Brucella abortus and Agrobacterium tumefaciens are pathogenic bacteria that infect animals and plants, respectively. These bacteria are genetically similar and are found within the same Class, Alphaproteobacteria, and Order, Rhizobiales, of the domain Eubacteria; however, they survive and replicate in vastly different environmental niches. In Order to adapt to different environments, bacteria utilize several mechanisms of gene regulation to tightly control gene expression. Two of these mechanisms include transcriptional regulators and small regulatory RNAs (sRNAs), which can activate and repress gene expression through various interactions with DNA, mRNA, and proteins. A well-conserved transcriptional regulator among the Rhizobiales is VtlR, a virulence-associated transcriptional LysR regulator. The objectives of this dissertation were three fold: 1) characterize the known regulon of VtlR in B. abortus with regards to gene regulatory function and virulence, 2) determine the regulon of VtlR in A. tumefaciens and define the mechanism by which this regulation occurs, and 3) define the role of an ABC-type transport system indirectly regulated by VtlR in B. abortus that putatively imports the non-proteinogenic amino acid gamma-aminobutyric acid (GABA). VtlR was characterized in B. abortus as a virulence-associated transcriptional regulator that directly activates four genes: the sRNA AbcR2, and the three small hypothetical proteins BAB1_0914, BAB2_0512, and BAB2_0574; and deletion of vtlR led to a significant defect in the ability of B. abortus to cause infection in vitro and in vivo. Since dysregulation of abcR2 alone could not account for the defect in virulence, it was hypothesized that one or all three hypothetical proteins could be responsible for a virulence phenotype observed in ΔvtlR. This turned out to not be the case, as a deletion of the entire VtlR regulon displayed no difference in virulence compared to the parental strain. Further characterization of the small hypothetical proteins is outlined in Chapter 2 and the data revealed bona fide translation of each small protein, and the deletion strain of the VtlR regulon displayed a growth defect when grown in the presence of the sugar fucose. This phenotype was subsequently observed in ΔvtlR as well. This led to the identification of a putative fucose transport and metabolism locus in B. abortus that has yet to be studied. In A. tumefaciens, VtlR is necessary for proper attachment to plant cells and biofilm formation and regulates over 200 genes, significantly more than the four genes VtlR regulates in B. abortus. The mechanism by which this occurs was unknown, and the relationship between VtlR and AbcR1 or AbcR2 was uncharacterized. The data in Chapter 3 outline the VtlR network by showing that VtlR regulation of myriad genes in A. tumefaciens is primarily indirect via the direct regulation of a few sRNAs. This direct interaction was shown experimentally and a VtlR binding box was identified in the A. tumefaciens genome. This project outlines the divergence of a regulatory element between phylogenetically related organisms that occupy different environmental niches. The AbcR sRNAs are conserved throughout the Rhizobiales and regulate numerous ABC-type transport systems within these bacteria. In A. tumefaciens, one of these transport systems specifically transports the amino acds proline and GABA. B. abortus contains homologs of this system, which led to the hypothesis that the brucellae may also transport GABA but for a yet unknown purpose. The data in Chapter 4 revealed that B. abortus also transports GABA in vitro and this transport is under the regulation of AbcR1 and AbcR2. This transport was increased under extreme nutrient limitations and was uninhibited by the presence of other amino acids. Metabolic studies showed GABA is not utilized by B. abortus under aerobic conditions, and transcriptomic data revealed increased expression of several loci in the presence of GABA. Altogether, this study uncovers a putative signaling role for the amino acid GABA that has been understudied in bacterial pathogens that infect animal hosts. Overall, the work presented in this dissertation is focused on further elucidating the biological role of downstream regulatory targets of both VtlR and the sRNAs AbcR1 and AbcR2 in the related organisms Brucella abortus and Agrobacterium tumefaciens. Findings show that while there are similarities between the two systems, there are also many differences that may be attributed to the vastly different lifestyles of each organism. / Doctor of Philosophy / Brucella abortus and Agrobacterium tumefaciens are two highly related bacterial pathogens that infect mammals and plants, respectively. Although genetically related, both organisms survive and replicate in vastly different environmental niches with one living in the soil (i.e., A. tumefaciens) and the other living within immune cells of the infected host (i.e., B. abortus). In Order to quickly adapt to changing environmental conditions, the bacteria must rapidly control gene expression through multiple regulatory mechanisms. The works presented in this dissertation will focus on further characterizing one of these regulatory systems and comparing the homologous systems shared by B. abortus and A. tumefaciens. This includes uncovering a putative sugar transport and metabolism system, as well as discovering the potential for host-pathogen signaling via the well-studied neurotransmitter GABA.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-09-14T12:27:00Z No. of bitstreams: 1 patriciapaivacorsetti.pdf: 2969873 bytes, checksum: f90d3d721f56a1166b3f3bbc78e327a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-09-26T20:17:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patriciapaivacorsetti.pdf: 2969873 bytes, checksum: f90d3d721f56a1166b3f3bbc78e327a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T20:17:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patriciapaivacorsetti.pdf: 2969873 bytes, checksum: f90d3d721f56a1166b3f3bbc78e327a9 (MD5) Previous issue date: 2011-10-07 / Brucella abortus é uma bactéria patogênica Gram-negativa, que causa uma doença crônica em bovinos, humanos e outras espécies denominada brucelose. A habilidade do hospedeiro em montar uma resposta tipo Th1/pró-inflamatória contra a bactéria é crucial para o controle e resolução da infecção. Evidências sugerem que a citocina IFN-γ produzida pelo perfil Th1 é crucial para o controle da infecção em camundongos. A interleucina-10 (IL-10) é conhecida por diminuir a produção de IFNγ in vitro interferindo diretamente no processo da eliminação do patógeno. Durante a infecção pela B. abortus, a IL-10 pode atuar limitando a resposta inflamatória e favorecendo o estabelecimento da infecção persistente em camundongos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da IL-10 endógena na infecção pela B. abortus. Para acessar o papel da IL-10, camundongos deficientes para IL-10 (IL-10 KO) ou 129 Sv/Ev foram infectados com a cepa S2308 de B. abortus e foram avaliados os númerso de bactérias viáveis recuperadas no baço desses animais. Uma, 2, 3, 6 e 14 semanas após infecção, camundongos IL-10 KO apresentaram menor número de bactérias recuperadas quando comparadas com o grupo controle em todos os tempos de infecção, principalmente em 14 semanas. Adicionalmente, constatou-se por análise de curva de sobrevivência em um período de 14 semanas após infecção que aproximadamente 35% dos camundongos IL-10 KO morrem somente na 2ª ou 3ª semana. Ademais, a produção de IFN-γ, IL-10, IL-17 e TNF-α foi avaliada em esplenócitos dos camundongos infectados quando estimulados in vitro com a B. abortus viva (S2308), morta pelo calor (HKBA), LPS de E. coli ou ConA. Os animais IL-10 KO apresentaram uma maior quantidade de IFN-γ e TNF-α no sobrenadante das células estimuladas com Brucella quando comparada a produção destas citocinas pelas células provenientes dos camundongos 129 Sv/Ev. A citocina IL-17 somente foi produzida pelas células dos animais IL-10 KO em todos os tempos analisados. Adicionalmente, a produção de TNF-α, IL-6, IL-12-p40, NO e IL-10 foram avaliados em macrófagos derivados da medula óssea, dos animais IL-10 KO e 129 Sv/Ev. TNF-α, NO, IL-6 e IL-12 apresentaram aumento nos animais IL-10 KO apenas quando estimulados com HKBA. Entretanto, nos animais 129 Sv/Ev a bactéria viva e morta estimularam a produção de IL-10. Estas mesmas citocinas foram avaliadas em sobrenadante de cultura de células dendríticas derivadas da medula óssea. Níveis mais elevados de TNF-α e IL-12-p40 foram obtidos no sobrenadante de células de animais IL-10 KO quando comparados ao grupo controle, em todos os tempos e estímulos da cinética de infecção. A expressão de TGF-β foi avaliada por PCR em tempo real em células esplênicas nos tempos 0 (não infectado), 1, 2 e 6 semanas de infecção estimulados com a bactéria viva. Na 2ª semana após infecção os animais IL-10 KO expressaram níveis mais elevados de TGF-β em relação ao grupo controle, porém na 6ª semana este perfil é invertido. Adicionalmente, o nível de células CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) presente no baço dos animais infectados foi analisado por citometria de fluxo. Esta população encontrouse aumentada nos animais IL-10 KO a partir da 3ª e 6ª semanas após a infecção. Análises histopatológicas descritiva dos fígados destes animais durante toda a cinética de infecção demonstraram a diminuição gradativa dos granulomas nos dois grupos estudados, porém essa redução foi mais eficiente nos camundongos IL-10 KO principalmente na 6ª semana após a infecção considerando-se a área do granuloma, analisada por morfemetria digital, e a recuperação do parênquima hepático. Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho suportam que a ausência da produção da IL-10 está associada a uma maior resistência à infecção pela bactéria B. abortus em modelo murino, através do aumento da produção de citocinas próinflamatórias culminando com uma maior eliminação da bactéria e uma resolução mais rápida da patologia tecidual do hospedeiro levando, assim, a um controle efetivo da infecção. / Brucella abortus is a Gram-negative pathogenic bacterium which causes a chronic disease in bovine, humans and others species called brucellosis. The host ability to mount a Th1/pro-inflammatory response against the bacteria is crucial to control and to solve the infection. It is suggested that IFN-γ produced by Th1cells is crucial to control the infection in mice. The interleukin IL-10 is considered to be responsible to decrease the IFN-γ production in vitro interfering directly in the pathogen elimination. During B. abortus infection, IL-10 acts limiting inflammatory response favoring the establishment persistence infection in mice. The goal of this study was evaluated the role of endogenous IL-10 during B. abortus infection. To assess the role of IL-10 in vivo, IL-10 knockout (IL-10 KO) mice or 129 Sv/Ev mice were infected with B. abortus strain S2308 and the number of viable bacteria recovery from the spleen were evaluated. One, 2, 3, 6 and 14 weeks post infection, IL-10 KO mice showed lower number of bacteria in the spleen when compared to wild type mice during all the time points. It was observed the increase of the difference at 14th week post infection. Additionally, it was demonstrated by survival curve in a period of 14 weeks post infection that approximately 35% of IL-10 KO mice died only at 2 or 3 weeks. Furthermore, the IFN-γ, IL-10, IL-17 and TNF-α production were measured in the supernatant from spleen cell culture in vitro when the cells were stimulated with alive B. abortus (S2308), heat killed B. abortus (HKBa), E. coli LPS or ConA. IL-10 KO cells showed greater increase in IFN-γ and TNF-α level in the supernatant from these cells when they were stimulated with Brucella when compared to wild type cells production. IL-17 was only detected in the supernatant from IL-10 KO cells in all time points analyzed. In addition, the TNF-α, IL-6, IL-12-p40, NO and IL-10 levels were evaluated in bone-marrow macrophage derived cell supernatant. TNF-α, NO, IL-6 and IL-12 showed augmented in IL-10 KO cells when stimulated with HKBa. However, only in supernatant from 129 Sv/Ev mice it was observed IL-10 production. In bone-marrow dendritic cell supernatant greater levels of TNF-α and IL-12-p40 were observed in IL-10 KO cells when compared to wild type mice cells during all time points analyzed when the cells were stimulated with all stimulus. The TGF-β expression was evaluated by real time PCR in splenic cells culture at 0 (non-infected cells), 1, 2 and 6 weeks after infection with S2308. At 2 weeks post infection the IL-10 KO cells demonstrated greater increased of TGF-β expression when compared to wild type cells. At 6 weeks post infection the TGF-β expression profile showed inverted. Additionally, the level of CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) cells was assessed at spleen of infected mice by flow cytometry during the infection process. This population was increased at 3th and 6th weeks post infection in IL-10 KO mice. Descriptive histopathology analyses were done at liver level demonstrating a gradual diminishment of granuloma in both kinds of analyzed animals. However, the decrease pathology was more effective at IL-10 KO livers considering the granuloma area, measured by digital morphometry, and the hepatic parenchyma recovery. Taken together, the data provided by this work support that the lack of IL-10 is related to higher resistance to B. abortus infection in murine infection throughout the increase production of pro-inflammatory cytokines culminating with better bacteria elimination and a quicker tissue pathological resolution leading to a more effective control of this infection.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se desarrolló y validó un ensayo inmunoabsorbente ligado a un enzima (ELISA), usando antígeno lipopolisacárido rugoso (LPS-R) de la cepa RB51 de Brucella abortus para el diagnóstico de infección con B. ovis en ovinos. Se probaron 2 tipos de placas de poliestireno NUNC 69620 y Maxisorp, 2 tipos de tampones de distinto pH con 2 diferentes conjugados: policlonal anti IgG-ovina (Sigma A3415) y monoclonal anti IgG-caprino/ovino (Sigma A9452), las diluciones del antígeno y del conjugado del trabajo se obtuvieron mediante una titulación en tablero de ajedrez. El ensayo se validó utilizando la placa NUNC 69620 con una sensibilización del antígeno 1:50 en el tampón carbonato-bicarbonato y el uso del conjugado monoclonal, en 55 sueros de ovinos positivos a examen clínico y a la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y 338 sueros de ovinos provenientes de un rebaño libre de la enfermedad, confirmados por medio de fijación del complemento (FC). Para comparar las placas, las densidades ópticas (DO) fueron llevadas a porcentajes de positividad (PP), el punto de corte fue un 39,5% utilizando la metodología “Receiver-Operator Characteristic” (ROC), estimando la sensibilidad y la especificidad en un 92.7% y un 98,5% respectivamente. Estos resultados permiten establecer que el ELISA desarrollado sea una alternativa real, para el diagnóstico serólogico de B. ovis en el país

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Brucelosis bovina es una enfermedad que ha llevado a los distintos países a establecer estrategias de control y prevención de la enfermedad. En Chile las estrategias establecidas por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) son vigilancia, saneamiento y prevención en el ganado bovino. Esta última medida consiste en la vacunación con B. abortus cepa RB51. La ventaja de esta cepa es que no produce interferencia diagnóstica con pruebas que utilizan el lipopolisacárido liso (s-LPS) como antígeno. El presente estudio caracterizó la respuesta inmune humoral y celular generada en el ganado bovino vacunado con esta cepa. Para esto se contó con un grupo de 25 terneras las cuales fueron vacunadas con 1- 3 x 1010 UFC de B. abortus RB51, entre la edad de 4 y 8 meses. Estas fueron mantenidas y manejadas en su rebaño durante el período de estudio en el cual se realizaron cuatro muestreos los días 0, 30, 180 y 360 post vacunación, recolectando dos muestras de sangre de cada animal una con y otra sin anticoagulante (heparina de sodio). Las muestras obtenidas fueron procesadas en cinco pruebas diagnósticas distintas y éstas son: rosa de bengala, ELISA indirecto, ELISA competencia las cuales detectan la respuesta inmune humoral al s-LPS de Brucella. También se usaron la prueba de ELISA citosol de RB51 que detecta la respuesta inmune humoral frente a proteínas del citosol de RB51 y finalmente la prueba de IFN bovino, que detecta la respuesta inmune celular frente a RB51. Los resultados obtenidos, demostraron que la cepa RB51 no induce anticuerpos contra el s-LPS de Brucella tal como era esperado, pero sí induce anticuerpos frente a proteínas citosólicas de cepa RB51. Durante el período de estudio, sólo una vaquilla arrojó resultados positivos a estas pruebas y esto se debió probablemente al resultado de una infección natural como consecuencia de la presencia de brucelosis en el rebaño. Los resultados obtenidos frente a la prueba de IFN bovino demostraron que cepa RB51 induce respuesta inmune celular, detectable mediante la presencia de esta citoquina que fue liberada al plasma bovino por los linfocitos estimulados con el citosol de RB51. La evolución del porcentaje de animales negativos a las pruebas que usan s-LPS como antígeno fue estable ya que, exceptuando la vaquilla positiva antes mencionada, todos los animales permanecieron negativos a los cuatro muestreos. La prueba de ELISA citosol de RB51muestra un evidente aumento en el porcentaje de animales positivos entre el primer y segundo muestreo, para luego permanecer constante en los muestreos siguientes, esto debido a los anticuerpos generados como respuesta post vacunatoria a las proteínas de RB51, que decaen con el tiempo. Finalmente la prueba de IFN bovino muestra un aumento del porcentaje de animales positivos entre el primero y segundo muestreo y luego decrece en forma constante, hasta el último muestreo / Financiamiento: IFS B/1800-2

Un brote de bovinos de raza Hereford fueron inoculados a repetición con Brucella abortus cepa 19 durante un período de doce meses. Elaboraron anticuerpos correspondientes a la clase Ig M e Ig G, siendo los últimos los que predominaron y persistieron hasta el final del experimento. Los anticuerpos de la clase Ig G correspondieron a poblaciones de anticuerpos diferentes: aglutinantes y no aglutinantes o bloqueantes, estos detectados por reacción de Coombs. Ambos tipos de anticuerpos fueron separados mediante inmunoadsorciones seriadas y purificadas por cromatografía de intercambio iónico. Se les caracterizó como pertenecientes aa calse Ig G1, siendo estudiadas sus propiedades inmunoquímicas y biológicas. Los anticuerpos aglutinantes fueron capaces de aglutinar el antígeno, fijar complemento y facilitar la depuración sanguínea de Brucella abortus cepa 19 marcada con 131 I en ratones e inhibieron la multiplicación de Brucella abortus en el bazo de ratones inoculados con estas bacterias. Por el contrario los anticuerpos coaglutinantes, fueron incapaces de facilitar la depuración sanguínea de bacterias y facilitaron su multiplicación en bazo. A la luz de estos resultados postulamos la hipótesis de que estos anticuerpos intervendrían en el facilitamiento de la permanencia y multiplicación de las brucelas en el huésped, siendo éste, uno de los mecanismos responsables de la iniciación y/o mantenimiento de la cronicidad en la brucelosis bovina. / Hereford cattles were repeatedely inoculated with Brucella abortus strain 19 for twelve months. Antibodies elaborated belonging to classes Ig M and Ig G, thelatter being the ones that predominated and persisted till the end of the experiment. Ig G antibodies were related to two different types of antibodies: agglutinating and non-agglutinating antibodies, were specifically purified by immunoadsortion and latter purified by ionic exchange chromatography. They were characterised as Ig G1, and its inmunochemical and biological properties were studied. Agglutinating antibodies were able to agglutinate the antigen, fix the complement and increased blood clearance of Brucella abortus strain 19 marked with 131 I in mice and inhibited the multiplication of Brucella in mice spleen inoculated with these bacteria. On the other hand, the co-agglutinating antibodies unable to facilate the bacterial blood clearence and enhaced its multiplication in spleen. Owing to these results we postulate that these antibodies would facilitate the permanence and multiplication of bacteria in the guest. This mechanism would be responsible for the beginning and maintainans of chronic cattle brucellosis.

A mortalidade fetal é uma causa importante de perdas reprodutivas em animais domésticos e tem impacto significativo na rentabilidade de um sistema de produção animal. No Brasil, poucas informações são disponíveis sobre as principais causa de aborto em bovinos. O presente estudo resultou em cinco artigos. O primeiro artigo descreve as principais causas de aborto bovino diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul no período 2003-2011. Neste período um total de 490 fetos bovinos foi analisado. Causas específicas de aborto foram encontradas em 46,7 % dos casos. Infecções por protozoários, em especial Neospora caninum acometeram 33 % dos casos (162/490). Bactérias em 6,3 % (31/490), seguidas por fungos 0,8% (4/490) foram causas adicionais de abortos. Em dois fetos (0,4 %), coinfecções por dois agentes foram identificadas. Causas não infecciosas foram observadas em 3 % dos abortos e malformações congênitas a 2,6%. No segundo artigo estima-se a ocorrência de abortos por Brucella abortus em bovinos na região sul, caracterizando os achados macroscópicos, histopatológicos, bacteriológicos, imuno-histoquímicos e de PCR desta enfermidade. No terceiro artigo relata-se a infecção por Geotrichum candidum em feto bovino abortado associado a lesões de pele e pulmonares. A ocorrência de malformações congênitas múltiplas em um feto bovino abortado é relatada no quarto artigo e casos de condrodisplasia tipo Dexter em fetos bovinos abortados são descritos no quinto. / The fetal mortality is an important cause of reproductive failure in domestic animals and has a significant impact on the profitability of a livestock production system. In Brazil, little information is available on the main cause of abortion in cattle. This study resulted in five articles. The first article describes the main causes of abortion in cattle diagnosed in the period January 2003 to december 2011. A total of 490 fetuses, from several Brazilian states, were evaluated. Specific causes of abortion were found in 46,7 % of cases. Protozoan abortions especially Neospora caninum were detected in 33 % (162/490) of the cases. Bacterial abortions corresponded to 6,3 % (31/490), followed by fungal 0,8 % (4/490). In two aborted fetuses (0,4 %), a co-infection with two agents could be identified. Noninfectious diseases could be associated with 3 % of the abortions and congenital malformations with 2,6%. In the second article estimated the incidence of abortion by Brucella abortus in cattle in the southern region, characterizing the macroscopic findings, histological, bacteriological, immunohistochemical and molecular aspects of this disease. The third article relates a Geotrichum candidum infection in aborted bovine fetus associated with skin and lung lesions. The occurrence of multiple congenital malformations in an aborted bovine fetus is reported in the fourth article and cases of Dexter chondrodysplasia type of aborted fetuses are described in the fifth.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-07-07T19:08:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 867144 bytes, checksum: b1dfb9c08a4b085feda6d150ced1327c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T19:08:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 867144 bytes, checksum: b1dfb9c08a4b085feda6d150ced1327c (MD5) Previous issue date: 2017-03-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mycobacterium bovis e Brucella abortus são os agentes etiológicos da tuberculose e da brucelose bovinas, doenças infectocontagiosas de ocorrência mundial que geram grandes prejuízos econômicos e podem ser transmitidas aos humanos principalmente através do contato direto com animais contaminados e da ingestão de leite cru e derivados. No Brasil existe o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose, criado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, que estabelece a realização do diagnóstico e normatiza as medidas de controle dessas zoonoses. Os métodos oficiais para diagnóstico de brucelose e tuberculose no animal vivo possuem sensibilidade e especificidade variáveis, são laboriosos e demandam tempo. Para aumentar a eficácia do controle destas doenças são necessários métodos rápidos e acurados, que atuem como ferramenta auxiliar no diagnóstico in vivo dessas enfermidades sem a necessidade de procedimentos invasivos. Para garantir a credibilidade e confiabilidade de novos métodos de diagnóstico é necessário que os mesmos sejam validados. No presente estudo foram realizados ensaios para a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para a detecção do DNA de M. bovis e B. abortus em amostras de leite cru artificialmente contaminados, usando como critério o desempenho analítico (sensibilidade e especificidade analítica), repetibilidade, reprodutibilidade interna e robustez. Inicialmente cinco metodologias de extração de DNA foram testadas e as que apresentaram melhores resultados foram os kits comerciais DNeasy mericon Food Kit – Qiagen e Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit – Promega. Os limites de detecção obtidos na qPCR validada nesse estudo foram de 2,3 pg de DNA de M. bovis e 20,7 fg de DNA de B. abortus. As repetibilidades eviii reprodutibilidades aliadas à robustez apresentadas nesse trabalho indicam que os métodos avaliados podem ser utilizados de forma auxiliar ao diagnóstico in vivo oficial de tuberculose e brucelose bovinas, após ser testada em animais naturalmente infectados. / Mycobacterium bovis and Brucella abortus are the etiological agents of bovine tuberculosis and brucellosis, infectious diseases globally disseminated that cause substantial economic losses and can be transmitted to humans mainly through direct contact with contaminated animals and the intake of raw milk and milk products. In Brazil there is the National Program for the Control and Eradication of Brucellosis and Tuberculosis, created by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply, which establishes the diagnosis and regulates the control measures of these zoonosis. The official methods for diagnosis of brucellosis and tuberculosis in the living animal have variable sensitivity and specificity, are laborious and time consuming. In order to increase the efficacy of brucellosis and tuberculosis control, rapid and accurate methods are necessary to act as an auxiliary tool in the in vivo diagnosis of these diseases without the need of invasive procedures. To ensure the credibility and reliability of new diagnostic methods, they must be validated. In the present study, the validation of a real-time polymerase chain reaction (qPCR) for the detection of M. bovis and B. abortus in artificially contaminated raw milk samples was performed using analytical performance (analytical sensitivity and specificity), repeatability, internal reproducibility and robustness. Initially five DNA extraction methodologies were tested and the ones that presented the best results were the commercial kits “DNeasy Mericon Food Kit – Qiagen” and “Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit – Promega”. The limits of detection obtained in the qPCR validated in this study were 2.3 pg of M. bovis DNA and 20.7 fg of B. abortus DNA. The repeatability and reproducibility associated with the robustness presented in this study indicate that the evaluated methods can be used as an auxiliaryx tool to the in vivo official diagnosis of bovine tuberculosis and brucellosis, after being tested in naturally infected animals. / Nos dois impressos faltaram as últimas 12 páginas com referência bibliográfica.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-27Bitstream added on 2014-06-13T20:35:27Z : No. of bitstreams: 1 blankenheim_tm_me_jabo.pdf: 1604167 bytes, checksum: 4a1bd2c15849129ba10ee344bb637ad3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O trabalho teve como objetivo analisar a resposta sorológica induzida pela vacinação com a dose padrão de 60-120x109 organismos da amostra B19 de Brucella abortus em bezerras da raça Tabapuã, com idade entre 3 e 8 meses, pelos testes sorológicos preconizados pelo Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) para diagnóstico da brucelose bovina. Foram examinadas amostras de soro sanguíneo de 72 animais em quatro provas sorológicas: antígeno acidificado tamponado (AAT), teste de soroaglutinação lenta juntamente com o teste de 2-mercaptoetanoll (2-ME), reação de fixação de complemento (RFC) e teste de polarização fluorescente (TPF), o qual foi interpretado de duas formas: ponto de corte variável e ponto de corte fixo. As amostras de soro sanguíneo foram colhidas imediatamente antes da vacinação, e após 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 e 360 dias. Foi calculada a especificidade dos testes, e os resultados foram comparados pelo indicador kappa e pelo teste ² de McNemar. O TPF apresentou especificidade mais elevada do que os outros testes nas amostras colhidas dos 30 aos 90 dias após a vacinação, mas com o passar do tempo a diferença entre a especificidade do TPF e a dos outros testes diminuiu. Aos 270 dias de vacinação, observou-se especificidade de 93,74% no AAT, no 2-ME e na RFC. No TPF com ponto de corte variável a especificidade foi 87,5%, e com ponto de corte fixo foi 100,0%. Foi possível concluir que o TPF apresentou maior capacidade de discriminação dos títulos de anticorpos vacinais logo após a vacinação, quando comparado com os outros testes preconizados pelo PNCEBT, apresentando-se, portanto, como uma ferramenta útil para o diagnóstico da brucelose bovina, além de ser de execução fácil e rápida / The study aimed to analyze the antibody response induced by vaccination with the standard dose of 60-120x109 organisms of Brucella abortus strain 19 in Tabapuã heifers, aged between 3 and 8 months, by serological tests recommended by the National Program for Brucellosis and Tuberculosis Control and Eradication (PNCEBT) for the diagnosis of bovine brucellosis. Serum samples of 72 animals were examined by four serological tests: rose Bengal test (RBT), standard agglutination test with the 2-mercaptoetanol (2-ME) test, complement fixation test (CFT) and fluorescence polarization assay (FPA), which was interpreted in two ways: variable cutoff and fixed cutoff. Heifers were bled immediately prior to vaccination, and after 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 and 360 days. Specificity of the tests were calculated, and the results were compared using the kappa statistic and the McNemar's ² test. The FPA had a higher specificity than the other tests on the samples collected from 30 to 90 days after vaccination, but over time this difference decreased. At 270 days of vaccination, the specificity of RBT, 2-ME and RFC was 93.74%. The specificity of the FPA with variable cutoff was 87.5%, and with fixed cutoff was 100.0%. It was concluded that FPA had a higher discrimination ability for vaccination antibody titers shortly after vaccination, when compared with other tests recommended by the PNCEBT, and is a useful tool for the diagnosis of bovine brucellosis, besides being easy and quick to perform

Orientador: Luis Antonio Mathias / Coorientador: Raphaella Barbosa Meirelles Bartoli / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Anna Monteiro Correia Lima Ribeiro / Resumo: O trabalho teve como objetivo analisar a resposta sorológica induzida pela vacinação com a dose padrão de 60-120x109 organismos da amostra B19 de Brucella abortus em bezerras da raça Tabapuã, com idade entre 3 e 8 meses, pelos testes sorológicos preconizados pelo Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) para diagnóstico da brucelose bovina. Foram examinadas amostras de soro sanguíneo de 72 animais em quatro provas sorológicas: antígeno acidificado tamponado (AAT), teste de soroaglutinação lenta juntamente com o teste de 2-mercaptoetanoll (2-ME), reação de fixação de complemento (RFC) e teste de polarização fluorescente (TPF), o qual foi interpretado de duas formas: ponto de corte variável e ponto de corte fixo. As amostras de soro sanguíneo foram colhidas imediatamente antes da vacinação, e após 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 e 360 dias. Foi calculada a especificidade dos testes, e os resultados foram comparados pelo indicador kappa e pelo teste ² de McNemar. O TPF apresentou especificidade mais elevada do que os outros testes nas amostras colhidas dos 30 aos 90 dias após a vacinação, mas com o passar do tempo a diferença entre a especificidade do TPF e a dos outros testes diminuiu. Aos 270 dias de vacinação, observou-se especificidade de 93,74% no AAT, no 2-ME e na RFC. No TPF com ponto de corte variável a especificidade foi 87,5%, e com ponto de corte fixo foi 100,0%. Foi possível concluir que o TPF apresentou maior capacidade de discriminação dos títulos de anticorpos vacinais logo após a vacinação, quando comparado com os outros testes preconizados pelo PNCEBT, apresentando-se, portanto, como uma ferramenta útil para o diagnóstico da brucelose bovina, além de ser de execução fácil e rápida / Abstract: The study aimed to analyze the antibody response induced by vaccination with the standard dose of 60-120x109 organisms of Brucella abortus strain 19 in Tabapuã heifers, aged between 3 and 8 months, by serological tests recommended by the National Program for Brucellosis and Tuberculosis Control and Eradication (PNCEBT) for the diagnosis of bovine brucellosis. Serum samples of 72 animals were examined by four serological tests: rose Bengal test (RBT), standard agglutination test with the 2-mercaptoetanol (2-ME) test, complement fixation test (CFT) and fluorescence polarization assay (FPA), which was interpreted in two ways: variable cutoff and fixed cutoff. Heifers were bled immediately prior to vaccination, and after 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 and 360 days. Specificity of the tests were calculated, and the results were compared using the kappa statistic and the McNemar's ² test. The FPA had a higher specificity than the other tests on the samples collected from 30 to 90 days after vaccination, but over time this difference decreased. At 270 days of vaccination, the specificity of RBT, 2-ME and RFC was 93.74%. The specificity of the FPA with variable cutoff was 87.5%, and with fixed cutoff was 100.0%. It was concluded that FPA had a higher discrimination ability for vaccination antibody titers shortly after vaccination, when compared with other tests recommended by the PNCEBT, and is a useful tool for the diagnosis of bovine brucellosis, besides being easy and quick to perform / Mestre

A mortalidade fetal é uma causa importante de perdas reprodutivas em animais domésticos e tem impacto significativo na rentabilidade de um sistema de produção animal. No Brasil, poucas informações são disponíveis sobre as principais causa de aborto em bovinos. O presente estudo resultou em cinco artigos. O primeiro artigo descreve as principais causas de aborto bovino diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul no período 2003-2011. Neste período um total de 490 fetos bovinos foi analisado. Causas específicas de aborto foram encontradas em 46,7 % dos casos. Infecções por protozoários, em especial Neospora caninum acometeram 33 % dos casos (162/490). Bactérias em 6,3 % (31/490), seguidas por fungos 0,8% (4/490) foram causas adicionais de abortos. Em dois fetos (0,4 %), coinfecções por dois agentes foram identificadas. Causas não infecciosas foram observadas em 3 % dos abortos e malformações congênitas a 2,6%. No segundo artigo estima-se a ocorrência de abortos por Brucella abortus em bovinos na região sul, caracterizando os achados macroscópicos, histopatológicos, bacteriológicos, imuno-histoquímicos e de PCR desta enfermidade. No terceiro artigo relata-se a infecção por Geotrichum candidum em feto bovino abortado associado a lesões de pele e pulmonares. A ocorrência de malformações congênitas múltiplas em um feto bovino abortado é relatada no quarto artigo e casos de condrodisplasia tipo Dexter em fetos bovinos abortados são descritos no quinto. / The fetal mortality is an important cause of reproductive failure in domestic animals and has a significant impact on the profitability of a livestock production system. In Brazil, little information is available on the main cause of abortion in cattle. This study resulted in five articles. The first article describes the main causes of abortion in cattle diagnosed in the period January 2003 to december 2011. A total of 490 fetuses, from several Brazilian states, were evaluated. Specific causes of abortion were found in 46,7 % of cases. Protozoan abortions especially Neospora caninum were detected in 33 % (162/490) of the cases. Bacterial abortions corresponded to 6,3 % (31/490), followed by fungal 0,8 % (4/490). In two aborted fetuses (0,4 %), a co-infection with two agents could be identified. Noninfectious diseases could be associated with 3 % of the abortions and congenital malformations with 2,6%. In the second article estimated the incidence of abortion by Brucella abortus in cattle in the southern region, characterizing the macroscopic findings, histological, bacteriological, immunohistochemical and molecular aspects of this disease. The third article relates a Geotrichum candidum infection in aborted bovine fetus associated with skin and lung lesions. The occurrence of multiple congenital malformations in an aborted bovine fetus is reported in the fourth article and cases of Dexter chondrodysplasia type of aborted fetuses are described in the fifth.