Os implantes dentais são considerados uma modalidade de tratamento bastante previsível para a reposição de dentes perdidos. Os implantes osseointegráveis principalmente quando colocados em regiões anteriores devem oferecer, além de excelente função, ótima estética, e fonética. Sendo que o critério para o sucesso envolve o estabelecimento do contorno de tecido mole, apresentando a área interproximal intacta. O propósito deste estudo foi avaliar a influência das diferentes distâncias (3 e 5 mm) entre a crista óssea e ponto de contato interdental, na formação de papila gengival associado à presença de diferentes distâncias (2 e 3 mm) entre implantes contíguos e na região de extremo livre mesial e distal. Foram selecionados para o experimento 8 cães adultos jovens e executada a exodontia dos 4 pré-molares mandibulares: p1, p2, p3, p4, para cada hemi-mandibula. Três meses após as exodontias foram colocados 3 implantes Replace Select Tapered com superfície tratada e dimensões de 4,3 X 10 mm, em cada hemimandibula animal. O primeiro implante foi colocado a 10 mm da distal do canino remanescente, o segundo (intermediário) foi colocado a 2 mm do primeiro e o terceiro implante (posterior) foi colocado a 3 mm do segundo. Foi iniciada a reabilitação protética, no dia da colocação dos implantes. Primeiramente foi feita a moldagem para a confecção das próteses metálicas. As coroas metálicas definitivas, confeccionadas, apresentaram distância do ponto de contato à crista óssea de 3 e 5 mm lado esquerdo e direito respectivamente. Ao completar 12 semanas pós-colocação das próteses definitivas, os animais foram sedados e as análises clínicas foram executadas. Esta avaliação foi feita a partir da utilização de um compasso de pontas secas, medindo as distâncias entre os pontos de contato e as pontas das papilas (PC - P) e dos pontos de contato aos extremos livres mesial e distal (PC - ELM e PC ELD respectivamente). O delineamento das situações experimentais foi executado levando em consideração as associações das diferentes distâncias interimplantar com as diferentes distâncias do ponto de contanto a crista óssea, assim encontramos a seguinte disposição: Situação 01 (PC3A) Distância do ponto de contato a gengiva do extremo livre mesial, do lado esquerdo; Situação 02 (PC3B) Distância do ponto de contato, a gengiva interproximal sendo à distância interimplantar de 2 mm, lado esquerdo da mandíbula; Situação 03 (PC3C) Distância do ponto de contato, a gengiva interproximal sendo a distância interimplantar de 3 mm, lado esquerdo da mandíbula; Situação 04 (PC3D) Distância do ponto de contato a gengiva do extremo livre distal, do lado esquerdo Situação 05 (PC5A) Distância do ponto de contato a gengiva do extremo livre mesial, do lado direito; Situação 06 (PC5C) Distância do ponto de, a gengiva interproximal sendo a distância interimplantar de 3 mm, lado direito da mandíbula; Situação 07 (PC5B) Distância do ponto de contato, a gengiva interproximal sendo a distância interimplantar de 2 mm, lado direito da mandíbula e Situação 08 (PC5D) Distância do ponto de contato a gengiva do extremo livre distal, do lado direito. Ao analisar as medias das alturas gengivais temos: PC3A a média de 2,9±0,5 mm; PC3D 2,5±0,5 mm; PC3B 1,8±0,6 mm; PC3C 2,0±0,8 mm; PC5A 3,0±0,5 mm; PC5D 3,5±0,4 mm; PC5C 3,6±0,4 mm e PC5B 3,9±0,7 mm. Como as premissas de aderência à distribuição normal, independência entre os indivíduos estudados e pareamento entre as diferentes etapas foram cumpridas, empregou-se a análise de variância (ANOVA) para mensurações repetidas, a dois fatores. Nos casos em que a ANOVA encontrou diferença entre as situações testadas, uma comparação a posteriori foi executada por meio do teste de Bonferroni. O nível de significância empregado para todos os testes foi de 0,05 (5%). Logo as distâncias de 2,0 e 3,0 mm entre implantes contíguos não apresentaram diferença significativa na formação de papila quando as restaurações protéticas são confeccionadas com 3 ou 5 mm de distância entre o ponto de contato e a crista óssea. Considerando a provável reabsorção óssea em ambos os grupos, quando a distância do ponto de contato à crista óssea foi inicialmente de 3 mm esta condição apresentou melhores resultados na formação de papilas do que a distância de 5 mm em todas as situações estudadas. A presença do ponto de contato de 3 mm influência positivamente na formação de papila, quando comparada com as regiões de extremo livre. / The dental implants are considered a form of treatment rather predictable for replacement of lost teeth Implants should offer, as well as excellent function, aesthetics and phonetics great, especially when placed in anterior regions, where the criterion for success involves the establishment contour of the soft tissue, showing the area intact interproximal The purpose of this study was to evaluate the influence of different distances between the bone crest and interdentally contact point, with 3 and 5 mm, the formation of gingival papilla associated with the presence of different distances of 2 and 3 mm between implants and the adjacent region of mesial and distal end free. Were selected for the experiment 08 dogs and young adults performed the extraction of the 4 pre molars mandibles: p1, p2, p3, p4, for each hemi-mandible. Three months after the tooth extractions were placed 3 Replace Select Tapered implants with treated surface and dimensions of 4.3 X 10 mm in each animal hemi mandibles. The first implant was placed at 10 mm distal of the canine left, the second (middle) was placed at 2 mm from the first and third implant (back) was placed at 3 mm from the second. Prosthetics rehabilitation has begun on the day of the placement of implants. First was the casting for the manufacture of metal stents, since the provisional prostheses were made of acrylic resin so that the distance between the point of contact and the bone crest is 3 mm on the left side of the mandible and 5 mm on the right. The final metal crowns, made, made from the point of contact to bone crest of 3 and 5 mm. After completing 12 weeks after placement of final prosthesis, the animals were sedated and the clinical tests were performed. This evaluation was made from the use of a dry bar for tips, measuring the distances between the points of contact and the tips of the papillae (PC - P) and the contact points of the mesial and distal ends free (PC - PC and ELM - ELD respectively). The design of the experimental situations was implemented taking into account the associations of different distances interimplantar with different distances from the long bone crest, we found the following provision: Location - 01 (PC3A) Distance from the point of contact to end the free gingiva mesial to the left; Situation - 02 (PC3B) Distance from the point of contact, the gingival interproximal distance being interimplantar of 2 mm, the left side of the mandible; Situation - 03 (PC3C) Distance from the point of contact, the gingival interproximal and interimplantar a distance of 3 mm, the left side of the mandible; Situation - 04 (PC3D) Distance from the point of contact to the extreme free gingival distal to the left position - 05 (PC5A) Distance from the point of contact to the extreme free gingival mesial on the right side; Situation - 06 (PC5C) distance from the interproximal gingival interimplantar the distance of 3 mm, right side of the jaw; Situation - 07 (PC5B) Distance from the point of contact, the gingival interproximal the distance interimplantar of 2 mm, the right side of the mandible and Situation - 08 (PC5D) Distance from the point of contact to free distal end of the gingival on the right side. In examining the measures of gingival heights are: PC3A an average of 2.9 ± 0.5 mm; PC3D 2.5 ± 0.5 mm; PC3B 1.8 ± 0.6 mm; PC3C 2.0 ± 0.8 mm; PC5A 3.0 ± 0.5 mm; PC5D 3.5 ± 0.4 mm; PC5C 3.6 ± 0.4 mm and PC5B 3.9 ± 0.7 mm. As adherence to the assumptions of normal distribution, independence among the subjects studied and matching between the different stages have been completed, using the analysis of variance (ANOVA) for repeated measurements, the two factors. Where ANOVA found the difference between the conditions tested, a posteriori comparison was performed using the Bonferroni test. The significance level used for all tests was 0.05 (5%). Once the distances of 2.0 and 3.0 mm between adjacent implants showed no significant difference in the formation of the papilla when prosthetic restorations are made with 3 or 5 mm distance between the point of contact and the bone crest. Considering the probable bone resorption in both groups, where the distance from the point of contact to the bone crest was originally the condition of 3 mm showed better results in the formation of papillae than the distance of 5 mm in all cases studied. The presence of the point of contact 3-mm positively influence the formation of papilla, when compared with regions of extreme freedom.

Orientador: Paulo Sérgio Cerri / Banca: Lea Assed Bezerra da Silva / Banca: Mario Tanomaru Filho / Resumo: Perfurações radiculares acidentais ocorrem em cerca de 2-12% dos dentes tratados endodonticamente. Estas perfurações causam injúria aos tecidos periodontais adjacentes e, frequentemente, promovem a invasão bacteriana culminando com a inflamação do ligamento periodontal e reabsorção óssea podendo levar a perda do elemento dental. Dentre os materiais indicados para o selamento destas perfurações, o MTA tem sido largamente usado. O MTA é basicamente composto por silicatos de cálcio (80%) e óxido de bismuto (Bi2O3; 20%), usado como agente radiopacificador. Silicato tricálcico (STC) é um biomaterial utilizado associado ao óxido de zircônio (ZrO2) e o óxido de nióbio (Nb2O5) é um radiopacificador alternativo. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta dos tecidos periodontais promovida pelo silicato tricálcico puro (Mineral Research Processing, Meyzieu, França) associado ao ZrO2 ou ao Nb2O5 comparando-os ao MTA-Angelus, em perfuração de furca de molares de ratos. Foram utilizados 80 ratos, distribuídos em 4 grupos: GS (sham), STC+ZrO2, STC+Nb2O5 e GMTA, de acordo com o material de selamento. No grupo GS, as perfurações no assoalho da câmara pulpar não foram seladas. O acesso da cavidade foi restaurado com cimento de ionômero de vidro fotopolimerizável. Os 1os molares esquerdos, sem perfurações no assoalho da câmara pulpar, foram usados como controle (GC). Após os períodos de 7, 15, 30 e 60 as maxilas foram removidas, fixadas, descalcificadas e incluídas em parafina. Os cortes c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Accidental radicular perforation occurs in about 2-12% of endodontically treated teeth. These perforations lead to injury of periodontal tissues and frequently promote bacterial invasion inducing to periodontal ligament inflammation and bone resorption may lead to tooth loss. Among the materials suitable for the sealing of these perforations, the MTA has been widely used. MTA is basically composed of calcium silicate (80%) and bismuth oxide (Bi2O3, 20%), a radiopacifying agent. Tricalcium silicate (TCS) is a biomaterial used associated with zirconium oxide (ZrO2) and niobium oxide (Nb2O5) is an alternative radiopacifier. Our purpose was to evaluate response of the periodontium adjacent to furcation perforations in rat molars filled with pure tricalcium silicate (Mineral Research Processing, Meyzieu, France) associated with ZrO2 or Nb2O5 and MTA-Angelus. Eighty rats were distributed into four groups: SG (sham), TCS+ZrO2, TCS+Nb2O5 and MTAG according to the sealing material. In the SG group, the perforations in the pulp chamber floors were not sealed. The access cavity was restored with light-cure glass-ionomer cement. The left upper first molars, without perforations in the pulp chamber floors, were used as controls (CG). After 7, 15, 30 and 60 days, fragments of maxilla were fixed, decalcified and embedded in paraffin. In the HE-stained sections, the volume density of inflammatory cells (VvIC), fibroblasts (VvFb) and blood vessels (VvBV) was obtained. The width of the periodo... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As doenças periodontais (DP) afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por micro-organismos gram-negativos anaeróbios presentes no biofilme periodontal. A evolução da doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares, que atuam no micro ambiente local modulando a resposta do hospedeiro em busca do controle da infecção. Acredita-se que citocinas inflamatórias, quimiocinas e seus receptores estão envolvidos na migração celular para os tecidos periodontais, contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de determinação de resistência ou susceptibilidade às DP; ou no desencadeamento do dano tecidual decorrente da resposta. Neste projeto, avaliou-se o papel das células CCR5+ na DP experimental induzida pela inoculação oral de Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos C57BL/6 wild type e camundongos CCR5-knockout. Os resultados mostram que a maioria das células CCR5+ possuem fenótipo compatível com células T do subtipo Th1, devido a co-expressão de CD3 e CXCR3; além de co-expressarem RANKL. Na ausência das células CCR5+, houve uma significativa diminuição da migração de células inflamatórias totais e RANKL+ para os tecidos periodontais, diminuição da reabsorção óssea alveolar, diminuição dos níveis de expressão de citocinas pró-inflamatórias TNFα-, IL-1β e IFN-γ, assim como diminuição na expressão de MMP-1, MMP-2 e MMP-13. Sua ausência não interferiu no controle da infecção periodontal apesar da diminuição dos níveis de iNOS. Estes resultados conduzem à conclusão de que a maioria das células CCR5+ são células T do subtipo Th1, que atuam como importantes moduladoras das citocinas TNFα-, IL-1β e IFN-γ, das metaloproteinases de matriz MMP-1, MMP-2 e MMP-13, e que também expressam e modulam a expressão de RANKL, tendo participação importante na imunopatogenese da DP experimental, sem interferir no controle da infecção periodontal. Estes fatos tornam as células CCR5+ potenciais alvos para intervenção terapêutica visando ao controle das doenças periodontais. / The periodontal diseases (PD) affect the supportive tissues of the teeth and are triggered by periodontopathogens present in the dental biofilm. The clinical outcome is highly influenced by the host inflammatory and immune response with participation of many cellular types, that act in the local microenvironment modulating the host response to control the infection. Inflammatory cytokines, chemokines and its receptors are thought to be involved in the cellular migration to the periodontal tissues, but there is little knowledge about the mechanisms of determination of resistance or susceptibility to the PD and in the triggering of tissue damage by immune response components. This study evaluated the role of CCR5+ cells in the experimental PD induced by oral inoculation of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in C57BL/6 wild type mice and CCR5-knockout mice. The phenotypic analysis of inflammatory infiltrate demonstrated that the most of CCR5+ cells coexpress CD3 and CXCR3, suggesting a phenotype compatible with Th1-type cells, and also co-express RANKL. In the absence of CCR5+ cells there was a significant overall reduction of inflammatory cells and RANKL+ cells influx to the periodontal tissues, reduction in the alveolar bone resorption, reduction in the levels of pro-inflammatory cytokines TNFα-, IL-1β and IFN-γ expression, as a reduction in the expression of MMP-1, MMP-2 and MMP-13. The absence of CCR5+ cells did not impair the control of periodontal infection, despite the reduction of iNOS levels. In conclusion, these data demonstrate that the most of CCR5+ cells are Th1 cells, which act as important modulators of TNFα-, IL-1β and IFN-γ, MMP-1, MMP- 2 and MMP-13 levels, and which also express and modulate the expression of RANKL, playing an important role in the immunopathogenesis of experimental PD, without impairing the control of periodontal infection. These facts point to CCR5+ cells as potentials targets to therapeutic interventions aimed to control periodontal diseases.

Tensão elevada no osso pode provocar reabsorção óssea. O objetivo deste estudo é avaliar por meio do método dos elementos finitos tridimensionais as áreas de concentração de tensões no osso basal após realização dos orifícios para inserção dos implantes e com implantes osseointegrados, em mandíbulas com três níveis de reabsorção e prótese mucosa-suportada. Foram confeccionados 7 modelos por meio do software de CAD: Rhinoceros 4.0 SR9; 1 (controle)- mandíbula com 15mm de altura e sem orifício; 2- mandíbula com 15mm de altura e 2 orifícios de 3,75mm de diâmetro; 3- mandíbula com 15mm e 2 implantes osseointegrados; 4- mandíbula com 20mm e 2 orifícios; 5- mandíbula com 20mm e 2 implantes osseointegrados 6- mandíbula com 26mm e 2 orifícios e 7- mandíbula com 26mm e 2 implantes osseointegrados. A força aplicada foi de 60N no sentido axial, nos dentes artificiais da prótese removível total reembasada com 2mm de material macio. Após a discretização dos modelos foi realizado o ensaio pelo método dos elementos finitos por meio do Software NEiNastran for Windows Version 10.0.3.997. Os resultados evidenciaram aumento da tensão no osso cortical em relação ao medular. Mandíbulas sem perfuração apresentaram picos de tensão mais elevados que as com implantes osseointegrados. Nas mandíbulas com orifícos os picos de tensão se localizaram no sentido vestíbulo-lingual enquanto nas com implantes esses picos de tensão foram no sentido mésio-distal. Quanto mais reabsorvida a mandíbula maior a tensão transmitida pela base da prótese removível total ao orifício. Conclui-se que as mandíbulas com 15 e 20 mm de altura com orifícios apresentaram maiores picos de tensão que as com implantes osseointegrados, enquanto nas com 26mm de altura não houve diferença entre ambas condições / Increased pressure in the bone can cause resorption. The purpose of this study is to evaluate areas of stress concentration in the basal mandibular bone after perforation for inserting the implants and dental implants in mandibles with three levels of resorption and muco-supported dental prosthesis using the three-dimensional finite element method. 7 models were produced through CAD software: Rhinoceros 4.0 SR9; 1 (control) -15mm jaw height and without perforation; 2- 15mm jaw height and two perforations of 3.75 mm in diameter; 3- 15mm jaw height with 2 osseointegrated dental implants; 4- 20mm jaw height and 2 perforations; 5- 20mm jaw heigth with two osseointegrated dental implants; 6- 26mm jaw height and two perforation; and 7- 26mm jaw height with two osseointegrated dental implants. The force of 60N was applied in the axial direction to the artificial teeth denture provisional recover with 2mm soft material for edentolous tissue conditioner. After discretization of the test models it was performed a trial using the finite element method through NEiNastran Software for Windows Version 10.0.3.997. The results showed increased tension in cortical bone in relation to the medular bone. Mandibles without perforation showed stress peaks higher than those with dental implants. In the jaws with drilling the stress peaks were located in the buccal-lingual direction while in those with implant they were in the mesial-distal direction. The more resorbed jaw greater the tension transmitted by the base of full removable denture to the drilling. The study concluded that the jaws 15 and 20 mm height perforated had higher stress peaks than the ones with dental implants while in the 26mm height perforated no difference between the two conditions was observed

A radiografia é uma das ferramentas primárias de auxílio ao diagnóstico e monitoração do tratamento das doenças periodontais. Porém, a análise subjetiva dessas radiografias feita pelo dentista só consegue identificar lesões quando o quadro clínico apresenta perda acima de 30% do conteúdo mineral do osso, levando um sério desafio ao exercício da odontologia. Em muitas situações clínicas, o dentista também precisa ser capaz de quantificar o tamanho de uma lesão para determinar a taxa de progressão ou cura da doença. A técnica de subtração digital de radiografias provê a detecção de mudanças ósseas sutis, de cerca de 5%, levando ao diagnóstico precoce da doença e aumentando assim o sucesso de seu tratamento. Desta forma, o esquema de auxílio ao diagnóstico de reabsorção óssea periodontal através de subtração digital de radiografias odontológicas proposto no presente trabalho emprega a técnica de subtração digital de radiografias, onde duas radiografias odontológicas, tiradas em intervalos de tempos planejados, são subtraídas para obter uma nova imagem onde serão visíveis somente estruturas que mudaram de uma imagem em relação à outra. Será gerada uma imagem que auxiliará o dentista a efetuar um diagnóstico precoce e instituir o melhor plano de tratamento, e assim acompanhar a resposta do tratamento a partir de novas imagens subtraídas. Na fase anterior à subtração, é necessário o alinhamento, para garantir que estruturas idênticas em ambas imagens estejam no mesmo local, e evitando que o resultado da subtração seja errôneo. O alinhamento consiste na marcação de 4 pontos em regiões de alto contraste em ambas as imagens para que a imagem subseqüente seja alinhada em translação e em rotação em relação à primeira. Posteriormente, uma técnica de correção de contraste é utilizada para corrigir eventuais diferenças de contraste. A subtração fornecerá três formas de visualização, na imagem subtraída, da área onde ocorreu uma reabsorção ou ganho ósseo. Uma delas é a subtração qualitativa, cujas áreas onde as imagens se mantiveram idênticas são mostradas em preto, e áreas onde ocorreram mudanças, em branco. A segunda é a subtração quantitativa, que gera a imagem subtraída em níveis de cinza, mostrando em tons de cinza uniformes áreas onde as imagens se mantiveram idênticas; em tons de cinza escuros, onde ocorreu reabsorção óssea; e em tons de cinza claros, onde ocorreu ganho ósseo. Além destas duas subtrações, há uma terceira subtração, a subtração quantitativa porcentagem-colorida, que mostrará a porcentagem de reabsorção ou ganho ósseo através de áreas coloridas na imagem. O intervalo de porcentagens poderá ser escolhido pelo dentista e a este intervalo poderá ser atribuída uma cor para visualização. Intervalos de porcentagens negativas indicam reabsorção óssea e intervalos de porcentagens positivas, ganho ósseo. Os testes realizados encontraram um erro médio de 7,5% no resultado da subtração, sendo que deste total, 3,5% é o erro introduzido pelo digitalizador. É importante ressaltar que esta taxa representa o erro não somente do algoritmo desenvolvido, mas também a propagação do erro em todas as etapas do processo, ou seja, aquisição, digitalização, alinhamento e subtração. Portanto, o erro da subtração deduzido do erro do digitalizador é de somente 4,0%. / Radiography is one of the primary features to help diagnose and monitor the treatment of periodontal diseases. However, the subjective analysis of these radiographs by the dentist only can identify lesions above 30% of mineral bone loss, leading to a serious challenge for the practice of odontology. In many clinical situations, the dentist needs to quantify the size of a lesion to determine the rate of progression or healing the disease. The digital subtraction radiography technique provides the detection of subtle bone changes, i.e., changes of around 5%, leading to an early diagnosis and enlarging the success of its treatment. The aided diagnosis scheme for periodontal bone resorption through odontological digital subtraction radiography proposed in this work employees the digital subtraction radiography technique, where two odontologic radiographs taken at intervals of planned times are subtracted to obtain a new image where only structures that have been changed from one image to the other will be visible. It will generate an image to help the dentist make an early diagnosis and establish the best treatment plan, besides accompanying the treatment’s response starting from new subtracted images. In the stage previous to the subtraction, the lining up is necessary to assure that identical structures on both images are in the same place, avoiding an erroneous result of the subtraction. It consists in marking 4 points in places with high contrast on both images for the subsequent image to be first lined up in translation and then in rotation in relation to the first one. Then, a contrast correction technique is used to correct possible contrast differences. The subtraction will provide three ways of visualization in the subtracted image of the area where a bone resorption or gain occurred. One of them is the qualitative subtraction, where areas kept identical are showed in black and areas where changes occurred are showed white. The second is the quantitative subtraction, which generates a subtracted image in gray levels, showing in uniform gray levels the areas where the images remained identical, in dark gray levels the areas where there was bone resorption and in light gray levels the area with bone gain. The third subtraction is called colored-percentage quantitative subtraction, which shows the percentage of bone resorption or gain through colored areas on the radiograph. The intervals of percentage can be chosen by the dentist and he/she can attribute a color for visualization to this interval. Negative percentage intervals indicate bone resorption and positive percentage intervals correspond to bone gain. The tests performed found a mean error of 7.5% in the result of the subtraction, of which 3.5% correspond to the error introduced by the digitalizer. It is important to stress that this rate represents the error not only for the algorithm developed, but the spreading of the error to all process stages, such as acquisition, digitalization, lining up and subtraction. Therefore, the subtraction error deduced from the digitalizer error is only 4,0%.

A acidose metabólica causa perda de mineral ósseo e a estimulação mecânica causa remodelamento ósseo adaptativo. A reabsorção óssea que caracteriza essas mudanças ósseas depende da acidificação extracelular pela secreção vetorial de H+ pelos osteoclastos. A H+-ATPase vacuolar em paralelo com o trocador Cl-/H+ (CLC7) são os mecanismos conhecidos envolvidos na reabsorção óssea, entretanto, os osteoclastos também expressam canais para H+ dependentes a voltagem. Este trabalho foi realizado para avaliar a contribuição dos canais para H+ na função celular visando à compreensão de seu relacionamento com a H+-ATPase vacuolar e o CLC7 (1); analisar se o fluxo de fluido extracelular modifica a secreção de H+ (2) e avaliar a diferenciação dos osteoclastos in vitro sob acidose metabólica devido à redução do HCO3- (3). Osteoclastos de ratos Wistar foram obtidos diretamente dos animais ou foram diferenciados in vitro (com M-CSF e RANKL) e semeados sobre vidro, plástico ou substratos mineralizados em <font face=\"Symbol\">&#945;-MEM + 10% SFB, em pH 7,4 ou 6,9, e então mantidos em incubadora com 5% CO2, a 37<font face=\"Symbol\">&#176;C. A diferenciação celular foi avaliada pela contagem de células TRAP-positivas ou de núcleos marcados por DAPI. A secreção de H+ foi avaliada por epifluorescência, utilizando-se BCECF-AM, sensível a pH. Os registros do pH intracelular foram feitos na vigência de soluções tamponadas por HEPES, na ausência de CO2/HCO3- (pH 7,4, 300 mOsm/L H2O, a 37<font face=\"Symbol\">&#176;C), na presença ou ausência de perfusão contínua de fluido extracelular a uma velocidade de 5 ml/min. Na ausência de perfusão, os osteoclastos exibiram variações cíclicas do pHi (acidificação e alcalinização espontâneas), com período de 12 a 45 minutos (n = 35) e amplitude de 0,12 a 1,43 unidades de pHi. As oscilações não foram abolidas por concanamicina (100 mM) (n = 3), por NPPB (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 3), na ausência de Na+ extracelular (n = 5) ou na ausência de Cl- extracelular (n = 3). O fluxo de fluido aboliu as oscilações e a ausência de Cl- extracelular modificou significativamente seu padrão. Na ausência de perfusão, a secreção de H+ após acidificação intracelular induzida foi abolida por Zn2+ (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 5). Além disso, na presença de perfusão, a secreção de H+ após acidificação intracelular induzida foi abolida por NPPB (n = 4) e não foi abolida por bafilomicina (200 nm) (n = 3). A acidose metabólica não modifica o número de osteoclastos diferenciados in vitro, entretanto, o tratamento das culturas com Zn2+ causou redução do numero de células mononucleares e aumento relativo do número de osteoclastos multinucleados em relação ao controle tanto em pH 7,4 quanto em pH 6,9. / Metabolic acidosis can cause a loss of bone mineral and the mechanic stimulation can cause adaptative bone remodeling. The bone resorption characteristic of these bone changes aforementioned depends on the extracellular acidification by osteoclastmediated proton secretion. The H+ secretion by vacuolar H+-ATPase together with Clsecretion through a Cl-/H+ exchanger (CLC7) are the known mechanisms involved in the bone resorption; however, osteoclasts also express voltage-gated proton channels. The proposed aims of these work were to evaluate the contribution of proton channels in the osteoclast function for better understanding its relation with vacuolar H+-ATPase and CLC7 (1); to analyze whether the flow of extracellular fluid modifies the H+ secretion or not (2); and to analyse the osteoclast differentiation in vitro under metabolic acidosis due to HCO3- reduction (3). Osteoclasts were freshly isolated or generated from bone marrow precursor cells (using M-CSF and RANK- L) from of Wistar rats. The cells were placed on glass coverslips, plastic coverslips, or on mineralized substrate in <font face=\"Symbol\">&#945;-MEM + 10% FBS, pH 7.4 or 6.9, and then maintained in a 5% CO2 incubator at 37<font face=\"Symbol\">&#176;C. The differentiation was analyzed by counting of TRAP-stained cells or DAPIstained nuclei. The H+ secretion was analysed by epifluorescence, using the pHsensitive dye BCECF-AM. The intracellular pH record was done using a standard HEPES-buffered solution free of CO2/HCO3- (pH 7.4, 300 mOsm/L H2O, at 37<font face=\"Symbol\">&#176;C), with or without continuous perfusion of extracellular fluid at a rate of 5 ml/min. In the absence of perfusion, the osteoclasts exhibit cyclic pHi variations (spontaneous acidification and alkalinization), with a period of 12 to 45 minutes (n = 35) and amplitude difference between maximal and minimal pHi of 0.12 to 1.43 units pHi. These oscillations were not abolished in the presence of oncanamycin (100 mM) (n = 3), NPPB (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 3), in the absence of Na+ (n = 5) or in the absence of Cl- (n = 3) in the extracellular solution. The fluid flow itself abolished the pH oscillations and the absence of extracellular Cl- modifies significantly these patterns. In the absence of perfusion, the H+ secretion after induced intracellular acidification was abolished by Zn2+ (100 <font face=\"Symbol\">mM) (n = 5). In addition, in the presence of perfusion, the H+ secretion after induced intracellular acidification was abolished by NPPB (n = 4) and was not abolished by bafilomycin (200 nm) (n = 3). Metabolic acidosis does not modify the number of osteoclasts differentiated in vitro, however, when the cell culture was treated with Zn2+, there was a significant reduction in the number of mononuclear cells and a relative increase in the number of multinucleated osteoclasts compared to control, both in pH 7.4 and pH 6.9 medium.

A radiografia é uma das ferramentas primárias de auxílio ao diagnóstico e monitoração do tratamento das doenças periodontais. Porém, a análise subjetiva dessas radiografias feita pelo dentista só consegue identificar lesões quando o quadro clínico apresenta perda acima de 30% do conteúdo mineral do osso, levando um sério desafio ao exercício da odontologia. Em muitas situações clínicas, o dentista também precisa ser capaz de quantificar o tamanho de uma lesão para determinar a taxa de progressão ou cura da doença. A técnica de subtração digital de radiografias provê a detecção de mudanças ósseas sutis, de cerca de 5%, levando ao diagnóstico precoce da doença e aumentando assim o sucesso de seu tratamento. Desta forma, o esquema de auxílio ao diagnóstico de reabsorção óssea periodontal através de subtração digital de radiografias odontológicas proposto no presente trabalho emprega a técnica de subtração digital de radiografias, onde duas radiografias odontológicas, tiradas em intervalos de tempos planejados, são subtraídas para obter uma nova imagem onde serão visíveis somente estruturas que mudaram de uma imagem em relação à outra. Será gerada uma imagem que auxiliará o dentista a efetuar um diagnóstico precoce e instituir o melhor plano de tratamento, e assim acompanhar a resposta do tratamento a partir de novas imagens subtraídas. Na fase anterior à subtração, é necessário o alinhamento, para garantir que estruturas idênticas em ambas imagens estejam no mesmo local, e evitando que o resultado da subtração seja errôneo. O alinhamento consiste na marcação de 4 pontos em regiões de alto contraste em ambas as imagens para que a imagem subseqüente seja alinhada em translação e em rotação em relação à primeira. Posteriormente, uma técnica de correção de contraste é utilizada para corrigir eventuais diferenças de contraste. A subtração fornecerá três formas de visualização, na imagem subtraída, da área onde ocorreu uma reabsorção ou ganho ósseo. Uma delas é a subtração qualitativa, cujas áreas onde as imagens se mantiveram idênticas são mostradas em preto, e áreas onde ocorreram mudanças, em branco. A segunda é a subtração quantitativa, que gera a imagem subtraída em níveis de cinza, mostrando em tons de cinza uniformes áreas onde as imagens se mantiveram idênticas; em tons de cinza escuros, onde ocorreu reabsorção óssea; e em tons de cinza claros, onde ocorreu ganho ósseo. Além destas duas subtrações, há uma terceira subtração, a subtração quantitativa porcentagem-colorida, que mostrará a porcentagem de reabsorção ou ganho ósseo através de áreas coloridas na imagem. O intervalo de porcentagens poderá ser escolhido pelo dentista e a este intervalo poderá ser atribuída uma cor para visualização. Intervalos de porcentagens negativas indicam reabsorção óssea e intervalos de porcentagens positivas, ganho ósseo. Os testes realizados encontraram um erro médio de 7,5% no resultado da subtração, sendo que deste total, 3,5% é o erro introduzido pelo digitalizador. É importante ressaltar que esta taxa representa o erro não somente do algoritmo desenvolvido, mas também a propagação do erro em todas as etapas do processo, ou seja, aquisição, digitalização, alinhamento e subtração. Portanto, o erro da subtração deduzido do erro do digitalizador é de somente 4,0%. / Radiography is one of the primary features to help diagnose and monitor the treatment of periodontal diseases. However, the subjective analysis of these radiographs by the dentist only can identify lesions above 30% of mineral bone loss, leading to a serious challenge for the practice of odontology. In many clinical situations, the dentist needs to quantify the size of a lesion to determine the rate of progression or healing the disease. The digital subtraction radiography technique provides the detection of subtle bone changes, i.e., changes of around 5%, leading to an early diagnosis and enlarging the success of its treatment. The aided diagnosis scheme for periodontal bone resorption through odontological digital subtraction radiography proposed in this work employees the digital subtraction radiography technique, where two odontologic radiographs taken at intervals of planned times are subtracted to obtain a new image where only structures that have been changed from one image to the other will be visible. It will generate an image to help the dentist make an early diagnosis and establish the best treatment plan, besides accompanying the treatment’s response starting from new subtracted images. In the stage previous to the subtraction, the lining up is necessary to assure that identical structures on both images are in the same place, avoiding an erroneous result of the subtraction. It consists in marking 4 points in places with high contrast on both images for the subsequent image to be first lined up in translation and then in rotation in relation to the first one. Then, a contrast correction technique is used to correct possible contrast differences. The subtraction will provide three ways of visualization in the subtracted image of the area where a bone resorption or gain occurred. One of them is the qualitative subtraction, where areas kept identical are showed in black and areas where changes occurred are showed white. The second is the quantitative subtraction, which generates a subtracted image in gray levels, showing in uniform gray levels the areas where the images remained identical, in dark gray levels the areas where there was bone resorption and in light gray levels the area with bone gain. The third subtraction is called colored-percentage quantitative subtraction, which shows the percentage of bone resorption or gain through colored areas on the radiograph. The intervals of percentage can be chosen by the dentist and he/she can attribute a color for visualization to this interval. Negative percentage intervals indicate bone resorption and positive percentage intervals correspond to bone gain. The tests performed found a mean error of 7.5% in the result of the subtraction, of which 3.5% correspond to the error introduced by the digitalizer. It is important to stress that this rate represents the error not only for the algorithm developed, but the spreading of the error to all process stages, such as acquisition, digitalization, lining up and subtraction. Therefore, the subtraction error deduced from the digitalizer error is only 4,0%.

Abstract Rheumatoid arthritis and osteoarthritis are two chronic joint diseases, which cause two of the largest socioeconomical burdens among all joint diseases according to the World Health Organization. Both diseases are associated with changes in bone structure and bone cell, especially osteoclast, function. The etiology or pathogenesis of these diseases are not completely understood. Traditionally, osteoarthritis is seen as a disease resulting from mechanical wear of cartilage and bone, and rheumatoid arthritis as an autoinflammatory disease of synovial tissue. However, also in osteoarthritis chronic inflammation is present in synovial tissue, and in rheumatoid arthritis large changes in bone structure are seen. The field of study focusing on this connection between inflammation and bone is called osteoimmunology and it can explain many features of these chronic diseases linking joint health to disturbances in bone homeostasis. Here, the study focused on the function of osteoclasts in normal and pathological environments, and on the factors that have an effect on bone resorption, with a special emphasis on the protein osteopontin. Samples of synovial fluid and serum from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients were analyzed for factors affecting osteoclasts, and in vitro cell cultures of human derived osteoclasts were used to analyze osteoclast function in normal and pathological environment. The phosphorylation of osteopontin was found to be increased in rheumatoid arthritis, along with multiple other inflammatory factors that also affect osteoclasts, such as IL-6, IL-8 and VEGF. Osteoclast cell cultures showed how the use of different patient samples significantly affected osteoclastogenesis, due to so-called inflammatory osteoclastogenesis. Additionally, we show that osteoclasts deposit osteopontin into the resorption lacunae during bone resorption. Based on the results, the inflammatory component present in both osteoarthritis and rheumatoid arthritis significantly affects osteoclast function, and its further study in the future may reveal new therapeutic possibilities. Especially the new discoveries of osteopontin’s role in normal osteoclast function and its changes seen between osteoarthritis and rheumatoid arthritis may prove to have therapeutic potential. / Tiivistelmä Nivelreuma ja nivelrikko ovat kroonisia nivelsairauksia, jotka Maailman terveysjärjestön (WHO) mukaan aiheuttavat eniten sosioekonomista haittaa. Molemmissa sairauksissa luiden rakenteessa ja luusolujen, erityisesti osteoklastien, toiminnassa tapahtuu muutoksia. Kummankaan taudin etiologiaa tai patogeneesiä ei täysin tunneta. Perinteisesti ajatellaan, että nivelrikko johtuu rusto- ja luukudoksen mekaanisesta kulumisesta ja nivelreuma nivelkalvon autoinflammatoorisesta tulehduksesta. Kuitenkin nivelrikossa nähdään myös selkeä nivelkalvon krooninen tulehdus ja nivelreumassa suuria luun rakenteen muutoksia. Tutkimusala, joka tutkii tulehduksen ja luun yhteyttä, on nimeltään osteoimmunologia. Tässä väitöskirjassa tutkitaan osteoklastien toimintaa ja niihin vaikuttavia tekijöitä, erityisesti proteiini osteopontiinia, normaalissa ja tautiympäristössä. Analysoin osteoklasteihin vaikuttavia tekijöitä nivelrikko- ja nivelreumapotilaiden näytteistä sekä osteoklastien toimintaa soluviljelmissä. Soluviljelmissä käytettiin nivelreuma- ja nivelrikkopotilaiden näytteitä mahdollisimman totuudenmukaisen ympäristön luomiseksi osteoklasteille. Tutkimuksessa osoitettiin, kuinka osteopontiinin fosforylaatio on lisääntynyt nivelreumapotilaiden nivelnesteessä. Myös useiden muiden osteoklasteihin vaikuttavien tekijöiden, kuten IL-6:n, IL-8:n ja VEGF:n, havaittiin lisääntyneen nivelreumassa. Osteoklastien soluviljelmissä havaittiin selkeät erot siinä, miten eri potilasnäytteet vaikuttavat osteoklasteihin ja erityisesti tulehduksen aiheuttamaan osteoklastien syntyyn. Osoitan myös, miten osteoklastit erittävät osteopontiinia luunhajotuskuoppaan luun hajotuksen aikana. Tutkimustulosten mukaan krooninen tulehdustila nivelrikossa ja nivelreumassa vaikuttaa huomattavasti osteoklastien toimintaan. Uskon, että lisätutkimukset tällä saralla voivat paljastaa uusia hoidollisia mahdollisuuksia. Erityisesti uudet löydökset osteopontiinin roolista osteoklastien toiminnassa sekä muutoksista nivelrikossa ja nivelreumassa vaativat jatkotutkimuksia, jotta proteiinin kliininen merkittävyys saadaan selvitettyä.

Inflammatory processes in, or in close vicinity of, the skeleton often lead to loss of bone tissue. Different cytokines have been shown to be involved as stimulators of inflammatory induced osteoclastic bone resorption. During inflammatory processes also the kallikrein-kinin system is activated, leading to production of kinins that can cause pain, vasodilation and increased permeability of vessels. Kinins can also induce bone resorption in vitro. All cytokines and kinins that stimulate bone resorption stimulate in parallell prostaglandin synthesis, and prostaglandins, per se, have also been shown to induce bone resorption. The aim of this project was to increase the knowledge about the mechanisms involved in the interactions between different inflammatory mediators (i.e. kinins, cytokines and prostaglandins) suggested to be involved in the pathogenesis of inflammatory bone resorbing diseases. Human osteoblasts (MG-63) are equipped with both kinin B1 and B2 receptors linked to prostaglandin release and the stimulation of prostaglandin release are likely mediated via separate molecular mechanisms (Paper I). Activation of B1 or B2 receptors causes synergistic stimulation of PGE2 synthesis induced by either interleukin-1b (IL-1b) or tumour necrosis factor-a (TNF-a) (Paper II). The molecular mechanism involves increased expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and results in synergistic potentiation of receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) protein expression. The synergistic interaction is dependent on the activation of NF-kB and the mitogen-activated protein kinases (MAPK) p38 and JNK (Paper II). The synergistic increase in RANKL expression might be an explanation why kinins potentiate IL-1b induced bone resorption, a mechanism likely to be important in inflammation induced bone resorption in diseases such as periodontal disease and rheumatoid arthritis. The synergism between kinins and IL-1b or TNF-a might also be dependent on regulation of kinin receptors, since both IL-1b and TNF-a markedly upregulated B1 and B2 receptors, both at the mRNA level and protein level (Paper III). This upregulation is not further potentiated by the kinins, and different kinin receptor agonists do not regulate the receptors for IL-1b or TNF-a, in MG-63 cells. No other cytokines known to stimulate bone resorption regulates the expressions of B1 and B2 receptors. The IL-1b- or TNF-a-induced enhancements of B1 and B2 receptor expressions involve activation of NF-kB and MAPK. The enhancement of kinin receptors may also be an important mechanism in the synergistic interactions between the two pro-inflammatory cytokines and kinins (paper III). IL-4 and IL-13 are two cytokines that have been shown to inhibit bone resorption. We have shown that COX-2 and both B1 and B2 receptors are down-regulated by IL-4 and IL-13, via a ‘signal transducer and activator of transcription6’ (STAT6) dependent pathway, which might be an important regulatory mechanism in inflammation induced bone resorption (paper IV). In conclusion, the mechanisms behind the synergistic potentiation of prostaglandin formation and increased bone resorption caused by co-stimulation with kinins and IL-1b or TNF-a seem to involve both potentiation of COX-2 and subsequently increased levels of RANKL, as well as upregulation of B1 and B2 kinin receptors. Interestingly, IL-4 and IL-13 decreased the expressions of COX-2 and both B1 and B2 receptors. These events might be important in the regulation of inflammation induced bone resorption in diseases such as periodontitis and rheumatoid arthritis.

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative à l’étiologie complexe et diverse. Les travaux de ces dernières années ont démontré que l’OA est une pathologie affectant tous les tissus de l’articulation incluant le cartilage, la membrane synoviale et l’os sous-chondral. L’OA se traduit par une déstructuration et une perte de fonctionnalité de l’articulation, et est principalement caractérisée par une perte de cartilage articulaire. L’inflammation de la membrane synoviale joue un rôle déterminant dans la progression de l’OA, toutefois elle serait secondaire à la dégradation du cartilage. De plus, l’os sous-chondral est également le siège de nombreuses transformations lors de l’OA. Il est fortement suggéré que ces changements ne correspondent pas seulement à une conséquence, mais pourraient être une cause du développement de l’OA impliquant une communication entre ce tissu et le cartilage. Il est maintenant bien établi que les voies inflammatoires et cataboliques jouent un rôle crucial dans l’OA. C’est pourquoi, nous avons étudié l’implication d’une nouvelle famille de récepteurs membranaires, les PARs, et plus particulièrement le PAR-2 dans les voies physiopathologiques de l’OA. Notre hypothèse est que l’activation de PAR-2 au cours de l’OA est un phénomène majeur du développement/progression de la maladie faisant du récepteur PAR-2 un candidat privilégié pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement le cartilage mais aussi l’os sous-chondral. Pour cette étude, nous avons travaillé in vitro avec des chondrocytes (Cr) et des ostéoblastes (Ob) OA respectivement du cartilage et de l’os sous-chondral du condyle fémoral humain. Nos résultats ont démontré que PAR-2 était plus exprimé dans les Cr et les Ob OA que dans les cellules normales. Par ailleurs, PAR-2 est régulé positivement par certains facteurs retrouvés au cours de l’OA comme l’IL-1β, le TNF-α et le TGF-β dans les Cr OA, et par l’IL-1β, le TNF-α et la PGE2 dans les Ob OA. De plus, les principaux facteurs cataboliques et inflammatoires, soit la MMP-1, la MMP-13 et la COX-2 sont produits en quantité plus élevée suite à l’activation du récepteur dans le cartilage OA. De même, l’activation de PAR-2 dans les Ob OA conduit à une production accrue de facteurs pro-résorptifs tels que RANKL, l’IL-6, la MMP-1 et la MMP-9, et à l’augmentation de l’activité pro-résorptive de ces cellules. En outre, dans les deux types tissulaires étudiés, l’activation de PAR-2 augmente l’activité de certaines protéines de la famille des MAPKinases comme Erk1/2, p38 et JNK. Finalement, nous avons conclu notre étude en employant un modèle in vivo d’OA induite chez la souris sauvage et déficiente pour le gène PAR-2. Nos résultats ont démontré que l’absence d’expression et de production de PAR-2 influençait le processus inflammatoire et les changements structuraux affectant à la fois le cartilage et l’os sous-chondral, conduisant à un ralentissement du développement de l’OA. Nos travaux de recherche ont donc permis de montrer que le récepteur PAR-2 est un élément majeur du processus OA en agissant sur les voies cataboliques et inflammatoires du cartilage, et sur le remodelage tissulaire de l’os sous-chondral. Mots-clés : Arthrose, chondrocyte, cartilage, ostéoblaste, os sous-chondral, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, résorption osseuse, MAPKinase, catabolisme, inflammation / Osteoarthritis (OA) is a complex degenerative articular disease. Recent studies have shown that OA is a pathology affecting all the tissues of the joint including the cartilage, the synovial membrane and the subchondral bone. OA is regarded as destruction and a loss of functionality of joint, and is mainly characterized by a loss of articular cartilage. The synovial inflammation also plays a key role in the progression of OA; however, it is believed to be secondary to cartilage degradation. In addition, there are also in the subchondral bone numerous changes which occur during the course of the disease. It is strongly suggested that these changes in subchondral bone are not just a consequence but could be a cause of the development of OA, thus involving a cross-talk between this tissue and the cartilage. It is now well established that inflammatory and catabolic pathways play a crucial role during OA. This is why we have engaged the study of the involvement of a new family of membranous receptors, the PARs, and more particularly PAR-2 during the pathophysiological process of OA. Our hypothesis is that PAR-2 activation during OA course is a major phenomenon for the development/progression of the disease, and that PAR-2 seems a suitable candidate for the development of new therapeutic approaches targeting not only the cartilage but also the subchondral bone. Thus, we have performed in vitro studies on OA chondrocyte (Cr) and osteoblasts (Ob) cells issued respectively from human femoral condyle cartilage and subchondral bone. Our results showed that PAR-2 was expressed at a higher level in the OA Cr and Ob compared to normal cells. Moreover, PAR-2 is found to be positively regulated by some factors present during the course of OA, such as IL-1β, TNF-α and TGF-β in the OA Cr, and IL-1β, TNF-α and PGE2 in the OA Ob. In addition, the main catabolic and inflammatory factors including MMP-1, MMP-13 and COX-2 are enhanced following PAR-2 receptor activation in the OA cartilage. Similarly, the activation of PAR-2 in OA Ob lead to an increased production of pro-resorptive factors such as RANKL, IL-6, MMP-1 and MMP-9, and an increased pro-resorptive activity of these cells. In addition, in both tissue types, PAR-2 activation increases the activity of certain protein MAPKinases family such as Erk1/2, p38 and JNK. Finally, we have performed an in vivo study using an OA induced model in wild-type and PAR-2 gene knock-out mice. Our results demonstrated that the absence of PAR-2 expression and production influenced the inflammatory process and structural changes affecting the cartilage and the subchondral bone, leading to a slowing down of OA development. Our research investigation have bring to light that PAR-2 receptor is a key element during OA process by acting on the cartilage catabolic and inflammatory pathways as well as the tissue remodelling of the subchondral bone. Keywords : Osteoarthritis, chondrocyte, cartilage, osteoblast, subchondral bone, PAR-2, MMPs, COX, ILs, RANKL, bone resorption, MAPKinase , catabolism, inflammation