Pancitopenia é uma manifestação frequente na leishmaniose visceral (LV) cuja patogenia não é esclarecida. Neste estudo, a patogenia foi analisada em cão e camundongo com LV. Cães com LV, naturalmente infectados, sem coinfecção com erliquiose, foram classificados de acordo com as alterações hematimétricas em: pancitopenia, bicitopenia, citopenia e sem alterações hematológicas. O mielograma revelou um aumento na proporção mielóide:eritróide nos cães infectados em relação ao grupo controle. Havia mudanças no padrão morfológico e quantitativo nas células sanguíneas, particularmente na série eritróide em cães pancitopênicos. Na contagem diferencial, notou-se a diminuição da porcentagem de linfócitos, plasmócitos e monócitos que tinham correlação com a gravidade das alterações hematológicas. No exame histopatológico da medula óssea, observaram-se aumento na celularidade, hiperplasia megacariocítica, proliferação macrofágica e degeneração e/ou necrose. No estudo de fatores de crescimento e citocinas, o aumento da expressão de IFN-?, GM-CSF, IL-7 e TNF-? parece assumir um papel importante nos cães bicitopênicos, e IL-3 nos cães com citopenia. A expressão de IGF-I, em contraste, estava diminuída significantemente em cães pancitopênicos em relação aos demais grupos. Os dados sugerem, portanto, a ocorrência de uma dishematopoiese com a diminuição da expressão de IGF-I na doença severa. Em camundongos C57BL/6 infectados por via intravenosa com L. (L.) donovani, as alterações hematológicas foram analisadas com 28 dias pós-infecção quando vimos o desenvolvimento de um quadro pancitopênico. O mielograma revelou displasia celular, aumento na proporção mielóide:eritróide e do índice de maturação mielóide, bem como, uma hipoplasia eritróide. Além disso, observamos um aumento significante na porcentagem de linfócitos e macrófagos nos animais infectados. No exame histopatológico havia um aumento significante da celularidade com infiltrado e/ou proliferação de células mononucleares similares a macrófagos. Na caracterização dessas células por microscopia confocal, estas expressavam F4/80, um marcador típico de macrófagos residentes e/ou estromais. Por citometria de fluxo, constatamos um aumento significante na porcentagem de células F4/80+ em proliferação. Além disso, utilizamos outros marcadores expressos em macrófagos como CD169 e CD11b, e vimos que a população F4/80+CD169+CD11b+ estava diminuída nos camundongos infectados. Com base nesses dados, consideramos o camundongo C57BL/6 infectado por L. (L.) donovani um bom modelo para o estudo da dishematopoiese na LV e que os macrófagos estromais devam ter um papel importante, o que merece estudos futuros mais aprofundados. / Pancytopenia is a common manifestation in visceral leishmaniasis (VL) that may contribute to lethality. We assessed the factors involved in the pathogenesis of pancytopenia in canine and murine VL. We selected dogs with VL but without erlichiosis that were classified according to hematological alterations in: pancytopenia, bicytopenia, cytopenia and dogs infected without hematological changes. The myelogram revealed an increase in the myeloid:erythroid cell ratio in infected dogs compared with healthy dogs and changes in the morphological and quantitative patterns in hematopoietic cells, particularly in erythroid series of the pancytopenic dogs. In differential cell count, decrease in the percentage of lymphocytes, plasma cells and monocytes correlated with the severity of hematological changes. In the histopathological examination of the bone marrow, the main alterations were the increase in cellularity, megakaryocytic hyperplasia, macrophage proliferation and degeneration and/or necrosis. Addressing the growth factors and cytokines, increased expression of IFN-?, GM-CSF, IL-7 and TNF-? seemingly plays an important role in bicytopenic dogs, and the expression fo IL-3 in dogs with cytopenia. In contrast, pancytopenic dogs had a significant decrease in the IGF-I expression compared with other groups. The data suggest a dyshematopoiesis with participation of IGF-I in severe stage of disease. In L. (L.) donovani-intravenously infected C57BL / 6 mice hematological changes were evaluated at 28 days post-infection when pancytopenia was established. The bone marrow examination showed cellular morphological changes, an increase in myeloid:erythroid ratio and myeloid maturation index, and erythroid hypoplasia. Moreover, we observed a significant increase in the percentage of lymphocytes and macrophages in infected animals. In histopathological examination, we observed a significant increase in the cellularity accompanied by infiltration and/or proliferation of mononuclear cells resembling macrophages. We characterized these cells as F4/80+ cells by confocal microscopy, a typical marker of residents and/or stromal macrophages. Using flow cytometry, we found a significant increase in the percentage of F4/80 in proliferation. In addition, we used other macrophage markers such as CD169 and CD11b, when a reduction in F4/80+CD169+CD11b+ population was shown in infected mice. Based on these data, we may consider L. (L.) donovani-infected C57BL/6 mouse a good model for the study of dyshematopoiesis in VL and that stromal macrophage may have important role in the in the hematopoiesis that deserve further studies .

Não disponível / Not available

Paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina, é uma doença granulomatosa causada pelo fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp. O maior número de casos dessa doença tem sido reportado no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina. A existência de extensas áreas endêmicas, alto potencial incapacitante devido a fibroses pulmonares, grande quantidade de mortes prematuras, faz com que a PCM seja considerada um grave problema de Saúde Pública. Apesar do tratamento medicamentoso ser relativamente eficiente, o tempo longo de uso das drogas e os efeitos colaterais provocados podem levar a diminuição da adesão ao tratamento diminuindo assim eficácia. O uso de vacinas terapêuticas pode ser uma importante ferramenta no controle da PCM. Uma das modalidades investigadas pelo nosso grupo é a utilização de células dendríticas (DCs) pulsadas com o peptídeo P10 como vacina terapêutica no controle da PCM. Resultados apresentados por nosso grupo, demonstraram que DCs diferenciadas a partir de células de medula óssea de camundongos saudáveis pulsadas com o peptídeo 10 (P10) podem ser utilizadas como adjuvante no tratamento da paracoccidioidomicose experimental em camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos. Assim sendo, nossa proposta no presente trabalho foi avaliar se DCs diferenciadas de células de medula óssea (BMDCs) ou de monócitos circulantes (MoDCs) de camundongos (BALB/c) infectados apresentam modulação prévia devido à exposição a antígenos fúngicos, avaliamos in vitro a capacidade das células dendríticas diferenciadas a partir de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 estimular proliferação de linfócitos CD8+ e CD4+, analisamos a capacidade de células dendríticas derivadas de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 pulsadas com P10 em induzir uma resposta protetora. Nossos resultados obtidos são promissores e reforçam dados já publicados pelo grupo os quais demonstraram a eficiência do peptídeo P10 no tratamento da paracoccidioidomicose experimental; apontam que o P10 é capaz de modular ativamente células dendríticas diferenciadas de monócitos circulantes e diferenciadas de células de medula óssea; demonstram que BMDCs e MoDCs pulsadas ou não com P10 tem a capacidade de estimular proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+; confirmaram que BMDC e MoDCs pulsadas ou não com P10 diminuem a carga fúngica no tecido pulmonar, estimulando um padrão de citocinas misto, porém com predominância de citocinas pró-inflamatórias que incitam resposta imune celular do tipo Th1, que é protetora na PCM. Estes dados foram respaldados com a análise dos cortes histológicos onde os pulmões dos camundongos tratados com BMDCs ou MoDCs pulsadas com P10 apresentaram parênquima pulmonar mais conservado em comparação com os pulmões dos grupos que não receberam tratamento com BMDCs ou MoDCs, com diminuição significativa de células fúngicas viáveis / Paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America, is a granulomatous disease caused by the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. The highest number of cases of this disease has been reported in Brazil, Colombia, Venezuela and Argentina. The existence of extensive endemic areas, a high incapacitating potential due to pulmonary fibroses, and a large number of premature deaths, makes the PCM considered a serious public health problem. Although the drug treatment is relatively efficient, the long time of use of the drugs and the side effects provoked can lead to the decrease of the adherence to the treatment thus diminishing their effectiveness. The use of therapeutic vaccines can be an important tool in the control of PCM. One of the modalities investigated by our group is the use of dendritic cells (DCs) pulsed with the peptide P10 as therapeutic vaccine in the control of PCM. Results presented by our group demonstrated that DCs differentiated from bone marrow cells of healthy mice pulsed with peptide 10 (P10) can be used as an adjuvant in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis in immunocompetent and immunosuppressed mice. Thus, our proposal in the present study evaluated the capacity of differentiated DCs of bone marrow cells (BMDCs) or circulating monocytes (MoDCs) of infected mice (BALB/c) exhibited previous modulation due to exposure to fungal antigens, we evaluated in vitro the ability of differentiated dendritic cells from circulating monocytes from Pb18 infected mice to stimulate proliferation of CD8+ and CD4+ lymphocytes, we analyzed the ability of dendritic cells derived from circulating monocytes from mice infected with P. brasiliensis pulsed with P10 to induce a protective response. Our results are promising and reinforce data already published by the group which demonstrated the efficiency of the peptide P10 in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis; suggest that P10 is capable of actively modulating differentiated dendritic cells from circulating and differentiated monocytes from bone marrow cells; demonstrate that BMDCs and MoDCs pulsed or not with P10 have the ability to stimulate proliferation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes; confirmed that BMDC and MoDCs pulsed or not with P10 decrease the fungal load in lung tissue, stimulating a pattern of mixed cytokines but with a predominance of pro-inflammatory cytokines that stimulate Th1-type cellular immune response that is protective in PCM, these data were supported with analysis of the histological sections where the lungs of the mice treated with BMDCs or MoDCs pulsed or not with P10 showed more conserved pulmonary parenchyma compared to the lungs of the groups that did not receive treatment with BMDCs or MoDCs, with significant decrease of viable fungal cells

A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica de alta incidência e mau prognóstico, caracterizada por fadiga, dispnéia e grande limitação aos esforços físicos. Essas alterações não estão apenas limitadas ao comprometimento cardíaco, mas em parte, são decorrentes também de alterações morfo-funcionais da musculatura esquelética. Para a dissertação foram utilizados camundongos com deleção dos genes para os receptores ?2A e ?2C adrenérgicos (KO) que desenvolvem cardiomiopatia induzida por hiperatividade simpática, associada à sinais clínicos de IC e 50% de mortalidade aos sete meses de idade. Foi objetivo desse estudo realizar a caracterização fenotípica do músculo esquelético por meio de avaliações funcionais e morfológicas em camundongos KO previamente ao desenvolvimento da IC (três meses de idade), e ao longo de sua progressão (cinco e sete meses de idade). Somente na faixa etária de sete meses de idades foi constatado o estabelecimento da miopatia muscular esquelética. Nessa fase, observou-se rarefação vascular, atrofia muscular, aumento na porcentagem de fibras glicolíticas e redução na atividade máxima da enzima citrato sintase, que em conjunto, contribuem para a antecipação da fadiga observada nesse modelo, e como conseqüência, para a redução da tolerância aos esforços. Os resultados sugerem que os camundongos KO apresentam alterações morfo-funcionais da musculatura esquelética semelhantes às observadas nos demais modelos de IC e em indivíduos portadores dessa síndrome. Portanto, sendo um ótimo modelo experimental para estudos de futuras estratégias terapêuticas que visem minimizar as alterações na musculatura esquelética decorrentes da IC / Heart failure (HF) is a clinical syndrome with high incidence and bad prognostic, characterized by fatigue, dyspnea, and increased intolerance to exercise. These changes are not only related to the cardiovascular tissue, but are at least in part, consequence of morphofunctional alterations in skeletal muscles. To the present study it was used mice lacking both ?2A/?2C AR subtypes (KO) which develop cardiomyopathy induced by sympathetic hyperactivity, associated to clinical signals of HF and 50% of mortality at seven months of age. The aim of the present study was characterize the phenotype of skeletal muscle by functional and morphological evaluations in KO before (three months of age) and during the HF progression (five and seven months of age). Skeletal muscle alterations due HF were observed only at seven months of age. The alterations were characterized by vascular rarefaction, muscular atrophy, increase in glycolitic fibers percentage and reduction of maximal activity of citrate synthase and contributed with early fatigue observed in this model, and consequently, exercise intolerance. The results of present study suggest that KO mice present morphofunctional changes in skeletal muscles in a similarly to others models of HF and in patients that have this syndrome. Therefore, consisting in an excellent experimental model to future studies related to therapeutic strategies to minimize the skeletal muscle changes due HF

Mulheres asmáticas na pós-menopausa podem apresentar piora dos sintomas, portanto neste trabalho investigamos o papel dos hormônios sexuais femininos (HSF) sobre a inflamação alérgica pulmonar. A re-exposição ao antígeno exacerbou a inflamação alérgica pulmonar e a liberação de mediadores no pulmão dos animais alérgicos ovariectomizados (OVx). O valor da reatividade traqueal foi semelhante ao observado nos animais alérgicos Sham/OVx. O tratamento com estrógeno exacerbou a inflamação pulmonar, mas atenuou a reatividade das vias aéreas. O tratamento com progesterona não alterou o número de células do lavado broncoalveolar e atenuou a reatividade das vias aéreas, apesar acentuar a produção de muco e de colágeno. O tratamento com estrógeno em associação com a progesterona atenuou a inflamação pulmonar aos valores encontrados nos animais alérgicos Sham/OVx. Nossos estudos apontam para uma possível dissociação entre os efeitos moduladores dos HSF sobre a resposta inflamatória, notadamente no recrutamento celular e as alterações de mecânica respiratória. / Asthmatic postmenopausal women may experience worsening of symptoms, so in this work we investigated the role of female sex hormones (HSF) on pulmonary allergic inflammation. The re-exposure to antigen exacerbated allergic lung inflammation and release of mediators in the lungs of ovariectomized allergic mice (OVX ) . The value of tracheal reactivity was similar to that observed in allergic Sham/OVx . Treatment with estrogen exacerbated pulmonary inflammation but attenuated airways reactivity. Treatment with progesterone did not alter the number of cells in bronchoalveolar lavage and attenuated airways reactivity, although enhance mucus production and collagen. Treatment with estrogen in combination with progesterone attenuated lung inflammation to the values found in allergic animals Sham/OVx. Our studies point to a possible dissociation between the modulatory effects of HSF on the inflammatory response, especially on cell recruitment and alterations in respiratory mechanic.

INTRODUÇÃO: O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma doença cardiovascular que apresenta altas taxas de morbimortalidade associado à prejuízo da função cardíaca, disfunção autonômica e alteração do sistema renina angiotensina (SRA). Tem se estabelecido na literatura que a atuação do polimorfismo de genes do SRA, como o da enzima conversora da angiotensina (ECA), poderia contribuir para maior ocorrência de IAM e óbito. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da variação do número de cópias do gene da ECA no infarto agudo do miocárdio. MÉTODOS: Foram utilizados camundongos machos adultos, geneticamente modificados para expressar diferentes concentrações fisiológicas da enzima conversora de angiotensina: animais com uma cópia do gene da ECA (ECA 1), que apresentam menores níveis plasmáticos de ECA; com duas cópias do gene da ECA (ECA 2), que apresentam níveis plasmáticos intermediários de ECA; com três cópias do gene da ECA (ECA 3), que apresentam maiores níveis plasmáticos de ECA. Os animais foram divididos em nove grupos (n=10): três grupos sem infarto - ECA 1, ECA 2 e ECA 3; três grupos infartados e avaliados sete dias após o infarto - ECA 1-7, ECA 2-7 e ECA 3-7; três grupos infartados e avaliados 28 dias após o infarto - ECA 1-28, ECA 2-28 e ECA 3-28. Os animais infartados foram submetidos ao IAM pela ligadura da coronária esquerda. Todos os animais passaram por avaliação de ecocardiografia, para determinar a morfometria e função cardíaca e foram canulados para registro direto da pressão arterial. A partir dos sinais de pressão arterial foram realizadas as análises da variabilidade da frequência cardíaca (VFC), da variabilidade da pressão arterial sistólica e do barorreflexo espontâneo. O tecido cardíaco dos animais infartados foi coletado para quantificação da área de infarto e de colágeno, por meio de técnicas histológicas, e o plasma foi destinado para análise do perfil inflamatório por técnica de ELISA. RESULTADOS: Quando comparados os animais não infartados, em relação aos dados ecocardiográficos, observou-se que os animais com três cópias do gene da ECA apresentaram maiores valores de relação E/A do que os animais com duas e uma cópia do gene da ECA (ECA 3: 1,80 ± 0,14 vs. ECA 2: 1,24 ± 0,16 e ECA 1: 1,08 ± 0,14). Não houve diferença entre os grupos não infartados na pressão arterial sistólica (ECA 1: 124,6 ± 4,0; ECA 2: 127,1 ± 5,62; ECA 3: 129,2 ± 3,32 mmHg) e diastólica (ECA 1: 87,90 ± 3,00; ECA 2: 86,79 ± 2,63; ECA 3: 85,08 ± 1,85 mmHg), bem como na frequência cardíaca (ECA 1: 682,7 ± 12,54; ECA 2: 654,6 ± 15,77; ECA 3: 625,6 ± 25,60 bpm). Em relação aos parâmetros autonômicos nos grupos não infartados, o componente de muito baixa frequência da VFC, em valores percentuais, foi menor no grupo ECA 1 do que no ECA 2 (ECA 1: 7,87 ± 1,98 vs. ECA 2: 18,00 ± 4,25 %) e o índice de Down Gain do barorreflexo espontâneo foi maior no grupo ECA 3 em comparação com os grupos ECA 2 e ECA 1 (ECA 3: 3,80 ± 0,50 vs. ECA 2: 2,00 ± 0,36 e ECA 1: 2,24 ± 0,30 ms/mmHg). Em relação aos dados ecocardiográficos, comparando os animais não infartados e os animais infartados avaliados sete dias após o infarto, observou-se que: a relação E/A foi maior no grupo ECA 3-7 do que nos grupos não infartados com uma e duas cópias e do que no grupo infartado com duas cópias do gene da ECA (ECA 3-7: 3,47 ± 0,50 vs. ECA 1: 1,08 ± 0,14, ECA 2: 1,24 ± 0,16 e ECA 2-7: 1,74 ± 0,25); a mudança de área fracional foi menor nos grupos infartados ECA 1-7, ECA 2-7 e ECA 3-7 em comparação com os não infartados (ECA 1-7: 30,10 ± 1,80, ECA 2-7: 31,12 ± 1,47 e ECA 3-7: 21,30 ± 1,47 vs. ECA 1: 37,14 ± 1,67, ECA 2: 37,16 ± 1,23 e ECA 3: 40,68 ± 1,28 %), e entre os infartados, foi menor no grupo ECA 3-7 do que nos grupos ECA 2-7 e ECA 1-7; a fração de encurtamento foi menor nos grupos ECA 3-7 e ECA 2-7 do que no grupo ECA 3 (ECA 3-7: 16,81 ± 1,6 e ECA 2-7: 17,25 ± 2,1 vs. ECA 3: 25,00 ± 1,2 %). Em relação aos parâmetros hemodinâmicos, não foram observadas diferenças na pressão arterial e frequência cardíaca entre os grupos sete dias após o infarto. Quanto aos parâmetros autonômicos comparando os animais não infartados e os animais infartados avaliados sete dias após o infarto, observou-se que: a modulação simpática foi maior no grupo ECA 3-7 do que nos grupos ECA 1, ECA 2 e ECA 1-7 (ECA 3-7: 14,85 ± 2,36 vs. ECA 1: 4,76 ± 2,00, ECA 2: 4,34 ± 1,40 e ECA 1-7: 5,13 ± 1,88 ms²); e o balanço simpatovagal foi maior no grupo ECA 3-7 do que no grupo ECA 1-7 (ECA 3-7: 2,22 ± 0,17 vs. ECA 1-7: 0,81 ± 0,25). Sete dias após o infarto, foi observado aumento no peso do coração no grupo ECA 3-7 em comparação aos grupos não infartados (ECA 3-7: 0,205 ± 0,01 vs. ECA 1: 0,135 ± 0,006, ECA 2: 0,146 ± 0,006 e ECA 3: 0,145 ± 0,008 g). Quando comparados os grupos infartados sete e 28 dias após o infarto do miocárdio observou-se que: a relação E/A foi menor no grupo ECA 2-28 do que o grupo ECA 3-7 (ECA 2-28: 1,75 ± 0,14 vs. ECA 3-7: 3,47 ± 0,50); a espessura do septo intraventricular na diástole foi menor no grupo ECA 1-28 em comparação ao grupo ECA 1-7 (ECA 1-28: 0,63 ± 0,03 vs. ECA 1-7: 0,87 ± 0,06 mm); não houve diferença entre os grupos na pressão arterial e na frequência cardíaca; o componente de baixa frequência da VFC em valores absolutos foi menor nos grupos ECA 1-28 e ECA 3-28 em comparação ao grupo ECA 3-7 (ECA 1-28: 4,09 ± 1,45 e ECA 3-28: 6,04 ± 1,03 vs. ECA 3-7: 14,85 ± 2,36 ms2); o índice de eficiência do barorreflexo foi maior no grupo ECA 1-28 do que nos grupos infartados avaliados sete dias após o infarto (ECA 1-28: 0,28 ± 0,03 vs. ECA 1-7: 0,15 ± 0,02, ECA 2-7: 0,17 ± 0,01 e ECA 3-7: 0,17 ± 0,01); a avaliação histológica mostrou maior deposição de colágeno no grupo ECA 2-7 em comparação ao grupo ECA 1-7 (ECA 2-7: 41,20 ± 2,87 vs. ECA 1-7: 23,09 ± 4,15 mm²) e menor deposição de colágeno no grupo ECA 1-28 do que o grupo ECA 2-7 (ECA 1-28: 22,09 ± 5,41 vs. ECA 2-7: 41,20 ± 2,87 mm²); o grupo ECA 1-28 apresentou menor área de infarto comparado ao grupo ECA 3-7 (ECA 1-28: 33,62 ± 2,40 vs. ECA 3-7: 48,90 ± 1,72 mm²). Em relação ao perfil inflamatório dos animais infartados sete e 28 dias após o infarto, os animais com uma cópia do gene da ECA apresentam maiores valores de IL-10 comparados aos animais com duas e três cópias do gene da ECA (ECA 1(7-28): 65,04 ± 5,90 vs. ECA 2(7-28) + ECA 3(7-28): 37,06 ± 6,00 pg/ml) e menores valores de TGF beta (ECA 1 (7-28): 91,44 ± 11,33 vs. ECA 2(7-28) + ECA 3(7-28): 122,0 ± 8,00 pg/ml). A curva de sobrevivência mostrou que os animais infartados com 3 cópias do gene da ECA apresentaram menor sobrevivência (41%) e os animais com 1 cópia do gene da ECA maior sobrevivência (71%) ao final do estudo. CONCLUSÃO: De maneira geral, os nossos resultados de função cardíaca, função autonômica cardiovascular, perfil inflamatório, área de infarto e curva de sobrevivência indicam que os animais com três cópias do gene da ECA apresentaram pior evolução após o infarto do miocárdio em relação aos animais com uma cópia do gene da ECA / INTRODUCTION: Acute myocardial infarction (AMI) is a cardiovascular disease with high morbidity and mortality rates associated with impairment of cardiac function, autonomic dysfunction, and altered renin angiotensin system (RAS). It has been established in the literature that the performance of the RAS gene polymorphism, such as angiotensin converting enzyme (ACE), could contribute to a higher occurrence of AMI and death. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of the variation of the number of copies of the ACE gene in the acute myocardial infarction. METHODS: Adult male mice, genetically modified to express different physiological concentrations of the angiotensin converting enzyme were used: animals with one copy of the ACE gene (ACE 1), which had lower plasma levels of ACE; with two copies of the ACE gene (ACE 2), which present intermediate plasma levels of ACE; with three copies of the ACE gene (ACE 3), which have higher plasma levels of ACE. The animals were divided into nine groups (n = 10): three groups without infarction - ACE 1, ACE 2 and ACE 3; three infarcted groups assessed seven days after infarction - ACE 1-7, ACE 2-7 and ACE 3-7; three infarcted groups assessed 28 days after infarction - ACE 1-28, ACE 2-28 and ACE 3-28. Infarcted animals were submitted to AMI by ligature of the left coronary artery. All animals underwent echocardiographic evaluation to determine morphometry and cardiac function and were cannulated for direct recording of blood pressure. The analysis of heart rate variability (HRV), systolic blood pressure variability and spontaneous baroreflex were performed from blood pressure signals. The cardiac tissue of the infarcted animals was collected for quantification of the infarct area and collagen by means of histological techniques, and the plasma was used for analysis of the inflammatory profile by ELISA technique. RESULTS: When compared non-infarcted animals, in relation to echocardiographic data, it was observed that animals with three copies of the ACE gene had higher values of E/A ratio than animals with two and one copies of the ACE gene (ACE 3 : 1.80 ± 0.14 vs. ACE 2: 1.24 ± 0.16 and ACE 1: 1.08 ± 0.14). There was no difference between the non-infarcted groups on systolic blood pressure (ACE 1: 124.6 ± 4.0, ACE 2: 127.1 ± 5.62, ACE 3: 129.2 ± 3.32 mmHg) and diastolic blood pressure (ACE 1: 87.90 ± 3.00, ACE 2: 86.79 ± 2.63, ACE 3: 85.08 ± 1.85 mmHg), as well as in heart rate (ACE 1: 682.7 ± 12, 54, ACE 2: 654.6 ± 15.77, ACE 3: 625.6 ± 25.60 bpm). Regarding the autonomic parameters in the non-infarcted groups, the very low frequency component of HRV, in percentage values, was lower in the ACE 1 group than in the ACE 2 (ACE 1: 7.87 ± 1.98 vs. ACE 2: 18.00 ± 4.25 %) and the Down Gain index of the spontaneous baroreflex was higher in the ACE 3 group compared to the ACE 2 and ACE 1 groups (ACE 3: 3.80 ± 0.50 vs. ACE 2: 2.00 ± 0.36 and ACE 1: 2.24 ± 0.30 ms/mmHg). Regarding the echocardiographic data, comparing non-infarcted animals and infarcted animals evaluated seven days after infarction, it was observed that: the E/A ratio was higher in the ACE group 3-7 than in the non-infarcted groups with one and two copies of ACE and higher than in the infarcted group with two copies of the ACE gene (ACE 3-7: 3.47 ± 0.50 vs. ACE 1: 1.08 ± 0.14, ACE 2: 1.24 ± 0.16 and ACE 2-7: 1.74 ± 0.25); the fractional area change was smaller in the infarcted groups ACE 1-7, ACE 2-7 and ACE 3-7 compared to non-infarcted (ACE 1-7: 30,10 ± 1,80, ACE 2-7: 31, 12 ± 1.47 and ACE 3-7: 21.30 ± 1.47 vs. ACE 1: 37.14 ± 1.67, ACE 2: 37.16 ± 1.23 and ACE 3: 40.68 ± 1.28 %), and among infarcts, was lower in the ACE group 3-7 than in the ACE groups 2-7 and ACE 1-7; the shortening fraction was lower in the ACE groups 3-7 and ACE 2-7 than in the ACE group 3 (ACE 3-7: 16.81 ± 1.6 and ACE 2-7: 17.25 ± 2.1 vs. ACE 3: 25.00 ± 1.2 %). Regarding hemodynamic parameters, no differences were observed in blood pressure and heart rate among the groups seven days after the infarction. Regarding the autonomic parameters comparing non-infarcted animals and infarcted animals evaluated seven days after infarction, it was observed that: sympathetic modulation was higher in the ACE group 3-7 than in the ACE 1, ACE 2 and ACE 1-7 groups (ACE 3-7: 14.85 ± 2.36 vs. ACE 1: 4.76 ± 2.00, ACE 2: 4.34 ± 1.40 and ACE 1-7: 5.13 ± 1.88 ms2); and the sympatovagal balance was higher in the ACE group 3-7 than in the ACE group 1-7 (ACE 3-7: 2.22 ± 0.17 vs. ACE 1-7: 0.81 ± 0.25). Seven days after infarction, an increase in heart weight was observed in the ACE group 3-7 compared to non-infarcted groups (ACE 3-7: 0.205 ± 0.01 vs. ACE 1: 0.135 ± 0.006, ACE 2: 0.146 ± 0.006 and ACE 3: 0.145 ± 0.008 g). When comparing infarcted groups 7 and 28 days after myocardial infarction, it was observed that: the E/A ratio was lower in the ACE group 2-28 than the ACE group 3-7 (ACE 2-28: 1.75 ± 0.14 vs. ACE 3-7: 3.47 ± 0.50); the thickness of the intraventricular septum in diastole was lower in the ACE group 1-28 compared to the ACE group 1-7 (ACE 1-28: 0.63 ± 0.03 vs. ACE 1-7: 0.87 ± 0.06 mm); there was no difference between groups in blood pressure and heart rate; the low frequency component of HRV in absolute values was lower in the ACE groups 1-28 and ACE 3-28 compared to the ACE group 3-7 (ACE 1-28: 4.09 ± 1.45 and ACE 3-28: 6.04 ± 1.03 vs. ACE 3-7: 14.85 ± 2.36 ms2); the baroreflex efficiency index was higher in the ACE group 1-28 than in the infarcted groups assessed seven days after the infarction (ACE 1-28: 0.28 ± 0.03 vs. ACE 1-7: 0.15 ± 0.02, ACE 2-7: 0.17 ± 0.01 and ACE 3-7: 0.17 ± 0.01); the histological evaluation showed greater collagen deposition in the ACE group 2-7 compared to the ACE group 1-7 (ACE 2-7: 41.20 ± 2.87 vs. ACE 1-7: 23.09 ± 4.15 mm²) and lower collagen deposition in the ACE group 1-28 than the ACE group 2-7 (ACE 1-28: 22.09 ± 5.41 vs. ACE 2-7: 41.20 ± 2.87 mm²); the ACE group 1-28 had a lower infarction area compared to the ACE group 3-7 (ACE 1-28: 33.62 ± 2.40 vs. ACE 3-7: 48.90 ± 1.72 mm²). In relation to the inflammatory profile of infarcted animals seven and 28 days after infarction, animals with one copy of the ACE gene had higher IL-10 valuescompared to animals with two and three copies of the ACE gene (ACE 1 (7- 28): 65.04 ± 5.90 vs. ACE 2 (7-28) + ACE 3 (7-28): 37.06 ± 6.00 pg/ml) and lower TGF beta values (ACE 1 (7 -28): 91.44 ± 11.33 vs. ACE 2 (7-28) + ACE 3 (7-28): 122.0 ± 8.00 pg/ml). The survival curve showed that animals infarcted with 3 copies of the ACE gene had lower survival (41%) and animals with 1 copy of the ACE gene had greater survival (71%) at the end of the study. CONCLUSION: Our results of cardiac function, cardiovascular autonomic function, inflammatory profile, infarct area and survival curve indicate that animals with three copies of the ACE gene presented a worse evolution after myocardial infarction in relation to the animals with a copy of the ACE gene

Há um número crescente de pessoas e animais com obesidade e sobrepeso, com consequente aumento no número de pacientes resistentes à insulina e portadores de Diabetes mellitus (DM). O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tem sido caracterizado como uma molécula importante em inúmeros mecanismos fisiopatológicos. Em diabéticos, pesquisas indicam uma redução deste fator em alguns tecidos estudados, sendo esta menor expressão envolvida com o desenvolvimento de hipóxia tecidual e não cicatrização de feridas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos caracterizar um modelo diabético induzido por dieta, avaliar a vascularização, expressão gênica e proteica do VEGFA e seus receptores FLT1 e KDR em pâncreas de camundongos diabéticos e não diabéticos, antes e após a terapia gênica com VEGF. O estudo consistiu de 2 fases para as quais foram utilizados cinquenta camundongos, na primeira fase foram utilizados 28 animais distribuídos em 6 grupos experimentais: submetidos à dieta controle (CT) e dieta hipercalórica (DH) por 3, 4 e 6 meses. Na segunda fase, 4 grupos experimentais foram avaliados aos 4 meses: CT e DH sem vetor terapêutico (CTPLL e DHPLL) e CT e DH com vetor terapêutico (CTVEGF e DHVEGF). A análise gênica pelo PCR em tempo real e proteica pela imuno-histoquímica evidenciou queda na expressão de VEGF, FLT1 e KDR no grupo DH, sendo que a variável estereológica de densidade de volume vascular (Vv) indicou queda significativa (p<0,05) da vascularização pancreática no grupo DH em relação ao CT aos 3, 4 e 6 meses do estudo. O DM foi caracterizado com queda significativa (p<0,05) na insulinemia após 4 meses com DH. Após a injeção pancreática no grupo DHVEGF do lentivírus contendo a sequência que condifica o VEGF, foram observados aumento na expressão gênica de VEGF , FLT1 e KDR (p<0,05), com aumento de Vv vascular pancreático e aumento na insulinemia. Os resultados obtidos sugerem que é possível obter um modelo animal diabético induzido por dieta, que o VEGF e seus receptores participam da evolução e estabelecimento do quadro diabético, levando a uma redução da vascularização pancreática, e que o aumento na expressão do transgene no pâncreas de camundongos diabéticos possa contribuir para a revascularização pancreática e função das células B. / There is an increasing number of people and pets showing overweight and obesity, with a consequent growth of the number of insulin-resistant and diabetic patients. The vascular endothelial growth factor (VEGF) has been characterized as an important molecule in many physiopathological states. Recent studies indicate a reduction in VEGF content in some tissues of diabetic patients causing tissue hypoxia and impairing cicatrization. In this context, this study aimed to characterize a diet-induced diabetic animal model and to evaluate vascularization, gene and protein expression of VEGFA and its receptors KDR and FLT1, in pancreas of diabetic and non-diabetic mice before and after gene therapy with VEGF. The study was divided in two phases and fifty male mice were used. In the first phase 28 animals were distributed into 6 groups: control diet (CT) and high calorie diet (DH) for 3, 4 and 6 months. In the second phase, four experimental groups were evaluated at 4 months: CT and DH without therapeutic vector (CTPLL and DHPLL) and CT and DH with therapeutic vector (CTVEGF and DHVEGF). The genetic analysis using real time PCR and protein by immunohistochemistry showed decrease in expression of VEGF, FLT1 and KDR in the DH group, and the stereological estimate of vascular volume density (Vv) indicated a significant decrease (p <0,05 ) of vascularization in pancreatic DH group relative to the CT at 3, 4 and 6 months of the study. Diabetic mice were characterized with a significant decrease (p <0,05) in insulin after 4 months with DH. After injection of lentivirus containing the VEGF sequence in DHVEGF´s pancreas, increase in VEGF, FLT1 and KDR gene expression (p <0.05) was observed, accompanied by the increase of vascular Vv and insulinemia. The results suggest that it is possible to obtain a diabetic animal model induced by diet, that VEGF and its receptors participate in the development and establishment of the diabetic state, leading to a reduction of pancreas vascularization, and that the increase of transgene expression in the pancreas of diabetic mice may contribute to the revascularization and function of pancreatic B cells.

O plexo mioentérico é uma vasta rede de nervos e gânglios localizado entre as camadas longitudinal e circular da túnica muscular externa de todo o trato gastrintestinal (TGI). A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia ligada ao cromossomo X causada pela ausência da distrofina que, além dos evidentes efeitos degenerativos no músculo esquelético, causa severas alterações do TGI. No entanto as causas dessas alterações não são claras. Pesquisadores demonstraram que a distrofina é expressa nas fibras musculares lisas e também nos neurônios do plexo mioentérico, todavia não existe um consenso sobre o papel desta nessas estruturas. Desta forma pretende-se estudar os componentes do plexo mioentérico do intestino delgado de camundongos mdx (o modelo animal da DMD) nas idades de 4 e 10 semanas e de seus respectivos controles, camundongos C57BL/10. Os animais de ambos os grupos tiveram o intestino delgado retirado e seccionado em segmentos oral, médio e aboral para posterior avaliação através das técnicas histoquímicas de evidenciação neuronal: NADH-d, NADPH-d e AChE. Além disso, a musculatura lisa e os neurônios do plexo mioentérico foram analisados por MET. A análise quantitativa mostrou que o grupo MDX4 apresentou uma área total do intestino delgado significativamente maior que o C4 (p<0,05). Para as técnicas da NADH-d e NADPH-d foi observado um gradiente crescente de densidade numérica neuronal, no sentido oral-aboral, para todos os grupos estudados. O grupo MDX4 apresentou uma densidade neuronal significativamente menor que o C4 (p<0,05), todavia MDX10 e C10 foram iguais. Além disso, a densidade neuronal dos grupos de 10 semanas foi significativamente menor que dos de 4 semanas para ambas as técnicas (p<0,05). Em relação à estimativa do número total de neurônios, MDX10 e C10 apresentaram uma significativa redução de neurônios NADH-d positivos, quando comparada à dos grupos MDX4 e C4 (p<0,05), porém, para os neurônios NADPH-d positivos, a estimativa dos grupos de 10 semanas foi estatisticamente superior que à dos de 4 semanas (p<0,05). O grupo MDX4 apresentou uma área do perfil de neurônios nitrérgicos significativamente maior que o C4 (p<0,05). Na técnica da NADH-d, não foi detectada diferença significativa relativa à esse aspecto. Comparativamente ao grupo C4, os neurônios do grupo MDX4 não apresentaram intensa reatividade a AChE, mas foram iguais em 10 semanas. Referente à ultra-estrutura dos neurônios, esta apresentou-se preservada em todos os grupos, no entanto as fibras musculares lisas do grupo MDX apresentaram alterações morfológicas. / The myenteric plexus is an extensive network of nerve strands and ganglia located between the outer longitudinal and inner circular muscle layers of the external muscle coat of the gastrointestinal tract (GI). Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a X-linked degenerative muscular myopathy caused by the absence of dystrophin which, apart from the obvious degenerative effects in skeletal muscle, causes severe alterations of gastrointestinal (GI) tract. However the causes of these changes remain unclear. Researchers have shown that dystrophin is expressed in both smooth muscle fibers and myenteric plexus neurons, however there is no consensus on the role of it in these structures. Thus, we intend to study the components of the myenteric plexus of the small intestine of mdx mice (an animal model for DMD) at the ages of 4 and 10 weeks and their respective controls, C57BL/10 mice. The animals of both groups had the small intestine removed and sectioned into oral, middle and aboral segments for further evaluation by histochemical techniques of neuronal evidencing: NADH-d, NADPH-d and AChE. In addition, smooth muscle and myenteric plexus neurons were analyzed by TEM. The quantitative analysis showed that the MDX4 group had a significantly higher small intestine total area than the C4 (p <0.05). For the techniques of NADH-d and NADPH-d was observed an increasing gradient of neuronal numerical density, in the oral-aboral direction, for all groups. The MDX4 group showed a significantly lower neuronal density than C4 (p<0.05), however MDX10 and C10 were the same. In addition, the neuronal density of 10 weeks groups was significantly lower than those of 4 weeks for both techniques (p <0.05). Considering the total estimative number of neurons, MDX10 and C10 showed a significant reduction of NADH-d positive neurons, compared to groups MDX4 and C4 (p <0.05), but for the NADPH-d positive neurons, the estimative of 10 weeks groups was statistically higher than that of 4 weeks (p <0.05). The MDX4 group showed an nitrergic neurons profile area significantly higher than the C4 (p <0.05). In the technique of the NADH-d, no significant difference was detected on this aspect. Compared to the C4 group, neurons of MDX4 group did not show intense AChE reactivity, but they were equal in 10 weeks. Concerning the neurons ultrastructure, it was preserved in all groups, however the smooth muscle fibers of MDX group showed morphological changes.

Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P<0.001) of 33.1%, compared to a non-significant weight loss of 4.2% for the control group (saline injected mice + electroporation). The injected quadriceps muscles of the DNA-treated mice showed a 48% weight increase, when compared to the control group (P<0.001). Another electrotransfer study was carried out comparing the use of the genomic hGH sequence (gDNA) with the complementary sequence (cDNA), cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. It was observed that hGH was more efficiently expressed in the circulation of lit/scid mice, for 21 days, when injecting cDNA. Lentiviral vectors containing the hGH (cDNA and gDNA) and the mGH (cDNA) genes were also constructed and will be used in a next study, both for the transduction of keratinocytes or for in vivo electrotransfer. Lentiviral vectors will in fact be necessary for future studies, considering their reduced toxicity when compared to retroviral vectors. The results of this work, as well as opening perspectives of new studies, will establish in the near future conditions for gene therapy as a feasible and safe option for the treatment of GH deficiency and other systemic diseases.

As células dendríticas (DCs) são críticas no processo de indução de imunidade e tolerância periférica. Estas células apresentam inúmeros receptores em sua superfície e podem ser classificadas em diferentes subpopulações de acordo com a expressão dos mesmos. Anticorpos monoclonais dirigidos contra diferentes receptores celulares vêm sendo utilizados com sucesso no tratamento de patologias como câncer. Nos últimos dez anos, demonstrou-se que é possível enviar antígenos diretamente para o receptor DEC205 presente na superfície das DCs. Quando isso acontece na ausência de estímulo inflamatório, o resultado é a indução de tolerância imunológica. Quando o antígeno é enviado a estas mesmas células na presença de um estímulo inflamatório, o resultado é a indução de uma forte resposta imunológica. Geramos um anticorpo <font face=\"Symbol\">aDEC205 em fusão com a proteína 2 de superfície dos amastigotas (ASP-2) de Trypanosoma cruzi e estudamos o efeito da administração deste anticorpo in vivo na presença de diferentes adjuvantes em duas linhagens distintas de camundongos. Observamos que ambas as linhagens de camundongos não foram capazes de gerar anticorpos, mas a resposta imune celular foi suficiente para reduzir a parasitemia quando desafiados com tripomastigotas cepa Y de Trypanosoma cruzi. Camundongos A/J foram capazes de mediar apresentação cruzada. Mapeamos um peptídeo que é reconhecido por camundongos BALB/c. Camundongos imunizados com Poly (I:C) como estímulo de maturação mostrou-se superior ao CpG. / As part of the innate immune system, dendritic cells (DCs) are critical in the process of induction of immunity and peripheral tolerance. These cells offer many receptors on their surface and can be classified in different subsets according to the expression there of. Monoclonal antibodies directed against different cellular receptors have been used successfully to treat diseases such as cancer. In the last ten years has been demonstrated that antigen can be sent directly to the receiver DEC205 present on the surface of DCs in vivo. When this happens in the absence of concomitant inflammatory stimulus, the result is the induction of immunological tolerance. Moreover, when the antigen is sent to the same cells in the presence of an inflammatory stimulus, the result is to induce a strong immune response. In this study we generated an antibody <font face=\"Symbol\">aDEC205 fusion protein with the amastigote surface protein 2 (ASP-2) from Trypanosoma cruzi and study the effect of administration of this antibody in vivo in the presence of different adjuvants in two distinct strains of mice. We observed that both strains of mice were unable to generate antibodies, but cellular immune response was sufficient to reduce the parasitemia when challenged with trypomastigotes Y strain of Trypanosoma cruzi. The mice A/J were able to mediate cross-presentation. In contrast, we mapped a peptide that is recognized by BALB/c mice. In counterpart mice immunized with Poly (I:C) as maturation stimuli was superior to CpG.