Le cancer du pancréas est un cancer très agressif et de pronostic très sombre. Il est diagnostiqué tardivement et se montre résistant aux traitements. Dans ce contexte, il est nécessaire de mettre en évidence de nouveaux marqueurs spécifiques de cette pathologie dévastatrice. Le but de notre étude était de rechercher un marqueur « génétique » de ce cancer au sein du gène de la lipase sels biliaires-dépendante (BSDL) localisé en position 9q34.3 et plus particulièrement au niveau de l'exon 11 de ce gène codant pour le domaine C-terminal de la protéine et constitué de séquences répétées (séquences VNTR). L’analyse des électrophérogrammes obtenues après séquençage de Sanger à partir des amplicons de PCR réalisées sur l’ADNg extraits de tissus de patients atteints de cancer du pancréas, a permis d’identifier deux altérations génétiques : (i) la présence d’un SNP (Single Nucleotide Polymorphism) synonyme référencé rs488087, impliquant la transition c.1719C>T ; qui semble être associée au développement d’un cancer du pancréas sporadique et pourrait être un potentiel facteur prédictif de ce cancer permettant de cibler des populations à risque, (ii) la présence d’une insertion d’un nucléotide C induisant l'apparition d'une protéine BSDL tronquée présentant une séquence C-terminale modifiée contre laquelle ont été développé des anticorps polyclonaux. Cette nouvelle séquence pourrait constituer un potentiel marqueur diagnostique et/ou thérapeutique du cancer du pancréas. Ces deux altérations génétiques constituent ainsi de potentiels marqueurs du cancer du pancréas. / Pancreatic cancer is a devastating disease progressing asymptomatically until death within months after diagnosis. In this context, it is necessary to identify new specific markers to develop diagnostic tools and to target an at risk population. The aim of our study was to find a "genetic" marker in the bile salt-dependant lipase gene (BSDL). The human BSDL gene is located on the long arm of chromosome 9 in 9q34.3 with a variable number of tandem repeats (VNTR) in the coding region of exon 11. The electropherograms obtained after Sanger sequencing analysis of gDNA amplified from pancreatic cancer tissue samples allowed us to highlight: (i) the presence of a SNP (Single Nucleotide Polymorphism) involved in c.1719C>T transition which is referenced rs488087. rs488087 seems to be associated with the sporadic pancreatic cancer development and may be a predictive factor of pancreatic cancer for targeting an at risk population, (ii) the presence of a C nucleotide insertion leading to a premature stop codon with truncated protein and to the modification of the C-terminal sequence end. This new C-terminal sequence, alteration could be used as a potential diagnostic and/or therapeutic marker. Finally, these two genetic alterations identified in BSDL gene could constitute potential markers of pancreatic cancer.

Le taux de mortalité dû au cancer est en hausse d’année en année. Le cancer du pancréas est l’un des plus mortels. Avec un taux de survie inférieur à 20% un an suivant le diagnostic, il y a une urgence pour développer de nouvelles molécules pour cibler cette maladie. La metformine, un biguanide utilisé cliniquement en tant qu’agent antidiabétique, s’est avérée à avoir des propriétés anticancéreuses. Les patients souffrant de diabète de type 2 prenant la metformine comme traitement sont moins à risque de développer plusieurs cancers dont celui du pancréas. Cependant, la metformine n’étant pas biodisponible, les doses à administrer seraient trop élevées pour la considérer comme thérapie anticancéreuse. Le groupe de recherche Schmitzer a synthétisé de nouveaux analogues de type biguanide plus lipophiles dans le but d’améliorer leur biodisponibilité. Le phényléthynylbenzyle biguanide (PEBB) est un des analogues présentant des propriétés antiprolifératives environ 800 fois plus puissantes que la metformine contre des cellules du cancer du pancréas. L’hexylbiguanide s’est aussi démarqué par sa spécificité pour les cellules cancéreuses et sa faible toxicité pour les cellules saines. Étant de bons candidats, des études in vivo ont été faites sur des souris en leur administrant le PEBB et l’hexylbiguanide afin d’obtenir des informations sur l’absorption et la distribution des composés. Pour ce faire, une méthode par LC-MS en mode multiple reaction monitoring (MRM) a été développée afin de quantifier différents analogues de biguanides dans le plasma de souris. De plus, une méthode par MALDI-TOF a été développée afin de localiser et quantifier les analogues dans les tissus par imagerie couplée à la spectrométrie de masse (IMS). Les expériences réalisées ont permis de suivre les composés dans le plasma et d’établir une cinétique d’absorption révélant que le PEBB atteint sa concentration plasmatique maximale environ à 1h après l’administration et que le composé est éliminé de la circulation sanguine à 80% au bout de 4h. Dans le cas de l’hexylbiguanide, la concentration plasmatique maximale est atteinte environ 30 minutes après l’administration pour être éliminé à plus de 90% après 4h. De plus, les études d’IMS ont révélé que le PEBB se distribue principalement dans le foie et légèrement dans les tumeurs. Aucune accumulation à long terme dans le foie n’a été observée, ce qui signifie que les risques de dommages hépatiques sont faibles. Les deux méthodes développées sont des méthodes puissantes IV et reproductibles afin de quantifier les différents types de biguanides dans les liquides biologiques ainsi que dans les tissus. / The death rate of cancer is increasing every year. Pancreatic cancer is one of the deadliest. With a survival rate of less than 20% one year post diagnosis, there is an emergency to develop new molecules to target this disease. Metformin, a biguanide clinically used as an antidiabetic agent, has been shown to have anticancer properties as well. Patients with type 2 diabetes taking metformin are less likely to develop several cancers including pancreatic cancer. However, due to the poor bioavailability of metformin, the doses would be too high to consider it as an anticancer treatment. The Schmitzer group has synthesized new biguanide analogues that are more lipophilic and thus more bioavailable. Phenylethynylbenzyl biguanide (PEBB) is one of the analogues with about 800 times more effective antiproliferative properties than metformin against pancreatic cancer cells. Hexylbiguanide also stood out for its specificity for cancer cells and its low toxicity for normal cells. In vivo studies were performed on mice by administering PEBB and hexylbiguanide to study the absorption and distribution of the compounds. For this aim, a LC-MS method was developed using Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode to quantify different biguanide analogues in mice plasma. Complementarily, a MALDI-TOF method was developed to localize and quantify the analogues in tissues by imaging coupled to mass spectrometry (IMS). The experiments performed allowed to follow the compounds in plasma to establish absorption kinetics. These experiments revealed that PEBB reaches its maximum plasma concentration at 1h after administration and the compound is eliminated from the bloodstream at 80% after 6h. For hexylbiguanide, the maximum plasma concentration is reached about 30 minutes after administration and more than 90% is eliminated after 4 hours. In addition, IMS studies have shown that PEBB is distributed mainly in the liver and slightly in tumors. No accumulation in the liver was observed, which suggests that the risk of liver damage is low. These two methods are powerful and reproducible methods to quantify the different types of biguanides in biological fluids and tissues.

Avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 5%, l'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est l'un des cancers les plus agressifs et pour lequel les thérapies existantes sont largement insuffisantes. Ce cancer est caractérisé par un tissu fibreux dense et un stroma très développé, en constante interaction avec la tumeur, favorisant le développement d'un environnement propice à la progression tumorale. Actuellement, la gemcitabine est la seule chimiothérapie approuvée capable de prolonger légèrement la survie des patients. Une thérapie ciblée dirigée contre l'EGFR, l'erlotinib, a prouvé que le ciblage de cette famille pourrait être une stratégie intéressante dans cette pathologie mais qu'une sélection des patients était indispensable pour augmenter les réponses thérapeutiques. Deux récepteurs de cette famille, HER2 et HER3, dimérisent pour former une entité particulièrement agressive et impliquée dans la croissance tumorale des PDACs. Diverses techniques récemment développées sont utilisées pour quantifier ces dimères, afin d'étudier leur rôle, mais également pour tenter de les cibler, et empêcher leur signalisation dans différents cancers. A l'heure actuelle, le pertuzumab est le seul anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur HER2, capable de bloquer sa dimérisation, et utilisé en clinique. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle de HER3 en tant que cible et marqueur pronostique de l'effet du pertuzumab sur les PDAC exprimant faiblement HER2. Puis dans une deuxième partie, nous avons étudié et comparé les effets de différents anticorps monoclonaux dirigés contre HER2 et/ou HER3, sur la prolifération tumorale de tumeurs du pancréas. L'ensemble de ces résultats a permis d'établir que le ciblage du dimère HER2/HER3 s'avère être une stratégie prometteuse pour inhiber la croissance des tumeurs du pancréas exprimant faiblement HER2, et que le récepteur HER3 pourrait être un marqueur pronostique de l'effet du pertuzumab. / With a 5-year survival lower than 5%, PDAC is one of the worst cancers in terms of mortality, and for which existing therapies are unsatisfying. This cancer is characterized by a dense fibrotic tissue and an over-developed stroma, in continual interaction with the tumor, promoting the development of an ideal environment for tumor progression.To date, gemcitabine is the only approved chemotherapy able to slightly increase patients' survival. The use of erlotinib, an EGFR targeting therapy, underlined that EGFR family targeting could be an interesting treatment strategy in this pathology, but that a better patients' selection is essential to increase therapeutic response. Two receptors of this family, HER2 and HER3, are able to dimerize to consititute an aggressive entity, involved in PDAC tumoral growth. Various recently developed techniques are used to quantify those dimers, in order to study their role, but also to target them and block their signaling in cancer cells. Pertuzumab is currently the only HER2-targeting monoclonal antibody able to block its dimerization and used in clinic. We first evaluated the role of HER3 as therapeutic target and prognostic marker of pertuzumab efficacy on HER2-low expressing PDACs. We then studied and compared therapeutic effects on pancreatic tumor proliferation of different antibodies targeting HER2 and/or HER3. Taken together, those results demonstrated that HER2/HER3 dimers targeting is a promising strategy to inhibit low-HER2 expressing pancreatic tumor growth, and that HER3 could be a pronostic marker for pertuzumab efficacy in those cancers.

Le cancer pancréatique représente la cinquième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. Son mauvais pronostic (survie à 5 ans inférieure à 3,5 % des cas) est dû à l’absence de facteurs de risques spécifiques interdisant une prévention efficace, et à un diagnostic tardif qui révèle un cancer agressif chez environ 90% des patients. Actuellement, le seul traitement curatif de ce cancer est la chirurgie, mais celle-ci ne peut être envisagée que dans 10 à 15 % des cas. L’adressage de molécules thérapeutiques vers l’organe, le tissu ou la cellule malade constitue aujourd’hui un défi majeur pour le traitement des maladies humaines notamment infectieuses, cancéreuses ou d’origine génétique. C’est pour ces raisons que le développement de nanotechnologies, en tant que vecteurs de médicaments, a pris un essor considérable au cours des dernières années. Dans ce contexte, le concept de squalènisation repose sur le couplage chimique entre le squalène (SQ), un lipide naturel précurseur de la synthèse du cholestérol, et des principes actifs (notamment des molécules anticancéreuses). Les bioconjugués ainsi formés sont alors capables de s’auto-assembler en solution aqueuse pour former des nanoparticules stables de diamètres compris entre 100 et 300 nm. L’exemple de référence dans ce domaine est la nanoparticule de gemcitabine-squalène (SQdFdC) qui a donné lieu à des résultats spectaculaires in vitro sur des lignées de cellules cancéreuses humaines In vivo, les nanoparticules de gemcitabine-squalène se sont avérées beaucoup plus efficaces que la gemcitabine libre sur des tumeurs solides greffées par voie sous-cutanée ainsi que sur des modèles murins de leucémies agressives métastatiques.Au vu de ces résultats encourageants, le projet de thèse a été développé autour de deux axes de recherche. (I) Dans un premier temps, les nanoparticules de gemcitabine-squalène ont été fonctionnalisées par un peptide capable de reconnaître et de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses pancréatiques. (II) Le deuxième axe de recherche a visé l’encapsulation d’un second principe actif au sein des nanoparticules de gemcitabine-squalène afin de développer le concept de nanoparticule « multi-thérapeutique ». / Pancreatic cancer is a lethal disease with the worst prognosis among all solid tumors. In the last decades, progresses in pancreatic cancer therapy had remained exceedingly slow and disappointing offering minimal benefits in median survival which remains of less than 6 months and the maximum of 5 years in the 6% of patients. One of the major requirements for a successful cancer therapy is its ability to selectively kill cancer cells with minimal damage to healthy tissues. In this context, a great deal of attention focused on advanced nanoscale systems (i.e., nanomedicines) with the aim to overcome the limits associated to the traditional drug delivery modalities. Nanomedicines can indeed enhance drug properties by (i) offering protection from degradation, (ii) enabling controlled release and distribution and increasing bioavailability while reducing undesired side effects.In the current work we aimed to propose novel nanoscale-based strategies to optimize pancreatic cancer treatment taking into account the specific physio-pathology of this tumor. The first approach relied on the design of a targeted nanomedicine able to specifically bind receptors mainly expressed onto pancreatic cancer cells in order to selectively increase drug accumulation in these cells saving healthy ones.In a second approach, by combining two therapeutic agents in the same nanoparticle we constructed a multi-therapeutic drug delivery system capable to increase the therapeutic index of the combined therapy. In particular, taking advantages from the “squalenoylation prodrug approach”, the research activity of this Ph.D. work lead to the to design of (i) a novel peptide-functionalized squalenoyl gemcitabine nanoparticle and (ii) a tyrosine kinase inhibitor-loaded squalenoyl gemcitabine nanoparticle. Obtained nanoparticles were investigated with respect to their physico-chemical properties and in vitro antitumor activity. The efficacy of peptide-functionalized nanoparticles in impairing tumor growth was assessed in vivo on an experimental model of pancreatic cancer.

L’adénocarcinome pancréatique canalaire (PDAC) est un cancer de mauvais pronostic en partie en raison de la résistance aux traitements conventionnels de chimiothérapie ou de radiothérapie. Certaines substances bioactives issues de l’alimentation (BFCs), prooxydantes sont capables de potentialiser l’action cytotoxique des drogues conventionnelles dans le PDAC. Par ailleurs ces BFCs pourraient augmenter les cassures de l’ADN induites par les radiations ionisantes. Objectifs : évaluer l’action combinée de BFCs en association avec la chimiothérapie et la radiothérapie dans des modèles de PDAC et identifier les mécanismes impliqués dans la chimio/radiosensibilisation. Méthodes : La survie cellulaire a été évaluée in vitro en présence de BFCs en combinaison sur 4 lignées tumorales pancréatiques. La production d’espèces réactives de l'oxygène (ROS) a été mesurée par cytométrie en flux et par microscopie à fluorescence. Les mécanismes moléculaires ont été décryptés par western-blot (voies de signalisation) et cytométrie en flux (cycle cellulaire et apoptose). Enfin nous avons évalué l’association de BFCs en gavage avec la chimiothérapie par gemcitabine intrapéritonéale et avec la radiothérapie de 2 Gy par fraction in vivo, sur des greffes sous-cutanée de cellules CAPAN-2. Résultats : In vitro, le resvératrol (R), la capsaïcine (C) et le sulforaphane (S) étaient cytotoxiques avec effet inhibiteur significativement plus élevé en combinaison (R+C), (C+S) ou (R+C+S), sans effet sur les fibroblastes. Par ailleurs, les combinaisons potentialisaient l’action autrement limitée de la gemcitabine sur les cellules testées in vitro. In vivo, l’addition de R+C au traitement par gemcitabine à dose réduite a permis une régression tumorale équivalente à celle obtenue avec la gemcitabine à pleine dose. Par ailleurs, in vitro, l’ajout des BFCs seuls et combinés à la radiothérapie augmente de façon significative la toxicité cellulaire sur la lignée épithéliale CAPAN-2, comparé au traitement par radiothérapie seule comme aux traitements par BFCs seuls ou combinés. In vivo, la combinaison R+C associée à la radiothérapie a permis une diminution significative des volumes tumoraux comparée à la radiothérapie seule. L’étude des voies de signalisation a montré une augmentation de protéines pro-apoptotiques avec l’association R+C, en rapport avec une induction augmentée de ROS, mais aussi, de façon surprenante, une inhibition de la réparation de l’ADN par inhibition de la phosphorylation d’ATM. Ces deux effets combinés précipitaient la mort des cellules tumorales. Conclusions : Les combinaisons de R+C ont un effet chimiosensibilisant et radiosensibilisant dans un modèle préclinique de PDAC, avec des mécanismes moléculaires identifiés pertinents dans le contexte des thérapies testées. En associant les BFCs, à la chimioradiothérapie avec gemcitabine, on peut espérer une double potentialisation de la radiothérapie et de la chimiothérapie, en augmentant l’efficacité de la RT, et en diminuant la dose de gemcitabine associée pour une même efficacité et une meilleure tolérance du traitement.Mots clés : Cancer du pancréas, Substances bioactives issues de l’alimentation, radiothérapie, chimiothérapie, resvératrol, capsaïcine / Background: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is of poor prognosis in part because of resistance to conventional treatments such as chemotherapy or radiotherapy. Some naturally occurring bioactive food components (BFCs), with pro-oxidant properties are able to potentiate the cytotoxic action of conventional drugs in the PDAC. In addition, these BFCs could increase the DNA breaks induced by ionizing radiation. Objectives: To evaluate the combined action of several BFCs in combination with chemotherapy and radiotherapy in PDAC models and to identify mechanisms involved in chemo / radiosensitization at the cellular and molecular levels. Methods: Cell survival was evaluated in vitro in the presence of BFCs in combination on 4 pancreatic tumor cell lines. The production of reactive oxygen species (ROS) was measured by flow cytometry and fluorescence microscopy. Molecular mechanisms have been decrypted by western blot (signaling pathways) and flow cytometry (cell cycle and apoptosis). Finally, we evaluated the association of BFCs in gavage with intraperitoneal gemcitabine chemotherapy and with radiotherapy (2 Gy/fraction) in vivo, on subcutaneous CAPAN-2 cell xenografts. Results: In vitro, resveratrol (R), capsaicin (C) and sulforaphane (S) were cytotoxic with significantly higher inhibitory effect in combination (R + C), (C + S) or (R + C + S), without effect on fibroblasts. In addition, the combinations potentiated the otherwise limited action of gemcitabine on cells tested in vitro. In vivo, the addition of R + C to treatment with gemcitabine at reduced dose allowed tumor inhibition equivalent to that obtained with gemcitabine at full dose. Furthermore, in vitro, the addition of BFCs alone and in combination with radiotherapy significantly increases cellular toxicity on the CAPAN-2 epithelial line, compared to radiotherapy alone and BFCs alone or combined. In vivo, the combination R + C associated with radiotherapy allowed a significant decrease in tumor volumes compared to radiotherapy alone. The study of signaling pathways showed an increase of proapoptotic proteins with the association R + C and radiotherapy, in relation with an increased induction of ROS, but also, surprisingly, an inhibition of the repair of the DNA by inhibition of ATM phosphorylation. These two combined effects precipitated the death of the tumor cells. Conclusions: Combinations of R + C have a chemosensitizing and radiosensitizing effect in a preclinical model of PDAC, with identified molecular mechanisms relevant in the context of the therapies tested. By combining BFCs with radiochemotherapy with gemcitabine, we can hope for a double potentiation of radiotherapy and chemotherapy, by increasing the effectiveness of RT, and by reducing the dose of gemcitabine associated for similar efficiency and better tolerance treatment.

L’oncogène K-ras est une petite GTPase de la super famille RAS, fréquemment impliquée dans les cancers, en particulier celui du pancréas, l’un des plus mortels dans les pays occidentaux. Les mutations de l’oncogène K-ras sont considérées comme l’un des événements initiateurs de la cancérogenèse pancréatique et son activité oncogénique est un élément indispensable à la progression tumorale. Cependant, le ciblage thérapeutique de K-ras reste inefficace, à ce jour. Se focaliser sur les cibles précoces de son activité oncogénique semble ainsi être une stratégie alternative intéressante. La mucine membranaire MUC4 est une glycoprotéine de haut poids moléculaire fréquemment dérégulée dans les cancers. Dans le cancer du pancréas, MUC4 est néo-exprimée dès les stades prénéoplasiques et est impliquée dans les propriétés biologiques permettant la progression tumorale et la chimiorésistance. La régulation de MUC4 par K-ras dans la cancérogenèse pancréatique reste à décrypter. En utilisant le modèle murin de cancérogenèse pancréatique Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D, nous avons mis en évidence que la néo-expression précoce de la mucine Muc4, dans les lésions pancréatiques prénéoplasiques intraépithéliales (PanINs) formées suite à la présence du K-ras muté, est corrélée avec l’activation des voies de signalisation ERK, JNK and NF-κB. In vitro, la transfection de mutants constitutivement activés de K-rasG12V dans les cellules tumorales humaines induit une augmentation de l’expression de MUC4. Cette activation intervient au niveau transcriptionel par le recrutement des facteurs de transcription AP-1 et NF-κB via les voies MAPK, JNK and NF-κB et au niveau post-transcriptionel par un mécanisme impliquant la RalB GTPase. Ensemble, ces résultats démontre que MUC4 est une cible transcriptionelle et post-transcriptionelle de l’activité oncogénique de K-ras dans le cancer du pancréas. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes pour développer des stratégies ciblant les étapes précoces de ce cancer. / K-ras oncogene is a small GTPase of the RAS superfamily, highly implicated in cancer, mainly in pancreatic cancer, one of the most deadly cancers in occidental countries. K-ras mutations are considered as an initiating event of pancreatic carcinogenesis and K-ras oncogenic activities are necessary components of cancer progression. However, K-ras clinical targeting remains ineffective until now. Focus on early downstream K-ras signalling may thus appear as an interesting strategy target in this cancer. The membrane-bound mucin MUC4 is a high molecular weight glycoprotein frequently deregulated in cancer. In pancreatic cancer, MUC4 is neo-expressed in the preneoplastic stages and thereafter is involved in cancer cell properties leading to cancer progression and chemoresistance. MUC4 regulation by K-ras in pancreatic carcinogenesis remains unknown. Using the Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D mouse model of pancreatic carcinogenesis, we show that the in vivo early neo-expression of the mucin Muc4 in pancreatic intraepithelial neoplastic lesions (PanINs) induced by mutated K-ras is correlated with the activation of ERK, JNK and NF-ΚB signalling pathways. In vitro, transfection of constitutively activated K-rasG12V in human pancreatic cancer cells led to the transcriptional upregulation of MUC4. This activation was shown to be mediated at the transcriptional level by AP-1 and NF-ΚB transcription factors via MAPK, JNK and NF-ΚB pathways and at the post-transcriptional level by a mechanism involving the RalB GTPase. Altogether, these results identifies MUC4 as a transcriptional and post-transcriptional target of K-ras in pancreatic cancer. This opens avenues in developing new approaches to target the early steps of this deadly cancer.

L’adénocarcinome pancréatique (PDA) présente une résistance accrue aux chimiothérapies. Un concept propose que sa composition cellulaire participe à ce processus en limitant l’accès aux drogues tout en modulant les capacités des cellules tumorales. En effet, les cellules non tumorales, principalement mésenchymateuses (CAFs) et immunitaires, représentent 70% de la masse tumorale et forment le microenvironnement intra-tumoral ou stroma. L’impact du stroma dans le développement et la progression des PDA se trouve être au centre d’un large champ d’investigations cliniques. Notre première étude a porté sur un facteur neurotrophique, Slit2, impliqué dans la guidance axonale est sécrété par les CAFs. Ce dernier induit une augmentation de la migration des cellules de Schwann et des changements morphologiques et quantitatifs des cellules neuronales. Ainsi, les nerfs se retrouvent plus nombreux et de taille plus importante dans la tumeur comparée à un pancréas sain, c’est ce qu’on appelle le remodelage neural. Notre second travail a permis d’identifier un complexe multi-protéique (ANXA6/LRP1/TSP1), associé au trafic vésiculaire, présent uniquement dans le compartiment stromal et plus particulièrement dans les CAFs. Ce complexe est porté par des vésicules extracellulaires et procure un avantage prolifératif et pro-migratoire aux cellules tumorales. Les données obtenues au cours de mon travail de thèse constituent un rationnel fort pour étudier le potentiel thérapeutique des éléments permettant le dialogue entre les différents compartiments de la tumeur dans le but de sensibiliser les cellules tumorales aux chimiothérapies et ainsi d’améliorer la survie des patients. / Pancreatic adenocarcinoma (PDA) is particularly resistant to current therapies. A concept suggests that its cellular composition participates in this process, limiting drugs access and affecting tumor cells behavior. Indeed, non-tumor cells, mainly mesenchymal (including Cancer Associated Fibroblasts, CAFs) and immune cells display over 70% of the tumor mass and form the intra-tumoral microenvironment or stroma. The impact of stroma in PDA development and progression is at the center of many clinical investigations. Firstly, we studied a neurogenic factor, Slit2, implicated in axon guidance pathway and secreted by CAFs. Slit2 increases Schawnn cells migration and morphologic changes of neural cells. Indeed, nerve size and density are increased in a tumor compared to a healthy pancreas, that is called, neural remodeling. Secondly, we worked on a multi-proteic complex (ANXA6/LRP1/TSP1), associated to vesicular trafficking, only expressed in stromal compartment, and mainly in CAFs. This complex is present in extracellular vesicles and confers proliferative and pro-migratory capacities to tumor cells. Data obtained during my thesis constitute an important rationale to target the crosstalk between tumor and stromal compartment, in order to sensitize tumor cells to chemotherapy and improve patient survival.

La mucine MUC1 est une oncoprotéine transmembranaire dont la surexpression dans 90% des adénocarcinomes pancréatiques a été associée à un mauvais pronostic. MUC1 est impliquée dans la transduction des signaux intracellulaires et dans les interactions cellulaires permettant de conférer aux cellules tumorales des propriétés accrues en termes de prolifération et d’invasion cellulaire. De plus il a été montré un rôle important de MUC1 dans la chimiorésistance à la gemcitabine, et dans la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules cancéreuses pancréatiques. De manière intéressante il a pu être montré que MUC1 pouvait être internalisée et localisée dans le compartiment nucléaire afin d’agir comme un co-activateur transcriptionnel permettant de moduler l’expression de nombreux gènes comme ceux de la voie Wnt/β-caténine, les cibles de Stat1/3 ou le cluster miR-200c/miR141. De plus, il a été démontré que MUC1 pouvait être régulé de façon épigénétique, par méthylation de son promoteur, par acétylation des histones et par les miARN.Notre objectif a été d’étudier l'inhibition de MUC1 par des miARN dérégulés dans le cancer pancréatique, afin de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique innovante dans le but de ralentir la progression de ce cancer. Nous avons sélectionné des miARN pouvant cibler la mucine MUC1 aussi bien au niveau de son 3’UTR, de son 5’UTR ou de sa région codante par l'utilisation des bases de données miRanda, miRWalk et TargetScan. Afin d’affiner cette sélection, nous avons ensuite retenu seulement ceux étant dérégulés dans le cancer pancréatique en étudiant leur expression dans des lignées cellulaires cancéreuses pancréatiques humaines ainsi que dans un modèle murin transgénique de cancérogenèse pancréatique et dans les tissus de patients atteints d'adénocarcinome pancréatique.Nous avons dans un premier temps mis en évidence que parmi les miARN sélectionnés, la surexpression de miR-29a, miR-183, miR-200a, miR-330-5p, miR-876-3p et miR-939 entraînait une diminution de l'expression protéique de MUC1. En établissant le profil d'expression des miARN dans les trois modèles de cancer pancréatique dont nous disposions, nous avons pu mettre en évidence une dérégulation globale de miR-29a et miR-330-5p dans les lignées cellulaires cancéreuses pancréatiques humaines ainsi que chez les patients atteints d'adénocarcinome pancréatique, et une dérégulation plus spécifique pour les autres miARN. Nous avons alors pu mettre en évidence que parmi l'ensemble des miARN sélectionnés, seuls les miARN miR-29a et miR-330-5p avaient la capacité d’interagir avec l'ARNm de MUC1 au niveau de son 3’UTR. Nous avons donc entrepris dans un second temps d’étudier le rôle de miR-29a et miR-330-5p dans le cancer du pancréas. Pour cela, nous avons utilisé une stratégie transitoire de surexpression et d'inhibition des miARN et une stratégie stable en réalisant des lignées surexprimant les miARN ainsi qu’une lignée déficiente en MUC1. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression de miR-29a et miR-330-5p, permettait de ralentir la prolifération cellulaire, la migration, l'invasion cellulaire, la croissance tumorale et augmentait la chimiosensibilité des cellules cancéreuses pancréatiques à la gemcitabine. En conclusion, l'ensemble de ces données a permis de mettre en évidence un ensemble de miARN dérégulés dans le cancer du pancréas ayant la capacité de réguler négativement l'expression protéique de la mucine MUC1. Nous avons également montré que miR-29a et miR-330-5p étaient les seuls à réguler directement l'expression de MUC1 et qu’ils agissaient comme des suppresseurs de tumeurs en altérant les propriétés biologiques des cellules cancéreuses pancréatiques, in vitro et in vivo. Ces données nous permettent de proposer ces deux miARN comme une nouvelle piste thérapeutique potentielle pour le traitement de ce cancer. / The mucin MUC1 is a transmembrane oncoprotein overexpressed in 90% of pancreatic adenocarcinoma and associated with a poor prognosis. MUC1 is involved in cell signaling and cell interaction to enhanced tumor cell properties like cell proliferation and invasion. Furthermore it has been shown an important role of MUC1 in chemoresistance to gemcitabine, the basic treatment of pancreatic cancer, and in the epithelial-mesenchymal transition of pancreatic cancer cells. Interestingly it has been shown that MUC1 could be internalized and localized in the nuclear compartment to act as a transcriptional coactivator to modulate the expression of many genes such as the Wnt/β-catenin, the targets of Stat1/3 or the miR-200c/miR141 cluster. Furthermore, it has been shown that MUC1 is regulated by epigenetics: by methylation of the promoter, histone acetylation and by miRNAs in breast and ovarian cancer.Our aim was to study the inhibition of MUC1 by miRNAs deregulated in pancreatic cancer, to propose a new innovative therapeutic strategy to slow down progression of this cancer.We selected miRNAs targeting the mucin MUC1, in its 3\\\'UTR, its 5\\\'UTR or its coding region by using databases such as Miranda, miRWalk and TargetScan. To refine this selection, we then selected only those being deregulated in pancreatic cancer by studying their expression in human pancreatic cancer cell lines, tissues from patients with pancreatic adenocarcinoma and transgenic mouse model of early pancreatic carcinogenesis.We initially demonstrated that among the selected miRNAs, overexpression of miR-29a, miR-183, miR-200a, miR-330-5p, miR-and miR-939 876-3p led to a decrease of MUC1 protein expression. By establishing the miRNA expression profile in the three models of pancreatic cancer that we had, we were able to demonstrate an overall deregulation of miR-29a and miR-330-5p in human pancreatic cancer cell lines and in patients with a pancreatic adenocarcinoma, and a more specifically deregulation for the other miRNAs.We were then able to show that among the selected miRNAs, only miRNAs miR-29a and miR-330-5p had the ability to interact with MUC1 mRNA on its 3\\\'UTR. We therefore undertook to study the role of miR-29a and miR-330-5p in pancreatic cancer. For this, we used a transient strategy to overexpress or inhibit miRNAs and stable cell lines overexpressing the miRNA as well as a deficient cell line for MUC1. We were able to show that overexpression of miR-29a and miR-330-5p slowed down cell proliferation, migration, cell invasion, tumor growth and increased chemosensitivity of pancreatic cancer cells to gemcitabine.In conclusion, all these data allowed us to identify a set of deregulated miRNAs in pancreatic cancer which have the ability to decrease the mucin MUC1 protein expression level. We also showed that miR-29a and miR-330-5p were the only ones that can regulate the expression of MUC1 directly and act as tumor suppressors by altering the biological properties of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo. These data allow us to propose these two miRNAs as a new potential therapeutic approach for the treatment of this cancer.

Le cancer colorectal (CRC) est le plus fréquent des cancers digestifs. Cependant, il est moins grave et moins fréquemment associé à une complication thrombo-embolique que le cancer du pancréas (PC). Les microparticules (MPs) sont de petites vésicules produites par bourgeonnement de la membrane cellulaire. Les MPs sont impliquées dans la croissance tumorale, le développement de métastases et l’activité pro-coagulante associée aux cancers. Les objectifs de ces travaux étaient d’identifier et de caractériser les différentes MPs dans le CRC and le PC, afin de décrire une signature microparticulaire, puis d’évaluer leur implication dans la survenue de complications thrombo-emboliques. Nous avons donc rapporté une signature microparticulaire spécifique dans le CRC et le PC par rapport à des pathologies bénignes colorectales et pancréatiques, ainsi que des sujets sains, que nous avons appelé “microparticulosome”. Le microparticulosome se modifie avec l’évolution de la maladie, pour se rapprocher des formes bénignes voire des sujets sains, en cas de rémission du CRC. De plus,il varie en présence ou non d'une complication thrombo-embolique. Nous avons également rapporté le cas d’un cancer du sein diagnostiqué grâce à des taux élevés de MPs exprimant la fibrine. En conclusion, les MPs pourraient constituer de nouveaux bio-marqueurs pertinents en cancérologie, dans le diagnostic, le pronostic de survie et de survenue d’une complication thrombo-embolique. La connaissance des interactions des MPs avec le microenvironnement tumoral permettra de mettre au point des thérapeutiques adaptées et efficaces dans la croissance tumorale et l’extension métastatique. / Colorectal cancer (CRC) is the most common gastrointestinal cancer. It is less serious and less frequently associated with thrombo-embolic event than pancreatic cancer (PC). Microparticles (MPs) are small vesicles produced and released by exocytic blebbing of the activated and apoptotic cell membrane from most, if not all, types of cells. They are known to be implicated in the tumor growth, the development of metastases and the cancer-associated procoagulant activity. Our objectives were to identify and to characterize the different concentrations of circulating MPs in CRC and PC, in order to describe a MPs hallmark, and to evaluate their implication in the occurrence of a venous thromboembolism. We have thus reported a specific hallmark of MPs in CRC and PC, comparing to benign colorectal and pancreatic diseases and healthy subjects, so-called the “microparticulosome”. We have observed that microparticulosome changed with the evolution of the disease, and tended to the signature observed for benign diseases or healthy subject in case of CRC remission. We also reported variations in the microparticulosome in case of an occurrence of a thrombo-embolic event.In conclusion, MPs may constitute new pertinent biomarkers in cancers, in the diagnosis, the survival prognostic and the prognostic of the occurrence of thrombo-embolic events. Understanding the interactions of MPs with tumor environment will allow to find efficient treatments against tumor growth and metastases development.

La sous-famille BTN3A comprend 3 isoformes : BTN3A1, A2 et A3. Le domaine intracellulaire B30.2 de BTN3A1 est impliqué dans la reconnaissance du Phosphoantigène (Pag) et l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2(LTVγ9Vδ2). BTN3A2, dépourvue de B30.2, pourrait être un récepteur-leurre. L’anticorps monoclonal (Acm) 20.1 reconnaît les trois isoformes de BTN3A et sensibilise les tumeurs à la lyse par les LTVγ9Vδ2, mimant l’action des Biphosphonates (N-BP). Nous avons étudié l’expression, la régulation et le ciblage de BTN3A en contexte d’hémopathie maligne et de tumeur solide. Nous avons montré que BTN3A2 est l’isoforme majoritairement exprimée par les blastes de Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) primaire. Cependant, l’Acm 20.1 sensibilise les blastes de LAM primaire à la lyse par les LT Vγ9Vδ2, même ceux résistants aux N-BP. Cet effet est confirmé dans des souris NOD-SCID-γcKO xénogreffées avec la lignée U937 ou des blastes primaires. Nous avons ensuite montré l’expression de BTN3A sur des lignées et des tumeurs pancréatiques primaires et observé qu’elle est associée au pronostic chez les patients atteints de cancer du pancréas. L’expression de BTN3A2, isoforme majoritairement exprimée augmente en contexte de stress cellulaire hypoxique et métabolique. La faible expression de BTN3A1 comparativement à BTN3A2 et le clivage des BTN3A pourraient favoriser l’échappement tumoral à la reconnaissance par les LT Vγ9Vδ2. Cependant, les LT Vγ9Vδ2 ont des fonctions cytolytiques préservées en hypoxie. Le ciblage de BTN3A par l’Acm 20.1 sur les tumeurs étudiées, en restaurant la lyse par les LT Vγ9Vδ2, offrirait des perspectives thérapeutiques notamment pour les tumeurs chimiorésistantes. / BTN3A subfamily comprises three isoforms: BTN3A1, A2 and A3. The B30.2 intracellular domain of BTN3A1is involved in Phosphoantigen recognition and Vγ9Vδ2 T cells activation. BTN3A2, devoid of B30.2 domain, could be « a decoy receptor ». The agonist anti-BTN3A monoclonal Antibody (mAb) 20.1 recognizes the three BTN3A isoforms and sensitizes tumors to Vγ9Vδ2 T cell lysis. This mAb mimics the effect of Aminobisphosphonates (N-BP). We studied BTN3A expression, regulation and targeting in tumors of hematological and solid origin. We showed that primary Acute Myeloïd Leukemia (AML) blasts express BTN3A with a main expression of BTN3A2. However, the 20.1 mAb sensitizes primary AML blasts to Vγ9Vδ2 T cell lysis even N-BP-poorly sensitive blasts. This was confirmed in NOD-SCID-γc KO mice xenografted with U937 human cell line or primary blasts. Next, we have demonstrated BTN3A expression in pancreatic cell lines and primary tumors. We observed that BTN3A is associated to prognosis in patients with pancreatic cancer. BTN3A2 is the most highly expressed isoform and its level of expression increases upon hypoxic and metabolic cellular stress. The weak expression of BTN3A1 compared to BTN3A2 isoform together with BTN3A molecules shedding could constitute an immune escape mechanism of tumor cells from Vγ9Vδ2 T cells recognition. Though, Vγ9Vδ2 T cells have preserved cytotoxic functions under hypoxic condition. BTN3A targeting with anti-BTN3A 20.1 mAb on the tumors we studied would open new therapeutic perspectives notably in chemoresistant tumors, thanks to the restoration of Vγ9Vδ2 T cell lysis.