A biotecnologia está revolucionando a atividade humana nas mais diversas áreas. No setor florestal, as novas tecnologias como transgenia, genômica, proteômica e bioinformática, estão sendo rapidamente incorporadas. A associação dessas tecnologias aos programas de melhoramento convencional de árvores pode acelerar o processo de obtenção de árvores com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. UDP-glicose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glicose, intermediário na interconversão de carboidratos envolvidos em várias funções metabólicas, como síntese de sacarose e de celulose. No presente trabalho, foi clonado o cDNA que codifica a UGPase. Este cDNA foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando-se mRNA extraído de tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.). Os primers específicos para a ORF do gene da UGPase foram definidos com base em seqüências conservadas entre genes ortólogos, já disponíveis em bancos de dados. O cDNA foi clonado no vetor pENTR-D TOPO e inserido, por meio de transformação química, em células competentes de Escherichia coli. O DNA plasmidial foi purificado e após seu sequenciamento, a presença de um inserto de 1402 pb foi confirmada. O alinhamento da seqüência deduzida de aminoácidos com outras UGPases revelou alta homologia a UGPases de batata e de outras espécies vegetais. Na seqüência do cDNA clonado foram identificados sítios de N-glicosilação, resíduos lisina e motivos conservados que possivelmente estão relacionados tanto com a capacidade de ligação ao substrato, como com a atividade catalítica da enzima. Também foi realizada uma análise de Southern blot para confirmar a presença deste gene no DNA genômico de batata e de eucalipto (Eucalyptus grandis). Posteriormente, o cDNA clonado será utilizado na avaliação do impacto de sua superexpressão na biossíntese de celulose e hemiceluloses e no desenvolvimento de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto. / Biotechnology is revolutionazing human activity in several fields. In forestry, new technologies like transgenies, genomics, proteomics and bioinformatics have been quickly consolidated. Assossiating these technologies with conventional forestry breeding will accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important intermediate in carbohydrate interconversion involved in various metabolic processes like sucrose and cellulose synthesis. In this work, it was cloned the cDNA that encodes UGPase. This cDNA was synthetized through RT-PCR using RNA extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber. The UGPase primers were designed based on the conserved sequences of hortologous genes, already available in public data banks. The cDNA was cloned into pENTR-D TOPO vector and introduced into Escherichia coli competent cells, by chemically transforming. The plasmid DNA was purified and the insert PCR amplified. The presence of 1402 bp insert was confirmed after sequencing. The alignment of the derived amino acids sequence with other UGPases revealed high homology to UGPases from potato and other plant species. Along the cDNA sequence N-glicolisation sites, Lysyl residues and conserved domain were identified, which probably are involved in substrate binding capacity, as well as catalytic ativity of the enzyme. Southern blot analysis was carried to confirm the presence of this gene in potato and eucalypt (Eucalyptus grandis) genomic DNA. The cloned cDNA will be used to evaluate the impact of overexpression on celullose and hemicelluloses biosynthesis and in the tobacco (Nicotiana tabacum) and eucalypt plant development.

A biotecnologia está revolucionando a atividade humana nas mais diversas áreas. No setor florestal, as novas tecnologias como transgenia, genômica, proteômica e bioinformática, estão sendo rapidamente incorporadas. A associação dessas tecnologias aos programas de melhoramento convencional de árvores pode acelerar o processo de obtenção de árvores com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. UDP–glicose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glicose, intermediário na interconversão de carboidratos envolvidos em várias funções metabólicas, como síntese de sacarose e de celulose. No presente trabalho, foi clonado o cDNA que codifica a UGPase. Este cDNA foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando-se mRNA extraído de tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.). Os primers específicos para a ORF do gene da UGPase foram definidos com base em seqüências conservadas entre genes ortólogos, já disponíveis em bancos de dados. O cDNA foi clonado no vetor pENTR-D TOPO e inserido, por meio de transformação química, em células competentes de Escherichia coli. O DNA plasmidial foi purificado e após seu sequenciamento, a presença de um inserto de 1402 pb foi confirmada. O alinhamento da seqüência deduzida de aminoácidos com outras UGPases revelou alta homologia a UGPases de batata e de outras espécies vegetais. Na seqüência do cDNA clonado foram identificados sítios de N-glicosilação, resíduos lisina e motivos conservados que possivelmente estão relacionados tanto com a capacidade de ligação ao substrato, como com a atividade catalítica da enzima. Também foi realizada uma análise de Southern blot para confirmar a presença deste gene no DNA genômico de batata e de eucalipto (Eucalyptus grandis). Posteriormente, o cDNA clonado será utilizado na avaliação do impacto de sua superexpressão na biossíntese de celulose e hemiceluloses e no desenvolvimento de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto. / Biotechnology is revolutionazing human activity in several fields. In forestry, new technologies like transgenies, genomics, proteomics and bioinformatics have been quickly consolidated. Assossiating these technologies with conventional forestry breeding will accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important intermediate in carbohydrate interconversion involved in various metabolic processes like sucrose and cellulose synthesis. In this work, it was cloned the cDNA that encodes UGPase. This cDNA was synthetized through RT-PCR using RNA extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber. The UGPase primers were designed based on the conserved sequences of hortologous genes, already available in public data banks. The cDNA was cloned into pENTR-D TOPO vector and introduced into Escherichia coli competent cells, by chemically transforming. The plasmid DNA was purified and the insert PCR amplified. The presence of 1402 bp insert was confirmed after sequencing. The alignment of the derived amino acids sequence with other UGPases revealed high homology to UGPases from potato and other plant species. Along the cDNA sequence N-glicolisation sites, Lysyl residues and conserved domain were identified, which probably are involved in substrate binding capacity, as well as catalytic ativity of the enzyme. Southern blot analysis was carried to confirm the presence of this gene in potato and eucalypt (Eucalyptus grandis) genomic DNA. The cloned cDNA will be used to evaluate the impact of overexpression on celullose and hemicelluloses biosynthesis and in the tobacco (Nicotiana tabacum) and eucalypt plant development.

Manguezais são ecossistemas localizados na confluência de terra e mar, característicos de áreas tropicais e subtropicais, cobrindo cerca de 18,1 milhões de hectares do planeta. A grande biodiversidade encontrada nestes ambientes ressalta a importância da busca por conhecimentos à seu respeito, como o estudo sobre novos princípios ativos derivados de microrganismos endofíticos presentes nas plantas de manguezais. Desta forma, o propósito do presente trabalho foi determinar a diversidade genética da comunidade de fungos endofíticos presentes em folhas e ramos das principais espécies arbóreas de manguezais de Cananéia e Bertioga (situados no estado de São Paulo, Brasil), e avaliar o potencial biotecnológico destes fungos em relação à produção de antibióticos contra os patógenos humanos Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e contra o fitopatógeno Xanthomonas axonopodis citri . Os resultados da primeira etapa do trabalho, que envolveu o isolamento e a caracterização de fungos endofíticos filamentosos, mostraram que a comunidade fúngica associada às plantas de manguezais é formada por pelo menos 35 gêneros diferentes, sendo que os gêneros mais frequentes foram Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum e Xylaria. Grande parte dos gêneros encontrados neste trabalho é de fungos de solo, indicando que eles estão adaptados às condições adversas dos manguezais. Os resultados mostraram que, dentre as linhagens produtoras de antibiótico, 29,41% pertencem ao gênero Diaporthe, o qual apresentou maior frequência na comunidade fúngica estudada. Após a avaliação de 344 fungos quanto ao potencial de atividade antimicrobiana, foi selecionada a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum, um endófito de folha de Laguncularia racemosa, para elucidação da estrutura química do seu antibiótico purificado. Por meio das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear e de Espectrometria de Massas o antibiótico foi identificado como ácido 3-hidroxipropiônico o qual apresentou atividade frente aos patógenos humanos Staphylococcus aureus e Salmonella tiphy. A estrutura química deste antibiótico foi modificada por meio de reação química de esterificação de Fischer-Speier para avaliar a relação da estrutura química e atividade biológica deste composto. O produto final da reação química de esterificação do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico não apresentou atividade antimicrobiana, indicando que o grupo hidroxila removido na reação é importante na atividade farmacológica desse composto. Além disso, a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum foi transformada geneticamente pelo sistema Agrobacterium tumefaciens, visando a obtenção de transformantes deficientes para produção de antibiótico e, com isso, a identificação de genes relacionados com a via de biossíntese do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico. A análise das sequências que flanqueiam o T-DNA, obtidas por TAIL-PCR, mostraram que os genes interrompidos nos transformantes estão relacionados com proteínas de domínios conservados envolvidos com diferentes funções como: translação de proteínas, homeostase do íon orgânico Mg2+, transporte intracelular, migração, adesão e proliferação celular e outras funções celulares. A caracterização da biblioteca de agrotransformantes constitui uma ferramenta importante para o estudo da biologia molecular de fungos que produzem compostos bioativos por meio do seu metabolismo secundário. / Mangroves are ecosystems situated beyond land and sea. They are more frequently found in tropical and subtropical areas englobing around 18.1 millions of hectares in the planet. The great biodiversity found in these ecosystems shows the importance of researching them, including studies regarding new compounds derived from endophytic fungi that inhabit these ecosystems. Therefore, the goal of this study was to determine the genetic diversity of the fungal endophytic community found in leaves and branches of the main arboreal species from mangrove of Cananéia and Bertioga (situated in São Paulo state, Brazil), and to evaluate the biotechnological potential of these fungi concerning the production of antibiotics against the human pathogens Staphylococcus aureus and Escherichia coli, and against the phytopathogen Xanthomonas axonopodis citri . The results of the first part of this work, including the isolation and characterization of the filamentous endophytic fungi, showed that the mangrove fungal community is made up of at least 35 different genera, from which the most frequent are Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum and Xylaria. Most of the fungal genera found in this study come from soil, which suggests that they are adapted to the adverse conditions of mangroves. The results show that among the antibiotic-produncing strains, 29.41% belong to the genus Diaporthe, which was the most frequently found in the studied fungal community. After the analysis of 344 fungi regarding the antibiotic activity potential, a strain of D. phaseolorum (a leaf endophyte of Laguncularia racemosa) was selected to unveil the chemical structure of their purified antibiotic. The nuclear magnetic resonance and the mass spectrometry techniques allowed the identification of the antibiotic as 3-hidroxypropionic acid, which displayed activity against the pathogens Staphylococcus aureus and Salmonella tiphy. The chemical structure of this antibiotic was modifyed by the chemical reaction of Fischer-Speier sterification in order to evaluate the chemical structure and biological activity of this compound. The final product of the chemical reaction of 3-hidroxipropionic acid sterification had no antibiotic activity, which suggests that the hydroxil group removed from the reaction is important to the pharmachological activity of this compound. Additionally, the strain 41.1(1) of D. phaseolorum was genetically transformed by the Agrobacterium tumefaciens system, in order to generate antibioticdeficient transformants, which would help to identify genes related to the biosynthesis pathway of the 3- hidroxypropionic acid antibiotic. The TAIL-PCR analysis revealed that the interrupted genes in the tranformants are related to proteins from conserved domains involved in different functions such as protein translation, Mg2+ ion homeostasis, intracellular transport, migration, adhesion and cellular proliferation and other cellular functions. The characterization of the agrotransformants library is an important tool to unveiling the molecular biology of fungi that produce bioactive compounds by the secondary metabolism.

Plantas transgênicas constituem interessantes alternativas para a produção de compostos com elevado valor agregado como polímeros industriais, proteínas farmacológicas e lipídios nutracêuticos. Como candidata à biofábrica, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) apresenta características agronômicas favoráveis, além de versatilidade de matéria-prima, que é empregada em fins tradicionais, como produção de álcool e açúcar, e até mesmo para geração de energia ou como forragem para alimentação de gado. Em nutrição animal, uma molécula bastante estudada é o ácido linoleico conjugado (CLA), que tem atividades anticarcinogênica, antidiabética, antiaterosclerose e moduladora do sistema imune e metabolismo de lipídios. O isômero t10,c12- CLA tem sido particularmente promissor na agropecuária por conta de inibição da síntese de gordura do leite e na melhoria do desempenho reprodutivo de vacas. Com o objetivo de avaliar a cana-de-açúcar como sistema biotecnológico para produção de CLA, o gene da isomerase do ácido linoleico de Propionibacterium acnes (pai) foi isolado e clonado, previamente caracterizado em Escherichia coli e, em seguida, utilizado na biolística de calos embriogênicos para regeneração de plantas transgênicas. No sistema procariótico, foi induzida a expressão de pai e a proteína heteróloga foi verificada como uma banda de 50 kDa, porém não houve alteração evidente do perfil de ácidos graxos da bactéria. Na cotransformação de cana-de-açúcar, o vetor pHA9, que contém o gene de seleção da neomicina fosfotransferase (nptII), foi bombardeado com uma das duas construções desenvolvidas com o promotor da poliubiquitina 1 de milho (pUbi1) dirigindo a expressão de pai adicionado ou não de sequência sinal da proteína de reparo de DNA recA para direcionamento para cloroplasto. Das cultivares CTC2 e IACSP9303046, foram obtidas eficiências de transformações de 2,2% e 1,7-7,1%, respectivamente. Um total de 156 plântulas foram regeneradas após regime de seleção com geneticina. Em seguida, 115 plântulas transgênicas foram identificadas por PCR para nptII e, entre essas, 29 e 48 foram PCRpositivas para pai e rec-pai, respectivamente. De 50 plantas aclimatizadas, 12 foram analisadas por Southern blot para nptII e 4 para pai, confirmando-se a transformação genética. Para comprovar a expressão de mRNA de pai, 27 plantas foram averiguadas por RT-PCR e RT-qPCR e indicaram produção de transcritos estudados. A análise de expressão das proteínas de folha por Western blot em 21 plantas selecionadas não produziu resultados conclusivos quanto à detecção de PAI. Essas mesmas foram analisadas por Cromatografia Gasosa, mas não foi detectado acúmulo de CLA. Embora seja possível a introdução e expressão do gene pai em cana-de-açúcar, é necessário avaliar em maior detalhe os fatores que possam afetar positivamente a produção de CLA, como tipo de tecido, compartimentos subcelulares para direcionamento proteico ou coexpressão de fosfolipases. / Transgenic plants are attractive alternatives for the production of high value compounds as industrial polymers, pharmacological proteins and nutraceutical lipids. As a candidate for biofactory, sugarcane presents favorable agronomic characteristics and versatility of raw material which is used for traditional purposes such as ethanol and sugar production and even for power generation or as forage feeding of cattle. In animal nutrition, a widely studied molecule is the conjugated linoleic acid (CLA), which has anticarcinogenic, antidiabetic, antiatherosclerosis and immune system and metabolism of lipids modulator activities. The isomer t10,c12-CLA has been particularly promising in agriculture because of inhibition of milk fat synthesis and improvement of the reproductive performance of cows. Aiming to evaluate the sugarcane as a system for biotechnological production of CLA, the linoleic acid isomerase gene from Propionibacterium acnes (pai) was isolated and cloned, previously characterized in Escherichia coli and then used for biolistic of embryogenic calli for regenerating transgenic plants. In the prokaryotic system, the expression of pai was induced and the heterologous protein was verified as a band of 50 kDa, but there was no obvious change in fatty acid profile of the bacterium. In cotransformation of sugarcane, pHA9 vector containing the selection gene neomycin phosphotransferase (nptII) was bombarded with one of the two constructions developed with the promoter of maize polyubiquitin 1 (pUbi1) driving the expression of pai, either added or not with the signal sequence of DNA repair protein recA for targeting to chloroplast. Cultivars CTC2 and IACSP93-3046 were obtained with transformation efficiencies of 2.2% and 1.7 a 7.1%, respectively. A total of 156 plantlets were regenerated after selection with geneticin regimen. After that, 115 transgenic plantlets were identified by PCR for nptII and among then, 29 and 48 were PCR-positive for pai and rec-pai, respectively. Of 50 acclimatized plants, 12 were analyzed by Southern blot for nptII and 4 for pai, confirming the genetic transformation. In order to prove the expression of pai mRNA, 27 plants were verified by RT-PCR and RT-qPCR and indicated the production of the studied transcripts. Expression analysis of leaf proteins by Western blot in 21 plants selected produced no conclusive results regarding the detection of PAI. Those were analyzed by gas chromatography and no accumulation of CLA was detected. Although it was possible to introduce and express the pai gene in sugarcane, it is necessary to evaluate in more detail the factors that may positively affect the production of CLA, as tissue type, subcellular compartments for protein targeting or coexpression of phospholipases.

O melhoramento genético das plantas cítricas, pelos métodos tradicionais, é dificultado por uma série de características da biologia de reprodução da espécie. Assim a utilização de técnicas modernas de biotecnologia, como a cultura de tecidos, a manipulação genética e a biologia molecular, têm se mostrado atrativas para o melhoramento genético da cultura. O objetivo deste trabalho é avaliar a transformação genética em variedades de laranja doce (Citrus sinensis) usando o gene xylA como gene de seleção. O trabalho foi realizado com a estirpe EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pNOV1457, com o gene xylA. Os isolados da bactéria foram mantidos em meio de cultura YEP suplementado com os antibióticos (ácido nalidíxico, canamicina e estreptomicina). Segmentos de epicótilo foram incubados, por um período de 20 minutos, com a suspensão bacteriana. Após a inoculação, os segmentos foram secos em papel toalha estéril, e incubados em placa de petri (100 x 15 mm) contendo o meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1), em ausência de luz, à temperatura de 24 C, por um período de 3 dias, com acetoseringona e sem acetoseringona durante o cocultivo. Após o co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração, constituído do meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xilose (15 mg.L-1). A transformação genética foi confirmada pela detecção do gene xylA nas plantas regeneradas por PCR. A extração do DNA foi feita pelo método de Dellaporta et al. (1983) e as reações de PCR foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizandose "primers" específicos para detecção do gene xylA. Analisando os dados obtidos verificou-se que foram obtidas plantas transgênicas, utilizando-se o sistema xylA/xilose, de 3 variedades de laranja doce Hamlin, Valência e Natal, com uma eficiência de transformação genética variando de 1 - 3%, em função do experimento e da variedade. A atividade da enzima xilose isomerase foi confirmada pelo teste clorofenol vermelho. Esse trabalho concluiu que é possível a regeneração de plantas transgênicas de variedades de laranja doce utilizando-se o sistema de seleção positiva xylA/xilose. / The genetic improvement of the citric plants, by traditional methods, is made difficult by a series species biology reproduction characteristics. The use of modern biotechnology techniques, as tissue culture, the genetic manipulation and molecular biology, have shown attractive for the culture genetic improvement. The objective of this work was to evaluate the genetic transformation in varieties of sweet orange (Citrus sinensis) using the gene xylA as selection gene. The work was carried out with the EHA 101 Agrobacterium tumefaciens, containing the plasmid pNOV1457, whith the gene xylA. The bacterium was culture in YEP media supplemented with antibiotics (nalidixic acid, kanamicyn e streptomycin). Epicotyl segments were incubated, for 20 min, with the bacterial suspension. After inoculation, the segments were dry in a sterile paper, and incubated in a petri dish (100 x 15mm) containing the medium EME + BAP (1 mg.L-1), in dark, at the temperature of 24 °C, for a period of 3 days, with and without acetoseryngone during the co-culture period. After the co-culture, the explants were transferred to culture medium of selection and regeneration, consisting of medium EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xylose (15 mg.L-1). The genetic transformation was confirmed by the gene detection by PCR. The DNA extraction was done by Dellaporta et al. (1983). PCR reactions were done in a thermal cycler PTC-100 (MJ Research) using specific "primers" for gene xylA detection. The enzyme xilose isomerase activity was confirmed by the red clorofenol test. It is possible to regenerate sweet orange transgenic plants using the positive select system based on xylA gene, of 3 sweer orange varieties Hamlin, Valencia and Natal, with a genetic transformation efficiency of 1-3%.

Diante do atual cenário de expansão dos plantios geneticamente modificados e da carência de metodologias no Brasil para prever os seus impactos foi desenvolvimento um método intitulado Impactos-PGM para Avaliação de Impactos Ambientais e Alimentares de Plantas Geneticamente Modificadas utilizando como ferramenta um Software de aplicação geral adequado e modificado com esta finalidade. Para tanto, foi inicialmente realizado o levantamento de indicadores de impactos a partir da literatura. Esta consulta foi realizada pela aplicação de questionário de acordo com a técnica delphi. Posteriormente, os especialistas foram entrevistados presencialmente: foram apresentados os indicadores mais representativos para a avaliação dos impactos das PGMs, possibilitando a elaboração do método Impactos-PGM por meio da adequação do Software Impactos. / In face of the current expansion scenario of genetically modified crops and the lack of methodologies in Brazil to predict its impacts, the present work has been proposed to develop a method entitled Impactos-GMP for \"Food and Environmental Assessment of Genetically Modified Plants (GMPs) Impacts using as tool a software of general application suitable and modified for this purpose. Thus, the survey was first conducted by identifying impact indicators from the literature. This survey was held through the application of a questionnaire according to the delphi technique. Subsequently, the researchers were interviewed in person to whom were presented the most representative indicators for GMPs assessing impacts, enabling the development of the method Impactos-GMP with the adequacy of the iImpacts software.

A dificuldade de transformação de tecido adulto de espécies lenhosas é uma barreira ainda a ser contornada para a maioria das cultivares de laranja doce de importância na citricultura brasileira. Esta dificuldade está relacionada ao alto nível de contaminação, ao baixo potencial regenerativo e à baixa capacidade de transformação de tecidos adultos de espécies lenhosas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar o protocolo de transformação genética de tecido adulto de três cultivares de laranja doce. Com ajustes no cultivo in vitro, foi possível obterem-se gemas adventícias transgênicas via Agrobacterium tumefaciens de três cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra e Valência, utilizando material adulto como fonte de explantes. As gemas transgênicas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e confirmados pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento 817 pb, correspondente a parte do gene uidA amplificada. A utilização de meio de co-cultivo com a adição de auxinas e citocininas (2,0 mg L-1 de 2,4 D; 2,0 mg L-1 de AIA e 1,0 mg L-1 de 2-iP), foi o mais eficiente para as três cultivares avaliadas. Meios de seleção com altas concentrações de citocinina (3 mg L-1) favoreceram a regeneração e, conseqüentemente, a transformação de gemas adventícias para as três cultivares estudadas. O uso da sonicação não foi eficiente para diminuir a contaminacão endofítica. Além disso, esta operação diminuiu a eficiência de transformação dos explantes. As eficiências médias de transformação genética encontradas para as três cultivares foram 2,5% para laranja Hamlin, 1,4% para laranja Pêra e 3,7% para laranja Valência. / The difficulty of tissue transformation of adult woody species is still an obstacle to be overcome for most sweet orange cultivars in the Brazilian citrus industry. This difficulty is related to the high level of contamination, low regenerative potential and low transformation capacity of adult tissues of woody species. Thus, the objective of this work was to optimize the protocol for genetic transformation of adult tissue of three cultivars of sweet orange. Therefore, with in vitro culture adjustments, it was possible to obtain transgenic adventitious buds though Agrobacterium tumefaciens of three sweet orange cultivars (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra and Valencia, using adult material as explants source. The transgenic buds were identified as transgenic by the GUS histochemical test and confirmed by the PCR analysis, which showed fragment amplification of 817 bp corresponding to the part of the amplified uidA gene. The use of co-culture media rich in auxins and cytokinins (2.0 mg L-1 of 2.4 D, 2.0 mg L-1 of AIA and 1.0 mg L-1 of 2-iP) was more efficient for all three cultivars. Selection media with high concentrations of cytokinin (3 mg L-1) promoted the regeneration and, consequently, the transformation of adventitious buds in the three cultivars. The use of sonication was not effective to reduce endophytic contamination. Moreover, this procedure reduced transformation efficiency of explants. The average efficiencies of genetic transformation for the three varieties were 2.5% for Hamlin, 1.4% for Pêra and 3.7% for Valência.

A dificuldade de transformação de tecido adulto de espécies lenhosas é uma barreira ainda a ser contornada para a maioria das cultivares de laranja doce de importância na citricultura brasileira. Esta dificuldade está relacionada ao alto nível de contaminação, ao baixo potencial regenerativo e à baixa capacidade de transformação de tecidos adultos de espécies lenhosas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar o protocolo de transformação genética de tecido adulto de três cultivares de laranja doce. Com ajustes no cultivo in vitro, foi possível obterem-se gemas adventícias transgênicas via Agrobacterium tumefaciens de três cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra e Valência, utilizando material adulto como fonte de explantes. As gemas transgênicas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e confirmados pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento 817 pb, correspondente a parte do gene uidA amplificada. A utilização de meio de co-cultivo com a adição de auxinas e citocininas (2,0 mg L-1 de 2,4 D; 2,0 mg L-1 de AIA e 1,0 mg L-1 de 2-iP), foi o mais eficiente para as três cultivares avaliadas. Meios de seleção com altas concentrações de citocinina (3 mg L-1) favoreceram a regeneração e, conseqüentemente, a transformação de gemas adventícias para as três cultivares estudadas. O uso da sonicação não foi eficiente para diminuir a contaminacão endofítica. Além disso, esta operação diminuiu a eficiência de transformação dos explantes. As eficiências médias de transformação genética encontradas para as três cultivares foram 2,5% para laranja Hamlin, 1,4% para laranja Pêra e 3,7% para laranja Valência. / The difficulty of tissue transformation of adult woody species is still an obstacle to be overcome for most sweet orange cultivars in the Brazilian citrus industry. This difficulty is related to the high level of contamination, low regenerative potential and low transformation capacity of adult tissues of woody species. Thus, the objective of this work was to optimize the protocol for genetic transformation of adult tissue of three cultivars of sweet orange. Therefore, with in vitro culture adjustments, it was possible to obtain transgenic adventitious buds though Agrobacterium tumefaciens of three sweet orange cultivars (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra and Valencia, using adult material as explants source. The transgenic buds were identified as transgenic by the GUS histochemical test and confirmed by the PCR analysis, which showed fragment amplification of 817 bp corresponding to the part of the amplified uidA gene. The use of co-culture media rich in auxins and cytokinins (2.0 mg L-1 of 2.4 D, 2.0 mg L-1 of AIA and 1.0 mg L-1 of 2-iP) was more efficient for all three cultivars. Selection media with high concentrations of cytokinin (3 mg L-1) promoted the regeneration and, consequently, the transformation of adventitious buds in the three cultivars. The use of sonication was not effective to reduce endophytic contamination. Moreover, this procedure reduced transformation efficiency of explants. The average efficiencies of genetic transformation for the three varieties were 2.5% for Hamlin, 1.4% for Pêra and 3.7% for Valência.

O melhoramento genético das plantas cítricas, pelos métodos tradicionais, é dificultado por uma série de características da biologia de reprodução da espécie. Assim a utilização de técnicas modernas de biotecnologia, como a cultura de tecidos, a manipulação genética e a biologia molecular, têm se mostrado atrativas para o melhoramento genético da cultura. O objetivo deste trabalho é avaliar a transformação genética em variedades de laranja doce (Citrus sinensis) usando o gene xylA como gene de seleção. O trabalho foi realizado com a estirpe EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pNOV1457, com o gene xylA. Os isolados da bactéria foram mantidos em meio de cultura YEP suplementado com os antibióticos (ácido nalidíxico, canamicina e estreptomicina). Segmentos de epicótilo foram incubados, por um período de 20 minutos, com a suspensão bacteriana. Após a inoculação, os segmentos foram secos em papel toalha estéril, e incubados em placa de petri (100 x 15 mm) contendo o meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1), em ausência de luz, à temperatura de 24 C, por um período de 3 dias, com acetoseringona e sem acetoseringona durante o cocultivo. Após o co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração, constituído do meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xilose (15 mg.L-1). A transformação genética foi confirmada pela detecção do gene xylA nas plantas regeneradas por PCR. A extração do DNA foi feita pelo método de Dellaporta et al. (1983) e as reações de PCR foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizandose "primers" específicos para detecção do gene xylA. Analisando os dados obtidos verificou-se que foram obtidas plantas transgênicas, utilizando-se o sistema xylA/xilose, de 3 variedades de laranja doce Hamlin, Valência e Natal, com uma eficiência de transformação genética variando de 1 - 3%, em função do experimento e da variedade. A atividade da enzima xilose isomerase foi confirmada pelo teste clorofenol vermelho. Esse trabalho concluiu que é possível a regeneração de plantas transgênicas de variedades de laranja doce utilizando-se o sistema de seleção positiva xylA/xilose. / The genetic improvement of the citric plants, by traditional methods, is made difficult by a series species biology reproduction characteristics. The use of modern biotechnology techniques, as tissue culture, the genetic manipulation and molecular biology, have shown attractive for the culture genetic improvement. The objective of this work was to evaluate the genetic transformation in varieties of sweet orange (Citrus sinensis) using the gene xylA as selection gene. The work was carried out with the EHA 101 Agrobacterium tumefaciens, containing the plasmid pNOV1457, whith the gene xylA. The bacterium was culture in YEP media supplemented with antibiotics (nalidixic acid, kanamicyn e streptomycin). Epicotyl segments were incubated, for 20 min, with the bacterial suspension. After inoculation, the segments were dry in a sterile paper, and incubated in a petri dish (100 x 15mm) containing the medium EME + BAP (1 mg.L-1), in dark, at the temperature of 24 °C, for a period of 3 days, with and without acetoseryngone during the co-culture period. After the co-culture, the explants were transferred to culture medium of selection and regeneration, consisting of medium EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xylose (15 mg.L-1). The genetic transformation was confirmed by the gene detection by PCR. The DNA extraction was done by Dellaporta et al. (1983). PCR reactions were done in a thermal cycler PTC-100 (MJ Research) using specific "primers" for gene xylA detection. The enzyme xilose isomerase activity was confirmed by the red clorofenol test. It is possible to regenerate sweet orange transgenic plants using the positive select system based on xylA gene, of 3 sweer orange varieties Hamlin, Valencia and Natal, with a genetic transformation efficiency of 1-3%.

Plantas transgênicas constituem interessantes alternativas para a produção de compostos com elevado valor agregado como polímeros industriais, proteínas farmacológicas e lipídios nutracêuticos. Como candidata à biofábrica, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) apresenta características agronômicas favoráveis, além de versatilidade de matéria-prima, que é empregada em fins tradicionais, como produção de álcool e açúcar, e até mesmo para geração de energia ou como forragem para alimentação de gado. Em nutrição animal, uma molécula bastante estudada é o ácido linoleico conjugado (CLA), que tem atividades anticarcinogênica, antidiabética, antiaterosclerose e moduladora do sistema imune e metabolismo de lipídios. O isômero t10,c12- CLA tem sido particularmente promissor na agropecuária por conta de inibição da síntese de gordura do leite e na melhoria do desempenho reprodutivo de vacas. Com o objetivo de avaliar a cana-de-açúcar como sistema biotecnológico para produção de CLA, o gene da isomerase do ácido linoleico de Propionibacterium acnes (pai) foi isolado e clonado, previamente caracterizado em Escherichia coli e, em seguida, utilizado na biolística de calos embriogênicos para regeneração de plantas transgênicas. No sistema procariótico, foi induzida a expressão de pai e a proteína heteróloga foi verificada como uma banda de 50 kDa, porém não houve alteração evidente do perfil de ácidos graxos da bactéria. Na cotransformação de cana-de-açúcar, o vetor pHA9, que contém o gene de seleção da neomicina fosfotransferase (nptII), foi bombardeado com uma das duas construções desenvolvidas com o promotor da poliubiquitina 1 de milho (pUbi1) dirigindo a expressão de pai adicionado ou não de sequência sinal da proteína de reparo de DNA recA para direcionamento para cloroplasto. Das cultivares CTC2 e IACSP9303046, foram obtidas eficiências de transformações de 2,2% e 1,7-7,1%, respectivamente. Um total de 156 plântulas foram regeneradas após regime de seleção com geneticina. Em seguida, 115 plântulas transgênicas foram identificadas por PCR para nptII e, entre essas, 29 e 48 foram PCRpositivas para pai e rec-pai, respectivamente. De 50 plantas aclimatizadas, 12 foram analisadas por Southern blot para nptII e 4 para pai, confirmando-se a transformação genética. Para comprovar a expressão de mRNA de pai, 27 plantas foram averiguadas por RT-PCR e RT-qPCR e indicaram produção de transcritos estudados. A análise de expressão das proteínas de folha por Western blot em 21 plantas selecionadas não produziu resultados conclusivos quanto à detecção de PAI. Essas mesmas foram analisadas por Cromatografia Gasosa, mas não foi detectado acúmulo de CLA. Embora seja possível a introdução e expressão do gene pai em cana-de-açúcar, é necessário avaliar em maior detalhe os fatores que possam afetar positivamente a produção de CLA, como tipo de tecido, compartimentos subcelulares para direcionamento proteico ou coexpressão de fosfolipases. / Transgenic plants are attractive alternatives for the production of high value compounds as industrial polymers, pharmacological proteins and nutraceutical lipids. As a candidate for biofactory, sugarcane presents favorable agronomic characteristics and versatility of raw material which is used for traditional purposes such as ethanol and sugar production and even for power generation or as forage feeding of cattle. In animal nutrition, a widely studied molecule is the conjugated linoleic acid (CLA), which has anticarcinogenic, antidiabetic, antiatherosclerosis and immune system and metabolism of lipids modulator activities. The isomer t10,c12-CLA has been particularly promising in agriculture because of inhibition of milk fat synthesis and improvement of the reproductive performance of cows. Aiming to evaluate the sugarcane as a system for biotechnological production of CLA, the linoleic acid isomerase gene from Propionibacterium acnes (pai) was isolated and cloned, previously characterized in Escherichia coli and then used for biolistic of embryogenic calli for regenerating transgenic plants. In the prokaryotic system, the expression of pai was induced and the heterologous protein was verified as a band of 50 kDa, but there was no obvious change in fatty acid profile of the bacterium. In cotransformation of sugarcane, pHA9 vector containing the selection gene neomycin phosphotransferase (nptII) was bombarded with one of the two constructions developed with the promoter of maize polyubiquitin 1 (pUbi1) driving the expression of pai, either added or not with the signal sequence of DNA repair protein recA for targeting to chloroplast. Cultivars CTC2 and IACSP93-3046 were obtained with transformation efficiencies of 2.2% and 1.7 a 7.1%, respectively. A total of 156 plantlets were regenerated after selection with geneticin regimen. After that, 115 transgenic plantlets were identified by PCR for nptII and among then, 29 and 48 were PCR-positive for pai and rec-pai, respectively. Of 50 acclimatized plants, 12 were analyzed by Southern blot for nptII and 4 for pai, confirming the genetic transformation. In order to prove the expression of pai mRNA, 27 plants were verified by RT-PCR and RT-qPCR and indicated the production of the studied transcripts. Expression analysis of leaf proteins by Western blot in 21 plants selected produced no conclusive results regarding the detection of PAI. Those were analyzed by gas chromatography and no accumulation of CLA was detected. Although it was possible to introduce and express the pai gene in sugarcane, it is necessary to evaluate in more detail the factors that may positively affect the production of CLA, as tissue type, subcellular compartments for protein targeting or coexpression of phospholipases.