Submitted by EFRAIN ENRIQUE ACEVEDO JIMENEZ null (enriqueacevedojimenez@hotmail.com) on 2016-03-10T12:19:26Z No. of bitstreams: 1 Jiménez_ee_dr_jabo.pdf: 1090007 bytes, checksum: 8163507cf7a78fc0b9aa5479e1e8abc3 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-03-10T20:29:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 jimenez_eea_dr_jabo.pdf: 1090007 bytes, checksum: 8163507cf7a78fc0b9aa5479e1e8abc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-10T20:29:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jimenez_eea_dr_jabo.pdf: 1090007 bytes, checksum: 8163507cf7a78fc0b9aa5479e1e8abc3 (MD5) Previous issue date: 2016-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os critérios de seleção mais empregados para bubalinos no Brasil incidem em atributos associados a aspectos produtivos. Entretanto, o sucesso do sistema produtivo depende de diversos fatores ambientais e genéticos, sendo que a produção de leite depende diretamente da reprodução dos animais. Neste sentido, a reprodução pode ser usada na geração de novas características indicadoras de precocidade sexual no processo de seleção dos animais. O objetivo deste estudo foi obter a confiabilidade das avaliações genômicas para a predição dos valores genéticos genômicos de produção de leite (PL), idade ao primeiro parto (IPP) e intervalo entre partos (IEP) utilizando as metodologias de GBLUP, Bayes Cπ e LASSO Bayesiano. Foram genotipados 452 búfalos (57 machos e 395 fêmeas) utilizando o painel de 90K Axiom® Buffalo Genotyping Array da Affymetrix. Para a comparação dos modelos relacionadas ao delineamento de cross-validação, foram utilizadas a correlação de Pearson e a regressão entre a variável resposta (valor desregredido da característica) e o valor genético considerando apenas marcadores, e considerando marcadores mais o efeito poligenico (GEVBM e GEVBT). Concluiu-se que em estudos de seleção genômica recomenda-se a utilização das informações poligênicas e dos marcadores para obter uma melhor predição genômica nas características do estudo nos bubalinos. Entre os modelos estudados os resultados mostram que as predições bayesianas e GBLUP apresentaram estimativas equivalentes. Entretanto poderia ser recomendado a utilização do GBLUP nas avaliações genômicas das características em bubalinos, devido a que o GBLUP tem uma menor exigência computacional e facilidade em convergência. / CAPES: 5615119

As dosagens de estradiol e progesterona são utilizadas em grande número de pesquisas em reprodução animal. Vários métodos e anticorpos para quantificação vêm sendo desenvolvidos, porém cada metodologia analítica possui vantagens e limitações. O radioimunoensaio é o mais utilizado, mas tem como principal desvantagem o envolvimento de material radioativo. A preocupação neste setor aliada às exigências das legislações em questões ambientais, têm aumentado a necessidade do desenvolvimento de novas técnicas sem a utilização de material radioativo. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a técnica xMAP-Multiplex® para dosagem de estradiol e progesterona em vacas, ovelhas e búfalas. Foram utilizados cinco animais de cada espécies. O ciclo estral dos animais foi sincronizado com a utilização de prostaglandina e amostras sanguíneas foram coletadas durante o ciclo estral. As concentrações séricas de progesterona e estradiol dos animais do estudo foram obtidas pelo MILLIPLEX® MAP Multi Species Steroid kit (STTHMAG-21K; Millipore, Billerica, MA). Nas condições em que este experimento foi realizado, os resultados mostraram que esta técnina é viável para a avaliação do perfil progesterônico destas espécies, mas não para avaliar o perfil estrogênico. / Quantification of estradiol and progesterone are used in a big number of animal´s reproduction´s researches. Several methods and antibodies to quantify them have been developed, but each analytical methodology has advantages and limitations. Radioimmunoassay is the most widely used method, but it has as major disavantage the use of radioactive material. The concerns at this area added to the requirements of legislations about environmental topics have increased the need to development techniques without the use of radioactive material. The aim of this research was to evaluate the xMAP-Multiplex® technique to quantify progesterone and estradiol in ovines, bovines and bubalins. Five animals of each species were used. The estrous cycle of the animals was synchronized by prostaglandin and blood samples were collected during the estrous cycle. The seric concentrations of progesterone and estradiol were obtained by MILLIPLEX® MAP Multi Species Steroid kit (STTHMAG-21K; Millipore, Billerica, MA). Under the conditios of this experiment the results showed that this technique is practicable to evaluate progesterone´s profile in those animals, but not to evaluate their estradiol´s profile.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-09-20T18:00:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_IsolamentoCaracterizacaoAnalise.pdf: 641185 bytes, checksum: 67fcd80f5a59d812927fc3a56104a235 (MD5) / Rejected by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br), reason: Aguardar as orientações on 2017-10-10T16:50:48Z (GMT) / Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-10-17T18:08:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_IsolamentoCaracterizacaoAnalise.pdf: 641185 bytes, checksum: 67fcd80f5a59d812927fc3a56104a235 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-11-23T17:07:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_IsolamentoCaracterizacaoAnalise.pdf: 641185 bytes, checksum: 67fcd80f5a59d812927fc3a56104a235 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-23T17:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_IsolamentoCaracterizacaoAnalise.pdf: 641185 bytes, checksum: 67fcd80f5a59d812927fc3a56104a235 (MD5) Previous issue date: 2011-02-01 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / Células-tronco adultas são conhecidas por seu potencial e plasticidade para se diferenciar em vários tipos celulares diferentes (multipotência), tendo assim, implicações para a terapia celular, bem como biotecnologias reprodutivas. No presente trabalho relatamos o isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais (CTM) derivadas de tecido adiposo de bovinos e bubalinos. As células foram isoladas por digestão enzimática da biópsia do tecido adiposo e cultivadas por pelo menos dez passagens in vitro,dando apoio a sua capacidade proliferativa. Estas células também foram submetidas à caracterização imunofenotípica para visualizar a presença de marcadores de CTM, CD90, CD105 e CD79, e ausência de marcadores de Células-Tronco Hematopoiéticas, CD45, CD34 e CD73, A fim de provar a sua multipotência, as células foram induzidas a diferenciação em três tipos de células diferentes e coradas com corantes tecidos-específicos (condrogênico-Alcian Blue, osteogênica-Alizarina Red e adipogênica-Oil-Red O) para confirmar a sua diferenciação em condrócitos, ostoblastos e adipócitos. Nossos resultados indicam que o tecido adiposo de bovinos e bubalinos podem ser usados como fonte de células-tronco mesenquimais (CTM), transformando-as em uma opção interessante de modelos animais para terapia celular e medicina regenerativa. Além disso, essas células podem ser relevantes para a biotecnologia reprodutiva desde o uso de CTM de doadoras nucleares, pois têm sido associadas com um aumento nas taxas de desenvolvimento de embriões clonados. / Adult stem cells are known for their potential and plasticity to differentiate into several different cell types (multipotency), which has implications for cell therapy as well as reproductive biotechnologies. In the present work we report isolation and characterization of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from adipose tissue of cattle and buffaloes. Cells isolated by enzymatic digestion of adipose-tissue biopsy were grown for at least ten passages in vitro giving support to of their proliferative capacity. These cells were also subjected to immunophenotypic characterization to visualize the presence, of CD90, CD105 and CD79, and absence, of CD45, CD34 and CD73, wich are positive and negative markers of MSCs, respectively. In order to determine their multipotency, the cells were induced to differentiate into three different cell types and stained with tissue-specific dyes (Chondrogenic-Alcian Blue, Osteogenic- Alizarin Red and Adipogenic-Oil-Red O) to ensure their differentiation into chondrocytes, ostoblasts and adipocytes. Our results indicate that adipose tissue of cattle and buffaloes can be used as a source of mesenchymal stem cells (MSCs), turning them into an interesting option of animal models for cell therapy and regenerative medicine. Additionally, these cells may be relevant for reproductive biotechnology since the use of MSCs as nuclear donors has been linked to an increase in the developmental rates of cloned embryos.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

As dosagens de estradiol e progesterona são utilizadas em grande número de pesquisas em reprodução animal. Vários métodos e anticorpos para quantificação vêm sendo desenvolvidos, porém cada metodologia analítica possui vantagens e limitações. O radioimunoensaio é o mais utilizado, mas tem como principal desvantagem o envolvimento de material radioativo. A preocupação neste setor aliada às exigências das legislações em questões ambientais, têm aumentado a necessidade do desenvolvimento de novas técnicas sem a utilização de material radioativo. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a técnica xMAP-Multiplex® para dosagem de estradiol e progesterona em vacas, ovelhas e búfalas. Foram utilizados cinco animais de cada espécies. O ciclo estral dos animais foi sincronizado com a utilização de prostaglandina e amostras sanguíneas foram coletadas durante o ciclo estral. As concentrações séricas de progesterona e estradiol dos animais do estudo foram obtidas pelo MILLIPLEX® MAP Multi Species Steroid kit (STTHMAG-21K; Millipore, Billerica, MA). Nas condições em que este experimento foi realizado, os resultados mostraram que esta técnina é viável para a avaliação do perfil progesterônico destas espécies, mas não para avaliar o perfil estrogênico. / Quantification of estradiol and progesterone are used in a big number of animal´s reproduction´s researches. Several methods and antibodies to quantify them have been developed, but each analytical methodology has advantages and limitations. Radioimmunoassay is the most widely used method, but it has as major disavantage the use of radioactive material. The concerns at this area added to the requirements of legislations about environmental topics have increased the need to development techniques without the use of radioactive material. The aim of this research was to evaluate the xMAP-Multiplex® technique to quantify progesterone and estradiol in ovines, bovines and bubalins. Five animals of each species were used. The estrous cycle of the animals was synchronized by prostaglandin and blood samples were collected during the estrous cycle. The seric concentrations of progesterone and estradiol were obtained by MILLIPLEX® MAP Multi Species Steroid kit (STTHMAG-21K; Millipore, Billerica, MA). Under the conditios of this experiment the results showed that this technique is practicable to evaluate progesterone´s profile in those animals, but not to evaluate their estradiol´s profile.

O presente estudo está apresentado em Capítulo 1 (Divergência folicular; DF) e 2 (Capacidade ovulatória), e em cada estão incluídos dois experimentos [1 - em bubalinos (Bubalus bubalis); 2 - em zebuínos (Bos indicus)]. Os objetivos do Capítulo 1 foram determinar o momento e diâmetro na DF e avaliar o perfil das concentrações plasmáticas de FSH e LH próximo à seleção folicular. No Experimento 1, a ovulação foi considerada o dia zero (D0), a partir do qual 10 novilhas Murrah foram examinadas por ultra-sonografia (US) a cada oito horas (h) até o D4 e, posteriormente, a cada 24h até o D6. A avaliação da DF foi realizada por análise visual do gráfico de cada novilha (Ginther et al., 1996) e regressão linear segmentada (Bergfelt et al. 2003). As amostras de sangue, para dosagem de FSH e LH, foram colhidas com intervalos de 8h nas primeiras 24h pós-ovulação. A partir deste momento foram feitas colheitas a cada 4h até o D4 e após, a cada 12h até o D6. No método visual, o intervalo ovulação-DF, e o diâmetro dos folículos dominante (FD) e subordinado (FS) foram de, respectivamente, 63,2±5,7h; 7,2±0,3mm e 6,4±0,3mm (média±EPM). No método matemático estes mesmos parâmetros foram de, respectivamente, 61,9±4,9h; 7,3±0,3mm e 6,3±0,3mm. Não houve diferença entre os dois métodos de avaliação da DF (P>0,05). As concentrações plasmáticas de FSH e LH não variaram ao longo do tempo (P>0,05). No Experimento 2, 12 novilhas Nelore foram submetidas à US a cada 12h até o D5 e estes mesmos intervalos foram adotados para as colheitas de sangue (dosagem de FSH e LH). No método visual, o intervalo ovulação-DF, e os diâmetros do FD e FS foram de, respectivamente, 61,0±5,8h; 6,2±0,2mm e 5,8±0,2mm. No método matemático estes mesmos parâmetros foram de, respectivamente, 57,2±6,0h; 6,2±0,3mm e 5,9±0,3mm. Não houve diferença entre os métodos (P>0,05). As concentrações plasmáticas de FSH e LH não variaram ao longo do tempo (P>0,05). No Capítulo 2, o objetivo foi avaliar o diâmetro no qual o FD adquire capacidade ovulatória após administração de 25mg de LH. Os grupos foram formados de acordo com o diâmetro do FD no momento do tratamento com LH (7,0-8,4mm; 8,5-10,0mm e >10,0mm, em ambos os experimentos). No Experimento 1, foram utilizadas 29 novilhas bubalinas Murrah x Mediterrâneo. A partir do D3 (pós-ovulação), os exames US foram realizados a cada 12h até 48h do tratamento com LH. Nos grupos 7,0-8,4; 8,5-10,0 e >10,0mm, os diâmetros foliculares no momento da aplicação do LH foram de 7,8c±0,1; 9,3b±0,2 e 11,0a±0,3mm e as taxas de ovulação de 0,0%b (0/10); 50,0%a (5/10) e 55,6%a (5/9), respectivamente. No Experimento 2, 29 novilhas Bos indicus foram monitoradas por US a cada 24h a partir da ovulação até o tratamento com LH, e então a cada 12h durante 48h. Nos grupos 7,0-8,4; 8,5-10,0 e >10,0mm, os diâmetros foliculares no momento da aplicação do LH foram de 7,6c±0,1; 9,6b±0,1 e 10,9a±0,2mm e as taxas de ovulação de 33,3%b (3/9); 80,0%a (8/10) e 90,0%a (9/10), respectivamente. / Present study is presented in Chapter 1 (Follicle deviation; FD) and 2 (Ovulatory capacity). Each chapter includes two experiments [1 - in buffaloes (Bubalus bubalis); 2 - in zebu cattle (Bos indicus)]. In Chapter 1, aims were to determine moment and diameter deviation and to evaluate FSH and LH plasmatic profiles encompassing follicle selection. In Experiment 1, ovulation was considered day 0 (D0). From D0, 10 Murrah heifers were examined by ultrasound (US) each eight hours (h) until D4 and then, every 24h until D6. FD evaluation was performed by visual analysis (Ginther et al., 1996) and by segmented linear regression (Bergfelt et al., 2003). Blood samples were harvested each 8h in the first 24h post ovulation. From this moment blood collections were performed every 4h until D4 and after that, each 12h until D6. Interval ovulation-FD, dominant (DF) and subordinate follicle (SF) diameters, by visual method, were, respectively, 63.2±5.7h; 7.2±0.3mm and 6.4±0.3mm (mean±SEM). These same end points, by mathematical method, were, respectively, 61.9±4.9h; 7.3±0.3mm and 6.3±0.3mm. No differences between both methods of FD evaluation (P>0.05) were found. No changes in plasmatic FSH and LH levels along the time (P>0.05) were found. In Experiment 2, 12 Nelore heifers were submmited to US each 12h until D5, and these same intervals were used to blood harvests (FSH and LH profiles). Interval ovulation-FD, dominant (DF) and subordinate follicle (SF) diameters, by visual method, were, respectively, 61.0±5.8h; 6.2±0.2mm and 5.8±0.2mm. These same end points, by mathematical method, were, respectively, 57.2±6.0h; 6.2±0.3mm and 5.9±0.3mm. No differences between both methods of FD evaluation (P>0.05) were found. No changes in plasmatic FSH and LH levels along the time (P>0.05) were found. In Chapter 2, aim was to evaluate diameter in which DF acquires ovulatory capacity after administration of 25mg of LH. The animals were assigned in groups according to DF diameter at LH treatment (7.0-8.4mm; 8.5-10.0mm and >10.0mm, in both experiments). In Experiment 1, 29 Murrah x Mediterrâneo heifers were used. From D3 (post ovulation), US examinations were performed each 12h until 48h after LH treatment. Follicle diameters at LH chalenge in groups 7.0-8.4mm, 8.5-10.0mm and >10.0mm, were 7.8c±0.1, 9.3b±0.2 and 11.0a±0.3mm, and ovulation rates were 0.0%b (0/10), 50.0%SUP>a (5/10) and 55.6%a (5/9), respectively. In Experiment 2, 29 Bos indicus heifers were monitored by US every 24h from ovulation until LH chalenge, and then each 12h during 48h. Follicle diameters at LH treatment in groups 7.0-8.4mm, 8.5-10.0mm and >10.0mm, were 7.6c±0.1, 9.6b±0.1 and 10.9a±0.2mm, and ovulation rates were 33.3%b (3/9), 80.0%a (8/10) and 90.0%a (9/10), respectively

Com o objetivo de estudar os efeitos do uso da Somatotropina Recombinante Bovina (rBST) no lipidograma e constituição do leite de bubalinos foram utilizadas 28 búfalas divididas em dois grupos: Grupo 1 constituído de 14 búfalas nas quais foi realizada uma aplicação de 500 mg de rBST e Grupo 2 - constituído de 14 búfalas que não receberam qualquer tratamento hormonal (grupo controle). Durante o experimento, os animais tiveram amostras de plasma e soro sanguíneo, bem como de leite colhidas periodicamente nos seguintes momentos: dia da aplicação da rBST, 1º, 3º, 5º, 7º, 10º e 14º dia após a aplicação da rBST. A fim de minimizar possíveis influências da fase da lactação, todas as búfalas utilizadas no experimento estarvam entre 100 e 200 dias de lactação e com produção de leite variando entre 5 e 10 litros por dia. O lipidograma foi avaliado por meio da determinação dos teores séricos de colesterol, triglicérides, ácidos graxos não esterificados e β-HBO e teores plasmáticos de glicose, enquanto a constituição do leite de búfalas foi avaliada por meio de determinação dos teores lácteos de gordura, proteína, lactose, sólidos totais e do número de células somáticas. Durante a avaliação dos resultados obtidos podemos notar que a aplicação da somatotropina recombinante bovina não influenciou os teores séricos de NEFA, colesterol e triglicérides bem como os plasmáticos de glicose. No entanto os teores séricos de β-HBO foram afetados pelo tratamento instituído, pois verificou-se que, a partir do 1º dia após o início do tratamento hormonal, os teores séricos de -HBO no grupo tratado com rBST eram entre 0,21 e 0,55 mg/dL maiores do que os encontrados no grupo controle. Quando avaliamos a composição do leite temos que os resultados nos permitem afirmar que o tratamento instituído não interfere nas concentrações de gordura, lactose, sólidos totais e no número de células somáticas. Nos primeiros dias após a aplicação da rBST ocorria uma diminuição dos teores lácteos de proteína, sendo verificado que no 3º dia após o início do tratamento hormonal os valores lácteos de proteína encontrados no grupo tratado com rBST (3,59 ± 0,22 g/dL) eram significativamente menores do que os observados no grupo controle (3,89 ± 0,22 g/dL). A partir do 5º dia após o início do tratamento hormonal, os valores de proteína passam a oscilar sem que qualquer diferença estatística entre o grupo tratado e controle possam ser observados. / With the aim to evaluate the influence of recombinant bovine somatotropin (rBST) in the lipid profile and milk composition of lactating Murrah water buffaloes, we collected and analyzed samples of blood serum and plasma and milk of clinically healthy animals. We determined the concentrations of cholesterol, triglycerides, nonesterified fatty acids (NEFA), -hydroxibutyrate (-HBO) and glucose from the blood samples. Milk samples were collected after milking and the following parameters were evaluated: fat, protein, lactose, total solids and somatic cell count. The influence of rBST was studied through 28 animals divided in 2 experimental groups: Experimental Group 14 animals that received a single application of 500mg rBST; Control Group - 14 animals that didn´t receive any hormonal treatment. Blood and milk samples were collected in the following moments: day of rBST application, 1st, 3rd, 5th, 7th, 10th and 14th day after the rBST application. To minimize the influence of lactation, the samples were collected between 100-200 days of lactation and the milk yields per cow range from 5 10 Liters. According to the results of this research, we concluded that one single application of rBST didn´t affect the NEFA, cholesterol, triglycerides and glucose blood levels. The serum β-HBO concentration was influenced by the hormonal treatment. In the experimental group, after 24 hours from the treatment, the β-HBO level ranged 0.21 - 0.55 mg/dL and it was greater than that of control group. The fat, lactose, total solids and somatic cell count were not influenced by the rBST treatment. In the first days after the application of rBST, the milk protein decreased gradually reaching its low level in the 3rd day after the application (3.59 ± 0.22 g/dL) and was significant lower than that of control group (3.89 ± 0.22 g/dL). After the 5th day, the milk protein values oscillated without any statistical difference between both groups.

No intuito de descrever a evolução do desenvolvimento do concepto bubalino entre 10 e 60 dias de gestação, esse estudo utilizou a metodologia de mensuração por Crow rump para revelar a idade estimada de 96 embriões e fetos coletados no Matadouro municipal de Macapá, no estado do Amapá entre os anos de 2006 a 2008. Os parâmetros utilizados consistiram em medidas de comprimento (crânio caudal) e peso utilizando-se balança eletrônica de precisão. Para visualização macroscópica foram feitas fotografias, e a microscopia eletrônica de varredura auxiliou na identificação de inúmeras estruturas externas dos embriões. Foram realizados cortes histológicos de 5µm os quais foram corados em HE e picrosirius, e submetidos a técnicas de imunohistoquimica para detecção de Oct4, PCNA e vimentina. Nossos resultados revelam que embriões de mamíferos até a 5° semana de gestação são muito semelhantes aos de outras espécies de mamíferos já estudados. Similaridades entre bovinos e bubalinos persistem com exceção dos estágios fetais onde aparentemente búfalos se desenvolvem mais rapidamente que bovinos. Em conclusão, o estudo indica características importantes que podem ser utilizadas para verificar a viabilidade de embriões de búfalos e auxiliar avaliações em exames complementares como os de ultrassonografia, e também indicam a presença de importantes sítios de células pluripotentes em regiões diferentes do embrião dependendo do estágio de desenvolvimento em que o mesmo se encontra. / The aim of this study was to describe the developmental changes in the bubaline conceptus from 10-60 days of gestation using the Crown rump methodology to diagnostic the estimated age of those 96 embryos and fetuses obtained at Matadouro Municipal de Macapá, on Amapá state, from 2006 until 2008. Parameters used were cranio-caudal length (CR) and weight. For macroscopic view photographies were done, Scanning electron microscopy helps to identify inumerous external structures of the embryos. Histotogic section of 5µm were done and stained using Hematoxilin-Eosin, picrosirius, and also subjected to immunohistochemistry for Oct4, PCNA and vimentin were evaluated. Transmission electron microscopy was used in fetal membranes to describe it better. The obtained results revealed that mammal embryos until 5th weeks of gestation has to much similar characteristics to others studied species. Similarities between bovine and bubaline persist; except on fetal stages that buffalos seems develop faster than bovine ones. In conclusion, the overall data indicated the important characteristics that can be evaluated to verify the viability of buffalo embryos and help the evaluations of ultrasonographic exams, also identify the presence of important regions with pluripotente cells that changes according to the stage of the embryo development.