Made available in DSpace on 2012-09-06T01:11:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 598.pdf: 9014270 bytes, checksum: 50ddc5b9b9f3b1a57694ee2b65989074 (MD5) Previous issue date: 2003 / Os sistemas de tratamento de esgotos por lodos ativados, utilizando como suporte aeróbio o oxigênio puro, vem sendo utilizados cada vez com maior freqüência no tratamento de efluentes industriais e, recentemente, no tratamento de esgotos domésticos. No dimensionamento destes sistemas de tratamento tem sido utilizada uma DBO, que utiliza oxigênio puro como suporte aeróbio, que reflete de forma mais realista a eficiência destes sistemas na remoção da matéria orgânica biodegradável. Apesar da grande importância desta DBO modificada não há referências na literatura sobre a sua cinética. Neste trabalho foi estudada a diferença entre os coeficientes cinéticos e os graus de eficiência na remoção da matéria orgânica biodegradável, de um sistema que utilize para análise de DBO um suporte aeróbio tradicional (DBOt), e de outro que utilize oxigênio puro como suporte aeróbio (DBOm). A metodologia operacional desta pesquisa foi baseada na realização de análises para avaliação do comportamento da DBO, quando em meio de ar atmosférico ou em meio de oxigênio puro através da incubação por cinco dias a 20oC e com leitura de oxigênio dissolvido, realizada diariamente, pelo método Winkler. Os resultados das análise demonstraram significativa diferença entre os valores da DBOt e da DBOm, foi obtido um fator de correlação da razão DBOm/DBOt de 1,523 mais ou menos 0,103, demonstrando um aumento da eficiência na remoção da matéria orgânica de cerca de 50 por cento, pelo uso do oxigênio nas condições do ensaio. Através destes resultados obtidos, foram calculados os coeficientes cinéticos (K) associados à redução da DBO; tanto tradicional (DBOt) quanto modificada (DBOm). Além dos aspectos técnicos dos sistemas de tratamento com oxigênio puro, descritos sucintamente neste trabalho, foi realizada uma investigação das aplicações destes sistemas no Brasil, com ênfase em sua evolução histórica entre as décadas de oitenta e noventa. Nesta pesquisa, de cunho mercadológico, da evolução histórica desta técnica de tratamento, foi realizada uma pesquisa de campo com entrevistas aos gerentes de marketing das empresas que fabricam sistemas de aeração com oxigênio puro para tratamento de efluentes. Como resultado desta investigação, é apresentado no capítulo três um consolidado de caráter qualitativo.

BATISTA, A. B. Caracterização estrutural da Mo-CBP3, uma albumina 2S de sementes de Moringa oleifera lamarck e seu modo de ação contra fungos fitopatogênicos. 2013. 154 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-01T19:25:40Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-10-06T23:10:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-06T23:10:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) Previous issue date: 2013 / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi. / Mo-CBP3 é uma proteína ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 são descritas, revelando correlação entre sua estabilidade estrutural e atividade antifúngica. Em adição, para melhor compreensão dos mecanismos pelos quais essa proteína exerce ação antifúngica, sua habilidade de induzir a produção endógena de espécies reativas de oxigênio e de causar alterações morfológicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani é uma espécie de fácil manuseio e desenvolvimento rápido, ideal para ensaios in vitro, e de relevância, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilização segura da Mo-CBP3 como agente químico contra fungos, seus efeitos citotóxicos sobre células eucarióticas também foram investigados. Mo-CBP3 é uma proteína ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, análise por espectrometria de massas revelou que essa proteína consiste de múltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 é composta por duas cadeias polipeptídicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contém a sequência NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resíduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequência NH2-terminal. Análises in silico das sequências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzida confirmaram a presença de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sítios potenciais de O-glicosilação e fosforilação. Além disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteínas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 é composta por 30,3% α-hélices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescência, excitações de uma solução da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissão máxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 é altamente estável, se apresentando indiferente às mudanças de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinação de conídios de vários fungos fitopatogênicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistático como fungicida, dependendo da concentração usada. Ligação da Mo-CBP3 à superfície de células fúngicas ocorre, pelo menos em parte, via interação eletrostática, já que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitório. Mo-CBP3 induziu a produção de espécies reativas de oxigênio e causou perda de assimetria e deformações em células de F. solani. Desorganização do sistema de endomembranas, condensação do citosol e aumento de vacuolização também foram observados. Mo-CBP3 não mostrou atividade hemolítica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das células MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteína não é tóxica para células humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos em baixas concentrações e, também, na ausência de citotoxicidade para células humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifúngicas ou na produção de plantas transgênicas mais resistentes a fungos.

FONTENELE, A. V. Defesa antioxidativa em plantas de arroz duplamente silenciadas nas APXs citosólicas e expostas a estresses abióticos. 2011. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-03T18:51:13Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_avfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-10-08T19:11:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_avfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-08T19:11:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_avfontenele.pdf: 3273822 bytes, checksum: b0c73d66c7fd124476cb951f4490ba97 (MD5) Previous issue date: 2011 / The aim of this study was to characterize physiological and biochemical aspects that show if rice plants (Oryza sativa) knockdown on cytosolic ascorbate peroxidase enzyme (cAPX) are more susceptible to oxidative stress than the wild type plants. APX is an important enzyme from oxidative metabolism of plants, acting on regulation of the endogenous levels of hydrogen peroxide (H2O2). For this, rice plants knockdown on cAPX (Apx1/2s) and wild type (WT) were used for the experimentation. The plants were silenced by interference RNA technical (iRNA) and were grown for 35 days into 1.5 L pots containing nutritive solution under greenhouse conditions. The experiment I was performed with leaves segments immersed in methyl viologen (MV) 50 μM for 24h and the experiment II was performed by application of the following treatments: salt stress, high light and MV. The results from experiment I shown Apx1/2s plants have a higher level of H2O2 high than the levels found on WT rice plants, suggesting that Apx1/2s plants present a level of H2O2 near a level of cell signaling. The fact of WT plants had accumulated H2O2 1h after the treatment suggest the necessity of a signaling H2O2 level for stimulate defense systems. Apx1/2s plants unlike of WT plants presented a constant decline on H2O2 content, indicating a likely H2O2 scavenging excess. After 3h of treatment the chloroplastic enzymes SOD, APX and PHGPx presented upper active in Apx1/2s plants, in control and stress, compared with WT plants. These results suggest the existence of an antioxidant system quite active in the Apx1/2s plants. In experiment II the Apx1/2s plants presented no differences in the photochemical parameters when compared with WT plants, even possessing a smaller photosynthesis under controlled conditions. The energy dissipation (NPQ) in the Apx1/2s plants under high light was, in average, higher than WT plants, suggesting better energy dissipation. Even with efficient energy dissipation, the plants could not avoid the excess of energy in the photosystem and they suffered photoinhibition and damage in photosynthetic apparatus (Fv/Fm). In relation the WT plants, Apx1/2s plants presented a higher activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and PHGPx under controlled conditions, probably intending compensate the lack of cAPX. In the MV treatment the chloroplastic PHGPx was stimulated above 100% in the Apx1/2s plants, indicating that these plants can repair oxidative damage faster than the WT plants. The results suggest that Apx1/2s plants, despite the absence of cAPX, activated additional security systems to compensate the lack of cAPX and respond quickly and efficiently to stress situations. / O objetivo do presente trabalho foi caracterizar aspectos fisiológicos e bioquímicos que mostrem se plantas de arroz (Oryza sativa) deficientes da enzima citosólica peroxidase do ascorbato (cAPX) são mais suscetíveis ao estresse oxidativo do que as plantas com cAPX. A APX é uma importante enzima do metabolismo oxidativo de plantas, atuando na regulação dos níveis endógenos do peróxido de hidrogênio (H2O2). Para isso, plantas deficientes em cAPX (Apx1/2s) e plantas não transformadas (WT) foram utilizadas para a experimentação. As plantas foram silenciadas pela técnica do RNA de interferência (iRNA) e cultivadas por 35 dias em vasos de 1.5 L contendo solução nutritiva sob condições de casa de vegetação. O experimento I foi realizado com segmentos de folhas imersos em metil-viologênio (MV) 50 M durante 24h, e o experimento II foi realizado pela aplicação dos seguintes estresses abióticos: salinidade, alta luminosidade e MV. Os resultados do experimento I mostraram que as plantas Apx1/2s possuem um nível basal de H2O2 maior do que os níveis encontrados nas plantas WT, sugerindo que as plantas Apx1/2s apresentam um nível de H2O2 próximo de um nível de sinalização celular. O fato das plantas WT terem acumulado H2O2 após 1h de tratamento sugere a necessidade de um nível sinalizador de H2O2 para ativação dos sistemas de defesa. As plantas Apx1/2s ao contrario das WT apresentaram uma queda constante no conteúdo de H2O2, indicando uma provável remoção do excesso de H2O2. Após 3h de tratamento as enzimas SOD, APX e PHGPx de cloroplasto apresentaram atividade superior nas plantas Apx1/2s, tanto no controle quanto no estresse, comparadas com as plantas WT. Esses resultados sugerem existência de um sistema antioxidante bastante ativado nas plantas Apx1/2s. No experimento II as plantas Apx1/2s não apresentaram diferenças nos parâmetros fotoquímicos quando comparadas com as plantas WT, mesmo possuindo uma menor fotossíntese em condições controle. A dissipação do excesso de energia (NPQ) nas plantas Apx1/2s tratadas com luz foi, em média, maior que das plantas WT, indicando uma possível maior eficiência na dissipação de energia. Mesmo com eficiente dissipação de energia ambas as plantas não conseguiram evitar energia excessiva no fotossistema e acabaram sofrendo fotoinibição e danos no aparato fotossintético (Fv/Fm). Em relação às plantas WT, as Apx1/2s apresentaram maior atividade das enzimas antioxidativas SOD, CAT e PHGPx nas condições controle, na provável tentativa de compensar a ausência da cAPX. No tratamento com MV a isoforma cloroplástica da PHGPx foi estimulada em mais de 100% nas plantas Apx1/2s, indicando que essas plantas podem reparar danos oxidativos com mais rapidez que as WT. Os dados sugerem que as plantas Apx1/2s, apesar da ausência da cAPX, ativam sistemas adicionais de proteção antioxidativa para compensar essa ausência e responder mais rápida e eficientemente a situações de estresse.

NOBRE, C. B. Caracterização físico-química e efeito sobre bactérias orais de uma lectina de sementes de Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff. 2012. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-31T20:03:44Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_cbnobre.pdf: 1864484 bytes, checksum: 118f59fa7f9546d508dc8870d7c1b826 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-16T20:56:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_cbnobre.pdf: 1864484 bytes, checksum: 118f59fa7f9546d508dc8870d7c1b826 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-16T20:56:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_cbnobre.pdf: 1864484 bytes, checksum: 118f59fa7f9546d508dc8870d7c1b826 (MD5) Previous issue date: 2012 / Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff seeds, a species belonging to the Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Dalbergieae tribe, have a glucose/mannose specific lectin rabbit erythrocytes that agglutinate native or treated with proteolytic enzymes. The lectin from Andira surinamensis seeds was purified by affinity chromatography on Mannose-Sepharose matrix followed by ion exchange chromatography on DEAE-Sephacel matrix. This procedure resulted in a purified lectin, named ASL. ASL purification process was monitored by specific hemagglutinating activity and SDS-PAGE, where it was observed that this lectin is composed of six protein bands, a higher molecular weight of approximately 20 kDa and five other bands of lower apparent molecular weight between 15 and 12 kDa.The intact molecular mass of the purified lectin was determined by mass spectrometry with electrospray ionization (ESI). The analysis of the intact mass spectrum showed the presence of two majority ions of molecular mass 12.220+ 2 and 13.258 + 2 Da. ASL also had its primary structure partially sequenced by mass spectrometry sequence. This lectin is a glycoprotein and shows high stability, being able to maintain their hemagglutinating activity in a wide pH range and after exposure to temperatures up to 80 °C for 1 hour. After dialysis against the chelating agent EDTA, ASL had its hemagglutinating activity decreased, but recovered its activity after the addition of metals, being dependent on divalent metal cations. We also evaluate the effect of ASL on planktonic bacterial growth and biofilm formation and found that it interfered with the growth of two different planktonic gram-positive bacterial strains (Streptococcus mitis and Streptococcus salivarius) and biofilm formation by Stafilococcus aureus e Streptococcus salivarius. / As sementes de Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff, uma espécie pertencente à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Dalbergieae, possuem uma lectina glicose/manose específica, que aglutina eritrócitos de coelhos nativos ou tratados com enzimas proteolíticas. A lectina de sementes de Andira surinamensis foi purificada através de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose seguida por cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-Sephacel. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada de ASL. O processo de purificação da ASL foi monitorado pela atividade hemaglutinate específica e SDS-PAGE, onde se observou que essa lectina é composta por seis bandas protéicas, uma de maior peso molecular aparente de aproximadamente 20 kDa e outras cinco bandas de menor peso molecular aparente entre 15 e 12 kDa. A massa molecular intacta da lectina purificada foi determinada através da técnica de espectrometria de massa com Ionização por Eletrospray (ESI). A análise do espectro de massa intacta mostrou a presença de dois íons majoritários de massa molecular de 12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da. ASL também teve sua estrutura primária parcialmente sequenciada através de espectrometria de massa sequencial. Essa lectina é uma glicoproteína e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH e após exposição a temperaturas de até 80 ºC por 1hora. Após diálise contra o agente quelante EDTA, ASL teve sua atividade hemaglutinante diminuída, porém recuperou sua atividade após a adição de metais, mostrando-se dependente de cátions metálicos divalentes. Foi avaliado também o efeito da ASL no crescimento planctônico bacteriano e na formação de biofilmes e observou-se que ela interferiu no crescimento planctônico de duas diferentes cepas bacterianas gram-positivas (Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius) e na formação de biofilme por Staphylococcus aureus e Streptococcus salivarius.

FARIAS, D. F. Biossegurança alimentar de proteínas Cry: dos métodos clássicos à era ômica. 2013. 242 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-26T21:13:54Z No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Currently at least 12 varieties of cotton expressing Cry proteins from Bacillus thruringiensis (Bt) are released for sale in Brazil to confer resistance to insect attack. However, these proteins are active against lepidopteran, whereas the major pest of Brazilian cotton is a beetle, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). In this context, great efforts have been dedicated in the search for new Cry molecules active against coleopteran. Using techniques of in vitro directed molecular evolution, the Cry8Ka5 mutant protein was developed, which is several times more toxic against the boll weevil than the original protein, Cry8Ka1, initially discovered. Given its promising activity against coleopteran, Cry8Ka5 is being used for the development of a new Bt cotton, as well as of other Bt crops of economic importance. However, as part of legal requirements for the commercial release of a transgenic plant, the recombinant products should be tested for their food safety (FS) in order to detect potential allergenic, toxic and antimetabolic effects. This study aimed to perform a comprehensive FS assessment of the Cry8Ka5 mutant protein and of the Cry1Ac protein, already incorporated in several commercialized Bt crops. The latter was used as a protein control or test depending on the originality of the approach used in each section of this work. The FS evaluation performed covered not only the legal requirements but also the implementation of methodologies hitherto never proposed to assess the safety of consumption of Bt. For that, this study was structured in four chapters. Chapter 1 aimed to conduct a literature review on the state of the art of Bt plants and Cry proteins, as well as provide a general understanding of the concepts and current legislation in GM plants FS. Chapter 2 aimed to evaluate the FS of Cry8Ka5 mutant entomotoxin through the two-step method based on weights of evidence that, in turn, meets the recommendations of CTNBio. In this section, the Cry1Ac protein was used as experimental control, since similar approaches have already been performed with this molecule. Based on official methods, we conclude that it is not expected any risk associated with consumption of protein Cry8Ka5 due to the following results found: 1. Bt products were shown to have a long history of safe use, 2. The protein showed no significant similarity in its primary amino acid sequence with known allergenic, toxic and/or antinutritional proteins; 3. The mode of action and high specificity against insects of Cry proteins are well known; 4. Cry8Ka5 was highly susceptible to digestion in simulated gastric fluid; 5. The protein Cry8Ka5 caused no significant adverse effects in mice (5,000 mg protein/kg body weight, orally, single dose). Chapter 3 aimed to evaluate the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins as to their cyto- and genotoxicity in a serie of conventional and alternative tests as well as antimicrobial effects. The proteins did not cause cyto- or genotoxic effects in human lymphocytes (both with IC50 > 1,000 µg/mL in all tests), did not cause hemolysis in human (types A, B, AB and O), rabbit and rat (both with IC50 > 1,000 µg/mL for all species) rythrocytes, but only Cry8Ka5 caused changes in the topography of the cell membrane of human O type erythrocytes at a concentration of 1,000 µg/mL, detected by atomic force microscopy. Furthermore, the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins showed no cytotoxicity against Artemia sp. nauplii (LC50 > 700 and >1000 µg/mL, respectively), and did not inhibit the growth of four strains of bacteria and four of yeasts (both with MIC > 1,000 µg/mL for all microrganisms tested). Finally, Chapter 4 aimed to evaluate the effects of Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins and of a "pool" of peptides of each one (Cry8Ka5-pep and Cry1Ac-pep, respectively), obtained by in vitro sequential digestion, on the gene expression profile of MCF-7 breast carcinoma cells and Caco-2 colon carcinoma cells, both human. No sample caused changes in the gene expression profile of differentiated Caco-2 cells (used as a model for human intestinal epithelium), even when tested at high concentration (100 µg/mL). In the exposure tests with undifferentiated MCF-7 cells, only Cry1Ac (at 100 µg/mL) caused significant changes in the gene expression pattern. However, this effect was not detected after treatment of these cells with the sample digested of Cry1Ac Cry1Ac-pep), which, in turn, better mimic actual conditions of exposure to Cry molecules. The experimental approaches used in the last three chapters were quite useful and, after all the above, it was possible to confirm the harmless nature of the Cry1Ac protein and conclude that the Cry8Ka5 protein is a safe biotechnological tool for the development of Bt cotton plants to confer resistance against the cotton boll weevil attack. / Atualmente são liberadas para comercialização no mercado agrobiotecnológico brasileiro, pelo menos, 12 variedades de algodão expressando proteínas Cry de Bacillus thruringiensis (Bt) para conferir resistência ao ataque de insetos. Contudo, essas proteínas são ativas contra lepidópteros, enquanto que a principal praga da cotonicultura brasileira é um coleóptero, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Neste contexto, têm-se feito um grande esforço na busca por novas moléculas Cry ativas contra coleópteros. Utilizando técnicas de evolução molecular dirigida in vitro, foi desenvolvida a proteína mutante Cry8Ka5, que é várias vezes mais tóxica contra o bicudo do que a proteína original, Cry8Ka1, inicialmente descoberta. Dada a sua atividade promissora contra coleópteros, Cry8Ka5 está sendo utilizada para o desenvolvimento de um novo algodão Bt, bem como de outras culturas Bt de importância econômica. No entanto, como parte das exigências legais para a liberação comercial de uma planta transgênica, essa proteína recombinante deve ser testada quanto a sua biossegurança alimentar (BA) a fim de detectar potenciais efeitos alergênicos, tóxicos e/ou antimetabólicos. Assim, este trabalho objetivou realizar uma ampla avaliação de BA da proteína mutante Cry8Ka5 e da proteína Cry1Ac, já incorporada em várias culturas Bt comercializadas. A última foi utilizada como proteína controle ou teste dependendo do ineditismo da abordagem empregada em cada seção do trabalho. Nesse âmbito, a avaliação de BA proposta cobriu desde as exigências legais até a execução de metodologias, até então, nunca propostas para avaliação de segurança de consumo de produtos de Bt. Para tanto, este trabalho estruturou-se em quatro capítulos. O Capítulo 1 objetivou realizar uma revisão da literatura acerca do estado da arte das plantas Bt e proteínas Cry, bem como fornecer um entendimento geral sobre os conceitos e a legislação vigente em BA de plantas GM. Já o Capítulo 2 objetivou avaliar a BA da entomotoxina mutante Cry8Ka5 através do método de duas etapas baseado em pesos de evidência que, por sua vez, atende a todas as recomendações da CTNBio. Neste caso, a proteína Cry1Ac foi utilizada como controle experimental, pois abordagens similares já foram realizadas com essa molécula. Baseando-se nos métodos oficiais, é possível concluir que não é esperado qualquer risco associado ao consumo da proteína Cry8Ka5 devido aos seguintes resultados encontrados: 1. Produtos Bt mostraram ter longo histórico de uso seguro; 2. A proteína Cry8Ka5 não mostrou similaridade significativa de sua sequência de aminoácidos primária com proteínas alergênicas, tóxicas e/ou antinutricionais; 3. As proteínas Cry mostraram possuir modo de ação bastante compreendido e elevada especificidade contra insetos; 4. Cry8Ka5 foi altamente susceptível à digestão em fluído gástrico simulado; 5. A proteína Cry8Ka5 não causou efeitos adversos relevantes em camundongos (5.000 mg de proteína/Kg de peso corpóreo, via oral, dose única). Por sua vez, o Capítulo 3 objetivou avaliar a proteína Cry8Ka5 e a Cry1Ac quanto aos seus efeitos cito- e genotóxicos em uma série de testes clássicos e alternativos, além de pesquisar seus efeitos antimicrobianos. As proteínas não causaram efeitos cito- ou genotóxicos em linfócitos humanos (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL em todos os testes), não promoveram hemólise em suspensões de eritrócitos de humanos (tipos A, B, AB e O), de coelho e rato (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL para todas as espécies), enquanto somente a Cry8Ka5 causou alterações na topografia de membrana celular de eritrócitos humanos do tipo O, na concentração de 1.000 µg/mL, detectadas via microscopia de força atômica. Além disso, as proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac não apresentaram citotoxicidade elevada contra naúplios de Artemia sp. (CL50 > 700 e > 1000 µg/mL, respectivamente) e não inibiram o crescimento de quatro cepas de bactérias e quatro de leveduras (ambas com CIM > 1.000 µg/mL para todos os microrganismos testados). Por fim, o Capítulo 4 objetivou avaliar os efeitos das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac e de um “pool” de peptídeos de cada uma (Cry8Ka5-pep e Cry1Ac-pep, respectivamente), obtidos por digestão sequencial in vitro, sobre o perfil de expressão gênica de células de carcinoma de mama MCF-7 e de carcinoma de cólon Caco-2, ambas de origem humana. Nenhuma das amostras testadas causou alterações no perfil de expressão gênica das células Caco-2 diferenciadas (utilizadas como um modelo de epitélio intestinal humano), mesmo quando testadas em alta concentração (100 µg/mL). Nos testes de exposição com células MCF-7 indiferenciadas, apenas a proteína Cry1Ac causou alterações significativas no padrão de expressão gênica. Contudo, esse efeito não foi detectado após tratamento dessas células com a amostra digerida de Cry1Ac (Cry1Ac-pep), que, por sua vez, mimetiza melhor as condições reais de exposição às moléculas Cry. As abordagens experimentais utilizadas nos três últimos capítulos mostraram-se bastante úteis e, após tudo que foi exposto, foi possível confirmar o caráter inócuo da proteína Cry1Ac, bem como concluir que a proteína Cry8Ka5 é uma ferramenta biotecnológica segura para o desenvolvimento de plantas de algodão Bt para conferir resistência ao ataque do bicudo-do-algodoeiro.

FARIAS, D. F. Proteínas de sementes de Amburana cearensis (Allemao) A. C. Smith: valor nutricional e bioatividade contra patógenos e vetores de doenças. 2009. 187 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-26T20:59:40Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_dffarias.pdf: 1943323 bytes, checksum: dd2074b7cf88fa8338feee08dbcd7b3f (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-06T17:16:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_dffarias.pdf: 1943323 bytes, checksum: dd2074b7cf88fa8338feee08dbcd7b3f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-06T17:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_dffarias.pdf: 1943323 bytes, checksum: dd2074b7cf88fa8338feee08dbcd7b3f (MD5) Previous issue date: 2009 / Amburana cearensis (Allemao) A. C. Smith, usually known in portuguese language as “Imburana-de-Cheiro” or “Cumaru”, is a leguminous tree, subfamily Papilionoideae with common occurrence in “Caatinga” Dominium. Despite the numerous ethnobotanical uses, few studies report biological activities of medical interest and / or agribusiness for this species or yet its utilization as food for humans and / or animals. This study aimed to evaluate the proteins of A. cearensis on its nutritional value associated with its biochemical characterization and as to the presence of bioactivity against bacteria, yeasts and filamentous fungi, all pathogens of humans, animals or plants of economic importance, and also against the vectors of disease, Aedes aegypti and Ae. albopictus. For this, seeds were collected in areas of caatinga trees in the municipality of Quixadá - CE and, subsequently, dried and finely ground. The seeds of A. cearensis have high nutritional potential, evidenced by the high content of proteins (22.69  0.81 g 100 g-1), lipid (24.45 2.02 g 100 g-1) and dietary fiber (34.75 1.78 g 100 g-1), keeping smaller quantities of starch (11.43 0.18 g 100 g-1), of total sugars (5.60 0.09 g 100 g-1) and minerals (4.51 0.21 g 100 g-1). Its amino acid composition is comparable to that of soybeans and beans. Moreover, the seeds have moderate levels of antinutritional factors, being detected only trypsin inhibitory activity (27.41 ± 0.03 gTI Kg-1), urease activity (434 ± 34 U kg-1) and some secondary metabolites such as tannins, phenols, flavones, flavonols, and xantone steroids. Chemical components, probably of low molecular mass present in seeds flour incorporated into diets, seem to interfere with their acceptance and use by animals since when the protein fraction (F0/90), obtained from its soluble protein, was incorporated into the balanced diet, the rats accepted well the diets and their performance indicated that F0/90 a good source of protein, comparable to major sources of vegetable protein such as soy and beans. Proteins of A. cearensis seeds are mainly composed of globulins (74.43 g 100 g-1) and albumins (14.23 g 100 g-1), with smaller quantities of glutelin basic proteins (10.07 g 100g-1), prolamins (1.20 g 100 g-1) and glutelin acidic proteins (0.07 g 100 g-1). The seeds crude extract (GE) offers a wide variety of proteins as shown by electrophoretic profiles with a predominance of proteins with apparent molecular mass over 45.0 kDa. The seeds of A. cearensis show also high bioactive potential, especially the activities of their majority proteins (albumins and globulins) against the growth of human pathogenic bacteria and yeast and phytopathogenic filamentous fungi, and against larvae of Aedes aegypti and Ae. albopictus. The inhibitory activity of the growth of phytopathogenic fungi concentrated in the albumins F70/90 fraction, being rich in proteins of low molecular mass (<30 kDa). Thus we can conclude that F0/90 is a good source of protein food when compared to other plant sources already used by the population. In addition, the globulins and albumins of A. cearensis are promising sources of bioactive proteins to be studied further and in greater purity. / Amburana cearensis (Allemao) A. C. Smith, popularmente conhecida como Imburana-de-Cheiro ou Cumaru, é uma leguminosa arbórea da subfamília Papilionoideae de ocorrência freqüente na região do domínio Caatinga. Apesar dos inúmeros usos etnobotânicos, poucos trabalhos relatam atividades biológicas de interesse médico e/ou agroindustrial para esta espécie ou, mesmo, sua utilização como fonte de alimento para humanos e/ou animais. Assim, o presente trabalho objetivou avaliar as proteínas de A. cearensis quanto a seu valor nutricional aliado à sua caracterização bioquímica e quanto à presença de bioatividade contra bactérias, leveduras e fungos filamentosos, todos patógenos do homem, de animais ou de plantas de importância econômica, e, ainda, contra os vetores de doenças, Aedes aegypti e Ae. albopictus. Para tanto, sementes foram coletadas em área de caatinga arbórea, no município de Quixadá – CE, sendo, posteriormente, desidratadas e finamente moídas. As sementes de A. cearensis possuem alto potencial nutricional, revelado pelo alto teor de proteínas (22,69  0,81 g. 100 g-1), lipídios (24,45 2,02 g. 100 g-1) e fibra alimentrar (34,75 1,78 g.100 g-1), retendo quantidades menores de amido (11,43 0,18 g.100g-1), açúcares totais (5,60 0,09 g.100 g-1), e de minerais (4,51 0,21 g.100 g-1). Sua composição aminoacídica é comparável àquela da soja e feijão. Além disso, as sementes apresentam moderados níveis de fatores antinutricionais, sendo detectados apenas atividade inibitória de tripsina (27,41 ± 0,03 gTI.Kg-1), atividade ureásica (434,0 ± 34,0 U.Kg-1) e alguns metabólitos secundários, como taninos, fenóis, flavonas, flavonóis, xantonas e esteróides. Componentes químicos, provavelmente de baixa massa molecular, presentes nas sementes incorporadas a dietas interferem na sua aceitação e aproveitamento por parte dos animais, uma vez que quando a fração proteica (F0/90) obtida de suas proteínas solúveis é incorporada à dieta balanceada, apresenta boa aceitação pelos animais, mostrando-se uma boa fonte de proteínas, comparável a importantes fontes de proteínas vegetais como a soja e os feijões. As proteínas das sementes de A. cearensis são compostas principalmente por globulinas (74,43 g. 100g-1) e albuminas (14,23 g.100 g-1), com quantidades menores de proteínas do tipo glutelinas básicas (10,07 g.100 g-1), prolaminas (1,20 g.100 g-1) e proteínas do tipo glutelinas ácidas (0,07 g.100 g-1). O extrato bruto (EB) das sementes apresenta uma grande diversidade de bandas proteicas com predominância de bandas com massa molecular aparente > 45,0 kDa. As sementes de A. cearensis possuem também alto potencial bioativo, destacando-se as atividades de suas proteínas majoritárias (globulinas e albuminas) contra o crescimento de bactérias e leveduras patógenas do homem e de fungos filamentosos fitopatogênicos, e atividade contra larvas de Aedes aegypti e Ae. albopictus. A atividade inibitória do crescimento de fungos fitopatogênicos concentra-se na fração F70/90 das albuminas, sendo rica em proteínas de baixa massa molecular (< 30 kDa). Assim, pode-se concluir que a F0/90 é uma boa fonte de proteína alimentar quando comparada a outras fontes vegetais já utilizadas pela população. Além disso, as globulinas e albuminas de A. cearensis são fontes promissoras de proteínas bioativas que devem ser estudadas mais detalhadamente e em maior grau de pureza.

REBOUÇAS, D. M. Efeito do ácido abscísico nas bombas de prótons vacuolares e enzimas antioxidantes em Vigna unguiculata (L.) Walp. 2011. 67 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-26T21:29:35Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_dmrebouças.pdf: 1242528 bytes, checksum: 64e827398a79fef2785d3fdba8efdf5b (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-19T21:11:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_dmrebouças.pdf: 1242528 bytes, checksum: 64e827398a79fef2785d3fdba8efdf5b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-19T21:11:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_dmrebouças.pdf: 1242528 bytes, checksum: 64e827398a79fef2785d3fdba8efdf5b (MD5) Previous issue date: 2011 / Abscisic acid (ABA) is a phytohormone that plays critical roles in regulating plant responses to growth and development. The vacuole of higher plants is an organelle that occupies a larger part of the cell. The acidic condition is maintained by two distinct proton pumps, VATPase and V-PPase. It is known these proton pumps play essential roles in plant responses to environmental changes. The electrochemical gradient promoted by these enzymes is the driving force for the accumulation of ions and other solutes in the vacuole, being important to maintain cytosolic ion homeostasis and cellular metabolism. Antioxidant enzymes constitute a defense system against reactive oxygen species, which can cause damage to plant development. The aim of this study was to study the effect of the abscisic acid in the growth and physiological parameters, as well as the effect on vacuolar proton pumps and antioxidant enzymes (SOD, CAT and APX) from Vigna unguiculata cv. Pitiuba. The seeds of V. unguiculata were germinated in sand and grown for 15 days, with application of Hoagland solution in the absence (control) or presence of 0.1 µM ABA in the third, seventh and tenth days after germination.The effects of the abscisic acid (ABA) on the growth, stomatal conductance, transpiration, photosynthesis, internal CO2 concentration, V-ATPase subunit A and V-PPase activities and expression and antioxidant enzymes activities of Vigna unguiculata were analyzed. ABA increased the plants growth but did not affect the physiological parameters; induced an increase on V-ATPase hidrolytyc activity in leaves and on V-PPase in roots; ABA increased the transcripts of VuVHA-A and VuVHP in leaves and decreased the VuVHA-A transcripts in roots; caused increase in the leaves and roots catalase activity. These results suggest that the abscisic acid regulate the activity and the genes expression of the vacuolar proton pumps, as well as the antioxidant enzymes activity, being thus important effectors that regulate the development of V. unguiculata plants. / O ácido abscísico (ABA) é um fitohormônio que desempenha papéis críticos na regulação das respostas das plantas ao crescimento e desenvolvimento. O vacúolo de plantas superiores é uma organela que ocupa a maior parte da célula. A condição de acidez é mantida por duas bombas de prótons distintas, V-ATPase e V-PPase. Sabe-se que estas bombas de prótons desempenham um papel essencial nas respostas das plantas às mudanças ambientais. O gradiente eletroquímico promovido por essas enzimas é a força motriz para o acúmulo de íons e outros solutos no vacúolo, sendo importante para manter a homeostase citosólica de íons e o metabolismo celular. As enzimas antioxidantes constituem um sistema de defesa contra as espécies reativas de oxigênio, que podem provocar danos ao desenvolvimento das plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do ácido abscísico nos parâmetros de crescimento e fisiológicos, bem como o efeito na atividade hidrolítica e na expressão de transcritos das bombas de prótons vacuolares e na atividade de enzimas antioxidantes de plantas de Vigna unguiculata. As sementes de V. unguiculata foram germinadas em areia, onde cresceram por 15 dias, com aplicação de solução nutritiva de Hoagland na ausência (controle) ou presença de ABA 0,1 µM no terceiro, no sétimo e no décimo dias após a germinação. Os efeitos do ácido abscísico (ABA) sobre o crescimento, a condutância estomática, a transpiração, a fotossíntese, a concentração interna de CO2, a atividade e a expressão da subunidade A da V-ATPase e da V-PPase e a atividade de enzimas antioxidantes de Vigna unguiculata foram analisados. ABA aumentou o crescimento das plantas, mas não afetou os parâmetros fisiológicos; induziu um aumento na atividade hidrolítica da V-ATPase em folhas e da V- PPase em raízes; aumentou os transcritos de VuVHA-A e de VuVHP em folhas e diminuiu os transcritos de VuVHA-A em raízes e, por fim, causou aumento na atividade da catalase de folhas e de raízes. Esses resultados sugerem que o ácido abscísico regula a atividade e a expressão dos genes das bombas de prótons vacuolares, bem como as atividades de enzimas antioxidantes, sendo portanto importantes efetores que regulam o desenvolvimento de plantas de V. unguiculata.

MARQUES, E. C. Aclimatação de plantas de milho à salinidade mediada pelo pré-tratamento com nitroprussiato de sódio. 2013. 99f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-12-22T20:20:34Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_ecmarques.pdf: 3425020 bytes, checksum: c40c72166289fb8c960ae7853bdfdb2b (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-06T16:29:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_ecmarques.pdf: 3425020 bytes, checksum: c40c72166289fb8c960ae7853bdfdb2b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-06T16:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_ecmarques.pdf: 3425020 bytes, checksum: c40c72166289fb8c960ae7853bdfdb2b (MD5) Previous issue date: 2013 / This study was intended to evaluate the acclimation of maize (Zea mays) plants to salt stress, after pretreatment with sodium nitroprusside (SNP, a NO donor compound). The SNP concentration used was defined in an initial experiment, in which maize plants (variety BR 5011) were cultivated for two days in Hoagland solution plus NPS at 0 (not pretreated plants), 50, 75, 100 or 200 mM and then subjected to salt stress (NaCl at 0 or 80 mM). After seven days, the plants pretreated with NPS at 75 μM showed the best performance in saline conditions, considering that they had a higher growth, a lower lipid peroxidation in leaves, an increased K+ content and a lower Na+ content in shoots compared to other plants in saline conditions. Based on this, it was performed a second experiment, in which the maize acclimation mediated by the pretreatment with 75 μM SNP was evaluated after 7 and 14 days of stress salt (80 mM NaCl). The SNP-pretreatment resulted in an increased leaf area and a fastest growing in saline conditions as compared to non-pretreated plants, but this difference was observed only after 7 days of stress. Although salt stress have reduced stomatal conductance in both time periods, there was an increase in the net photosynthesis and transpiration when plants were pretreated with NPS. In general, the salt stress reduced the macronutrient content in plants, in both times of stress, but this was less evident in those who had been pretreated with NPS, especially after 7 days of stress. Oxidative damages in leaves and roots of maize plants have been partially mitigated by pretreatment with SNP. In saline conditions, the contents of ascorbate and glutathione were generally highest in plants pretreated with NPS than in non-pretreated. In general, the activity of superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase in leaves and roots of maize was reduced by pretreatment with SNP, and it also depended on the time of stress to which the plants were subjected. However, there was little correlation between pretreatment with SNP and induction of antioxidant system. The mass spectrometry-coupled liquid chromatography allowed the identification of several proteins in leaf and root tissues, including proteins involved in photosynthesis and oxidative metabolism and, in general, their expression was influenced by the conditions that plants were subjected. The pretreatment with SNP induced important changes in corn plants more closely related to the oxidative homeostasis that protection, which does not persist throughout plant development. / Neste estudo pretendeu-se avaliar a aclimatação de plantas de milho (Zea mays) à salinidade, após serem pré-tratadas com nitroprussiato de sódio (NPS, composto capaz de liberar óxido nítrico). A concentração de NPS utilizada foi definida em um primeiro experimento, no qual plantas de milho (variedade BR 5011) foram cultivadas por dois dias em solução nutritiva de Hoagland acrescida de NPS nas concentrações de 0 (plantas não pré-tratadas), 50, 75, 100 ou 200 µM, e submetidas depois à salinidade (NaCl a 0 ou 80 mM). Decorridos sete dias, as plantas pré-tratadas com NPS a 75 µM foram as que apresentaram melhor desempenho em condições salinas, tendo em vista que elas apresentaram um crescimento maior, uma menor peroxidação de lipídios nas folhas, um teor de K+ aumentado na planta e um menor teor de Na+ na parte aérea, em comparação às demais plantas nas condições salinas. Com base nisso, foi realizado um segundo experimento, no qual a aclimatação de plantas de milho, mediada pelo pré-tratamento com NPS a 75 µM, foi avaliada após 7 e 14 dias de estresse (NaCl a 80 mM). O pré-tratamento das plantas com NPS resultou em uma área foliar aumentada e em maior crescimento em condições salinas, em comparação às plantas não pré-tratadas, mas isso foi observado apenas aos 7 dias de estresse. Apesar de o estresse salino ter reduzido a condutância estomática das plantas nos dois tempos avaliados, houve aumento da fotossíntese líquida e da transpiração quando se pré-tratou as plantas com NPS. De modo geral, o estresse salino reduziu os teores de macronutrientes nas plantas de milho, em ambos os tempos de estresse, mas isso foi menos evidente naquelas que haviam sido pré-tratadas com NPS, especialmente aos 7 dias de estresse. Os danos oxidativos nas folhas e nas raízes das plantas de milho foram parcialmente atenuados pelo pré-tratamento com NPS. Nas condições salinas, os teores de ascorbato e glutationa foram geralmente maiores nas plantas pré-tratadas com NPS do que nas não pré-tratadas. De modo geral, a atividade das enzimas dismutase do superóxido, catalase e peroxidase do ascorbato nas folhas e nas raízes de milho foi reduzida pelo pré-tratamento com NPS, e isso também dependeu do tempo de estresse a que as plantas foram submetidas. No entanto, houve pouca correlação entre o pré-tratamento com NPS e a indução do sistema antioxidativo. A espectrometria de massas acoplada a cromatografia líquida permitiu a identificação de diversas proteínas nos tecidos foliares e radiculares, entre as quais, proteínas envolvidas com a fotossíntese e com o metabolismo oxidativo, e, de maneira geral, a expressão delas foi influenciada pelas condições a que as plantas estiveram sujeitas. O pré-tratamento com NPS induz alterações importantes nas plantas de milho, mais relacionadas à homeostase iônica que à defesa oxidativa, que não perduram ao longo do desenvolvimento da planta.

GONDIM, F. A. Pré-tratamento foliar com H2O2 como estratégia para minimizar os efeitos deletérios da salinidade em plantas de milho. 2012. 147 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-03-12T11:18:41Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_fagondim.pdf: 5363206 bytes, checksum: 294ead0f26d9ba5ef8aeedaf8788b237 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-11-30T17:56:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_fagondim.pdf: 5363206 bytes, checksum: 294ead0f26d9ba5ef8aeedaf8788b237 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-30T17:56:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_fagondim.pdf: 5363206 bytes, checksum: 294ead0f26d9ba5ef8aeedaf8788b237 (MD5) Previous issue date: 2012 / This study evaluated the effects of H2O2 leaf spraying pretreatment on the maize plant acclimation to salt stress, studying the physiological and biochemical mechanisms involved. The present thesis was divided into three independent experiments that resulted in three chapters, each one corresponding to a scientific article. The experiments were conducted under hydroponic conditions and maintained in greenhouse, the plant model used was triple hybrid of maize (Zea mays L.), BRS 3003. Eight days after sowing (DAS), the seedlings were sprayed with 10 mM H2O2 solution or distilled water (as a control). Forty-eight hours after the spraying beginning, the seedlings were subjected to treatment with NaCl at 80 mM. In the first study, we analyzed the effects of H2O2 leaf spraying pretreatment on the growth and on the levels of organic and inorganic solutes in maize plants under salt stress. It was observed that H2O2 leaf spraying pretreatment promoted plant acclimation to salt stress, reducing the deleterious effects of salinity on the maize growth. This effect can be attributed, at least partially, to a great production of proteins, and soluble carbohydrates and NO3- as well as lower levels of Cl- and Na+ in leaves. The second study evaluated the effects of H2O2 leaf spraying pretreatment on growth, antioxidative enzymes activity, lipid peroxidation (levels of malondialdehyde - MDA) and on the catalase expression (CAT) in maize plants under salt stress. It was observed that salinity reduced maize seedling growth when compared to control conditions, and H2O2 foliar spraying was effective in minimizing this effect. Analysis of the antioxidative enzymes (catalase, guaiacol peroxidase, ascorbate peroxidase and superoxide dismutase) revealed that H2O2 leaf spraying increased antioxidant enzyme activities. CAT was the most responsive of these enzymes to H2O2, with higher activity since the beginning of the treatment (48 h), while guaiacol peroxidase and ascorbate peroxidase were responsive only at later stages (240 h) of treatment. Increased CAT activity appears linked to gene expression regulation. Lower MDA levels were detected in plants with higher CAT activity, which may result from the protective function of this enzyme. Overall, we can conclude that pretreatment with H2O2 leaf spraying was able to reduce the deleterious salinity effects on seedling growth and lipid peroxidation. These responses could be attributed to the H2O2 ability to induce antioxidant defenses, especially CAT activity. The third study evaluated the effects of H2O2 leaf spraying pretreatment on leaf area, relative chlorophyll content, relative water content, gas exchange and on the H2O2, ascorbate and glutathione contents in salt-stressed maize plants. In general, the salinity reduced leaf area, relative chlorophyll content and relative water content of the maize plants in comparison to the plants that grew under control conditions, moreover H2O2 leaf spraying was effective in minimize this effect. The salt treatment reduced photosynthetic parameters and, the H2O2 leaf spray was able to partially reverse this effect. The H2O2 content was increased by salinity in both, leaves and roots, and H2O2 leaf spray was effective in reducing this negative effect. The H2O2 foliar application did not alter the redox state of the antioxidants studied (ascorbate and glutathione). / Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do pré-tratamento de pulverização foliar das plantas de milho com peróxido de hidrogênio (H2O2) sobre a aclimatação ao estresse salino, estudando os mecanismos fisiológicos e bioquímicos envolvidos. A presente tese foi dividida em três experimentos independentes que resultaram na produção de três capítulos, cada um correspondendo a um artigo científico. Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, sob condições hidropônicas, utilizando o híbrido triplo de milho (Zea mays L), BRS 3003. Oito dias após a semeadura, as plântulas foram pulverizadas com água destilada (controle) ou solução aquosa de H2O2 na concentração de 10 mM e, 48 h após o início da pulverização, foram submetidas ao tratamento com NaCl a 80 mM. No primeiro trabalho, foram estudados os efeitos da aplicação foliar de H2O2 no crescimento e nos teores de solutos orgânicos e inorgânicos de plantas de milho crescendo sob condições salinas. Verificou-se que o pré-tratamento de pulverização das plantas de milho com H2O2 induziu aclimatação das plantas de milho ao estresse salino, revertendo parcialmente os efeitos deletérios da salinidade no crescimento. Este efeito foi atribuído, pelo menos em parte, a um maior acúmulo de proteínas solúveis, carboidratos solúveis e NO3-, bem como a um menor acúmulo de íons tóxicos (Na+ e Cl-) nas folhas. O segundo trabalho avaliou os efeitos da aplicação foliar de H2O2 no crescimento, na atividade das enzimas antioxidativas, na peroxidação dos lipídios (teores de malondialdeído-MDA) e na expressão da enzima catalase (CAT) em plantas de milho sob condições de estresse salino. Constatou-se que a salinidade reduziu o crescimento das plantas e que a aplicação foliar de H2O2 minimizou este efeito. Observou-se também que as enzimas antioxidativas estudadas (catalase, peroxidase do guaiacol, perdoxidase do ascorbato e dismutase do superóxido) tiveram suas atividades aumentadas pela aplicação foliar de H2O2. A CAT se mostrou a principal enzima responsiva ao H2O2 e seu aumento de atividade parace estar relacionado à regulação da expressão gênica. Sob condições salinas, a menor peroxidação de lipídios foi encontrada nas plantas que apresentaram maiores atividades da CAT. De modo geral, concluiu-se que a pulverização foliar das plantas de milho com H2O2 foi capaz de reduzir os efeitos deletérios da salinidade no crescimento das plantas e na peroxidação dos lipídios. Essas respostas podem ser atribuídas, pelo menos em parte, à capacidade do H2O2 de induzir aumento na atividade e/ou expressão das enzimas antioxidativas, especialmente a CAT. O terceiro trabalho analisou os efeitos da aplicação foliar de H2O2 na área foliar, nos teores relativos de clorofila, nos teores relativos de água, nas trocas gasosas e nos teores de H2O2, ascorbato e glutationa de plantas de milho crescendo sob condições salinas. De modo geral, a salinidade reduziu a área foliar, os teores relativos de clorofila e os teores relativos de água e a pulverização foliar com H2O2 foi eficaz em minimizar esse efeito. A salinidade reduziu os parâmetros fotossintéticos (condutância estomática, transpiração, fotossíntese e concentração interna de CO2) e o pré-tratamento de pulverização das plantas com H2O2 foi capaz de reverter parcialmente esse efeito. Os teores de H2O2 foram aumentados pela salinidade tanto nas folhas como nas raízes e a pulverização foliar com H2O2 mostrou-se eficiente em reduzir este efeito, sem, contudo, alterar o estado redox dos antioxidantes analisados (ascorbato e glutationa).

SILVA, F. D. A. Caracterização bioquímica e molecular de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers]. 2011. 104 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-03-12T11:33:18Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_fdasilva.pdf: 2610057 bytes, checksum: 7d820816e20ddbbc55e76ef2b7175733 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-29T20:48:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_fdasilva.pdf: 2610057 bytes, checksum: 7d820816e20ddbbc55e76ef2b7175733 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-29T20:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_fdasilva.pdf: 2610057 bytes, checksum: 7d820816e20ddbbc55e76ef2b7175733 (MD5) Previous issue date: 2011 / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers] é uma das culturas de grande importância para a região Nordeste, pois representa um dos constituintes básicos da dieta de sua população. Embora a produção venha aumentando anualmente no país, a cultura enfrenta diversos tipos de estresses de natureza biótica e abiótica. Durante condições de estresses, espécies reativas de oxigênio (ROS) são produzidas acima da condição fisiológica, como consequência de alterações do metabolismo. O acúmulo de ROS, em vários tecidos, é nocivo para ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos. Sendo assim, a busca de mecanismos que atuem na remoção e controle da produção dessas espécies reativas é de fundamental importância. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar, nos seus aspectos bioquímicos, fisiológicos e moleculares, uma enzima antioxidante de folhas de feijão-de-corda, denominada de 2-cis-peroxirredoxina, que atua reduzindo o peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroperóxidos de alquil, produzindo água ou álcool, respectivamente. A 2-cis-peroxirredoxina purificada de folha de V. unguiculata, nomeada de Vu-2-cis-prx, foi obtida por fracionamento com sulfato de amônio (30-60%), cromatografia de afinidade em matriz de quitina e cromatografia de troca iônica em Resource Q. A Vu-2-cis-prx foi capaz de reduzir hidroperóxidos usando o poder redutor do NADPH e do DTT com auxílio do sistema tioredoxina. Apresentou massa molecular de, aproximadamente, 44 kDa/46 kDa, determinada por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão molecular em coluna Superose 12, respectivamente. Já em condições redutoras, apresentou massa molecular de 22 kDa, indicativo de se tratar de uma proteína homodimérica, formada pelo estabelecimento de pontes dissulfeto intermoleculares. A Vu-2-cis-Prx apresentou pI de cerca de 4,7 e a análise por eletroforese bidimensional, com e sem DTT, revelou que a Vu-2-cis-Prx foi focalizada em vários spots protéicos, indicando diferentes estados de oxidação. Sua sequência N-terminal revelou haver similaridade de 96% com a peroxirredoxina de Phaseolus vulgaris e de Populus tricocarpa, e de 94% com aquelas de Vigna radiata, Pisum sativum, Ricinus cummunis e Nicitiana tabacum, além de um resíduo de cisteína altamente conservado na posição 52 (Cys52). Análises por ESI-Q-TOF MS/MS demonstrou massa molecular e pI de 28,622 kDa/5,18, respectivamente. O espectro de dicroísmo circular e desconvolução em pH 7,0 revelaram que a estrutura secundária é composta de 7,6% de ?-hélice, 39% de folha-?, 22,1% de volta-?, e 31% de padrão não ordenado. A Vu-2-cis-Prx se comportou estável ao calor e apresentou temperatura de desnaturação (Tm) de 74 °C. Apresentou, ainda, ótimo de atividade em pH 7.0 e mudanças estruturais e funcionais em pH 3 e 9. Vu-2-cis-Prx não foi capaz de apresentar atividade antifúngica contra Colletrotrichum gloeosporioides, contudo foi capaz de prevenir a degradação de DNA plamidial por ROS (H2O2). Os transcritos de Vu-2-cis-Prx foram altamente expressos em raízes, caules e folhas e a sequência de seu gene demonstrou 100% de homologia com os ESTs FG931548.1 e FG883990.1 de feijão-de-corda, depositados no NCBI. A sequência putativa de aminoácidos revelou 2 resíduos de cisteína conservados e diversos domínios típicos de membros da subfamília de 2-cis-peroxirredoxinas. Modelagem molecular da Vu-2-cis-Prx revelou que o resíduo de cisteína que participa do sítio-redox, denominada de cisteína peroxidásica, está em um bolso no qual o solvente tem acesso, sendo formado por um motivo “loop-hélice”. A Cys52 foi localizada na primeira volta da hélice rodeada pelos aminoácidos Pro45, Thr49 e Arg128, que são conservados em todas as 2-cis-peroxirredoxinas. Além disso, a Vu-2-cis-Prx se mostrou capaz de formar oligômeros com diferentes estados de oxidação. Em suma, foi descrito aqui, pela primeira vez, a purificação e caracterização de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijão-de-corda que, semelhantemente a outros membros desta família, deve desempenhar papel crucial na protecção dos cloroplastos de plantas contra o estresse foto-oxidativo prevenindo, assim, danos ao aparato fotossíntético.