Uma dieta rica em gordura leva sabidamente a efeitos deletérios, associados a síndrome metabólica, por outro lado carboidratos como os frutooligossacarídeos (FOS) estão associados à melhora da saúde gastrointestinal e à prevenção do excesso de gordura corporal e das alterações metabólicas associadas. O presente estudo avaliou os efeitos em longo prazo de quantidades elevadas de FOS em parâmetros metabólicos, na esteatose hepática não alcoólica (EHNA) e nos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) de camundongos C57BL recebendo dieta normolipídica e hiperlipídica. Foram utilizados 60 animais divididos em seis grupos que receberam por quatro meses as seguintes dietas experimentais: controle (C), normolipídica rica em fibra (F), normolipídica suplementada com FOS (FOS), hiperlipídica (HL), hiperlipídica rica em fibras (HLF) e hiperlipídica com FOS (HLFOS). A dieta controle continha 5% de celulose microcristalina, enquanto a rica em fibras continha 15%; já as suplementadas com FOS, ambas continham 15% desse prebiótico. Foram analisados: peso dos animais; composição corporal; ingestão alimentar; glicemia de jejum; perfil lipídico sérico e hepático; histologias hepática e intestinal; malondialdeído (MDA), retinol e ?- tocoferol hepáticos; AGCC nas fezes. Ao final do período experimental não foi verificada alteração no consumo calórico entre os grupos, mas a suplementação com FOS na dieta hiperlipídica promoveu menor ganho de peso corporal e redução dos pesos do fígado e do tecido adiposo retroperitoneal em comparação ao HL e HF. O FOS preveniu a EHNA e diminuiu os níveis de da alanina aminotransferase e de colesterol sérico nos modelos experimentais animais de obesidade e síndrome metabólica (SM), mas sem alterações significativas no perfil lipídico hepático, na glicemia de jejum, na capacidade antioxidante total ou nas dosagens hepáticas de MDA, de retinol e de ?-tocoferol. Os grupos que receberam dieta rica em fibras não apresentaram melhora nos parâmetros metabólicos ou na EHNA como ocorreu com a suplementação de FOS, sendo que o grupo HLF apresentou aumento do MDA no fígado. Já na dieta normolipídica, o FOS e a celulose foram eficazes na preservação da vitamina E hepática. A histologia intestinal evidenciou que a dieta hiperlipídica aumentou o diâmetro total da luz intestinal e reduziu a espessura muscularentérica, sendo que tanto a suplementação com FOS como com celulose reverteram esses achados, sendo o FOS o mais efetivo. Já com relação aos grupos que receberam dieta normolipídica, houve diminuição da espessura muscular entérica tanto no grupo F como no FOS, sendo a celulose a que apresentou a maior redução, e o aumento do diâmetro da luz intestinal só foi verificado no grupo F. Por fim, não houve alteração nas dosagens dos três principais AGCC nas fezes. A suplementação em longo prazo com altas doses de FOS foi efetiva na redução do peso, da adiposidade, da EHNA e do colesterol sérico em camundongos C57BL com obesidade e SM induzidas por dieta hiperlipídica, além de prevenir parcialmente as alterações morfológicas do intestino presentes nesses modelos experimentais. Os benefícios encontrados com a oferta de altas doses de FOS não foram verificados nos grupos enriquecidos com celulose microcristalina / A high-fat diet is known to lead to deleterious effects associated with metabolic syndrome, on the other hand carbohydrates such as fructooligosaccharides (FOS) are associated with improved gastrointestinal health and prevention of excess body fat and associated metabolic abnormalities. The present study evaluated the long-term effects of high doses of FOS on metabolic parameters, non-alcoholic hepatic steatosis (NASH) and short chain fatty acids (SCFAs) of C57BL mice receiving normolipid and hyperlipidic diets. A total of 60 animals were divided into six groups, which received the following experimental diets for four months: control (C), fiber-rich normolipid (F), normolipid supplemented with FOS (FOS), hyperlipidic (HL), high-fiber hyperlipid (HLF) and hyperlipidemic with FOS (HLFOS). The control diet contained 5% microcrystalline cellulose, while the high fiber contained 15%; and those supplemented with FOS, both contained 15% of this prebiotic. It was analyzed: weight of the animals; body composition; food intake; fasting blood glucose; serum and hepatic lipid profile; hepatic and intestinal histologies; malondialdehyde (MDA), hepatic ?-tocopherol and retinol; AGCC in feces. At the end of the experimental period, no change in caloric intake between groups was observed, but supplementation with FOS in the hyperlipid diet promoted a lower body weight gain and reduced weights of the liver and retroperitoneal adipose tissue compared to HL and HF. FOS prevented NASH and decreased levels of alanine aminotransferase and serum cholesterol in experimental animal models of obesity and metabolic syndrome (MS), but without significant changes in hepatic lipid profile, fasting glycemia, total antioxidant capacity or dosages of MDA, retinol and ?-tocopherol. The groups that received a high fiber diet showed no improvement in metabolic parameters or NASH as occurred with FOS supplementation, and the HLF group presented increased MDA in the liver. In the normolipid diet, FOS and cellulose were effective in the preservation of hepatic vitamin E. The intestinal histology evidenced that the hyperlipidic diet increased the total diameter of the intestinal lumen and reduced enteric muscle thickness, and both FOS and cellulose supplementation reversed these findings, with FOS being the most effective. Regarding the groups that received a normolipid diet, there was a decrease in enteric musclethickness in both the F and FOS groups, with the cellulose being the one with the greatest reduction, and the increase in the diameter of the intestinal lumen was only verified in the F group. Finally, there was no change in the dosages of the three main SCFAs in the feces. Long-term supplementation with high doses of FOS was effective in reducing weight, adiposity, NASH and serum cholesterol in C57BL mice with obesity and MS induced by a hyperlipid diet, in addition to partially preventing the morphological alterations of the intestine present in these models experiments. The benefits found in the supply of high doses of FOS were not verified in groups enriched with microcrystalline celulose

Orientador: Juliana Campos Junqueira / Banca: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Graziella Nuernberg Back Brito / Resumo: Estudos realizados in vitro tem demonstrado que Streptococcus mutans podem produzir metabólitos capazes de inibir Candida albicans, tornando interessante a identificação e desenvolvimento de novas substâncias para o tratamento da candidose bucal. Assim, o objetivo desse estudo foi extrair, fracionar e identificar as substâncias produzidas por S. mutans e avaliar seus efeitos sobre a patogenicidade de C. albicans e na resposta imunológica em modelos de estudo in vivo. As substâncias do sobrenadante da cultura de S. mutans foram extraídas com acetato de etila e posteriormente fracionadas em coluna de sílica derivatizada C-18 (150 g, Φ = 3,5 cm) utilizando diferentes soluções de MeOH:H2O (36:64, 49:51, 60:40, 76:24, 100:0) como eluente, obtendo cinco diferentes frações (SM-F1, SM-F2, SMF3, SM-F4 e SM-F5). A identificação das substâncias contidas no extrato bruto e frações foi realizada por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Foram testados os efeitos do extrato bruto e frações do sobrenadante da cultura de S. mutans sobre a candidose experimental induzida em modelo invertebrado de Galleria mellonella e em camundongos imunossuprimidos. Para a escolha da concentração a ser testada nos modelos in vivo foi realizada a determinação da Concentração Inibitória Mínima do extrato bruto e frações sobre C. albicans. No modelo de infecção experimental com G. mellonella, os efeitos do extrato e frações foram analisados pelos testes de curva de sobrevivência, quantificaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / In vitro studies have shown that Streptococcus mutans can produce metabolites capable of inhibiting Candida albicans, becoming interesting the identification and development of new substances for the treatment of oral candidiasis. Thus, the objective of this study was to extract, fractionate and identify the substances produced by S. mutans and evaluate their effects on the pathogenicity of C. albicans and on the immune response in in vivo study models. Substances from the S. mutans culture supernatant were extracted with ethyl acetate and subsequently fractionated on a C-18 derivatized silica column (150 g, Φ = 3.5 cm) using different solutions of MeOH:H2O (36:64, 49:51, 60:40, 76:24, 100:0) as eluent, obtaining five different fractions (SM-F1, SM-F2, SM-F3, SM-F4 and SM-F5). The identification of the substances contained in the crude extract and fractions was performed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The crude extract products and the fractions of the supernatant of the S. mutans culture were assessed on experimental candidiasis induced in invertebrate model of Galleria mellonella and in immunosuppressed mice. For a choice of the concentration to be tested in the in vivo models, a determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the crude extract and fractions on C. albicans was performed. In the model of experimental infection with G. mellonella, the effects of extract and fractions were analyzed by the survival curve test, (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O conhecimento dos eventos biológicos que ocorrem no periápice dos dentes com necrose pulpar se torna importante para compreender o desenvolvimento das lesões periapicais. Muitas são as moléculas e mediadores que participam na instalação da lesão periapical, a partir da infecção bacteriana que ocorre no interior dos canais radiculares. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar moléculas do sistema imune inato, da osteoclastogênese e metaloproteinases em lesões periapicais (LP) induzidas experimentalmente em camundongos knockout e wild type. Para esse objetivo, o presente estudo foi dividido em dois trabalhos distintos. O primeiro teve como objetivo avaliar a expressão de metaloproteinase 2 (MMP2) e metaloproteinase 9 (MMP9) durante a progressão da LP em camundongos knockout para TLR2 (TLR2 KO) e MyD88 (MyD88 KO), em comparação com camundongos wild type (WT). O segundo estudo avaliou a correlação da expressão gênica e imunomarcação de RANK, RANKL, OPG, TLR2 e MyD88 durante a progressão da LP em camundongos WT. No primeiro estudo lesões periapicais foram induzidas em molares inferiores de 54 camundongos TLR2 KO, MyD88 KO e WT (n=18/grupo). Após 7, 21 e 42 dias, os animais foram eutanaziados e as mandíbulas foram dissecadas e submetidas a processamento histotécnico. Os cortes histológicos foram submetidos a imunohistoquímica e posteriormente foi avaliada presença ou ausência de MMP2 e MMP9 nos diferentes grupos. No segundo estudo, 35 camundongos WT foram utilizados. As lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de ambos os lados. Após 0 (G0), 7 (G7), 21 (G21) e 42 (G42) dias, os animais foram anestesiados e eutanasiados para que as mandíbulas fossem dissecadas e divididas ao meio.O lado direito das mandíbulas foi para o processamento histotécnico, para posterior marcação de RANK, RANKL, OPG, TLR2 e MyD88, por meio da imuno-histoquímica do lado esquerdo da mandíbula foi utilizado para a extração de RNA, para a determinação da expressão gênica de RANK (Tnfrsf11a), RANKL (Tnfrsf11), OPG (Tnfrsf11b), TLR2 (Tlr2) e MyD88 (Myd88) utilizando quantificação em Tempo Real da Reação da Polimerase em Cadeia (qRT-PCR). Para ambos os estudos, testes paramétricos e não paramétricos foram realizados com nível de significância de 5%. Foi possível observar, no primeiro estudo, que nos períodos iniciais da progressão da lesão periapical, houve um aumento na imunomarcação de MMP9 nos camundongos TLR2 KO e MyD88 KO, quando comparados aos WT, diferente da MMP2 que não se observou nenhum aumento na imunomarcação. No entanto, aos 42 dias observou-se uma redução da imunomarcação de MMP2 e um aumento da MMP9 nos camundongos TLR2 KO. Adicionalmente, no segundo estudo, foi possível observar um aumento da imunomarcação para RANK, RANKL, OPG, TLR2 e MyD88 durante a progressão da lesão periapical (p<0,05). O aumento da expressão de Tnfrsf11 foi diferente entre os grupos G0 e G42, e G21 e G42 (p=0,006). No entanto, a expressão de Tnfrsf11b foi diferente entre os grupos G0 e G7, G7, G21 e G42, sendo possível observar uma diminuição dessa expressão ao longo do tempo (p<0,001). Tlr2 foi mais expresso entre os grupos G0 e G42 (p=0,03). E a expressão da molécula Myd88 foi estatisticamente significante entre os grupos G0 e G7, G21 e G42 (p=0,01). A razão Tnfrsf11/Tnfrsf11b aumentou durante a progressão da lesão periapical (p=0,002). Também foi possível observar uma correlação moderada entre Myd88 e Rankl (r=0,42; p=0,03) e entre Myd88 e Tlr2 (r=0,48; p<0,0001). Após as metodologias empregadas e os dados analisados, concluímos que a produção de MMP2 e MMP9 foi modulada por TLR2 e Myd88 durante a progressão da lesão periapical. Alem disso, podemos sugerir que existe uma correlação positiva entre o sistema RANK/RANKL/OPG e as proteínas do sistema imune inato, TLR2 e MyD88, durante a perda óssea decorrente da infecção bacteriana dos canais radiculares e posterior progressão da lesão periapical. / Knowledge of the biological events occurring inteeth apex with pulp necrosis becomes important to understand the development of periapical lesions. There are manymolecules and mediators that participate in the installation of the periapical lesion, from the bacterial infection that occurs inside the root canals. Thus, the aim of the present study was to evaluate molecules of the innate immune system, osteoclastogenesis and metalloproteinases in experimentally apical periodontitis (AP) induced in knockout and wild type mice. For this purpose, the present study was divided into two distinct studies. The first one aimed to evaluate the expression of metalloproteinases 2 (MMP2) and metalloproteinases 9 (MMP9) during the progression of AP in TLR2 knockout mice (TLR2 KO) and MyD88 knockout mice (MyD88 KO), compared to wild type mice (WT). The second study evaluated the correlation of gene expression and immunostaining of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during LP progression in WT mice. In the first study AP were induced in lower molars of 54 TLR2 KO, MyD88 KO and WT mice (n = 18 / group). After 7, 21 and 42 days, the animals were euthanized and the jaws were dissected and submitted to histotechnical processing. The histological sections were submitted to immunohistochemistry and subsequently the presence or absence of MMP2 and MMP9 in the different groups was evaluated. In the second study, 35 WT mice were used. Periapical lesions were induced in the lower first molars on both sides. After 0 (G0) to 7 (G7), 21 (G21) and 42 (G42) days, the animals were anesthetized and euthanized so that the jaws were dissected and divided in half. The right side of the jaws was for the histotechnic processing, for subsequent imunostaining of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88, through immunohistochemistry and the left side of the jaws was used for the extraction of RNA, for the determination of expression of RANK (Tnfrsf11a), RANKL (Tnfrsf11), OPG (Tnfrsf11b), TLR2 (Tlr2) and MyD88 (Myd88) using Quantification Real Time of Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). For both studies, parametric and non-parametric tests were performed with significance level of 5%. It was possible to observe in the first study that in the initial periods of AP progression there was an increase in MMP9 immunostaining in TLR2 KO and MyD88 KO mice when compared to WT, different from MMP2 that no increase in immunostaining was observed. However, at 42 days there was a reduction in MMP2 immunostaining and an increase of MMP9 in TLR2 KO mice was observed. Additionally, in the second study, it was possible to observe an increase in the immunostaining for RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during periapical lesion progression (p <0.05). The increase in Tnfrsf11 expression was different between groups G0 and G42, and G21 and G42 (p = 0.006). However, the expression of Tnfrsf11b was different between the G0 and G7, G7, G21 and G42 groups, and a decrease in expression over time (p <0.001) was observed. Tlr2 was more expressed between the G0 and G42 groups (p = 0.03). And the expression of the Myd88 molecule was statistically significant between the G0 and G7, G21 and G42 groups (p = 0.01). The Tnfrsf11 / Tnfrsf11b ratio increased during the AP progression (p = 0.002). It was also possible to observe a moderate correlation between Myd88 and Rankl (r = 0.42, p = 0.03) and between Myd88 and Tlr2 (r = 0.48, p <0.0001). After the methodologies used and the data analyzed, we conclude that the production of MMP2 and MMP9 was modulated by TLR2 and Myd88 during the AP progression. In addition, we can suggest that there is a positive correlation between the RANK / RANKL / OPG system and the proteins of the innate immune system, TLR2 and MyD88, during bone loss due to bacterial infection of the root canals and subsequent progression of the apical periodontitis.

O conhecimento dos eventos biológicos que ocorrem no periápice dos dentes com necrose pulpar se torna importante para compreender o desenvolvimento das lesões periapicais. Muitas são as moléculas e mediadores que participam na instalação da lesão periapical, a partir da infecção bacteriana que ocorre no interior dos canais radiculares. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar moléculas do sistema imune inato, da osteoclastogênese e metaloproteinases em lesões periapicais (LP) induzidas experimentalmente em camundongos knockout e wild type. Para esse objetivo, o presente estudo foi dividido em dois trabalhos distintos. O primeiro teve como objetivo avaliar a expressão de metaloproteinase 2 (MMP2) e metaloproteinase 9 (MMP9) durante a progressão da LP em camundongos knockout para TLR2 (TLR2 KO) e MyD88 (MyD88 KO), em comparação com camundongos wild type (WT). O segundo estudo avaliou a correlação da expressão gênica e imunomarcação de RANK, RANKL, OPG, TLR2 e MyD88 durante a progressão da LP em camundongos WT. No primeiro estudo lesões periapicais foram induzidas em molares inferiores de 54 camundongos TLR2 KO, MyD88 KO e WT (n=18/grupo). Após 7, 21 e 42 dias, os animais foram eutanaziados e as mandíbulas foram dissecadas e submetidas a processamento histotécnico. Os cortes histológicos foram submetidos a imunohistoquímica e posteriormente foi avaliada presença ou ausência de MMP2 e MMP9 nos diferentes grupos. No segundo estudo, 35 camundongos WT foram utilizados. As lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de ambos os lados. Após 0 (G0), 7 (G7), 21 (G21) e 42 (G42) dias, os animais foram anestesiados e eutanasiados para que as mandíbulas fossem dissecadas e divididas ao meio.O lado direito das mandíbulas foi para o processamento histotécnico, para posterior marcação de RANK, RANKL, OPG, TLR2 e MyD88, por meio da imuno-histoquímica do lado esquerdo da mandíbula foi utilizado para a extração de RNA, para a determinação da expressão gênica de RANK (Tnfrsf11a), RANKL (Tnfrsf11), OPG (Tnfrsf11b), TLR2 (Tlr2) e MyD88 (Myd88) utilizando quantificação em Tempo Real da Reação da Polimerase em Cadeia (qRT-PCR). Para ambos os estudos, testes paramétricos e não paramétricos foram realizados com nível de significância de 5%. Foi possível observar, no primeiro estudo, que nos períodos iniciais da progressão da lesão periapical, houve um aumento na imunomarcação de MMP9 nos camundongos TLR2 KO e MyD88 KO, quando comparados aos WT, diferente da MMP2 que não se observou nenhum aumento na imunomarcação. No entanto, aos 42 dias observou-se uma redução da imunomarcação de MMP2 e um aumento da MMP9 nos camundongos TLR2 KO. Adicionalmente, no segundo estudo, foi possível observar um aumento da imunomarcação para RANK, RANKL, OPG, TLR2 e MyD88 durante a progressão da lesão periapical (p<0,05). O aumento da expressão de Tnfrsf11 foi diferente entre os grupos G0 e G42, e G21 e G42 (p=0,006). No entanto, a expressão de Tnfrsf11b foi diferente entre os grupos G0 e G7, G7, G21 e G42, sendo possível observar uma diminuição dessa expressão ao longo do tempo (p<0,001). Tlr2 foi mais expresso entre os grupos G0 e G42 (p=0,03). E a expressão da molécula Myd88 foi estatisticamente significante entre os grupos G0 e G7, G21 e G42 (p=0,01). A razão Tnfrsf11/Tnfrsf11b aumentou durante a progressão da lesão periapical (p=0,002). Também foi possível observar uma correlação moderada entre Myd88 e Rankl (r=0,42; p=0,03) e entre Myd88 e Tlr2 (r=0,48; p<0,0001). Após as metodologias empregadas e os dados analisados, concluímos que a produção de MMP2 e MMP9 foi modulada por TLR2 e Myd88 durante a progressão da lesão periapical. Alem disso, podemos sugerir que existe uma correlação positiva entre o sistema RANK/RANKL/OPG e as proteínas do sistema imune inato, TLR2 e MyD88, durante a perda óssea decorrente da infecção bacteriana dos canais radiculares e posterior progressão da lesão periapical. / Knowledge of the biological events occurring inteeth apex with pulp necrosis becomes important to understand the development of periapical lesions. There are manymolecules and mediators that participate in the installation of the periapical lesion, from the bacterial infection that occurs inside the root canals. Thus, the aim of the present study was to evaluate molecules of the innate immune system, osteoclastogenesis and metalloproteinases in experimentally apical periodontitis (AP) induced in knockout and wild type mice. For this purpose, the present study was divided into two distinct studies. The first one aimed to evaluate the expression of metalloproteinases 2 (MMP2) and metalloproteinases 9 (MMP9) during the progression of AP in TLR2 knockout mice (TLR2 KO) and MyD88 knockout mice (MyD88 KO), compared to wild type mice (WT). The second study evaluated the correlation of gene expression and immunostaining of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during LP progression in WT mice. In the first study AP were induced in lower molars of 54 TLR2 KO, MyD88 KO and WT mice (n = 18 / group). After 7, 21 and 42 days, the animals were euthanized and the jaws were dissected and submitted to histotechnical processing. The histological sections were submitted to immunohistochemistry and subsequently the presence or absence of MMP2 and MMP9 in the different groups was evaluated. In the second study, 35 WT mice were used. Periapical lesions were induced in the lower first molars on both sides. After 0 (G0) to 7 (G7), 21 (G21) and 42 (G42) days, the animals were anesthetized and euthanized so that the jaws were dissected and divided in half. The right side of the jaws was for the histotechnic processing, for subsequent imunostaining of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88, through immunohistochemistry and the left side of the jaws was used for the extraction of RNA, for the determination of expression of RANK (Tnfrsf11a), RANKL (Tnfrsf11), OPG (Tnfrsf11b), TLR2 (Tlr2) and MyD88 (Myd88) using Quantification Real Time of Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). For both studies, parametric and non-parametric tests were performed with significance level of 5%. It was possible to observe in the first study that in the initial periods of AP progression there was an increase in MMP9 immunostaining in TLR2 KO and MyD88 KO mice when compared to WT, different from MMP2 that no increase in immunostaining was observed. However, at 42 days there was a reduction in MMP2 immunostaining and an increase of MMP9 in TLR2 KO mice was observed. Additionally, in the second study, it was possible to observe an increase in the immunostaining for RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during periapical lesion progression (p <0.05). The increase in Tnfrsf11 expression was different between groups G0 and G42, and G21 and G42 (p = 0.006). However, the expression of Tnfrsf11b was different between the G0 and G7, G7, G21 and G42 groups, and a decrease in expression over time (p <0.001) was observed. Tlr2 was more expressed between the G0 and G42 groups (p = 0.03). And the expression of the Myd88 molecule was statistically significant between the G0 and G7, G21 and G42 groups (p = 0.01). The Tnfrsf11 / Tnfrsf11b ratio increased during the AP progression (p = 0.002). It was also possible to observe a moderate correlation between Myd88 and Rankl (r = 0.42, p = 0.03) and between Myd88 and Tlr2 (r = 0.48, p <0.0001). After the methodologies used and the data analyzed, we conclude that the production of MMP2 and MMP9 was modulated by TLR2 and Myd88 during the AP progression. In addition, we can suggest that there is a positive correlation between the RANK / RANKL / OPG system and the proteins of the innate immune system, TLR2 and MyD88, during bone loss due to bacterial infection of the root canals and subsequent progression of the apical periodontitis.

O Cimento de Ionômero de Vidro (CIV) é um material restaurador utilizado na Odontologia Minimamente Invasiva pois, além de apresentar propriedade adesiva à estrutura dental, apresenta propriedades tais como liberação e absorção de íons flúor, compatibilidade biológica com os tecidos bucais e coeficiente de expansão térmica similar ao da dentina. No entanto, o CIV apresenta baixa resistência mecânica, alta suscetibilidade à perda e ao ganho de água nas primeiras 24 horas (sinérese e embebição), período prolongado de presa e polimento ruim. Apesar desse material ter sido introduzido na Odontologia há mais de 40 anos, sua fórmula original vem sofrendo alterações, com o objetivo principal de aprimorar as propriedades mecânicas e alcançar melhores resultados clínicos. Dentre os CIV convencionais, destaca-se o EQUIA&reg; Forte Fil (GC Corporation, Tokyo, Japan), material elaborado com o objetivo de aprimorar as características físicas e estéticas do seu antecessor EQUIA&reg; Fil. No entanto, até o momento não existem trabalhos biológicos avaliando o desempenho do EQUIA&trade; Forte e Ketac&trade; Universal Aplicap&trade;. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta do tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos isogênicos após implante de diferentes cimentos de ionômero de vidro (EQUIA&reg; Forte Fil, EQUIA&reg; Fil e Ketac&trade; Universal Aplicap&trade;). Foram utilizados 87 camundongos isogênicos da linhagem BALB/c divididos em 12 grupos, sendo 9 experimentais (Ketac, E. Fil e E. Forte nos períodos de 7, 21 e 63 dias) e 3 controles (tubos de polietileno vazios, nos mesmos períodos). Decorridos os períodos experimentais, a porção do tecido conjuntivo subcutâneo circundante ao material implantado foi removida e submetida ao processamento histotécnico e à coloração com hematoxilina e eosina. Foi realizada a descrição da reação tecidual em contato com cada material, análise semi-quantitativa do fibrosamento e do infiltrado inflamatório e análise quantitativa da espessura do tecido reacional granulomatoso em contato com o material testado ou tubo de polietileno. Os dados foram analizados estatisticamente (&alpha;=0,05), utilizando o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo Pós-teste de Dunn. Inicialmente, o fibrosamento não foi diferente entre os materiais testados (p>0,05), porém passou a ser diferente aos 21 dias, com o controle apresentando o estágio mais avançado de fibrosamento, e chegando ao final do experimento com o Grupo EQUIA&reg; Forte Fil com estágio mais avançado de fibrosamento, em comparação ao grupo EQUIA&reg; Fil (p<0,05). O infiltrado inflamatório, por sua vez, não apresentou diferença entre os materiais testados ao longo dos períodos experimentais (p>0,05). A área do tecido reacional granulomatoso foi maior para o Grupo E. Forte, diferindo do controle em todos os períodos avaliados (p<0,05). De acordo com os resultados obtidos, concluiu-se que todos os cimentos à base de ionômero de vidro testados apresentaram compatibilidade tecidual, de acordo com os diferentes parâmetros avaliados / The Glass Ionomer Cement (GIC) is a restorative material used in Minimally Invasive Dentistry. Besides it presenting adhesive properties to the dental structure, GIC has properties such as release and absorption of fluoride ion, biological compatibility with buccal tissues and expansion coefficient similar to that of dentin. However, GIC presents low mechanical resistance, high susceptibility to loss and water gain in the first 24 hours (syneresis and imbibition), prolonged setting time and poor polishing. Although this material was introduced in Dentistry more than 40 years ago, its original formula has undergone changes, with the main objective of improving the mechanical properties and achieving better clinical results. Among the conventional GIC, we highlight EQUIA&reg; Forte Fil, a material developed with the aim of improving the physical and aesthetic characteristics of its predecessor EQUIA&reg; Fil. However, there are no biologic researches evaluating the performance of EQUIA&reg; Forte and Ketac&trade; Universal Aplicap&trade;. The aim of this study was to evaluate the subcutaneous connective tissue response of isogenic mice after implanting different glass ionomer cements (EQUIA&reg; Forte Fil, EQUIA&reg; Fil and Ketac&trade; Universal Aplicap&trade;). Eighty-seven isogenic mice of the BALB/c were divided into 12 groups, 9 were experimental (Ketac, E. Fil and E. Forte at 7, 21 and 63 days) and 3 controls (empty polyethylene tubes at the same experimental time). After the experimental periods, the portion of the subcutaneous connective tissue surrounding the implanted material was removed and subjected to histotechnical processing and staining with hematoxylin and eosin. A description of the tissue reaction in contact with each material, semi-quantitative analysis of f collagen fiber formation and inflammatory infiltrate and quantitative analysis of the tissue thickness of the granulomatous reaction tissue in contact with the tested material or polyethylene tube were performed. Data were analyzed statistically (&alpha;=0.05) using the Kruskal-Wallis test, followed by the Dunn Post test. Initially, the collagen fiber formation was not different between the tested materials (p>0.05), but it became different at 21 days, with the control presenting the most advanced stage of collagen fiber formation, and reaching the end of the experiment with the EQUIA&reg; Forte Fil group with a more advanced stage of collagen fiber formation, compared to the EQUIA&reg; Fil group (p<0.05). Inflammatory infiltrate, on the other hand, showed no difference between the materials tested during the experimental periods (p>0.05). The tissue thickness was larger for the EQUIA&reg; Forte Fil group, differing from the control group in all evaluated periods (p<0.05). According to the results obtained, it was concluded that all the glass ionomer - based cements tested showed tissue compatibility, according to the different parameters evaluated

No presente trabalho, desenvolvemos uma estratégia vacinal baseada em vacinas de DNA que codificam proteínas do HPV-16, o tipo viral de maior relevância epidemiológica, fusionadas à glicoproteína D (gD) do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). A vacina que contêm o gene da E7 de HPV-16 fusionada à gD de HSV-1 (pgDE7), administrada em regime vacinal de quatro doses, foi capaz de gerar significativa ativação de células T CD8+ E7-específicas e apresentar 40% de efeito protetor anti-tumoral terapêutico em camundongos desafiados com células transformadas que expressam as proteínas E6 e E7 do HPV-16 (células TC-1). A partir das evidências geradas, desenvolvemos um novo vetor vacinal que codifica as proteínas E7, E6 e E5 do HPV-16 (pgD-E7E6E5). Em ensaios em modelo murino, apenas uma dose da vacina foi capaz de gerar ativação de células T CD8+ específicas e 70% dos camundongos previamente desafiados com células TC-1 e inoculados com 3 doses da vacina mantiveram-se livres de tumores. Como tentativa de potencializar o efeito protetor terapêutico encontrado, adotamos duas medidas: a co-administração de plasmídeos que codificam citocinas e a otimização de códons da sequência gênica que codifica a proteína quimérica. A combinação das vacinas pgDE7 ou pgD-E7E6E5 com plasmídeos que carregam os genes das citocinas IL-2, IL-12 ou GM-CSF foi capaz de aumentar a proteção terapêutica para 100% em regime vacinal de dose única. A adequação da sequência antigênica ao sistema de expressão humano, aumentou em cerca de 5 vezes o potencial terapêutico do vetor vacinal pgDE7. Em conjunto, os dados apresentados nesta tese demonstram a evolução do desenvolvimento de uma estratégia vacinal contra tumores induzidos por HPV-16 e encorajam seu potencial para uso em futuros ensaios clínicos. / The development of immunotherapeutic strategies against human papillomavirus (HPV) is a priority for the control of HPV-induced lesions and cervical cancer. In this study, we developed DNA vaccines encoding HPV-16 proteins fused to glycoprotein D (gD) of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) as an approach to control HPV-16 induced tumors. The vaccine encoding HPV-16 E7 fused to HSV-1 gD (pgDE7), when administered in a four doses vaccine regimen, was able to generate significant activation of E7-specific CD8+ T cells and showed 40% of therapeutic anti-tumor effect in mice previously challenged with tumor cells expressing HPV-16 E6 and E7 proteins (TC-1 cells). Following these evidences, we developed a new vaccine vector encoding HPV-16 E7, E6, E5 proteins fused to HSV-1 gD (pgD-E7E6E5). Only one vaccine dose generated antigen-specific CD8+ T cell responses and three doses conferred 70% protection to mice previously challenged with TC-1 cells. As an attempt to enhance the observed therapeutic anti-tumor effects, we tested two approaches: co-administration of cytokine-expressing plasmids and codon optimization of the gene encoding the chimeric protein. The combination of the vaccines pgDE7 or pgD-E7E6E5 with plasmids encoding the cytokines IL-2, IL-12 or GM-CSF increased the therapeutic protection to 100% of the vaccinated animals following a single dose. The gene sequence adaptation increased by a factor of 5 the therapeutic potential of the pgDE7 vaccine. In summary, the data presented in this thesis demonstrated the development of a vaccine strategy against HPV-16 induced tumors and reinforces its potential use in future clinical trials.

Muitos estudos de câncer têm sido desenvolvidos, mas os mecanismos moleculares da tumorigênese e a resposta imune contra tumores não foi completamente elucidada. RMAS é uma linhagem celular mutante derivada de RMA. Ao contrário da última, RMAS é deficiente de MHC I e, portanto, é avlvo de células NK. O objetivo deste trabalho foi o uso deste par de células para estabelecer modelos murinos que possam ser usados para entender a resposta imune entre células CD8 e NK contra tumor e investigar o efeito da expressão de moléculas antiapoptóticas no comportamento tumoral in vivo. Essa abordagem pode prover informações relevantes para o desenvolvimento de novas terapias. Para desenvolver células EGFP, foi usado um vetor retroviral bicistrônico contendo o gene Egfp. Para desenvolver os modelos experimentais, camundongos C57BL6 WT foram injetados iv com diferentes números de células e curvas de sobrevivência foram geradas. Os padrões de doença e infiltração tumoral foram observadas por análises macroscópica, microscópica e por detecção de EGFP em tecidos. In vivo, células RMA. induziram paralisia enquanto RMA-S.Egfp, ascite. RMA.Egfp infiltrou a medula óssea enquanto RMA-S.Egfp, tecidos diferentes como fígado, rins e peritôneo, mas não a medula óssea. Os sinais clínicos apareceram após 15 dias da inoculação de >104 células e a morte, em 30 dias. Números <103 células não induziram doença nem morte, mas protegeram de ambas quando re-inoculadas 106 células RMA.Egfp. Camundongos CD4KO e CD8KO paralisaram e morreram antes do que os WT. Células RMA.BclW.Egfp foram mais resistentes a apoptose do que células RMA.Egfp in vitro e provocaram características clínicas piores: paralisia e morte anteriores, inchaço de membros e hemorragia de fígado e rins. / Many cancer studies have been developed, however the molecular mechanisms of tumorigenesis and immune responses to tumor is not completely elucidated. RMAS cells are a mutant lymphoma line derived from RMA cells. In contrast to the latter, RMAS are deficient in MHCI and, therefore, are targets for NK cells. Our aims were use these pair of cells to establish mouse models that can be used to understand CD8T vs NK cell immune responses to tumors and investigate the effect of expression of antiapoptotic molecules in tumor behavior in vivo. The combination of these approaches should provide relevant information for the development of novel immunotherapy. To develop EGFP cells we used a bicistronic retroviral vector containing Egfp gene. To develop the experimental models, WT C57BL/6 mice were iv injected with different cell numbers and survival curves were produced. In addition, clinical features and tumor spread was observed by macroscopy, microscopy and EGFP detection of tumor cell analysis in tissues. When injected in vivo, RMA.Egfp cells induced progressive paralysis while RMA-S.Egfp promoted ascites. RMA.Egfp cells infiltrated the bone marrow, while RMA-S.Egfp were found in different tissues such as liver, kidney and the peritoneum cavity, but were not found in bone marrow. The symptoms appeared 15 days post injection of >104 cells and the death was 30 days. Numbers of <103 cells do not induced pathology or death, but protected to paralysis and death when re-injected 106 RMA.Egfp cells. CD4KO and CD8KO mice showed paralysis and death earlier than WT mice. RMA.BclW.Egfp cells were more resistant to apoptosis than RMA.Egfp in vitro and induced worse clinical features in vivo: earlier paralysis and death, swelling of members, haemorragia of liver and kidneys.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos adultos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonial stem cells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a transgenia, no entanto os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento, o que encarece a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. O fenótipo molecular de células-tronco espermatogoniais tem sido objeto de estudo nas últimas décadas. Uma das moléculas mais estudadas como marcador na caracterização de espermatogônias é a alfa-6 integrina. Baseado nestas informações, a seguinte hipótese foi proposta: SSCs que apresentam maior expressão de alfa-6 integrina são mais eficientes para modificações genéticas e colonização de túbulos seminíferos. Para testar essa hipótese, as SSCs murinas foram dissociadas de testículos de camundongos com 8 a 11 dias de idade. Essas células foram cultivadas in vitro, caracterizadas quanto sua morfologia, congeladas e incubadas com anticorpo anti-alfa-6 integrina para a purificação das SSCs por separação celular ativada por fluorescência (FACS). Células testiculares foram geneticamente modificadas com a inserção do gene marcador LacZ e o transplante através dos ductos eferentes foi padronizado. As Células germinativas testiculares foram dissociadas e cultivadas in vitro, porém a viabilidade foi aquém da desejada, inviabilizando as etapas de transformação, transplante e posterior avaliação histológica. Usando o marcador molecular alfa-6 integrina foi possível separar populações de células germinativas testiculares por FACS e a expressão gênica de ITG&alpha;6, GFR&alpha;1, Oct-4 e Thy-1 foi detectada por RT-PCR quantitativo. Em conclusão, não foi possível comprovar a eficiência de transdução e colonização em túbulos seminíferos por células-tronco espermatogoniais selecionadas com alfa-6 integrina. / Throughout the reproductive life of adult males, spermatozoa are formed from spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for transgenesis, however the protocols require addition of growth factors, which increases the maintenance costs of these cells for a prolonged time, making of the cryopreservation of SSCs an alternative for this problem. The molecular phenotype of spermatogonial stem cells have been target of studies in recent decades. One of the most studied marker molecule in the characterization of spermatogonia is integrin alpha-6. Based on these informations, the following hypothesis was proposed: SSCs that show increased expression of integrin alpha-6 are more efficient for genetic modification and colonization of seminiferous tubules. In order to test this hypotesis, murine SSCs were dissociated from testes of 8 to 11 days old mice. These cells were in vitro cultured, characterized based on its morphology, frozen and incubated with anti-integrin alpha-6 antibody for the purification of SSCs by activated cell sorting fluorescence (FACS). Testicular cells were genetically modified with the insertion of the marker gene LacZ and transplantation through the efferent ducts was standardized. The testicular germ cells were dissociated and in vitro cultured, however viability was below expected, precluding the steps of transformation, transplantation and subsequent histological evaluation. Using molecular marker integrin alpha-6 it was possible to separate testicular germ cell populations by FACS and gene expression of ITG&alpha;6, GFR&alpha;1, Oct-4 and Thy-1was detected by quantitative RT-PCR. In conclusion, it was not possible to prove the efficiency of transduction and colonization in the seminiferous tubules by spermatogonial stem cells selected with alpha 6 integrin.

Neste estudo avaliou-se a ação da Angiotensina II (Ang II) e do bloqueio dos seus receptores AT1 e AT2 no remodelamento da matriz extracelular (MEC) e traçamos o perfil da sinalização intracelular envolvida no processo. O estudo foi feito in vivo em camundongos isogênicos C57Bl/6J submetidos a tratamento durante 7 e 14 dias com doses subpressoras de Ang II, bloqueador do receptor AT1 (Losartan) e uma combinação destes. Os animais foram sacrificados e procedeu-se a coleta de tecidos de artérias (aorta, carótida e femoral), coração, rins e pulmão para análise da síntese e degradação de componentes da MEC. Foram feitas avaliações hemodinâmicas, morfológicas em microscopia de luz, morfométricas, imunohistoquímicas para os componentes da matriz extracelular: colágeno (tipos I, III, IV e VI), fibronectina, tenascina-C, elastina, metaloproteinases (tipos 2 e 9), e quantificação de algumas proteínas ligadas à sinalização intracelular da via das Proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK - Mitogen-activated protein kinases) usando-se Western Blotting. / In this study we evaluated the action of Angiotensin II (Ang II) and the blockade of AT1 and AT2 receptors in the remodeling of extracellular matrix (ECM) and outlines the process involved in intracellular signaling. The study was done in vivo in C57Bl/6J inbred mice undergoing treatment for 7 and 14 days subpressor doses of Ang II, AT1 receptor blocker (Losartan) and a combination thereof. The animals were sacrificed and proceeded to collect tissues of arteries (aorta, carotid and femoral arteries), heart, kidneys and lungs for analysis of the synthesis and degradation of ECM components. We assessed hemodynamic, morphological light microscopy, morphometry, immunohistochemistry for extracellular matrix components: collagen (types I, III, IV and VI), fibronectin, tenascin-C, elastin, metalloproteinases (types 2 and 9) and quantification of some proteins related to intracellular signaling pathways of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) using Western Blotting.

O Trypanosoma cruzi, parasita causador da doença de Chagas, apresenta isolados virulentos e de baixa virulência. Exploramos o envolvimento do sistema imune nos baixos níveis de parasitemia de camundongos infectados com parasitas de baixa virulência Sylvio X10/4. Camundongos C57Bl/6 WT não apresentam parasitemia patente após 24 horas da infecção, e a análise da carga parasitária revelou que a maioria dos parasitas vão para o fígado e baço. O envolvimento dos anticorpos naturais foi descartado, e uma pequena participação do sistema complemento sugerida. Já camundongos IFN-<font face=\"Symbol\">gKO infectados apresentaram parasitemia intermitente nas primeiras semanas, e isto não pôde ser atribuído à deficiência na produção de proteínas de fase aguda. Anticorpos específicos parecem cruciais para o controle do parasita; além disso, animais que apresentam apenas IgM são resistentes à infecção. Assim, sugerimos que a rápida saída que segue a inoculação do Sylvio X10/4 é um processo de remoção ativa e, em longo prazo, não somente a IgG, mas a IgM tem um papel importante na proteção. / Trypanosoma cruzi, the parasite responsible for Chagas´ disease, displays virulent isolates and low-virulence ones. We explored the involvement of the immune system in the low level parasitemia of mice infected with low-virulence Sylvio X10/4 parasites. C57BL/6 WT mice do not show patent parasitemias after 24 hours after infection and the parasite load revealed that most parasites go to the liver and spleen. The involvement of natural antibodies was discarded and a small participation of the complement system was suggested. However, infected IFN-<font face=\"Symbol\">gKO mice showed intermittent patent parasitemias in the first weeks of infection and this can not be attributed to deficiency in the production of acute phase proteins. Parasite-specific antibodies seem crucial for parasite control, in addition, animals that have only IgM are resistant to infection. Thus, we suggest that the rapid clearance that follows Sylvio X10/4 inoculation is an active removal process and, at the long run, not only IgG, but also IgM play an important role in protection.