Recentment ha estat demostrada l’existència de cèl.lules progenitores en el greix que envolta el cor. Aquesta nova font cel!lular ha esdevingut una bona alternativa per a regenerar el miocardi infartat. Per aquest motiu, és possible que posant en contacte el teixit adipós cardíac en forma de biomembrana amb la zona infartada es pugui limitar l’extensió de l’infart de miocardi. Els objectius de la present tesi són: 1) Generar els perfils genètics de l’evolució de l’IM en el model porcí. 2) Determinar l’existència de cèl.lules mesenquimals al teixit adipós d’origen pericardíac i caracteritzar-les. 3) Avaluar l’efecte de la transposició d’un pedicle adipós pericardíac vascularitzat sobre: a. l’IAM en el model porcí per a valorar els possibles efectes beneficiosos sobre la mida de l’infart i la funció ventricular. b. l’ICM en el model porcí per a valorar els possibles efectes beneficiosos sobre la mida de l’infart i la funció ventricular.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC IDIBAPS) / Les patologies renals s’han convertit en una problemàtica a nivell mundial, en l’actualitat poden afectar a una de cada 9 persones al llarg de la seva vida i porten associats elevats costos econòmics. Malgrat els últims avenços científics i millores en el tractament d’aquestes patologies, el transplantament renal i la diàlisi continuen sent les dues úniques opcions terapèutiques efectives en el tractament de la insuficiencia renal. La regeneració de l’epiteli renal és determinant en la recuperació del pacient ja que determina que es pugui restablir la funcionalitat d’aquest òrgan. L’obtenció de precursors renals a partir de cèl•lules mare que puguin integrar-se i regenerar el ronyó lesionat s’ha convertit en una àrea de recerca biomèdica molt important. L’objecte d’estudi d’aquesta tesi va ser conèixer els mecanismes involucrats en la diferenciació de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl•lules mare adiposes (ASCS) cap al llinatge epitelial renal ja que aquestes cèl•lules poden ser una potencial font d’aquests precursors renals amb capacitat regenerativa. Recentment s’ha descobert que els miRNAs, que tenen la funció de regular l’expressió gènica en l’etapa post-transcripcional, són essencials en la diferenciació de les cèl•lules mare i s’han trobat miRNAs específics que regulen la diferenciació a un llinatge cel•lular en concret. En aquest sentit, el nostre objectiu general en aquest treball va ser estudiar el paper dels miRNAs en la diferenciació de cèl•lules mare a progenitors epitelials renals. Per això, primer de tot es van realitzar experiments de diferenciació en que els cossos embrionaris (EBs) induïts a partir de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) es van cultivar amb un medi de cultiu suplementat amb all-trans-retinoic acid (ATRA) i activina A, i les cèl•lules mare adiposes (ASCs) amb un medi amb una concentració fisiológica de glucosa suplementat amb ATRA. Amb aquests protocols de diferenciació, es van obtenir cèl•lules amb característiques de progenitors renals. Els EBs cultivats amb el protocol de diferenciació expressaven els marcadors de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 i Wnt9b). Les ASCs cultivades amb ATRA varen canviar la seva morfologia a una morfologia epitelial i van expressar marcadors tant de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Six2 i Megalina) com els marcadors epitelials (Citoqueratina 18, E-caderina). Un anàlisis de miRNAs va demostrar que la família de miRNAs let-7 es sobreexpressava durant la diferenciació dels EBs i que el miRNA let-7e més concretament era essencial en l’expressió dels marcadors Pax2, Wt1i Wnt4 ja que la seva silenciació disminuïa l’expressió d’aquests gens. En les ASCs, en canvi, es va demostrar que el miRNA let-7e també augmentava en la diferenciació i que a més tenia característiques d’inductor de la diferenciació, essent essencial en l’expressió tant dels marcadors de l’organogènesi renal (Pax2, Wt1, Wnt4, Megalina) com del marcador epitelial CK18. Profunditzant en el paper del miRNA let-7e en la diferenciació, es va demostrar amb experiments de Western blot, que el miRNA let-7e modula els nivells de β-catenina a través d’un mecanisme que implica la inhibició de la PKCβ i la conseqüent disminució en la fosforilació de la GSK3β (Ser-9) i que això és imprescindible per la correcta diferenciació de les ESCs. Per altra banda, en les ASCs es va demostrar utilitzant l’assaig del gen reporter de la luciderasa, que el miRNA let-7e inhibeix directament l’expressió de la metal•loproteinasa 9 i que d’aquesta manera modula la diferenciació de les ASCs al llinatge epitelial renal. / Role of miRNA in stem cell differentiation Renal diseases have become a worldwide problem that can affect one in nine people throughout their life. Despite recent scientific advances, kidney transplantation and dialysis are still the only two effective therapeutic options in renal failure. The regeneration of the epithelium is critical for patient recovery as it determines the restoration of the kidney functionality. Cell precursors obtained from renal stem cells that can regenerate and integrate the injured kidney have become an important research area. The aim of our study was to determine the mechanisms involved in the differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and adipose stem cells (ASCs) to renal epithelial lineage as these cells can be a source of these renal precursors with regenerative potential. It was recently discovered that miRNAs, which have the function of regulating gene expression in the post-transcriptional level, are essential in the differentiation of stem cells. In this sense, our main objective was to study the role of miRNAs in stem cells differentiation to renal epithelial progenitors. For this purpose, We have carried out experiments of stem cells differentiation. Embryoid bodies (EBs) from ESCs were cultured with activin A and ATRA and ASCs where cultured in a medium with physiological concentration of glucose supplemented with ATRA, obtaining progenitor cells with renal epithelial characteristics. EBs expressed the early kidney organogenesis markers (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 Wnt9b) and ASCs changed their morphology to a more epithelial one and expressed both markers of kidney organogenesis (Pax2, WT1, Wnt4, SIX2 i Megalin) and epithelial markers (cytokeratin-18 and E-cadherin). Furthermore, miRNA analysis and the subsequent overexpression and silencing of the miRNA let-7e in stem cells, demonstrates that this miRNA has characteristics of differentiation inductor and that is essential in the expression of both kidney organogenesis markers and epithelial markers. Furthermore, the ESCs, let-7e miRNA modulates β-catenin levels through a mechanism involving inhibition of PKCβ and the consequent decrease in the phosphorylation of GSK3 (Ser-9). Moreover, it was demonstrated using the luciferase assay, that the miRNA let-7e directly inhibits expression of gelatinase B (MMP9) in ASCs and thereby modulates its renal epithelial differentiation.

L'apoptosi pot ser induïda a través de nombrosos estímuls, entre els quals hi ha elsreceptors de mort. Per induir apoptosi TNFα necessita la participació d'inhibidors de latranscripció d'ARN o de la síntesi proteica, com són ActD i CHX. En aquest estudidemostrem com la citotoxicitat de TNFα en cèl·lules PC12 i en neurones corticalssensibilitzades amb ActD es dóna a través de l'activació de la caspasa iniciadora 8, dela generació de tBid i de la conseqüent activació de les pro-caspases-9 i -3. A més, eltractament amb TNFα/ActD no indueix diferències detectables en l'expressió deproteïnes involucrades en el complex de senyalització de TNFα. L'anàlisi de lesprincipals proteïnes antiapoptòtiques, com són FLIP, IAPs i els membres de la famíliade Bcl-2, demostra que Bcl-xL endogen és capaç de regular l'apoptosi induïda perTNFα, sense afectar l'activació de la via del factor de transcripció NF-κB. Lasobreexpressió de Bcl-xL dóna resistència a la mort promoguda per TNFα i ActD, i lareducció dels seus nivells indueix mort cel·lular per mitjà de TNFα, a través del'activació de JNK. Per confirmar la rellevància de Bcl-xL en el senyal promogut perTNFα, es va avaluar l'efecte de la reducció dels nivells basals de proteïnesantiapoptòtiques com Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w i Mcl-1, en el model cel·lular HeLa, onaquestes s'hi troben expressades de forma fisiològica, contràriament al que passa enles cèl·lules PC12, demostrant que Bcl-xL és la proteïna antiapoptòtica més rellevanten la protecció de la mort induïda per TNFα.Per altra banda, l'apoptosi induïda per TNFα pot ser deguda a l'acumulació d'elevatsnivells de hemo lliure. El grup hemo sensibilitza les cèl·lules Hepa a l'acció citotòxicade TNFα a través de la inducció d'estrès oxidatiu, que provoca un dany cel·lular queporta a l'activació de la via de JNK y de pro-caspasa-3. La producció de ROS i el danyinduït per estrès oxidatiu, així com la mort induïda per TNFα, conjuntament ambelevats nivells del grup hemo lliure, poden inhibir-se amb l'expressió de proteïnesprotectores com HO-1 y H-Ferritina. / La apoptosis puede ser inducida a través de numerosos estímulos, entre los cuales losreceptores de muerte. Para promover la apoptosis, TNFα necesita la colaboración deinhibidores de la trascripción del RNA o de la síntesis proteica, como ActD y CHX. Eneste estudio demostramos como la citotoxicidad de TNFα en células PC12 y enneuronas corticales sensibilizadas con ActD ocurre a través de la activación de lacaspasa iniciadora 8, la generación de tBid y la activación de las pro-caspasas-9 y -3.Además no se detectan diferencias de expresión, inducidas por TNFα/ActD, deproteínas involucradas en la formación del complejo de señalización de TNFα. Elanálisis de las principales proteínas antiapoptóticas, como FLIP, IAPs y miembros dela familia de Bcl-2, demuestra que Bcl-xL es la molécula endógena capaz de regular laapoptosis promovida por TNFα, sin afectar la activación de la vía del factor detrascripción NF-κB. La sobre-expresión de Bcl-xL confiere resistencia a la muerteapoptótica mediada por TNFα y ActD, y su disminución forzada es capaz de inducirmuerte celular únicamente tratando con TNFα por activación de JNK. Para confirmar larelevancia de Bcl-xL en la señal promovida por TNFα, la represión de proteínas antiapoptóticascomo Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w y Mcl-1 ha sido evaluada en el modelo de célulasHeLa, donde estas se expresan fisiológicamente al contrario que en las células PC12,demostrando que Bcl-xL es la proteína anti-apoptótica más importante en la protecciónde la muerte inducida por TNFα.Por otra parte, la apoptosis mediada por TNFα puede ser promovida por laacumulación de elevados niveles del grupo hemo libre. El grupo hemo sensibiliza lascélulas Hepa a la acción citotóxica de la citoquina TNFα a través de la inducción deestrés oxidativo, cuyo daño resulta en la activación de la vía de JNK y de pro-caspasa-3. La producción de ROS y el daño inducido por estrés oxidativo, así como la muerteinducida por elevados niveles del grupo hemo libre y de TNFα, pueden inhibirse por lasobre-expresión de proteínas protectoras como HO-1 y H-Ferritina. / Apoptotic cell death is triggered by several different stimuli, among which deathreceptors. To induce apoptosis, TNFα needs the cooperation of RNA transcription orprotein synthesis inhibitor, i.e. ActD and CHX. In this study we demonstrate that ActDrenders rat PC12 cells and primary mouse cortical neurons susceptible to the cytotoxiceffect of TNFα by the activation of the initiator caspase 8, generation of tBid andactivation of pro-caspase-9 and -3. Proteins involved in TNFα receptor signalingcomplex are not affected by TNFα/ActD stimulation. However, the analysis of antiapoptoticproteins, e.g. FLIP, IAPs and Bcl-2 family members, demonstrates that Bcl-xLis the endogenous regulator of neuronal sensitivity to TNFα-induced apoptosis and thatit operates in a NF-κB-independent manner. Bcl-xL overexpression completely protectsagainst TNFα/ActD-induced apoptosis, whereas its endogenous decrease sensitizes toTNFα cytotoxic effect promoting JNK-dependent cell death. To point out the relevanceof Bcl-xL in TNFα signaling pathway, endogenous decrease of the main anti-apoptoticBcl-2 family members, e.g. Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w and Mcl-1, was performed in HeLa cellline in which, contrarily to PC12, these proteins are expressed. The results obtaineddemonstrate that Bcl-xL is the most important Bcl-2-cytoprotective protein in regulatingTNFα cytotoxicity.Moreover, TNFα-induced cell death is promoted by high levels of free hemeaccumulation. Heme sensitizes Hepa cell line to TNFα-triggered apoptosis enhancingROS production and ROS-mediated damage. This results in JNK and pro-caspase-3activation. Oxidative stress-promoted apoptosis induced by heme/TNFα treatment isinhibited by the overexpression of HO-1 and H-Ferritin cytoprotective proteins.

Pluripotent cells are unique due to their developmental potential and the possibility to study them is the key step to understand human development. These cells are characterized by their ability to originate all the cellular lineages within an adult organism. Within embryonic milieu, pluripotent cells represent a dynamic fraction of the total cell number. Moreover, their physiological existence is constrained to early stages of embryonic development. In vitro culture of the different types of mammalian pluripotent cells, and singularly embryonic stem cells (ESC), enables the characterization of the pluripotent state. In the four articles included in this thesis we have addressed two different aspects of the molecular characterization of mammalian pluripotent cells. First, we investigated the establishment of the trophectoderm and the inner cell mass in the embryo measuring transcript abundance and protein presence of the transcription factors known to play a role in the earliest cellular differentiation process. In addition we have evaluated of genomic stability of human ESC lines during long-term culture, observing the accumulation of sukaryotypic aberrations such as loss of heterozygosity that affect loci comprising genes involved in genomic stability maintenance. We also checked the genomic status of two human ESC lines derived from embryos that had been diagnosed as abnormal after genetic preimplantation diagnosis (PGD). The molecular analysis of these cells ruled out the hypothesized self-correction of the aneuploidies between the PGD and the establishment of the cell lines. / Les cèl·lules pluripotents són úniques atesa la seva plasticitat durant el desenvolupament i la possibilitat d'estudiar-les és un pas essencial per poder comprendre el desenvolupament embrionari. Aquestes cèl·lules es caracteritzen per la seva habilitat per donar lloc a tots els llinatges cel·lulars de l'organisme. Dins de l'embrió, les cèl·lules pluripotents representen una fracció dinàmica del nombre total de cèl·lules i la seva existència fisiològica està constreta a els estadis més primerencs del desenvolupament embrionari. El cultiu in vitro dels diferents tipus de cèl·lules pluripotents en mamífers, i en especial les cèl·lules mare embrionàries, permet la caracterització d'aquest estat cel·lular. En els quatre capítols inclosos en aquesta tesi, hem tractat dos aspectes diferents de la caracterització molecular de les cèl·lules pluripotents. Primer, hem investigat l'establiment del trofectoderm i de la massa cel·lular interna en l'embrió mesurant l'abundància dels trànscrits i la presència de proteina dels factors de transcripció implicats en el primer process de diferenciació cel·lular conegut. A més, hem avaluat l'estabilitat genòmica de dues línies de cèl·lules mare en cultiu durant més de 40 passis. Com a resultat, hem observat l'acumulació de aberracions genòmiques a nivell subcariotípic, en especial pèrdua d'heterozigositat que afecta a locus que contenen gens implicats en el manteniment de l'estabilitat genòmica. També hem comprovat l'estatus genòmic de dos linies de cèl·lules mare embrionàries humanes derivades a partir d'embrions trobats aneuploids per un diagnòstic genètic preimplantacional. L'anàlisi molecular d'aquestes cèl·lules va descartar la hipòtesi d'una autocorrecció de les aneuploidies detectades entre el diagnòstic preimplantacional i la derivació de les línies a partir d'aquests embrions.

L'adenocarcinoma pancreàtic és una neoplàsia amb mal pronòstic per la que no existeixen marcadors específics. En aquesta tesi s'han estudiat possibles alteracions de les estructures glucídiques de la ribonucleasa pancreàtica humana (RNasa 1) de sèrum amb l'objectiu de determinar el seu ús diagnòstic. S'han descrit les estructures glucídiques de la RNasa 1 sèrica i de línies cel·lulars endotelials, i s'ha observat un increment en la proporció d'estructures biantenàries amb Fc en la RNasa 1 sèrica de pacients amb càncer de pàncreas, fet que podria ser d'utilitat diagnòstica. També, donada la gran similitud entre les estructures glucídiques descrites per la RNasa 1 sèrica i per l'endotelial, l'origen de la RNasa 1 sèrica sembla ser principalment endotelial. La RNasa 1 també s'ha avaluat per electroforesi bidimensional i s'ha establert una correlació entre el contingut d'àcid siàlic i el seu pI, fet que pot ajudar a la interpretació dels mapes bidimensionals d'altres glicoproteïnes. / Pancreatic adenocarcinoma has one of the highest mortality rates of all neoplasias and it has no specific markers. In this work, possible alterations in the glycan structures of human pancreatic ribonuclease (RNase 1) present in serum are investigated with the aim of determining its diagnostic utility. Serum and endothelial RNase 1 glycan structures have been described and an increase of biantennary structures with Fc in serum RNasen 1 from pancreatic cancer patients could be observed, what can be of diagnosis utility. Also, due to the high similarity between serum RNase 1 and endothelial RNase 1 glycan structures, it was concluded that endothelium can be the main producer of serum RNase 1. RNase 1 was also evaluated by two-dimensional electrophoresis and a correlation between the sialic acid content and the observed pI decrease could be establish, what may be very significant for understanding and interpreting two-dimensional maps from other glycoproteins.

Tesis por compendio / [ES] La lesión medular (LM) es un trastorno neurológico devastador y debilitante que se caracteriza por un grado variable de disfunción motora, sensorial y/o autonómica permanente. El trasplante de células madre neurales (NSC) ofrece una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de la LM al proporcionar neuroprotección y neuroregeneración. Sin embargo, el entorno generado tras la lesión limita el potencial terapéutico de las terapias celulares al dar lugar a una escasa supervivencia y engraftment de las células y a una diferenciación inadecuada. Además, las terapias celulares han mostrado hasta la fecha una recuperación funcional limitada en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se ha postulado el uso de terapias combinatorias para superar estas limitaciones y potenciar los beneficios terapéuticos de las terapias celulares. En esta tesis doctoral, se han estudiado distintas estrategias de combinación con el trasplante de NSC, como el uso de fármacos y biomateriales, con el objetivo de mejorar y potenciar el efecto de la terapia celular en el rescate de la actividad neuronal, en la modulación del proceso inflamatorio, en la supervivencia del trasplante, así como en su integración y diferenciación en el tejido medular. Así, En el capítulo 1 evaluamos la terapia combinada de células madre neurales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-NSCs), células madre mesenquimales (MSCs) y un nanoconjugado de curcumina (PA-C) en un modelo de LM subagudo, proporcionando un mayor grado de neuroprotección en comparación con los tratamientos individuales. En el capítulo 2 desarrollamos una estrategia mínimamente invasiva mediante el uso de un scaffold de ácido hialurónico en forma de semi-luna para el transplante de iPSC-NSCs combinado con PA-C. Así, los análisis histológicos demostraron que el tratamiento combinado de iPSC-NSCs y la PA-C presentaban una mayor preservación de fibras neuronales en la zona de la lesión y una reducción de la extensión de la cicatriz fibrótica. Por último, en el capítulo 3 se describe una estrategia terapéutica que se aproxima más a la traslación clínica mediante el trasplante de progenitores neurales fetales humanos (hfNPCs) condicionados previamente con una forma conjugada del inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS). Así, la combinación de las hfNPCs con el PGA-SS-FAS favoreció la migración del transplante en el tejido medular, la preservación de las interneuronas somatosensoriales Lbx1 inhibitorias y las Tlx3 excitatorias, así como la activación neuronal alrededor del epicentro de la lesión. Así pues, en la presente tesis doctoral se estudia y describe el beneficio aportado por tres estrategias combinatorias, que incrementan los efectos neuroprotectores proporcionados por la terapia celular en el tratamiento de lesiones medulares agudas y sub-agudas. / [CA] La lesió medul·lar (LM) és un trastorn neurològic devastador i debilitant que es caracteritza per un grau variable de disfunció motora, sensorial i/o autonòmica permanent. El trasplantament de cèl·lules mare neurals (NSC) ofereix una eina terapèutica prometedora per al tractament de la LM proporcionant neuroprotecció i neuroregeneració. Tot i això, l'entorn generat després de la lesió limita el potencial terapèutic de les teràpies cel·lulars donant lloc a una escassa supervivència i engraftment de les cèl·lules i a una diferenciació inadequada. A més, les teràpies cel·lulars han mostrat fins ara una recuperació funcional limitada als assajos clínics. Per tant, s'ha postulat l'ús de teràpies combinatòries per superar aquestes limitacions i potenciar els beneficis terapèutics de les teràpies cel·lulars. En aquesta tesi doctoral, s'han estudiat diferents estratègies de combinació amb el trasplantament de NSC, com ara l'ús de fàrmacs i biomaterials, amb l'objectiu de millorar i potenciar l'efecte de la teràpia cel·lular en el rescat de l'activitat neuronal, en la modulació del procés inflamatori, en la supervivència del trasplantament, així com en la seva integració i diferenciació al teixit medul·lar. Així, Al capítol 1 avaluem la teràpia combinada de cèl·llules mare neurals humanes derivades de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC-NSCs), cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i un nanoconjugat de curcumina (PA-C) en un model de LM subagut, proporcionant un major grau de neuroprotecció en comparació dels tractaments individuals. Al capítol 2 desenvolupem una estratègia mínimament invasiva mitjançant l'ús d'un scaffold d'àcid hialurònic en forma de semilluna per al trasplantament d'iPSC-NSC combinat amb PA-C. Així, els anàlisis histològics mostraren que el tractament combinat d'iPSC-NSCs i la PA-C incrementaba la preservació de fibres neuronals a la zona de la lesió i reduïa l'extensió de la cicatriu fibròtica. Finalment, al capítol 3 es descriu una estratègia terapèutica que s'aproxima més a la translació clínica mitjançant el trasplantament de progenitors neurals fetals humans (hfNPCs) condicionats prèviament amb una forma conjugada de l'inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS. Així, la combinació de les hfNPCs amb el PGA-SS-FAS va afavorir la migració del trasplantament al teixit medul·lar, la preservació de les interneurones somatosensorials Lbx1 inhibitòries i les Tlx3 excitatòries, així com l'activació neuronal al voltant de l'epicentre de la lesió. Així doncs, en aquesta tesi doctoral s'estudia i descriu el benefici aportat per tres estratègies combinatòries, que incrementen els efectes neuroprotectors proporcionats per la teràpia cel·lular en el tractament de lesions medul·lars agudes i sub-agudes. / [EN] Spinal cord injury (SCI) is a devastating and debilitating neurological disorder characterized by a variable degree of permanent motor, sensory and/or autonomic dysfunction. Neural stem cell (NSC) transplantation offers a promising therapeutic tool for the treatment of SCI by providing neuroprotection and neuroregeneration. However, the environment generated after injury limits the therapeutic potential of cell therapies by resulting in poor cell survival and engraftment and inadequate differentiation. In addition, cell therapies have shown limited functional recovery in clinical trials to date. Therefore, the use of combinatorial therapies has been postulated to overcome these limitations and enhance the therapeutic benefits of cell therapies. In this doctoral thesis, we have studied different combination strategies with NSC transplantation, such as the use of drugs and biomaterials, with the aim of improving and enhancing the effect of cell therapy in the rescue of neuronal activity, in the modulation of the inflammatory process, in the survival of the transplant, as well as in its integration and differentiation in the medullary tissue. Thus, In Chapter 1 we evaluated the combined therapy of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells (iPSC-NSCs), mesenchymal stem cells (MSCs) and a curcumin nanoconjugate (PA-C) in a subacute LM model, providing a higher degree of neuroprotection compared to single treatments. In Chapter 2, we developed a minimally invasive strategy by using a demilune hyaluronic acid scaffold for combined transplantation of iPSC-NSCs with PA-C. Thus, histological analyses demonstrated that the combined treatment of iPSC-NSCs and PA-C exhibited increased preservation of neuronal fibers in the lesion area and a reduction in the extension of the fibrotic scar. Finally, Chapter 3 describes a therapeutic strategy that more closely approximates clinical translation by transplanting human fetal neural progenitors (hfNPCs) preconditioned with a conjugated form of the Rho/Rock inhibitor fasudil (PGA-SS-FAS). Thus, the combination of hfNPCs with PGA-SS-FAS favored transplant migration within the spinal parenchyma, preservation of endogenous inhibitory Lbx1 and excitatory Tlx3 somatosensory interneurons, as well as endogenous neuronal activation around the lesion epicenter. Thus, this PhD thesis studies and describes the benefit provided by three combinatorial strategies, which increase the neuroprotective effects provided by cell therapy in the treatment of acute and sub-acute spinal cord injury. / This research was funded by Fundació Marató TV3 2017/refs.20172230, 20172231 and 20172110; FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación–Agencia Estatal de Investigación “RTI2018- 095872-B-C21/ERDF”, Agencia Valenciana de Innovación (AVI) INNVAL10/19/047 and TERCEL (RD12/0019/0011) funds from the Instituto de Salud Carlos III of Spain; Science by Women program, Women for Africa Foundation to HE and the grants FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-B-C21 and –C22/ERDF]; RISEUP project FetOpen in H2020 Program: H2020-FETOPEN-2018-2019-2020-01 and by Grants RTI2018-095872-B- C21 and PDI2021-1243590B-I00/ERDF funded by MCIN/AEI//10.13039/501100011033 and by ERDF A way of making Europe). This project was also funded by Project 964562 (RISEUP), H2020 FetOpen program / Bonilla Villamil, P. (2022). Study of Combinatorial Cell Therapy and Neuroprotective Agents for the Treatment of Spinal Cord Injury in Experimental Models [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191500 / Compendio

L'incessant augment del nombre de seqüències genòmiques, juntament amb l'increment del nombre de tècniques experimentals de les que es disposa, permetrà obtenir el catàleg complet de les funcions cel.lulars de diferents organismes, incloent-hi la nostra espècie. Aquest catàleg definirà els fonaments sobre els que es podrà entendre millor com els organismes funcionen a nivell molecular. Al mateix temps es tindran més pistes sobre els canvis que estan associats amb les malalties. Per tant, la seqüència en brut, tal i com s'obté dels projectes de seqüenciació de genomes, no té cap valor sense les anàlisis i la subsegüent anotació de les característiques que defineixen aquestes funcions. Aquesta tesi presenta la nostra contribució en tres aspectes relacionats de l'anotació dels gens en genomes eucariotes. Primer, la comparació a nivell de seqüència entre els genomes humà i de ratolí es va dur a terme mitjançant un protocol semi-automàtic. El programa de predicció de gens SGP2 es va desenvolupar a partir d'elements d'aquest protocol. El concepte al darrera de l'SGP2 és que les regions de similaritat obtingudes amb el programa TBLASTX, es fan servir per augmentar la puntuació dels exons predits pel programa geneid, amb el que s obtenen conjunts d'anotacions més acurats d'estructures gèniques. SGP2 té una especificitat que és prou gran com per que es puguin validar experimentalment via RT-PCR. La validació de llocs d'splicing emprant la tècnica de la RT-PCR és un bon exemple de com la combinació d'aproximacions computacionals i experimentals produeix millors resultats que per separat. S'ha dut a terme l'anàlisi descriptiva a nivell de seqüència dels llocs d'splicing obtinguts sobre un conjunt fiable de gens ortòlegs per humà, ratolí, rata i pollastre. S'han explorat les diferències a nivell de nucleòtid entre llocs U2 i U12, pel conjunt d'introns ortòlegs que se'n deriva d'aquests gens. S'ha trobat que els senyals d'splicing ortòlegs entre humà i rossegadors, així com entre rossegadors, estan més conservats que els llocs no relacionats. Aquesta conservació addicional pot ser explicada però a nivell de conservació basal dels introns. D'altra banda, s'ha detectat més conservació de l'esperada entre llocs d'splicing ortòlegs entre mamífers i pollastre. Els resultats obtinguts també indiquen que les classes intròniques U2 i U12 han evolucionat independentment des de l'ancestre comú dels mamífers i les aus. Tampoc s'ha trobat cap cas convincent d'interconversió entre aquestes dues classes en el conjunt d'introns ortòlegs generat, ni cap cas de substitució entre els subtipus AT-AC i GT-AG d'introns U12. Al contrari, el pas de GT-AG a GC-AG, i viceversa, en introns U2 no sembla ser inusual. Finalment, s'han implementat una sèrie d'eines de visualització per integrar anotacions obtingudes pels programes de predicció de gens i per les anàlisis comparatives sobre genomes. Una d'aquestes eines, el gff2ps, s'ha emprat en la cartografia dels genomes humà, de la mosca del vinagre i del mosquit de la malària, entre d'altres. El programa gff2aplot i els filtres associats, han facilitat la tasca d'integrar anotacions de seqüència amb els resultats d'eines per la cerca d'homologia, com ara el BLAST. S'ha adaptat també el concepte de pictograma a l'anàlisi comparativa de llocs d splicing ortòlegs, amb el desenvolupament del programa compi. / El aumento incesante del número de secuencias genómicas, junto con el incremento del número de técnicas experimentales de las que se dispone, permitirá la obtención del catálogo completo de las funciones celulares de los diferentes organismos, incluida nuestra especie. Este catálogo definirá las bases sobre las que se pueda entender mejor el funcionamiento de los organismos a nivel molecular. Al mismo tiempo, se obtendrán más pistas sobre los cambios asociados a enfermedades. Por tanto, la secuencia en bruto, tal y como se obtiene en los proyectos de secuenciación masiva, no tiene ningún valor sin los análisis y la posterior anotación de las características que definen estas funciones. Esta tesis presenta nuestra contribución a tres aspectos relacionados de la anotación de los genes en genomas eucariotas. Primero, la comparación a nivel de secuencia entre el genoma humano y el de ratón se llevó a cabo mediante un protocolo semi-automático. El programa de predicción de genes SGP2 se desarrolló a partir de elementos de dicho protocolo. El concepto sobre el que se fundamenta el SGP2 es que las regiones de similaridad obtenidas con el programa TBLASTX, se utilizan para aumentar la puntuación de los exones predichos por el programa geneid, con lo que se obtienen conjuntos más precisos de anotaciones de estructuras génicas. SGP2 tiene una especificidad suficiente como para validar esas anotaciones experimentalmente vía RT-PCR. La validación de los sitios de splicing mediante el uso de la técnica de la RT-PCR es un buen ejemplo de cómo la combinación de aproximaciones computacionales y experimentales produce mejores resultados que por separado. Se ha llevado a cabo el análisis descriptivo a nivel de secuencia de los sitios de splicing obtenidos sobre un conjunto fiable de genes ortólogos para humano, ratón, rata y pollo. Se han explorado las diferencias a nivel de nucleótido entre sitios U2 y U12 para el conjunto de intrones ortólogos derivado de esos genes. Se ha visto que las señales de splicing ortólogas entre humanos y roedores, así como entre roedores, están más conservadas que las no ortólogas. Esta conservación puede ser explicada en parte a nivel de conservación basal de los intrones. Por otro lado, se ha detectado mayor conservación de la esperada entre sitios de splicing ortólogos entre mamíferos y pollo. Los resultados obtenidos indican también que las clases intrónicas U2 y U12 han evolucionado independientemente desde el ancestro común de mamíferos y aves. Tampoco se ha hallado ningún caso convincente de interconversión entre estas dos clases en el conjunto de intrones ortólogos generado, ni ningún caso de substitución entre los subtipos AT-AC y GT-AG en intrones U12. Por el contrario, el paso de GT-AG a GC-AG, y viceversa, en intrones U2 no parece ser inusual. Finalmente, se han implementado una serie de herramientas de visualización para integrar anotaciones obtenidas por los programas de predicción de genes y por los análisis comparativos sobre genomas. Una de estas herramientas, gff2ps, se ha utilizado para cartografiar los genomas humano, de la mosca del vinagre y del mosquito de la malaria. El programa gff2aplot y los filtros asociados, han facilitado la tarea de integrar anotaciones a nivel de secuencia con los resultados obtenidos por herramientas de búsqueda de homología, como BLAST. Se ha adaptado también el concepto de pictograma al análisis comparativo de los sitios de splicing ortólogos, con el desarrollo del programa compi. / The constantly increasing amount of available genome sequences, along with an increasing number of experimental techniques, will help to produce the complete catalog of cellular functions for different organisms, including humans. Such a catalog will define the base from which we will better understand how organisms work at the molecular level. At the same time it will shed light on which changes are associated with disease. Therefore, the raw sequence from genome sequencing projects is worthless without the complete analysis and further annotation of the genomic features that define those functions. This dissertation presents our contribution to three related aspects of gene annotation on eukaryotic genomes. First, a comparison at sequence level of human and mouse genomes was performed by developing a semi-automatic analysis pipeline. The SGP2 gene-finding tool was developed from procedures used in this pipeline. The concept behind SGP2 is that similarity regions obtained by TBLASTX are used to increase the score of exons predicted by geneid, in order to produce a more accurate set of gene structures. SGP2 provides a specificity that is high enough for its predictions to be experimentally verified by RT-PCR. The RT-PCR validation of predicted splice junctions also serves as example of how combined computational and experimental approaches will yield the best results. Then, we performed a descriptive analysis at sequence level of the splice site signals from a reliable set of orthologous genes for human, mouse, rat and chicken. We have explored the differences at nucleotide sequence level between U2 and U12 for the set of orthologous introns derived from those genes. We found that orthologous splice signals between human and rodents and within rodents are more conserved than unrelated splice sites. However, additional conservation can be explained mostly by background intron conservation. Additional conservation over background is detectable in orthologous mammalian and chicken splice sites. Our results also indicate that the U2 and U12 intron classes have evolved independently since the split of mammals and birds. We found neither convincing case of interconversion between these two classes in our sets of orthologous introns, nor any single case of switching between AT-AC and GT-AG subtypes within U12 introns. In contrast, switching between GT-AG and GC-AG U2 subtypes does not appear to be unusual. Finally, we implemented visualization tools to integrate annotation features for gene- finding and comparative analyses. One of those tools, gff2ps, was used to draw the whole genome maps for human, fruitfly and mosquito. gff2aplot and the accompanying parsers facilitate the task of integrating sequence annotations with the output of homologybased tools, like BLAST.We have also adapted the concept of pictograms to the comparative analysis of orthologous splice sites, by developing compi.

En aquest treball de tesis doctoral s'estudia el paper de l'estrès oxidatiu tant a la etiologia com a la patofisiologia del dany vascular associat a la malaltia d'Alzheimer. Es demostra la capacitat de les cèl·lules musculars llises vasculars de produir pèptid β-amiloide (Aβ). L'estrès oxidatiu associat a edats avançades, estimula el processament amiloidogènic de l' APP a cèl·lules musculars llises vasculars portant a un augment de producció d' Aβ1-40 i Aβ1-42 contribuint així, a la formació dels depòsits amiloides vasculars. Alhora, els depòsits amiloides vasculars indueixen dany vascular a través d'estrès oxidatiu, a on la nitrotirosinació de proteïnes juga un paper clau en la inactivació d'enzimes essencials per la viabilitat cel·lular. La vitamina E i els estrogens tenen un efecte protector a neurones i cèl·lules musculars llises vasculars mentre que la vitamina E, però no els estrogens, és capaç de protegir les cèl·lules endotelials davant la toxicitat induïda pel pèptid Aβ. / In this thesis we study the effect of oxidative stress in the etiology and pathophysiology of the vascular damage associated to Alzheimer's disease. We demonstrate the production of amyloid-β-peptide (Aβ) by vascular smooth muscle cells. Oxidative stress related to advance ages, induces the amyloidogenic APP cleavage producing an increase of Aβ1-40 and Aβ1-42 by vascular smooth muscle cells, which in tum contribute to vascular amyloid deposits generation. Vascular amyloid deposits induce oxidative stress, in which protein nitrotyrosination plays a key role in essential enzymes inactivation. Vitamin E and estrogens are able to protect neurons and vascular smooth muscle cells while vitamin E, but not estrogens, is able to protect endothelial cells against Aβ-mediated toxicity.