its 3D structure known.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-16Bitstream added on 2014-06-13T20:29:22Z : No. of bitstreams: 1 okamoto_dn_me_sjrp.pdf: 676452 bytes, checksum: 7d8aa473e5171e8c8a4187d9499700da (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A presença de resíduos químicos no ambiente afeta todo o ecossistema. Uma das técnicas empregadas para o estudo dos efeitos tóxicos dos resíduos químicos é o biomonitoramento, que utiliza como modelos organismos vivos, entre eles os insetos. Um dos gêneros utilizados é a Drosophila, em particular a espécie D. melanogaster de distribuição cosmopolita. É um organismo geneticamente bem explorado, de fácil manutenção e rápido ciclo biológico, que após o seqüenciamento completo de seu genoma revelou homologia de 60% de seus genes com os genes de doenças humanas. Entre as substâncias químicas que foram investigadas neste trabalho, incluem-se três metais tóxicos (alumínio, cromo e chumbo), um corante (azul Coomassie brilliant G250) e o produto sintético acrilamida. A análise foi realizada em concentrações baixas (50µM) com ênfase na característica acumulativa de cada produto químico durante dez gerações de exposição. As análises, fundamentadas na biologia do inseto, avaliaram sua produtividade, alterações morfológicas, viabilidade das diversas fases do desenvolvimento, o peso dos insetos, o comportamento sexual e a atividade enzimática da carboxilesterase. Foi realizado também um experimento de produtividade comparativo com duas linhagens, uma massal e outra isofêmea. A exposição à acrilamida, aumentou a produtividade na primeira exposição, e também reduziu a viabilidade de ovos para adultos nas gerações F3 e F10. Por sua vez, entre os metais, o chumbo, afetou a viabilidade de ovos em pupas na décima geração e apresentou alterações no tempo de pré-cópula e de cópula. A exposição ao cloreto de alumínio, revelou na primeira e na quinta geração aumento do tempo de pré-cópula, e na décima geração aumento do tempo de cópula. O dicromato de potássio...