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Identifica si existe alguna asociación entre estos factores y el compromiso de la función motora. Sabiéndose que la recuperación de la función motora antecede a la recuperación funcional. Estudio de tipo observacional, descriptivo - correlacional y de corte transversal. La muestra estudiada está conformada por 50 pacientes post accidente cerebro vascular (ACV) en estadio crónico del Hospital Nacional Hipólito Unánue, durante el periodo noviembre - diciembre del 2016. Los factores pronósticos son recolectados mediante la revisión de historias clínicas y la función motora es medida mediante la subescala motora de Fugl Meyer. Para relacionar los factores pronósticos (tipo de ACV, hemisferio afectado, edad y sexo) con el compromiso de la función motora (leve, moderada, severa, muy severa), utiliza la prueba estadística del Chi-cuadrado teniendo en cuenta un valor p<0.05. / Tesis

El presente documento reporta el resultado del estudio técnico-económico, a nivel exploratorio, del diseño de una biorefinería para producir bioetanol y los siguientes coproductos: furfural, lignina glioxalada y residuos de levadura. Estos coproductos fueron introducidos en el proceso a evaluar, para ver si la producción de bioetanol, junto a la generación de otros productos, es sustentable económicamente. Las constantes variaciones en el precio del petróleo, lo altos niveles de CO2 que contribuyen a la crisis ambiental y el agotamiento inevitable de los recursos fósiles en el futuro, han impulsado la búsqueda de nuevas fuentes que permitan diversificar la matriz energética en Chile. Es así como surge la idea de estudiar el potencial uso del bioetanol, que es un biocombustible que tiene la capacidad de sustituir la gasolina tradicional. La ley en Chile permitirá una mezcla E5 de combustible que estará libre de impuestos, que significa 5% de bioetanol y 95% de gasolina tradicional. En este trabajo se seleccionó como materia prima el residuo de eucalipto por su potencial y versatilidad de adaptación al suelo chileno. Además, se determinó la región favorable para la instalación de la biorefinería, la cual estará ubicada en la comuna de Angol en la IX Región del país. La planta podría procesar anualmente 420 mil toneladas de residuos de eucalipto, con la cual se podría producir cerca de 80 mil m3 de bioetanol, que representa un 48% de la demanda estimada para el 2010 en Chile suponiendo un combustible E5. Además el balance de masa muestra que se producen 51 mil toneladas de furfural, 570 mil de lignina glioxalada, 78 mil de residuo de levadura y 85 mil de CO2. El diseño conceptual de la biorefinería se efectuó usando como pretratamiento la explosión a vapor por poseer mejores rendimientos industrialmente, superiores al 80%. Para la detoxificación se ocupa hidróxido de calcio, compuesto que logra la precipitación de inhibidores normalmente producidos en el pretratamiento. Para la fermentación se escogió el método de sacarificación y fermentación simultánea ocupando la cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae Red Star. Para la sacarificación se ocupa kit de celulasa comercial. El proceso tiene un rendimiento de 200 lt de bioetanol por tonelada de materia prima que se obtiene a 80 horas de fermentación y a una temperatura de 37 ° C. Para esta etapa se ocuparán 24 fermentadores (reactores batch) de 200 m3 cada uno. Para la destilación del bioetanol se ocupa 2 torres de destilación de 39 platos cada una, en donde en la primera se elimina la mayor cantidad de CO2, y en la segunda se retira agua obteniendo bioetanol al 95,4%. Del estudio técnico-económico resultó una inversión inicial de US$140 MM. El proyecto fue evaluado en un plazo de 20 años, con una tasa de descuento del 15% y bajo dos modos de financiamiento. El primer modo de financiamiento en donde la inversión es hecha en un 100% por interesados, mostró que el precio del bioetanol al que se debe vender para obtener un VAN igual a cero, es de 1.255 US$/m3, precio que es mayor al que se estima que se venderá el bioetanol en Chile (1.150 US$/m3), por ende este modelo no tendría ganancias. El otro modelo evaluado consistió en un financiamiento hecho con un 40% por préstamo bancario. En este modelo se obtuvo un precio del bioetanol igual a 1.055 US$/m3 para obtener un VAN igual a cero, una TIR del 15% y un periodo de recuperación de capital de 7 años. Este precio se considera poco rentable ya que es ligeramente menor al precio al cual se vendería el bioetanol en Chile (1.150 US$/m3), con lo que el VAN no sería superior a US$36 MM con una TIR del 20%. El modelo de biorefinería presentado parece no tener atractivos económicos para los inversionistas, pero bajo condiciones distintas como un alza importante en el precio del petróleo, una baja en el precio de las enzimas, pueden ser cruciales para obtener beneficios económicos importantes. Finalmente se recomienda profundizar la elección de los coproductos y de las tecnologías involucradas en el proceso con el fin de poder encontrar una configuración económica interesante.

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Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha cobrado gran importancia en la industria biotecnológica, dada su capacidad de producir proteínas recombinantes compatibles con su uso terapéutico en humanos. Este potencial ha motivado la búsqueda de estrategias para la optimización de los procesos cuyo objetivo es la síntesis de grandes cantidades de proteínas con aplicaciones biomédicas. Una de las estrategias utilizadas corresponde al cultivo en fuentes alternativas de carbono, tales como galactosa, las que al ser consumidas lentamente llevan a la obtención de un metabolismo más eficiente, con una reducción de la acumulación metabolitos inhibitorios tanto del crecimiento celular como de la síntesis del producto. Sin embargo, se ha observado que estos cultivos presentan baja velocidad de crecimiento por lo que es necesario suplementar estos medios con glucosa o realizar modificaciones al metabolismo celular de forma de obtener cultivos con mayores rendimientos. Para la obtención de una línea celular que presente un desempeño mejorado en cultivos con galactosa, se transfectaron células CHO de forma de sobre-expresar proteínas asociadas a pasos previamente reportados como limitantes del metabolismo de la galactosa, específicamente el transportador Slc2a8 y galactoquinasa Galk1. No se tuvieron resultados concluyentes con respecto a la sobre-expresión del transportador Slc2a8, debido a que el pool de clones obtenidos luego de la transfección no mantuvo su viabilidad durante tiempo suficiente para caracterizar su comportamiento en cultivo. Por otro lado, los resultados obtenidos mostraron que los clones seleccionados (CHO-Galk1) alcanzan mayor densidad celular en cultivos desarrollados en medio con glucosa y galactosa, además de ser capaces de crecer en un medio que sólo presenta galactosa, contrario a lo observado en la línea parental. Las células CHO-Galk1-2 presentan una mayor concentración de producto, llegando a sintetizar un 42% más de tPA que el control. El aumento más drástico de tasa de producción está asociado a la fase de crecimiento en galactosa. Los resultados obtenidos para el metabolismo de glucosa del clon CHO-Galk1-2 presentan diferencias con respecto al cultivo control, por lo que se plantea que la sobre-expresión de este gen puede tener efectos positivos en el metabolismo de glucosa. El análisis de flujos metabólicos permite observar un metabolismo eficiente, centrado en la producción de energía, asociado a un alto flujo en el ciclo del TCA, producción de biomasa y producto.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la glicemia sérica a 1 y 2 horas de la extracción venosa y su relación con el nivel de hematocrito. Se realiza un estudio cuantitativo, descriptivo, observacional, correlacional y prospectivo. Se recolecta la muestra de sangre en 3 tubos con activador de la coagulación y 2 capilares por cada uno de los 100 participantes. Uno de los tubos es centrifugado a los 15 minutos (tiempo esperado para la retracción del coagulo) de la toma de muestra, y son codificados y rotulados como tiempo 0 horas, una hora después de centrifugado el primer tubo se centrifuga. El segundo tubo, de igual modo es codificado y rotulado como 1 hora, de la misma manera con el 3er tubo a la 2da hora. Los tubos son congelados, inmediatamente después de haber sido centrifugados y separados, hasta el momento de su procesamiento. Mientras que el hematocrito es determinado mediante la micro centrifugación de los capilares. En muestras de población normoglicémica con hematocrito entre 35 a 37% la variación promedio de glucosa a 1 hora es de 3,6 mg/dL y a las 2 horas es de 6,8.mg/dL. La variación promedio de glucosa en las muestras con hematocrito entre 38 a 50% es de 6,8 mg/dL y 11,9 mg/dl a 1 y 2 horas respectivamente. En muestras de población hiperglicemica no se encuentra diferencia significativa en la variación de glucosa, entre las muestras con diferentes niveles de hematocrito, siendo la variación de glucosa promedio 8,2 mg/dL a 1 hora y 13,8 mg/dL a las 2 horas, en las muestras con hematocrito de 35 a 50 %. Se determina que tanto en muestras normoglicémicas como hiperglicémicas, a mayor hematocrito existe mayor consumo de glucosa con correlación baja. / Tesis

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / La enzima L-asparaginasa II, que hidroliza L-asparagina en ácido aspártico y amonio, es utilizada actualmente como agente quimioterapéutico, en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloblastica aguda (LLA), linfoma no Hodgkin, melanosarcoma y carcinoma hepatocelular entre otros, dado su efecto antineoplásico sobre ciertos tipos de células tumorales que son incapaces de producir L-asparagina y dependen de la circulante para su proliferación. A pesar de su rol exitoso en el tratamiento de estas enfermedades, su uso es constantemente reevaluado ya que genera efectos secundarios, asociados a la actividad inespecífica de la enzima sobre un segundo sustrato estructuralmente similar a la Lasparagina, la glutamina, generando pancreatitis, disfunción renal, trombosis, hemorragia y reacciones de hipersensibilidad. Además, otro factor que afecta su uso en tratamientos a largo plazo es la generación de anticuerpos en los tejidos posterior a su aplicación, neutralizando su efecto sobre células tumorales. La presencia de esta enzima se ha descrito en diversos organismos, siendo las actualmente utilizadas las producidas por microorganismos. Entre ellos, las bacterias marinas del orden actinobacteria son de gran interés, ya que se han descrito Lasparaginasas II sin actividad glutaminasa. Dado el interés por encontrar nuevas asparaginasas con baja o nula actividad glutaminasa es que se estudió una nueva Lasparaginasa II descrita en el genoma de la actinobacteria Salinispora tropica CNB 440 que hasta el momento no ha sido caracterizada. Para ello el gen que codifica la enzima L-asparaginasa II fue amplificado a partir del genoma de S. tropica CNB 440 y clonado en el vector de expresión pET22b(+), con el cual se quimiotransformó cepas de E. coli BL21(DE3) quimiocompetentes. Dada la presencia de inducción basal, las cepas fueron co-transformadas con el vector pLysS, obteniendo colonias doble transformantes de E. coli BL21(DE3) ASPII/pLysS, solucionando este problema. Posteriormente se indujo la expresión del constructo en células co-transformadas con IPTG, obteniendo la expresión de la proteína recombinante de forma soluble para los cultivos inducidos a 25ºC con 0.1 y 0.2 mM de IPTG. Luego se evaluó la actividad a 37ºC de la enzima L-asparaginasa II a partir de extractos crudos de los cultivos anteriores, mediante Nesslerización para los sustratos L-asparagina y L-glutamina, obteniendo exclusivamente actividad asparaginasa por parte de la enzima. Luego se realizó purificación de la proteína recombinante mediante cromatografía en columna Ni-NTA, obteniendo muchas proteínas contaminantes, por lo que se utilizó la técnica de cromatografía Ni-NTA en batch, para aumentar la especificidad por la proteína recombinante; sin embargo, su correcta purificación no fue posible. Finalmente se realizó una estimación de la actividad enzimática a partir de la muestra de extracto crudo inducido a 25ºC con 0.1 mM de IPTG, obteniéndose una actividad específica de la Lasparaginasa II de 117,81 U/mg y no actividad sobre L-glutamina. / The enzyme L-asparaginase II, which hydrolyzes L-asparagine to aspartic acid and ammonium, is currently used as a chemotherapeutic agent in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, acute myeloblastic leukemia, non-Hodgkin lymphoma, melanosarcoma and hepatocellular carcinoma, among others, due to its antineoplastic effect on certain types of tumor cells that are incapable of producing L-asparagine and depend on the circulating L-asparagine for their proliferation. Despite its successful role in the treatment of these diseases, its use is constantly reevaluated since it generates secondary effects, associated with the specificity of the enzyme to a second substrate due to its structural similarity, glutamine. These effects include pancreatitis, renal dysfunction, thrombosis, hemorrhage and hypersensitivity reactions. In addition, another factor that affects its use in long-term treatments is the generation of antibodies in the tissues after its application, neutralizing its effect on tumor cells. Asparaginases are distributed among living organisms, and those produced by microorganisms are currently used. Among them, marine bacteria of the actinobacteria order are of great interest, since L-asparaginases II without glutaminase activity has been reported. Given the interest in finding new asparaginases with low or no glutaminase activity, a new L-asparaginase II described in the genome of the actinomycete Salinispora tropica CNB 440 that has not been characterized yet, was studied. To accomplish this, the gene coding for the enzyme L-asparaginase II was amplified from the genome of S. tropica CNB 440 and cloned into the expression vector pET22b(+), which was used to chemotransform chemocompetent E. coli BL21 (DE3) strains. Given the presence of basal induction, the strains were co-transformed with the vector pLysS, obtaining double transformant colonies named E. coli BL21(DE3) ASPII/pLysS, solving this problem. Subsequently, the expression of the construct was induced with IPTG in cotransformed cells, obtaining the expression of the recombinant protein in a soluble form for the cultures induced at 25 ° C with 0.1 and 0.2 mM of IPTG. The activity at 37ºC of the enzyme L-asparaginase II was evaluated from crude extracts of the cultures, by Nesslerization for the substrates L-asparagine and L-glutamine, obtaining only asparaginase as enzymatic activity. Purification of the recombinant protein was initially performed by Ni-NTA column chromatography, obtaining a low-purity recombinant protein, so the technique was varied to Ni-NTA chromatography in batch, to increase the affinity for the asparaginase. However, its correct purification was not possible. Finally, an estimation of the enzymatic activity was made from crude extract induced at 25°C with 0.1 mM of IPTG, obtaining a specific activity of L-asparaginase II of 117.81 U/mg, and no activity on L-glutamine.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La 4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina quinasa (HMPK, EC 2.7.1.49) es una enzima perteneciente a la superfamilia riboquinasa y participa en la biosíntesis de tiamina (vitamina B1) en bacterias. Se ha descrito que esta enzima es capaz de catalizar dos fosforilaciones consecutivas dependientes de ATP altamente específicas sobre el sustrato hidroximetil pirimidina (HMP), generando como producto hidroximetil pirimidina pirofosfato. Esto contrasta notablemente con lo que se ha observado en las piridoxal quinasas de bacterias Gram positivas (HMPK/PLK, EC 2.7.1.35), un grupo de enzimas homólogas cercanas capaces de fosforilar hidroximetil pirimidina, piridoxal, piridoxina y piridoxamina, pero incapaces de catalizar dos fosforilaciones consecutivas, por lo que sólo producen hidroximetil pirimidina fosfato. Las HMPKs no han sido estudiadas tan exhaustivamente como las HMPK/PLKs y sólo hay dos caracterizaciones breves disponibles en la literatura; la de la HMPK de Escherichia coli y la de Bacillus subtilis. Por lo tanto, aún no se conoce si las propiedades observadas en las enzimas descritas son ubicuas para linajes bacterianos distintos, especialmente aquellos filogenéticamente distantes y que han sido sometido a presiones selectivas fuertes, como los extremófilos. Por esta razón, en este trabajo se realizó la caracterización bioquímica de la HMPK de la enterobacteria Salmonella typhimurium (StHMPK) y de la bacteria termófila Thermus thermophilus (TtHMPK). A través de experimentos de estequiometría de reacción y análisis de generación de productos, se demostró que ambas enzimas son capaces de catalizar dos fosforilaciones consecutivas. Experimentos de especificidad de sustrato revelaron que ambas enzimas son altamente específicas por hidroximetil pirimidina. Análisis filogenéticos mostraron que estas enzimas están estrechamente relacionadas con las HMPKs/PLK de organismos gram positivos, y estas últimas parecen ser descendientes directos de las HMPKs. Por lo tanto, para estudiar cómo estos grupos de enzimas han divergido en términos de sus actividades catalíticas, se realizaron simulaciones de dinámica molecular del complejo ternario (Mg·ATP - HMP) de StHMPK, para analizar el sitio de unión a sustrato y compararlo con el de la HMPK/PLK de Staphylococcus aureus (SaPLK). Los resultados mostraron que existe un alto grado de conservación entre ambos sitios, existiendo sólo unas pocas diferencias que podrían explicar la divergencia funcional observada, principalmente la presencia de una treonina adyacente a la base catalítica en StHMPK, que es reemplazada por una alanina en SaPLK, y la presencia de una glutamina en StHMPK que forma puentes de hidrógeno con el HMP. La caracterización cinética de StHMPK y TtHMPK mostró que ambas enzimas poseen una KM similar para HMP (cercana a 30μM) y que la Vmax para TtHMPK es un orden de magnitud menor que para StHMPK a 37 °C. Sin embargo, estos parámetros fueron obtenidos para las curvas de saturación de HMP, las cuales mostraban un comportamiento del tipo Michaelis-Menten, mientras que las curvas de saturación para ATP mostraron una clara desviación de este modelo y por lo tanto, no se pudieron determinar parámetros cinéticos. Finalmente, se realizó una caracterización estructural y biofísica para evaluar diferencias de estabilidad. Ambas enzimas parecen ser monómeros en las condiciones estudiadas, a diferencia de lo reportado para la enzima de E. coli que forma un tetrámero. Experimentos de desplegamiento por temperatura y agentes químicos mostraron que TtHMPK es significativamente más estable que StHMPK. Las bases estructurales de estas diferencias fueron analizadas mediante simulaciones de dinámica molecular, las que revelaron que la proteína termoestable es más rígida, tiene un menor contenido de residuos polares en el núcleo y tiene mayor cantidad de interacciones electrostáticas que su homólogo mesoestable. / 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine kinase (HMPK, EC 2.7.1.49) is a bacterial enzyme that belongs to the ribokinase superfamily and participates in the thiamine (vitamine B1) biosynthetic pathway. It has been described that this enzyme is capable to catalyze two consecutive highly specific ATP dependent phosphorylations on the substrate hydroxymethyl pyrimidine, yielding hydroxymethyl pyrimidine pyrophosphate. This contrast notoriously with what has been observed for the closely related homologous enzymes pyridoxal kinases from Gram positive bacteria (HMPK/PLK, EC 2.7.1.35), which can phosphorylate hydroxymethyl pyrimidine, pyridoxal, pyridoxine and pyridoxamine, but are unable to catalyze two consecutive phosphorylations, thus only produce hydroxymethyl pyrimidine phosphate. HMPKs have not been as extensively studied as HMPKs/PLK, and only two brief biochemical characterizations are available on the literature; the characterization of the HMPK from Escherichia coli and from Bacillus subtilis. Therefore, it is still unknown whether the properties observed in the described enzymes are ubiquitous among different bacterial lineages, especially those that come from a very distinct phylogenetic background and have been subject to strong selective pressures, as the enzymes from extremophilic organisms. For this reason, in this work we address the biochemical characterization of the HMPK from the enterobacteria Salmonella typhimurium (StHMPK) and the thermophilic bacteria Thermus thermophilus (TtHMPK). Through stoichiometric experiments and product generation analysis, it was established that both enzymes are able to perform two consecutive phosphorylations. Substrate specificity experiments revealed that both enzymes are highly specific for hydroxymethyl pyrimidine. Phylogenetic analysis of these enzymes showed that are closely related to HMPKs/PLK from Gram positive organisms, being the later a direct descendant from HMPKs. Therefore, to study how these two groups of enzymes have diverged so much in terms of their catalytic activities, we analysed the substrate binding site of StHMPK by molecular dynamics simulations of the ternary complex (Mg·ATP - HMP) and compared it to the binding site of the PLK from Staphylococcus aureus (SaPLK). The results showed that there is an overall great conservation among the active sites, with just a few differences that could be responsible for the functional divergences observed, mainly the presence of a threonine residue adjacent to the catalytic base in StHMPK which is replaced by an alanine in SaPLK, and the presence of a glutamine that forms hydrogen bonds with the HMP in StHMPK. Kinetic characterization of StHMPK and TtHMPK showed that both enzymes have a similar KM for HMP (around 30 μM) while the Vmax for TtHMPK is one order of magnitude lower than the Vmax for StHMPK. However, these parameters were obtained only for HMP saturation curves, which showed a Michaelis-Menten behaviour, whereas ATP saturation curves displayed a clear deviation from a Michaelis-Menten model and therefore, no kinetic parameters could be deduced from these experiments. Finally, a biophysical and structural characterization to assess stability differences was performed. Both enzymes seem to be in monomeric state under the conditions assayed, in contrast with what was reported for the enzyme from E. coli, which forms a tetramer. Thermal and chemical unfolding experiments showed that TtHMPK is significantly more stable than StHMPK. The structural basis for these differences were investigated through molecular dynamics simulations, which revealed that the thermostable protein is more rigid, has a reduced content of polar amino acids in its core, and has more electrostatic interactions than its mesostable homologous. / Julio del 2019

Tesis para optar al grado de Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / La macroalga parda Macrocystis pyrifera es una especie de algas marinas que posee una amplia distribución en aguas templadas y frías tanto del hemisferio norte como sur, formando bosques productivos de alta diversidad biológica. En Chile M. pyrifera se distribuye a lo largo de la costa desde Iquique al Cabo de Hornos. La importancia comercial de esta especie se ha incrementado en la última década, especialmente en la extracción de alginato y su uso como alimento de abalones. El alga se compone principalmente de carbohidratos heterogéneos (> 50% peso seco del alga) como fucoidano, alginato y laminarina, los cuales pueden ser empleados como plataforma para la producción de variados compuestos. Además, posee compuestos polifenólicos únicos en su especie conocidos como florotaninos los cuales han sido ampliamente estudiados por sus beneficios potenciales para la salud como anti-oxidantes, anti-cáncer, anti-diabetes, anti-inflamación y anti-microbianas, entre otras. En este trabajo se estudió el diseño de un proceso de extracción de florotaninos y carbohidratos desde M. pyrifera, usando enzimas marinas en la etapa de hidrolisis de los carbohidratos. Para lo cual se procedió en un primer paso a determinar condiciones que mejoran la extracción de florotaninos desde el alga, tales como temperatura de secado del alga, parámetros de extracción e identificación de los compuestos. En una segunda etapa se optimizó la producción de enzimas carbohidrasas, alginato liasa, fucoidanasa y 1,3-β-D-glucanasa, desde microorganismos marinos asociado a la macroalga, para ser empleadas posteriormente en el pre-tratamiento enzimático de M. pyrifera. En una tercera etapa se determinó condiciones de extracción simultánea de carbohidratos y florotaninos desde el alga incorporando la etapa previa de pre-tratamiento enzimático. Finalmente, se estudió la separación de florotaninos desde el extracto final usando resinas macroporosas. La evaluación de estas etapas permitió determinar que un pre-tratamiento enzimático del alga con carbohidrasas, producidas por el hongo marino Alternaria sp, a 25°C por 36 horas a un pH 7.0 y una razón alga/extracto enzimático de 1/20, seguido por extracción alcalina de fase solida con NaOH 0.5N a 100°C por 180 min en una razón sólido/líquido de 1/20. Obteniendo un extracto con concentración final de 452 mg carbohidrato/g alga y 2.14 mg florotaninos/g alga, lo cual representa un rendimiento de extracción específico de 89.6% para carbohidratos y 21.4% para florotaninos. Posteriormente, el uso de resina XAD-16N permitió la separación del 42% de los florotaninos desde el extracto. La fracción enriquecida en florotaninos fue liofilizada presentando una concentración de 14.2 mg florotaninos/g liofilizado. / The brown macroalgae Macrocystis pyrifera is a kind of seaweed that has a wide distribution in temperate and cold waters of both the Northern and Southern hemispheres, forming productive forests of high biological diversity. In Chile M. pyrifera it is distributed along the coast from Iquique to Cape Horn. The commercial importance of this species has increased in the last decade, especially in alginate extraction and use as food abalones. M. pyrifera (>50 % of the alga dry weight) as fucoidan, laminarin and alginate, which can be used as a platform for the production of many compounds is mainly composed of heterogeneous carbohydrate. In addition, the brown seaweeds have unique polyphenolic compounds in their species known as phlorotannins which have been widely studied for their potential health benefits such as prevention of oxidative stress-mediated radical, anti-cancer, anti-diabetes, anti-inflammation and anti-microbial, among others. In this work was studied in this paper the design of an extraction process phlorotannins and carbohydrates from Macrocystis pyrifera, using marine enzymes in the hydrolysis step carbohydrates. For which we proceeded in a first step to determine the conditions that improve phlorotannins extraction from algae such as seaweed drying temperature, parameters extraction and identification of compounds. In a second stage production carbohydrate active enzymes, alginate lyase, fucoidanase and 1,3-β-D-glucanase was optimized from microorganisms associated with marine macroalgae, to be employed subsequently in the enzymatic pretreatment of M. pyrifera. In a third stage of simultaneous extraction conditions of carbohydrate and phlorotannins was determined from M. pyrifera incorporating the previous stage enzymatic pretreatment. Finally, the separation of phlorotannins was studied from the final extract using macroporous resins. Evaluation of these stages allowed to determine that an enzymatic pretreatment with carbohydrate active enzymes, alginate, fucoidanasa and 1,3-β-D-glucanase produced by the marine fungus Alternaria sp, at 25°C for 36 hours pH 7.0 and algae/enzyme extract of 1/20, followed by alkaline extraction of the solid phase with 0.5 N NaOH at 100°C for 180 min in a solid/liquid ratio of 1/20 allowed obtain a final extract with a concentration 452 mg carbohydrate/g of alga and 2.14 mg phlorotannins/g of alga, which represents a specific extraction yield of 89.6% for carbohydrates and 21.4% for phlorotannins. Subsequently, the use of macroporous resin XAD- 16N allowed separation of the 42% of phlorotannins from the extract. Finally, the enriched fraction with phlorotannins was lyophilized presenting a concentration of 14.2 mg phlorotannins/g lyophilized. / Este trabajo es financiado por una beca CONICYT para estudio de doctorado en Chile, el proyecto AKA-ERNC 0009 OPTIFU; y por el Centro Basal financiado por CONICYT CeBiB FB0001

El trabajo incluido en esta tesis está encuadrado en un proyecto cuyo objetivo general es el desarrollo de un vector viral eficiente de expresión o silenciamiento de genes, basado en el virus del manchado foliar de los cítricos (Citrus leaf blotch virus, CLBV). Para desarrollar un vector viral a partir del genoma de CLBV era necesario disponer de un clon infeccioso del virus y de métodos eficientes de inoculación del mismo en plantas de cítricos. Se construyó un clon infeccioso de cDNA del genoma completo de CLBV bajo el promotor T7 del fago lambda y se pusieron a punto protocolos para el aislamiento de protoplastos de N. benthamiana, N. occidentalis y cidro Etrog. CLBV replicó en protoplastos de las tres especies transfectados con viriones purificados, aunque el nivel de replicación fue muy bajo y sólo se detectó a partir de 4-5 días post inoculación (dpi), que es el tiempo máximo de supervivencia de los protoplastos en nuestras condiciones de trabajo. La multiplicación del virus en protoplastos inoculados con transcritos de CLBV fue menor, detectándose sólo en algunos experimentos de transfección de protoplastos de N. benthamiana. Finalmente, la inoculación mecánica directa de plantas de cítricos o de N. benthamiana y N. occidentalis con transcritos de RNA del virus fue infructuosa, a pesar de que estos transcritos eran capaces de infectar protoplastos. Antes de modificar el clon infeccioso de CLBV para convertirlo en un vector viral eficiente, era necesario conocer la estrategia de expresión del genoma viral y caracterizar las secuencias implicadas en el reconocimiento y promoción de la síntesis de los RNAs subgenómicos (sgRNAs) para poder duplicar un promotor y expresar genes o fragmentos de genes mediante la formación de un nuevo sgRNA. Para mapear el promotor del CP-sgRNA de CLBV se construyeron varios mutantes a partir del clon IC-CLBV (clon infeccioso del genoma completo de CLBV bajo el promotor 35S de CaMV) mediante supresión de nucleótidos y mutagénesis dirigida. / Renovell Ferrer, MÁ. (2010). El virus del manchado foliar de los cítricos: caracterización del promotor del RNA subgenómico del gen de la proteína de la cápsida y del supresor del silenciamiento de RNA [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7324 / Palancia